CN102051365A - 一种β-脱卤酶的基因及制备3-羟基丙酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种β-脱卤酶的基因及制备3-羟基丙酸的方法。其β-脱卤酶的基因具有如SEQ No.1所示序列；保藏号为CGMCC No.4196的芽孢杆菌含具有如SEQ No.1所示序列的基因；其β-脱卤酶由具有如SEQ No.1所示序列的基因所编码。本发明制备3-羟基丙酸的方法包括以下步骤：(1)将芽孢杆菌的具有如SEQ No.1所示序列的基因通过质粒导入宿主细胞，得到重组细胞；(2)将重组细胞加入到离子缓冲溶液中破胞，离心得到上清液，将上清液经镍离子亲和层析柱和脱盐柱纯化得到纯酶液；(3)将3-氯丙酸溶液加入到纯酶液中进行反应得到3-羟基丙酸，3-氯丙酸相对于3-氯丙酸溶液和纯酶液总量的摩尔浓度为10～50mmol/L。本发明可得单一产物，转化率高，以10mmol/L3-氯丙酸为底物，反应24h后转化率可达98％。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备3-羟基丙酸的方法，特别涉及一种利用生物转化法生产3-羟基丙酸的方法。
背景技术
3-羟基丙酸(简称3-HP)是一个三碳无手性直链有机酸，分子量90.08。它是一种无色无味的油状液体，可与水、醇、醚等多种有机溶剂互溶。3-羟基丙酸与乳酸互为同分异构体，该分子两端分别带有一个羟基和一个羧基，化学性质较为活泼，工业上作为一种重要的化学中间体，可以用来合成很多重要的化工产品，如脱水生成丙烯酸，氧化生成丙二酸，与醇通过酯化作用生成酯，还可通过还原作用生成1，3-丙二醇等。3-羟基丙酸还可用于生产涂料、交联剂、水处理化学品和个人护理用品等。另外，由于3-羟基丙酸具有良好的生物可降解性和生物相容性，其聚合物可被应用于生产药物缓释材料以及作为手术缝合材料等。聚3-羟基丙酸可以替代许多化学基聚合材料，具有很大的应用潜力。基于3-羟基丙酸的这些优良性质及其在商业上的重大开发价值，2004年美国能源部报告将3-羟基丙酸列为当前世界上12种最具开发潜力的平台化工产品之一。
传统的3-羟基丙酸生产方法主要是化学合成法，如1，3-丙二醇氧化法，利用丙烯酸合成3-羟基丙酸等方法。由于化学反应中，很难在三碳化合物的一端引入功能基团，所以利用这些化学合成法生产3-羟基丙酸具有设备投资大、技术难度高、需要重金属催化污染环境等缺点，且生产过程中能耗高、收率低、副产物多、产品分离纯化较复杂，也致使产品生产成本相应较高。并且化学合成需要利用不可再生的石油资源为原料，这些都限制了3-羟基丙酸衍生产品及其聚合物的应用。
3-羟基丙酸的生物转化方法主要有两条途径。一条是由美国Gargill公司构建的，以葡萄糖为底物发酵生产3-羟基丙酸的转化路线。该路线由存在于丙酸梭菌体内的β-丙氨酸代谢路径和橙色绿曲挠菌的3-羟基丙酸循环路径组合而成。将3-羟基丙酰CoA脱水酶(OS19)基因和乳酰CoA脱水酶(LCD)基因克隆进大肠杆菌体内，得到了可以利用葡萄糖生产3-羟基丙酸的重组菌。目前该路径生产3-羟基丙酸的产量可达到25g/L以上。另一条是以甘油为底物生产3-羟基丙酸，路线涉及到甘油脱水酶和乙醛脱氢酶。甘油先通过甘油脱水酶的作用转化成3-羟基丙醛(3-HPA)，然后3-羟基丙醛在乙醛脱氢酶的作用下转化成为3-羟基丙酸。该工程菌产量仅为170mg/L。后由日本学者将这种构建思想进行了改进，在该途径中加入了1，3-丙二酸的代谢支路，并用二醇脱水酶代替了甘油脱水酶，用丙烯醛脱氢酶、磷酸转乙酰酶和丙酸激酶代替了醛脱氢酶，以1mol/L甘油为底物，3-羟基丙酸的产率达到了40％。但是由于发酵法生产3-羟基丙酸副产物多，分离纯化困难，目前还很难应用于大规模的工业生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的制备3-羟基丙酸的方法。
为实现上述目的，本发明首次构建了能表达β-脱卤酶的重组细胞。
具体地说，本发明所采取的技术方案是：
本发明的β-脱卤酶的基因具有如SEQ No.1所示序列。
本发明的芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.4196，含有具有如SEQ No.1所示序列的基因。
本发明的β-脱卤酶由具有如SEQ No.1所示序列的基因所编码。
本发明制备3-羟基丙酸的方法是包括以下步骤：
(1)将所述芽孢杆菌的具有如SEQ No.1所示序列的基因通过质粒导入宿主细胞，得到重组细胞；
(2)将所述重组细胞加入到离子缓冲溶液中破胞，离心得到上清液，将所述上清液经镍离子亲和层析柱和脱盐柱纯化得到纯酶液；
(3)将3-氯丙酸溶液加入到所述纯酶液中进行反应得到3-羟基丙酸，所述3-氯丙酸相对于3-氯丙酸溶液和纯酶液总量的摩尔浓度为10～50mmol/L。
进一步地，本发明步骤(3)中所述反应的温度为20～50℃。
进一步地，本发明所述宿主细胞为大肠杆菌。
进一步地，本发明所述离子缓冲溶液的摩尔浓度为100mmol/L、pH为4～10。
本发明方法相对于传统的化学合成方法和微生物发酵法具有以下优点：
传统的化学合成法具有技术难度高、设备投资大、生产过程中能耗高、需要重金属催化污染环境等缺点；现有微生物发酵法以甘油或葡萄糖为底物，代谢过程中会产生很多副产物，后期分离纯化难度高，且3-羟基丙酸的得率不高，而本发明采用生物转化法利用β-脱卤酶水解底物3-氯丙酸，反应条件温和，避免了使用重金属，对环境友好。另外，由于β-脱卤酶对底物3-氯丙酸具有专一性，反应后得到单一产物3-羟基丙酸，且转化率高，以摩尔浓度为10mmol/L的3-氯丙酸为底物，反应24h后转化率可达98％。
生物材料样品的保藏信息：
保藏的生物材料样品：芽孢杆菌3-CPA15(Bacillus sp.3-CPA15)；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所
(邮编：100101)；
保藏日期：2010年10月8日；
保藏登记号：CGMCC No.4196。
附图说明
图1为重组质粒pBHD表达质粒构建图。
图2为目标条带PCR产物电泳结果：其中，1-目标条带；M-DNA marker。
图3为重组pBHD表达质粒酶切验证电泳图：
其中，1-EcoRI/HindIII双酶切；2-EcoRI单酶切；3-HindIII单酶切；M-DNA marker。
图4为重组蛋白诱导表达图：
其中，1-没有外源基因的空白对照；2-BL21-pBHD全细胞(未诱导)；
3-BL21-pBHD全细胞(IPTG诱导)；4-BL21-pBHD破胞后沉淀；
5-BL21-pBHD破胞后上清；M-Protein marker。
图5为重组蛋白纯化SDS电泳图：
其中，1-纯化蛋白；M-Protein marker。
图6为3-氯丙酸和3-羟基丙酸的高效液相色谱分析图谱：其中，左侧峰为3-羟基丙酸(13.12min)，右侧为3-氯丙酸(20.73min)。
图7为β-脱卤酶水解3-氯丙酸制备3-羟基丙酸的过程曲线。
具体实施方式
以下实施例涉及的检测方法如下：
1.液相检测方法：液相色谱分析仪使用安捷伦公司的1100系统。色谱柱为有机酸分析柱Bio-Rad HPX-87H(30cm×7.8cm)，流动相为5mmol/L硫酸，流速为0.6ml/L。室温下测定紫外(UV)210nm下的吸收值。在本发明反应结束后，取产物100μl，加入0.1体积5mol/L硫酸终止反应。离心后，上清液经0.22μm滤膜过滤，取10μl进样检测，得到3-氯丙酸和3-羟基丙酸的液相图。
按以下公式计算底物3-氯丙酸的转化率：
底物转化率(％)＝(初始底物浓度-剩余底物浓度)/初始底物浓度×100％。
2.显色法检测氯离子浓度：将50μl样品、60μl饱和硫氰酸汞溶液和150μl质量浓度为160g/L的硫酸铁铵溶液加入到96孔酶标板中，室温静止10分钟，用Thermo公司的Multiskan Spectrum酶标仪检测460nm下的吸光值。
计算公式为Y＝0.12X+0.11，其中，X为氯离子摩尔浓度(mmol/L)，Y为460nm下的吸光值。
3.测序：送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。
实施例1带有β-脱卤酶基因的重组质粒的构建(参见图1)
(一)基因文库的构建和筛选
提取保藏号为CGMCC No.4196的芽孢杆菌(Bacillus sp.)3-CPA15的基因组，取10μl用0.001U-0.1U的Sau3A在37℃条件下酶切0.5小时，酶切片段进行琼脂糖凝胶电泳，选择酶切片段为1Kb-10Kb的酶浓度，在相同反应条件下制备基因组酶切片段，得到酶切产物a。将pUC19载体用BamHI在37℃酶切过夜，得到酶切产物b。将酶切产物a和b混合，加入T4连接酶，16℃过夜连接。得到连接体系c。将连接体系c转化E.coli XL-Blue超级感受态细胞，涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素，0.5mmol/L IPTG(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside)和40μlX-Gal(5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galactopyranoside，20％w/v in N，N’-dimethylformamide)的SOB平板上，培养16-20小时后，挑取阳性转化子(白色)，进行筛选。首先将阳性转化子重新接种在含有0.5mmol/LIPTG和10mmol/L3-氯丙酸的LB平板上，培养16-24小时后，将长出的菌落接种于含由1/2不含氯化钠的LB液体培养基和1/2基础盐液体培养基组成的复合培养基(含0.5mmol/L的IPTG和10mmol/L的3-氯丙酸)中，进行复筛。24小时后，取有菌体长出的培养液，离心取上清，利用显色法检测游离的氯离子的含量。挑选脱氯活性高的菌株，提取质粒进行测序。
(二)脱卤酶基因的亚克隆
用Vector NTI Advancell软件对测序结果进行开放阅读框(ORF)分析，对完整的阅读框序列设计一对引物，引物序列如下：
如SEQ No.2所示，上游引物为5’-cggaattcgtgtaccagctg-3’，其中划线部分为EcoRI酶切位点；
如SEQ No.3所示，下游引物为5’-ccaagctttcagtgattggagc-3’，其中划线部分为HindIII酶切位点。
以包含插入片段的pUC19质粒为模板，PCR扩增出目的片段，其电泳图如图2所示，其中，泳道1为包含酶切位点的长481bp的目的片段。将目的片段进行测序，确认目的片段的序列如SEQ No.1所示。
将该目的片段与pMD19T-SimpleVector(大连宝生物有限公司生产)连接。重组质粒转化E.coli XL-Blue感受态细胞，涂布于含有100μg/ml氨苄的SOB平板上(含有10mmol/L3-氯丙酸)，培养16-20小时后，挑取阳性转化子(白色)，该转化子质粒中插入的目的片段即为β-脱卤酶基因。提取转化子中的质粒，并用EcoRI和HindIII双酶切验证，琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，泳道1为双酶切体系电泳图，切胶回收大小为481bp的条带，得到切胶回收产物d。将pET30用EcoRI和HindIII双酶切过夜，切胶回收5.4Kb的片段，得到切胶回收产物e。将d和e以等摩尔比混合，加入T4连接酶，16℃过夜连接，得到连接体系f。将连接体系f转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-CondonPlus感受态细胞，涂布于含有50μg/ml卡纳霉素和34μg/ml氯霉素的SOB平板上，16-20小时后挑取单克隆培养得到重组细胞；将获得的重组细胞提取质粒进行测序，确认其具有如SEQ No.1所示序列。将连接了β-脱卤酶基因的质粒命名为pBHD。
实施例2构建重组E.coli BL21(DE3)-CondonPlus产β-脱卤酶。
(1)重组酶的诱导表达
将带有pBHD质粒的重组细胞接种于5ml LB液体培养基(含有50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素)中，37℃、220rpm培养过夜。按2∶100的比例将上述培养物接种于含100mlLB培养基(含有50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素)的500ml锥形瓶中，37℃、220rpm培养至OD600＝0.6-0.8，加入浓度为0.5mol/L的IPTG至IPTG终浓度0.5mmol/L。30℃条件下，于220rpm的摇床上诱导培养6h。
离心收集细胞，用预冷的上样缓冲液(20mmol/L磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，20mM咪唑，pH 7.5)洗涤2次。按10ml缓冲液/g湿细胞的比例将细胞重悬于上述缓冲液中，0℃下超声破胞。4℃下20000g离心20min，收集上清，即为粗酶液。蛋白表达经SDS-PAGE电泳分析，结果如图4所示，可溶性蛋白在80％以上。
(2)重组β-脱卤酶的亲和纯化
利用镍离子亲和层析柱HisTrapTMFF(GEHearthcare，1m)纯化重组酶。粗酶液经0.22μm滤膜(Millipore)过滤，用上样缓冲液平衡层析柱，流速1.0ml/min，将粗酶液上柱，用上样缓冲液冲洗约10个柱体积，基线走平后，用洗脱缓冲液(20mmol/L磷酸钠缓冲液，500mmol/LNaCl，250mmol/L咪唑，pH7.5)洗脱，得到酶液I。酶液I经SDS-PAGE电泳分析，结果如图5所示，纯度在95％以上。
(3)重组β-脱卤酶的脱盐纯化
将酶液I分成3等份，用脱盐柱(HisTrap Desalting，GE)进行脱盐处理。利用流动相为100mmol/L、pH4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液得到酶液A；利用100mmol/L、pH7的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液得到酶液B；用100mmol/L、pH10的碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液酶液C。
实施例3
取4ml实施例2中的酶液A，分成四份，每份1ml，分别加入3-氯丙酸溶液，使得3-氯丙酸相对于3-氯丙酸溶液和纯酶液总量的摩尔浓度为10mmol/L。将四份溶液分别放入温度为20℃、30℃、40℃和50℃的转速均为180rpm的恒温摇床中，24小时后用液相检测法检测底物3-氯丙酸和产物3-羟基丙酸的浓度，其在液相上的保留时间如图6所示，左侧峰为3-羟基丙酸(13.12min)，右侧为3-氯丙酸(20.73min)。计算底物3-氯丙酸的转化率，结果如表1，从表1中数据可知，在20～30℃条件下，转化率随温度升高而升高，在30℃时底物转化率为100％；在30℃～50℃，随着反应温度的升高，由于酶在高温下容易失活，底物转化率反而下降。
表1重组β-脱卤酶在不同温度下水解3-氯丙酸的反应转化率
实施例4
取5ml实施例2中的酶液C，平均分成5份，每份1ml，分别加入不同体积的3-氯丙酸溶液，使得3-氯丙酸相对于3-氯丙酸溶液和纯酶液总量的摩尔浓度分别为10mmol/L，20mmol/L，30mmol/L，40mmol/L，50mmol/L。在30℃、180rpm恒温摇床中反应，考察24h后底物的转化率，结果如表2，从表中数据可知，当底物浓度为10mol/L时，反应24h后底物转化率达到97％，随着底物浓度的增加，反应的转化率降低。
表2重组β-脱卤酶在不同底物浓度下24h的底物转化率
实施例5
取1ml实施例2的酶液B，加入3-氯丙酸溶液，使得3-氯丙酸相对于3-氯丙酸溶液和纯酶液总量的摩尔浓度为10mmol/L，30℃，180rpm，反应24h。每隔4小时取样，用液相检测法检测3-氯丙酸和3-羟基丙酸的浓度，如图7所示，从图中可知，随着反应时间的增加，底物的转化率不断增加，24h后，转化率在98％以上，最终得到3-羟基丙酸的浓度约为880mg/L。
Claims (7)
1.一种β-脱卤酶的基因，其特征是：具有如SEQ No.1所示序列。
2.一种芽孢杆菌，其特征是：其保藏号为CGMCC No.4196，含有具有如SEQNo.1所示序列的基因。
3.一种β-脱卤酶，其特征是：它由具有如SEQ No.1所示序列的基因所编码。
4.一种利用权利要求2的芽孢杆菌制备3-羟基丙酸的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)将所述芽孢杆菌的具有如SEQ No.1所示序列的基因通过质粒导入宿主细胞，得到重组细胞；
(2)将所述重组细胞加入到离子缓冲溶液中破胞，离心得到上清液，将所述上清液经镍离子亲和层析柱和脱盐柱纯化得到纯酶液；
(3)将3-氯丙酸溶液加入到所述纯酶液中进行反应得到3-羟基丙酸，所述3-氯丙酸相对于3-氯丙酸溶液和纯酶液总量的摩尔浓度为10～50mmol/L。
5.根据权利要求4所述的制备3-羟基丙酸的方法，其特征是：步骤(3)中所述反应的温度为20～50℃。
6.根据权利要求4所述的制备3-羟基丙酸的方法，其特征是：所述宿主细胞为大肠杆菌。
7.根据权利要求4所述的制备3-羟基丙酸的方法，其特征是：所述离子缓冲溶液的摩尔浓度为100mmol/L、pH为4～10。
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