CN102015770A - 免疫球蛋白组合物和生产其的方法 - Google Patents

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Abstract

在细菌培养物中生产免疫球蛋白的方法，该方法包含：(a)在第一种细菌宿主细胞中表达包含免疫球蛋白轻链的第一种多肽，从而形成包含免疫球蛋白轻链的包涵体；(b)在第二种细菌宿主细胞中表达包含免疫球蛋白重链的第二种多肽，从而形成包含免疫球蛋白重链的包涵体；(c)从包涵体回收第一种多肽和第二种多肽，从而得到重建的重链和重建的轻链；和(d)在允许重建的轻链和重建的重链主要重新折叠为完整免疫球蛋白的条件下，重新折叠重建的重链和重建的轻链。

Description

免疫球蛋白组合物和生产其的方法
发明领域和背景
本发明在其一些实施方案中涉及免疫球蛋白组合物和生产其的方法。
抗体近年来已经成为有前途的治疗蛋白，且是生物药的领先类别，年销售额超过200亿美元。连续的技术进步已经驱动单克隆抗体部分的增长，该部分直到最近仍然由诸如Remicade和Rituxan等嵌合抗体占优势，其在2008年中将继续驱动市场份额。但是，趋势在改变，人源化和全人单克隆抗体以及诸如Fab、scFv等重组抗体片段和缀合抗体，正在日益变成重要的单克隆抗体市场增长驱动器，预测化合物年增长率是20.9％。
尽管重组抗体片段正在稳定进展，抗体市场仍然由全长IgG抗体占优势。虽然通常在大肠杆菌表达系统中生产小抗体片段(Ward，1993；Kipriyanov和Little，1999)，已经传统地在哺乳动物细胞培养物中生产全长单克隆抗体，这是由于它们的起始杂交瘤来源和由于分子的复杂性(Simmons等人，2002)。对于全长IgG而言，存在几种备选的表达系统，例如在植物中(Ko和Koprowski，2005)或在转基因动物奶中(Houdebine，2002)，但是尚未获得普及(Kipriyanov和Le Gall，2004)。
20多年以前，Cabilly等人(Cabilly等人，1984，Proc Natl Acad Sci U S A 81，3273-7)报道了他们的生产IgG的尝试。他们得到了低质量的产物和低产率。其原因之一是，超过20年以来，认为在大肠杆菌中生产IgG是不实际的。
美国6,331,415公开了生产免疫球蛋白或至少含有免疫球蛋白重链和轻链的可变结构域的免疫功能的免疫球蛋白片段的方法。所述方法可以在单个细胞中或在分开的宿主细胞培养物中使用一种或更多种生成重链和轻链或其片段的载体。提供的结果(图8B和9)清楚地显示了与临床应用无关的异基因产物。
近年来，2个研究组已经报道了全长抗体在大肠杆菌中的装配(Simmons等人，2002；Mazor等人，2007b)。这2个研究组都使用指导可溶的重链和轻链向细菌周质中分泌的载体系统，它们在细菌周质中装配成可溶的有活性的IgG分子。第一项研究(Simmons等人，2002，和美国专利6,979,556，美国专利申请20070015244)生产抗体制品，其除了装配的IgG以外，还含有部分装配的物质，例如重链二聚体或只与轻链配对的这种二聚体。他们的结论是，他们描述的技术是在大肠杆菌中有效地生产全长无糖基化抗体的方法中的重要步骤，且产率高得足以提供用于研究目的的材料。他们进一步提出，这些蛋白作为治疗剂的应用，在不远的将来会具有进一步增加的滴度。第二项研究(Mazor等人，2007b)改善了表达条件，其中使用稍微不同的分泌质粒集合。他们得到了相当质量的IgG，其仍然含有部分装配的物质(Mazor等人2007b，补充图4)。Mazor等人，2007b报道的生产产率是约0.2-1mg/l(低密度摇瓶培养物)，而Simmons等人，2002报道了高达150mgIgG/升的产率(高密度发酵培养物)，在达到40OD550的细胞密度后诱导另外80小时。难以进行对比，但是他们的产率大概相当于每个摇瓶培养物几mg。
美国20080305516教导了在革兰氏阳性细菌或真核细胞中生产免疫球蛋白分子或至少包含免疫球蛋白重链和轻链的可变结构域的功能部分的免疫功能的免疫球蛋白片段的方法。所述方法包含，在2个分开的宿主细胞中生产重链和轻链，并在体外重新折叠免疫球蛋白分子或片段。该申请清楚地教导了不在革兰氏阴性细胞中表达抗体，这是因为在革兰氏阴性培养物中难以获得高分子量产物。另外，美国20080305516阐明，在大肠杆菌中生产大量目标蛋白的结果，经常是形成包涵体和后续的重新折叠，这会降低产率和质量。
Boss等人(1984 Nucleic Acids Research 12：3791-3806)教导了在单个大肠杆菌培养物或分开的大肠杆菌培养物中生产鼠IgM轻链和重链。在从包涵体重建和重新折叠后，仅检测到残余的抗体活性。表现出的产率较差，因为仅基于放射性的分析鉴别出了产物(参见其中的图3)。
发明内容
根据本发明的有些实施方案的一个方面，提供了在细菌培养物中生产免疫球蛋白的方法，该方法包含：
(a)在第一种细菌宿主细胞中表达包含免疫球蛋白轻链的第一种多肽，从而形成包含免疫球蛋白轻链的包涵体；
(b)在第二种细菌宿主细胞中表达包含免疫球蛋白重链的第二种多肽，从而形成包含免疫球蛋白重链的包涵体；
(c)从包涵体回收第一种多肽和第二种多肽，从而得到重建的重链和重建的轻链；和
(d)在允许重建的轻链和重建的重链主要重新折叠为完整免疫球蛋白的条件下，重新折叠重建的重链和重建的轻链。
根据本发明的有些实施方案，所述条件包含约1∶2的重链-轻链摩尔比。
根据本发明的有些实施方案，所述第一种细菌宿主和第二种细菌宿主各自是革兰氏阴性细菌。
根据本发明的有些实施方案，所述革兰氏阴性细菌是大肠杆菌。
根据本发明的有些实施方案，所述方法另外包含，在蛋白A/G/L上纯化免疫球蛋白分子。
根据本发明的有些实施方案，所述方法具有每1升重链细菌培养物至少50mg纯化的免疫球蛋白分子的产率，在诱导时具有2.5的O.D.600。
根据本发明的有些实施方案，第一种多肽和第二种多肽中的至少一种包含治疗部分。
根据本发明的有些实施方案，第一种多肽和第二种多肽中的至少一种包含可鉴别部分。
根据本发明的有些实施方案，主要重新折叠为完整免疫球蛋白包含至少80％的免疫球蛋白作为完整免疫球蛋白。
根据本发明的有些实施方案，所述重链属于γ家族。
根据本发明的有些实施方案，所述轻链属于κ家族。
根据本发明的有些实施方案，所述轻链属于λ家族。
根据本发明的有些实施方案的一个方面，提供了根据上述方法生产的免疫球蛋白。
根据本发明的有些实施方案的一个方面，提供了物质组合物，其包含革兰氏阴性制品残余物和至少90％免疫球蛋白。
根据本发明的有些实施方案，所述组合物包含不超过10％免疫球蛋白片段。
根据本发明的有些实施方案，所述免疫球蛋白选自：IgA，IgD，IgE和IgG。
根据本发明的有些实施方案，所述IgG包含IgG1，IgG2，IgG3或IgG4。
根据本发明的有些实施方案，所述免疫球蛋白选自：嵌合抗体，人源化抗体和全人抗体。
根据本发明的有些实施方案，所述免疫球蛋白是双特异性抗体。
根据本发明的有些实施方案，所述免疫球蛋白选自：灵长类动物免疫球蛋白，猪免疫球蛋白，鼠免疫球蛋白，牛免疫球蛋白，山羊免疫球蛋白和马免疫球蛋白。
除非另有定义，本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述那些相似或等同的方法和材料可以用于实践或测试本发明的实施方案，下文还是描述了示例性的方法和/或材料。在冲突的情况下，以本专利说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，无意成为必要的限制。
附图简述
本发明的有些实施方案在本文中仅作为实例参考附图予以描述。现在详细地具体参考附图，应强调的是，显示的细节仅作为实例和用于本发明实施方案的说明性讨论的目的。在这点上，说明书连同附图使得本领域技术人员显而易见如何实践本发明的实施方案。
在附图中：
图1是Inclonal表达载体的示意图。用于表达人γ1重链的质粒pHAK-IgH、用于表达人κ轻链的pHAK-IgL、用于表达与假单胞菌外毒素A的截短形式(PE38)融合的人γ1重链的pHAK-IgH-PE38、用于表达与PE38融合的人κ轻链的pHAK-IgL-PE38的图谱。
图2A-B是显示T427 Inclonal在大肠杆菌中的表达和纯化的蛋白凝胶照片。图2a-12％SDS/PAGE。泳道1，未诱导的大肠杆菌培养物。泳道2，诱导的重链。泳道3，诱导的轻链。泳道4，未纯化的重新折叠的IgG。泳道5，蛋白-A纯化的IgG。M，分子量标志物，以kDa为单位，泳道6，西妥昔单抗。泳道7，蛋白-A纯化的T427 Inclonal。在还原条件下分析泳道1-5，而泳道6-7则不是。通过GelCode Blue
Figure BPA00001251288700051
染色，使蛋白显影。图2B是使用HRP-缀合的抗人抗体和ECL显影的免疫印迹。泳道排列与在A中相同，只是泳道E＝西妥昔单抗
Figure BPA00001251288700052
。
图3中的图显示了通过凝胶过滤色谱法对T427 Inclonal和西妥昔单抗
Figure BPA00001251288700053
的分析。在TSK3000柱上分离IgG样品。箭头指示商品化的大小标志物在柱上的迁移图谱。
图4A-C中的图显示了T427 Inclonal的结合性质。图4A显示了通过ELISA测定法测得的与MBP-CD30的结合，而检测是使用HRP-缀合的抗人IgG。图4B显示了通过FACS分析测得的T427 Inclonal抗体的结合。左图-用10nM在哺乳动物细胞中生产的chT427-IgG或用T427 Inclonal温育稳定的A431/CD30转染的细胞(左图，1)。右图-在有×30摩尔过量的T427(dsFv)-PE38免疫毒素作为竞争剂存在下，T427 Inclonal结合的FACS分析。使用FITC-缀合的抗人抗体，检测结合。图4C中的图显示了T427-ZZ-PE38的特异性细胞毒性。用指定浓度的IgG-ZZ-PE38免疫缀合物或只用T427 IgG，温育A431/CD30细胞48h。使用酶MTT测定法，测定活细胞的相对数。每个点代表在三个独立实验中一式三份测定的一组数据的平均值。误差棒代表数据的标准差。
图5A-C示意地解释了IgG-毒素融合蛋白和它们通过SDS-PAGE的分离。图5A是在该研究中生产的inclonal的示意图。图5B是在非还原条件下蛋白-A-纯化的T427 Inclonal的免疫印迹。泳道1，IgG；泳道2，IgG-(二)-PE38；泳道3，IgG-(四)-PE38；图5C是在还原条件下蛋白-A-纯化的T427 Inclonal-PE38融合蛋白的免疫印迹。泳道1，IgG-(二)-PE38；泳道2，IgG-(四)-PE38.M，分子量标志物，以kDa为单位。
图6A-B是表征T427 Inclonal-毒素融合蛋白的图。图6A显示了在ELISA中与MBP-CD30结合的评价。检测是使用与HRP-缀合的山羊抗小鼠IgG混合的小鼠抗PE血清。图6B显示了inclonal-毒素融合体的特异性细胞毒性：用指定浓度的重组IgG-PE38融合蛋白或T427(dsFv)-PE38作为参照，温育A431/CD30细胞48h。使用酶MTT测定法，测定活细胞的相对数。每个点代表在三个独立实验中一式三份测定的一组数据的平均值。误差棒代表数据的标准差。
图7A-B是显示抗EGFR 225 Inclonal的结合性质的图。图7A-通过全细胞ELISA测试的与在A431细胞上表达的EGFR的结合。检测是使用HRP-缀合的抗人IgG。图7B-FACS分析：(b1)用10nM 225Inclonal或商品化的用作对照的抗EGFR抗体西妥昔单抗
Figure BPA00001251288700061
温育A431细胞。(b2)象在b1中一样，在不表达EGFR的G43黑素瘤细胞上的FACS分析。(b3)在有×30摩尔过量的225(scFv)-PE38免疫毒素作为竞争剂存在下，225 Inclonal结合A431细胞的FACS分析。使用FITC-缀合的抗人抗体，检测结合。
图8A-C是显示225 Inclonal-ZZ-PE38的分析的图。图8A-下述细胞系的EGFR表达水平的FACS分析：A431(粗体亮色灰色)，HEK293(粗体黑色灰色)和对照G43(细体亮色灰色)。通过用与FITC-缀合的抗人抗体混合的西妥昔单抗
Figure BPA00001251288700062
染色，检测EGFR水平。图8B-225 Inclonal-ZZ-PE38对A431细胞(表达高水平的EGFR)的细胞杀伤测定。图8C-225 Inclonal-ZZ-PE38对HEK293细胞(表达低水平的EGFR)的细胞杀伤测定，其中用指定浓度的IgG-ZZ-PE38免疫缀合物或只用IgG温育细胞48h。使用酶MTT测定法，测定活细胞的相对数。每个点代表在三个独立实验中一式三份测定的一组数据的平均值。误差棒代表数据的标准差。
图9A-B中的图显示了哺乳动物细胞生产的T427和T427 Inclonal在100％牛血清中温育后的稳定性分析。在100％牛血清中将IgG稀释至30μg/ml的终浓度，并在37℃温育指示的时间段。如图4A所述，通过ELISA评价每个反应中与MBP-CD30的残余结合活性。
本发明实施方案的描述
本发明在其有些实施方案中涉及免疫球蛋白组合物和生产其的方法。
在详细说明本发明的至少一个实施方案之前，应当理解，本发明的应用不一定限于下列描述中阐述或通过实施例例示的细节。本发明可以是其它实施方案或以各种方式实践或执行。
重组抗体已经成为诊断和治疗中的中枢模态，大量单克隆抗体处于临床试验的不同阶段。因此非常希望使重组抗体生产产率最大化，因为它会导致节省成本的生产。
同时使本发明回归实践，发明人已经发现了当作为包涵体从原核细胞系统表达时使免疫球蛋白的生产产率和装配最大化的条件。根据本发明的教导生产的重组抗体制品是非常均质的，因此制品中的主要物质是完整的免疫球蛋白，而存在的抗体片段仅是残余量。本文所述的方法在性质上是简单的，节省成本的，可以容易地放大，且特征在于转化、蛋白纯化和重新折叠之间相对较短的时间，使它可有效地用于在细菌中工业化生产抗体。
因而，根据本发明的一个方面，提供了在细菌培养物中生产免疫球蛋白的方法，该方法包含：
(a)在第一种细菌宿主细胞中表达包含免疫球蛋白轻链的第一种多肽，从而形成包含免疫球蛋白轻链的包涵体；
(b)在第二种细菌宿主细胞中表达包含免疫球蛋白重链的第二种多肽，从而形成包含免疫球蛋白重链的包涵体；
(c)从包涵体回收第一种多肽和第二种多肽，从而得到重建的重链和重建的轻链；和
(d)在允许重建的轻链和重建的重链主要(即超过50％、60％、70％、80％、90％或更多的抗体物质)重新折叠为免疫球蛋白的条件下，重新折叠重建的重链和重建的轻链。
本文使用的“抗体物质”是指免疫球蛋白和其片段(例如，Fab，重链单体，轻链单体，杂合体(heteromer)重链-轻链)。
本文互换使用的术语“完整的免疫球蛋白”或“完整的抗体”是指通过本领域熟知的方法生产的完整抗体，所述方法通常需要免疫接种(参见例如，Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1988，其通过参考引用并入本文)。所述抗体通常是单克隆抗体。
全部或完整抗体包含通过二硫键相互连接的至少2个重(H)链和2个轻(L)链。每个重链由一个重链可变区(在本文中缩写为VH)和一个重链恒定区组成。所述重链恒定区由3个结构域组成：CH1，CH2和CH3。每个轻链由一个轻链可变区(在本文中缩写为VL)和一个轻链恒定区组成。所述轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分成超变区，称作互补性决定区(CDRs)，其间间隔有更保守的区域，称作框架区(FR)。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，它们从氨基端向羧基端以下述次序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一种组分(C1q)。根据重链中恒定结构域的类型，将抗体归入5个大类中的一个：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，本发明的实施方案预见到它们中的任一个或下述的抗体亚型和类型。它们中的几个进一步分成子类或同种型，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，IgA2，IgAsec等。轻链可以属于″κ″或″λ″类别。与不同类别的免疫球蛋白对应的重链恒定结构域分别称作″α″、″δ″、″ε″、″γ″和″μ″。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。经常用于生理/临床情形中的IgG和/或IgM是用于本发明的抗体的示例性类别。
本发明的有些实施方案的抗体可以来自任意的哺乳动物来源，包括人、猪、鼠、牛、山羊、马、犬、猫、羊等。所述抗体可以是异源抗体。与转基因宿主(例如表达所述抗体的植物)有关地定义本文使用的″异源抗体″。
根据本发明的有些实施方案，所述抗体是分离的完整抗体(即，基本上不含有细胞物质、具有不同抗原特异性的其它抗体和/或其它化学试剂)。
本文使用的″重组抗体″是指通过重组方式制备、表达、建立或分离的完整抗体，例如(a)从免疫球蛋白基因(例如，人免疫球蛋白基因)的转基因动物(例如，小鼠)或源自它的杂交瘤分离的抗体；(b)从转化成表达抗体的宿主细胞分离的抗体；(c)从重组抗体文库分离的抗体；和(d)通过任意其它方式制备、表达、建立或分离的抗体，所述方式包括将免疫球蛋白基因序列与其它DNA序列剪接。在某些实施方案中，本发明的免疫球蛋白可以具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。在其它实施方案中，可以对这样的重组人抗体进行体外诱变，从而重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列包含尽管源自人种系VH和VL序列且与之有关、但是可能在人抗体体内种系库中天然地不存在的序列。
免疫球蛋白的下面的示例性实施方案包含在本发明的范围内。
本文使用的″人抗体″是指具有可变区的完整抗体，在所述可变区中，框架区和CDR区都源自人种系免疫球蛋白序列，后者如例如Kabat等人(参见Kabat 1991，Sequences of proteins of immunological Interest，5th Ed.NIH Publication No.91-3242)所述。人抗体的恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基残基(例如，通过随机的或定向的体外诱变或体内体细胞突变引入的突变)。但是，本文使用的术语″人抗体″无意包括这样的抗体，其中源自另一个哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列已经嫁接到人框架序列上。
本文使用的″嵌合的免疫球蛋白″是指其中可变区源自第一个物种且恒定区源自第二个物种的完整免疫球蛋白或抗体。通过基因工程，从属于不同物种的免疫球蛋白基因节段，可以构建嵌合的免疫球蛋白。
本文使用的″人源化免疫球蛋白″是指其中来自非人(例如，鼠)抗体的最小量小鼠部分移植到人抗体上的完整抗体；一般而言，人源化抗体是5-10％小鼠和90-95％人。
一般而言，人源化抗体基本上包含至少1个、一般2个可变结构域的全部，其中所有或基本上所有CDR区对应非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最佳地还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，一般是人免疫球蛋白的那种[Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)]。
对非人抗体进行人源化的方法是本领域众所周知的。一般地，人源化抗体含有由非人来源引入其中的一个或更多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为引入残基，其一般取自引入的可变结构域。人源化可以基本上根据Winter等人[Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988)]的方法进行，通过用啮齿动物的CDRs或CDR序列取代人抗体的相应序列。相应地，此类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中显著小于完整的人可变结构域已由来自非人种类的相应序列取代。在实践中，人源化抗体一般是其中某些CDR残基和可能的某些FR残基由来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代的人抗体。
人抗体还可以使用本领域已知的各种技术包括噬菌体展示文库[Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581(1991)]来生产。Cole等人和Boerner等人的技术同样可用于制备人单克隆抗体(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)和Boerner等人，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991)。类似地，人抗体还可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物例如内源性免疫球蛋白基因已部分或完全灭活的小鼠中来制备。攻击后，观察到人抗体生产，其在包括基因重排、装配和抗体文库的所有方面非常类似人抗体。这种方法描述在例如美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，以及下列科学出版物：Marks等人，Bio/Technology 10，：779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368 812-13(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology 14，845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；和Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13，65-93(1995)中。
本文使用的“双特异性的”或“双功能的”抗体是指具有2个不同重链/轻链对和2个不同结合部位的人工杂种抗体。通过多种方法，包括杂交瘤融合，可以生产双特异性的抗体。参见例如，Songsivilai和Lachmann(1990)Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人(1992)J.Immunol.148：1547-1553。
从通过本领域已知的多种技术中的任一种生产的抗体，可以得到用于本发明的VH和VL序列。
生产多克隆和单克隆抗体的方法是本领域熟知的(参见例如，Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1988，通过参考引用并入本文)。
通常，通过用包含希望的抗原或免疫原的免疫原免疫接种非人动物优选小鼠，提供抗体。或者，通过选择免疫球蛋白的组合文库，如例如Ward等人(Nature 341(1989)544)公开的，可以提供抗体。因而，根据本发明的教导，预见到任意抗体生产方法，只要免疫球蛋白抗体最终在细菌宿主中表达。
用抗原免疫非人哺乳动物的步骤可以任何本领域公知的方式进行，以刺激在小鼠中产生抗体(参见，例如，E.Harlow和D.Lane，Antibodies：A Laboratory Manual.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1988))。在一个优选的实施方案中，所述非人动物是哺乳动物，例如啮齿动物(例如，小鼠，大鼠，等)，牛，猪，马，兔子，山羊，绵羊，等。如提及的，可以遗传地修饰或改造非人哺乳动物，以生产″人″抗体，例如Xeno小鼠TM(Abgenix)或HuMAb-小鼠TM(Medarex)。通常，将免疫原在缓冲液中悬浮或溶解，可选择地使用佐剂，例如完全弗氏佐剂。用于测定免疫原数量、缓冲液类型和佐剂的量的方法，是本领域技术人员所公知的，并且不以任何方式限制本发明。对于不同的免疫原，这些参数可以不同，但容易被说明。
类似地，足以刺激产生抗体的免疫接种的位置和频率也是本领域公知的。在一种典型的免疫接种方法中，在第一天向非人动物腹膜内注射抗原，并且在大约一周后再次注射。随后在大约第20天，再次注射抗原，可选择地使用佐剂，例如不完全弗氏佐剂。该再次注射于静脉进行，并且可以重复连续若干天。然后在第40天进行静脉内或腹膜内加强注射，典型地不用佐剂。这一方法导致在大约40天后产生抗原-特异性的抗体生成B细胞。也可以利用其它方法，只要它们导致产生这样的B细胞，其表达针对免疫接种所使用的抗原的抗体。
在一个替代实施方案中，分离来自未免疫的非人哺乳动物的淋巴细胞，在体外培养，然后在细胞培养物中暴露于免疫原。然后收集该淋巴细胞，并进行下述融合步骤。
对于单克隆抗体，接下来的步骤是，从免疫的非人哺乳动物分离脾细胞，随后使这些脾细胞与永生细胞融合，以便形成抗体生成杂交瘤。从非人哺乳动物分离脾细胞是本领域公知的，并且典型地包括，从被麻醉的非人哺乳动物取出脾，将其切成小片，并从脾被膜中挤出脾细胞，并通过细胞过滤器的尼龙网筛到适宜的缓冲液中，以便产生单细胞悬浮液。冲洗细胞，离心，并重悬浮于溶解了任何血红细胞的缓冲液中。再次将溶液离心，并且最终将保留在沉淀中的淋巴细胞重悬浮于新鲜的缓冲液中。
淋巴细胞一旦被分离并且存在于单细胞悬浮液中，它们将融合成永生细胞系。尽管本领域已知许多其它用于产生杂交瘤的永生细胞系，其典型地是小鼠骨髓瘤细胞系。优选的鼠骨髓瘤细胞系包括但不限于：衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系，其获得自Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.U.S.A.，X63 Ag8653和SP-2细胞，其获得自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Rockville，Md.U.S.A。使用聚乙二醇等，实现该融合。然后，生成的杂交瘤在选择培养基中生长，该培养基含有一种或更多种抑制使未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基典型地包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，该物质阻止HGPRT-缺陷型细胞的生长。
杂交瘤典型地生长于巨噬细胞饲养层上。该巨噬细胞优选来自用于分离脾细胞的非人哺乳动同窝出生仔畜，并且典型地在将杂交瘤铺板的几天前用不完全弗氏佐剂等预处理。融合方法描述于(Goding，“Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，”第59-103页(Academic Press，1986))。
使细胞在选择培养基中生长充足的时间，以形成菌落并生成抗体。这通常是7～14天。然后检测杂交瘤菌落中结合免疫原/抗原的抗体生成。这一检测典型地是比色ELISA-型检测，尽管可以使用任何适合于杂交瘤所生长的小孔的检测法。其它检测法包括免疫沉淀和放射性免疫测定。检测产生目的抗体的阳性小孔，以确定是否存在一种或更多种不同的菌落。如果存在一种以上的菌落，可以重克隆并培养细胞，以保证只有单一细胞产生该生成目的抗体的菌落。典型地重克隆和重检测具有单一显性菌落的阳性小孔，以保证只有一种单克隆抗体被检测和生产。
然后在适当培养基例如DMEM或RPMI-1640中，以更大的量培养经证实生产单克隆抗体的杂交瘤。或者，可以作为动物中的腹水瘤，体内培养杂交瘤细胞。
培养足以生产希望的单克隆抗体后，将含有单克隆抗体的生长培养基(或腹水液)与细胞分离，纯化其中存在的单克隆抗体。通常通过凝胶电泳、透析、使用蛋白A或蛋白G-琼脂糖或连接到诸如琼脂糖或琼脂糖珠子等固体支持体上的抗-小鼠Ig的色谱法，实现纯化(都描述在，例如，Antibody Purification Handbook，Amersham Biosciences，publication No.18-1037-46，Edition AC，它的公开内容通过参考引用并入本文)。通常使用低pH缓冲液(pH 3.0或以下的甘氨酸或醋酸盐缓冲液)，从蛋白A、蛋白G或蛋白L柱洗脱结合的抗体，立即中和含有抗体的级分。合并这些级分，透析，并根据需要进行浓缩。
使用常规方法(例如，使用寡核苷酸探针，其能与编码例如鼠或人抗体的重链和轻链的基因特异性结合)，可以容易地将编码抗体的CDR的DNA分离并测序。一旦被分离，可以将DNA连接进表达载体中，然后将其转染进细菌宿主细胞。
将编码免疫球蛋白轻链和重链多肽的DNA序列独立地插入分开的重组载体中，后者可以是任意载体，可以方便地进行重组DNA操作，载体的选择经常依赖于要将其导入的宿主细胞。
根据一个具体实施方案，重链和轻链编码序列中的至少一个另外包括治疗或可鉴别部分的框架内序列，从而产生免疫毒素(例如，用于治疗用途，例如杀伤癌细胞)和免疫标记(例如，用于诊断用途)。因而，根据本发明的一个实施方案，重链包含该部分的框架内融合，轻链包含该部分的框架内融合，或重链和轻链都包含该部分的框架内融合(参见图5a)。
可鉴别部分可以是结合对的一个成员，其可以通过它与结合对的另一个成员的相互作用和直接可见的标记予以鉴别。在一个实施例中，结合对的该成员是可通过对应的标记的抗体鉴别的抗原。在一个实施例中，所述标记是荧光蛋白或产生比色反应的酶。
下面的表1提供了可鉴别的部分的序列的实例。
表1
Figure BPA00001251288700141
治疗部分可以是，例如，细胞毒素部分、毒素部分、细胞因子部分和双特异性抗体部分，下文提供了它们的实例。
下面的表2提供了治疗部分的序列的实例。
表2
应当理解，使用化学缀合(即，不通过重组DNA技术)，也可以实现这样的融合。
载体组分通常包括、但不限于下述的一种或更多种：启动子，复制起点，一种或更多种选择标记，和转录终止子序列。因而，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，它的复制独立于染色体复制，例如质粒。或者，载体可以是这样的载体，其当导入宿主细胞中时，整合进宿主细胞基因组中，并与它已经整合进的染色体一起复制。
载体优选是这样的表达载体，其中编码免疫球蛋白多肽的DNA序列可操作地连接至DNA转录所需的其它节段上。一般而言，表达载体源自质粒或病毒DNA，或可以含有二者的元件。术语“可操作地连接”表示，使它们的功能与它们的预期目的一致地安排节段，例如在启动子处开始转录，并沿着编码多肽的DNA序列进行。
选择能生产作为包涵体(即，可染色物质的核或胞质聚集体)的重组蛋白(即，重链和轻链)的细菌宿主。
使用的宿主细胞(例如，第一种宿主细胞和第二种宿主细胞)可以属于同一物种或不同物种。
根据本发明的具体实施方案，从革兰氏阴性细菌选择宿主细胞。
本文使用的″革兰氏阴性细菌″是指在显微镜下具有特征染色性质的细菌，它们在革兰氏染色方法中不染色或被醇脱色。革兰氏阴性细菌通常具有下述特征：(i)它们的细胞壁仅包含几层肽聚糖(该肽聚糖在革兰氏阳性细菌中以高得多的水平存在)；(ii)所述细胞在肽聚糖层外面被含有脂多糖(其由脂质A、核心多糖和O-多糖组成)的外膜包围；(iii)孔蛋白存在于外膜中，其作用类似于特定分子的孔；(iv)在肽聚糖层和次级细胞膜之间存在空隙，称作壁膜间隙；(v)S-层直接结合外膜，而不是肽聚糖；(vi)脂蛋白结合多糖主链，而在革兰氏阳性细菌中，不存在脂蛋白。
根据本发明的教导可以使用的革兰氏阴性细菌的实例包括、但不限于，大肠杆菌(Escherichia coli)，假单胞菌属(Pseudomonas)，欧文菌属(erwinia)和沙雷氏菌属(Serratia)。应当指出，除了大肠杆菌以外的诸如假单胞菌属这些革兰氏阴性细菌作为宿主细胞的应用，会提供巨大的经济价值，这是由于假单胞菌属的代谢和生理性质。在某些条件下，假单胞菌属例如可以生长至比大肠杆菌更高的细胞培养物密度，从而提供潜在更大的产物产率。
用于分别连接编码多肽的DNA序列、启动子(例如，组成型或诱导型)和任选的终止子序列并将它们插入含有复制所需信息的合适载体中的操作，是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。
根据本发明的教导适用的细菌表达载体的实例包括、但不限于，pETTM系统、T7系统和pBADTM系统，它们是本领域熟知的。
将表达载体导入细菌宿主细胞中的方法是本领域熟知的，且主要依赖于使用的宿主系统。
宿主细胞可以在相同的培养基中共培养，或分开培养。
在允许表达大量重组重链和轻链的有效条件下，培养宿主细胞。有效的培养条件包括、但不限于，允许重组蛋白生产的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。有效培养基是指在其中培养细菌以生产本发明的重组蛋白的任意培养基。这样的培养基通常包括具有可同化的碳、氮和磷源和适当盐、矿物质、金属和其它营养物(例如维生素)的水溶液。根据希望的量，可以在常规的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定盘和培养皿中培养本发明的细菌宿主。可以在适合重组宿主的温度、pH和氧含量，进行培养。这样的培养条件是在本领域普通技术人员的知识范围内。
一旦得到免疫球蛋白重链和轻链的适当表达水平，从包涵体回收多肽。从细菌包涵体回收重组蛋白的方法是本领域熟知的，通常包含细胞裂解，然后在变性剂中溶解[例如，De Bernardez-Clark和Georgiou，″Inclusion bodies and recovery of proteins from the aggregated state″Protein Refolding Chapter 1：1-20(1991)。也参见下面的实施例部分″Inclonal在大肠杆菌中的表达″]。
简而言之，通过简单的离心，可以从大批胞质蛋白分离包涵体，产生有效的纯化策略。然后可以用强变性剂如尿素(例如，8M)或盐酸胍和有时使用的极端pH或温度，将它们溶解。对于每种蛋白，应当将变性剂浓度、暴露时间和温度标准化。在彻底溶解之前，可以用变性剂和去污剂的稀释溶液洗涤包涵体，以去除一些污染蛋白。
最后，通过色谱技术，在变性条件下，可以对溶解的包涵体直接进行进一步纯化，或在纯化之前，可以将重链和轻链重新折叠成天然构象。
因而，在重新折叠之前和备选地或在重新折叠之后附加地，可以进一步纯化重建的/重新折叠的重链和轻链多肽(即，溶解的还原的多肽)。
抗体纯化的方法是本领域熟知的，且描述在上文和下面的实施例部分中。纯化IgG的其它方法描述在“Purification of IgG and insulin on supports grafted by sialic acid developing“thiophilic-like”interactions”Hamid Lakhiaria and Daniel Mullerb，Journal of Chromatography B 818卷，第1版，2005年4月15日，第53-59页。
替代地或附加地，通过可鉴别或治疗部分，可以进行基于亲和力的纯化(例如，使用结合PE38的抗体柱)。
为了提高重新折叠产率，以选择的使免疫球蛋白(即，完整的)的形成最大化的比例提供重建的重链和重建的轻链。为此目的，重链与轻链的摩尔比是约1∶1-1∶3，1∶1.5-1∶3，1∶2-1∶3。在一个示例性的实施方案中，重链与轻链的摩尔比是约1∶2。
因而，上述方法的实施方案生成免疫球蛋白。这样的免疫球蛋白也称作inclonal。这些inclonal提供在SEQ ID NO.1-12中。
上述方法可以空前的产率从原核细胞有效地得到正确折叠的、高度纯化的免疫球蛋白。可以在功能上和结构上检查正确折叠。测试活性的方法详细描述在下面的实施例部分(例如，抗原识别，细胞杀伤)。
本发明的教导提供了每1升重链细菌培养物至少50mg纯化的免疫球蛋白分子的免疫球蛋白产率，在诱导时具有2.5的O.D.600。
因而，本发明的实施方案提供了物质组合物，其包含革兰氏阴性制品残余物(如前文所述，例如包含脂多糖)和至少约70％、80％、85％、90％、95％或更多的免疫球蛋白。
本发明的组合物优选地不包括超过20％、15％、10％、5％或甚至更少的抗体片段(例如，Fab，重链单体，轻链单体，杂合体重链-轻链，治疗部分和可鉴别部分)。
使用本领域熟知的方法，可以为临床应用(体内)进一步去除革兰氏阴性残余物。
在需要时，可以对免疫球蛋白进行定位体外糖基化，这可以根据Isabelle Meynial-salles和Didier Combes所述的方法来实现。In vitro glycosylation of proteins：An enzymatic approach.Journal of Biotechnology 46卷，第1版，1996年4月18日，1-14页。
免疫球蛋白和包含它们的组合物(例如，药物组合物)可以用于诊断和治疗用途，这样可以包含在治疗或诊断试剂盒中。
因而，本发明的组合物必要时可以存在于包装或分配装置中，例如FDA批准的试剂盒，其可以包含一个或更多个含有活性成分(即，免疫球蛋白)的单位剂型。包装可以例如包括金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可以伴随施用说明书。包装或分配器还可以提供附于容器的由管理药物制造、使用或销售的政府机构规定形式的说明，所述说明反映机构批准的用于人或兽医施用的组合物形式。此类说明可以是例如由美国食品与药品管理局批准用于处方药的标签，或批准的产品插页。如上文进一步详述的，还可以制备包括在相容性药学载体中配制的本发明制剂的组合物，其置于合适容器中，并标记所示状况的治疗。
本文使用的术语“约”是指±10％。
术语“包含”、“包括”、“具有”和它们的后缀是指“包括但不限于”。该术语包括术语“由……组成”和“主要由……组成”。
短语“主要由……组成”是指，该组合物或方法可以包括额外的成分和/或步骤，但是仅适用于所述额外成分和/或步骤不实质上改变要求保护的组合物或方法的基本和新颖的特征。
本文使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式，除非上下文另有清楚说明。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括复数种化合物，包括它们的混合物。
在本申请中，本发明的不同实施方案可以以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应当理解为对本发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应当视作已经具体公开所有可能的子范围以及在该范围内的单个数值。例如，诸如从1至6的范围的描述，应当视作已经具体公开诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等子范围以及诸如1、2、3、4、5和6等在该范围内的单个数值。无论范围的宽度，这同样适用。
每当在本文中指示数值范围时，意在包括在指示范围内的任意引用的数值(分数或整数)。短语“范围是(第一个指示数字)至(第二个指示数字)/范围在(第一个指示数字)和(第二个指示数字)之间”和“范围是(第一个指示数字)至(第二个指示数字)/范围从(第一个指示数字)至(第二个指示数字)”在本文中互换使用，意在包括第一个和第二个指示数字和其间的所有分数和整数数值。
本文使用的术语“方法”是指完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括、但不限于，化学、药理学、生物学、生化和医学领域的从业人员已知的那些方式、手段、技术和程序或可以从已知的方式、手段、技术和程序容易地开发出的那些。
本文使用的术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转状况的进展，基本上改善状况的临床或美学症状，或基本上预防状况的临床或美学症状的出现。
词语“示例性的”在本文中用于指“用作一个实例、例子或例证”。描述为“示例性的”任意实施方案不一定理解为优选的或优于其它实施方案和/或排除来自其它实施方案的特征的掺入。
词语“任选地”在本文中用于指“在有些实施方案中提供，且在其它实施方案中不提供”。本发明的任意特定实施方案可以包括复数个“任选的”特征，除非这些特征冲突。
应当理解，为了清晰在分开的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征同样可以在单个实施方案中组合提供。相反，为了简洁在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可以分开地或以任何合适的亚组合形式提供，或在适合本发明的任意其它所述实施方案时提供。在不同实施方案的上下文中描述的某些特征不应当视作那些实施方案的必要特征，除非该实施方案在没有那些元素时不可实现。
上文描述的和在下面的权利要求书部分中要求保护的本发明的不同实施方案和方面，可以得到下述实施例的实验支持。
实施例
现在参考下述实施例，它们与上面的描述一起，以非限制性方式解释本发明。
通常，本文使用的命名法和在本发明中使用的实验室操作包括分子技术、生化技术、微生物技术和重组DNA技术。这些技术在文献中充分解释。参见，例如，″Molecular Cloning：A laboratory Manual″Sambrook等人，(1989)；″Current Protocols in Molecular Biology″I-III卷Ausubel，R.M.，编(1994)；Ausubel等人，″Current Protocols in Molecular Biology″，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，″A Practical Guide to Molecular Cloning″，John Wiley & Sons，New York(1988)；Watson等人，″Recombinant DNA″，Scientific American Books，New York；Birren等人(eds)″Genome Analysis：A Laboratory Manual Series″，1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；方法参见美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057；″Cell Biology：A Laboratory Handbook″，I-III卷Cellis，J.E.，编(1994)；″Current Protocols in Immunology″I-III卷Coligan J.E.，编(1994)；Stites等人(eds)，″Basic and Clinical Immunology″(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(编)，″Selected Methods in Cellular Immunology″，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；可利用的免疫测定法广泛地描述在专利和科学文献中，参见例如，美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；″Oligonucleotide Synthesis″Gait，M.J.，编(1984)；“Nucleic Acid Hybridization″Hames，B.D.，和Higgins S.J.，编(1985)；″Transcription and Translation″Hames，B.D.，和Higgins S.J.，编(1984)；″Animal Cell Culture″Freshney，R.I.，编(1986)；″Immobilized Cells and Enzymes″IRL Press，(1986)；″A Practical Guide to Molecular Cloning″Perbal，B.，(1984)和″Methods in Enzymology″1-317卷，Academic Press；″PCR Protocols：A Guide To Methods And Applications″，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等人，″Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual ″CSHL Press(1996)；它们都通过参考引用并入，如同在本文中充分阐述。在本文件中提供了其它一般参考文献。其中的操作被视作本领域熟知的，且为了方便读者予以提供。其中包含的所有信息通过参考引用并入本文。
一般材料和方法
作为可溶抗原的MBP-CD30的制备——在大肠杆菌中表达重组CD30(GENEBANK登录号AAA51947)，其作为结合麦芽糖的蛋白融合体。使用质粒pHR30HNB[Rozemuller，H.，Chowdhury，P.S.，Pastan，I.& Kreitman，R.J.Isolation of new anti-CD30 scFvs from DNA-immunized mice by phage display and biologic activity of recombinant immunotoxins produced by fusion with truncated pseudomonas exotoxin.Int J Cancer 92，861-870(2001)]作为模板，使用引物CD30(N)-BspHI-FOR和CD30(N)-NotI-REV(所有PCR引物都描述在下面的表3中)，通过PCR，回收与人CD30的胞外结构域(全长基因产物的残基51-383)相对应的DNA片段。
表3
Figure BPA00001251288700221
用BspHI和NotI消化PCR产物，并克隆进pMALc-NHNN载体(pMALc-NHNN是用于表达MBP融合蛋白的质粒，其通过在MBP编码序列的5’末端添加HIS-标签，从pMALc-NN改进而来[最初描述在Bach，H.等人Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies.J Mol Biol 312，79-93(2001)])。基本上如关于其它MBP融合蛋白所述[Bach，H.等人Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies.J Mol Biol 312，79-93(2001)]，生产和纯化蛋白。
重组225(scFv)-PE38免疫毒素的制备——使用质粒pCMV/myc/ER-225(scFv)[Shaki-Loewenstein，S.，Zfania，R.，Hyland，S.，Wels，W.S.& Benhar，I.A universal strategy for stable intracellular antibo dies.J Immunol Methods 303，19-39(2005)]作为模板，使用引物225-NdeI-FOR和225-NotI-REV，通过PCR，回收抗EGFR mAb 225的可变结构域。用NdeI和NotI消化PCR产物，并克隆进用相同酶线性化的pRB98-Amp表达载体的衍生物[Nagata，S.等人Novel anti-CD30 recombinant immunotoxins containing disulfide-stabilized Fvfragments.Clin.Cancer Res.8，2345-2355(2002)]。(在该衍生物中，用作克隆scFv的3’末端位点的HindIII位点被替换为NotI位点，以使它适用于从普通的噬菌体展示载体亚克隆)。得到的质粒称作pRB98-Amp-225(scFv)-PE38，用于在BL21(DE3)pUBS500细胞中表达scFv-PE38单链免疫毒素[Brinkmann，U.，Mattes，R.E.& Buckel，P.High-level expression of recombinant genes in Escherichia coli is dependent on the availability of the dnaY gene product.Gene 85，109-114(1989)]。如[Benhar，I.& Pastan，I.Cloning，expression and characterization of the Fv fragments of the anti-carbohydrate mAbs B1 and B5 as single-chain immunotoxins.Protein Eng 7，1509-1515(1994)；Buchner，J.，Pastan，I.& Brinkmann，U.A method for increasing the yield of properly folded recombinant fusion proteins：single-chain immunotoxins from renaturation of bacterial inclusion bodies.Anal Biochem 205，263-270(1992)]所述，进行重组单链免疫毒素的表达、重新折叠和纯化。如(Nagata，S.，Onda，M.，Numata，Y.，Santora，K.，Beers，R.，Kreitman，R.J.and Pastan，I.(2002)Novel anti-CD30 recombinant immunotoxins containing disulfide-stabilized Fv fragments.Clin.Cancer Res.8，2345-55)所述，进行重组免疫毒素T427(dsFv)-PE38的表达、重新折叠和纯化。
用于在哺乳动物细胞中表达嵌合的IgG 1的载体的构建
重链载体：使用质粒pRB98Amp-T427VH(C44)-PE38(dsFv-免疫毒素的VH-cys-PE38组分的表达载体)作为模板，通过PCR，回收抗CD30抗体T427的VH可变结构域[Nagata，S.等人Rapid grouping of monoclonal antibodies based on their topographical epitopes by a label-free competitive immunoassay.J Immunol Methods 292，141-155(2004)]。使用恢复G44(其在dsFv构型中突变成cys)的引物T427VH-BssHII-FOR和T427VH-C44G-REV，扩增T427VH的5’末端一半。使用引物T427VH-C44G-FOR和T427VH-NheI-REV，扩增T427VH的3’末端一半。组合得到的PCR产物，并使用引物T427VH-BssHII-FOR和T427VH-NheI-REV，装配成完整的VH结构域。用BssHII和NheI消化VH PCR产物，并克隆进使用相同酶线性化的pMAZ-IgH载体[Mazor，Y.，Barnea，I.，Keydar，I.& Benhar，I.Antibody internalization studied using a novel IgG binding toxin fusion.J Immunol Methods 321，41-59(2007)]。得到的质粒pMAZ-IgH-T427用于在哺乳动物细胞中以嵌合IgG1形式表达T427的重链(SEQ ID NO：1，2)。
轻链载体：使用质粒pRB98Amp-T427VL(C105)(dsFv-免疫毒素的VL-cys组分的表达载体)作为模板，通过PCR，回收抗CD30抗体T427的V-κ可变结构域。使用恢复G105(其在dsFv构型中突变成cys)的引物T427VL-BssHII-FOR和T427VL-BsiWI-REV，扩增T427VL。用BssHII和BsiWI消化VL PCR产物，并克隆进使用相同酶线性化的pMAZ-IgL载体(Mazor等人，同上)。得到的质粒pMAZ-IgL-T427用于在哺乳动物细胞中以嵌合IgG 1形式表达T427的轻链(SEQ ID NO：3，4)。
用于表达Inclonal的载体的构建
重链载体：如下将含有人IgG1的C-区的抗CD30抗体T427的VH可变结构域从pMAZ-IgH-T427(上述)亚克隆进基于T7的、IPTG-可诱导的细菌表达载体：使用质粒pMAZ-IgH-T427作为模板，使用引物CMV-Seq和CMV-antiseq-EcoRI-REV，通过PCR，扩增整个重链。用PstI和EcoRI消化PCR产物，并克隆进使用相同酶线性化的pRB98Amp-T427VH(C44)-PE38载体。得到的质粒pHAK-IgH-T427可以用于在大肠杆菌中以嵌合IgG1形式表达T427的重链。VH结构域可以交换进该质粒，作为NdeI-NheI片段。T427 inclonal重链的DNA序列与由哺乳动物表达载体pMAZ-IgH编码的重链序列(同上)相同。
如下构建用于在大肠杆菌中表达抗EGFR抗体225的重链的类似质粒：使用质粒pCMV/H6myc/cyto-225(Fv)[Shaki-Loewenstein，S.，Zfania，R.，Hyland，S.，Wels，W.S.& Benhar，I.A universal strategy for stable intracellular antibodies.J Immunol Methods 303，19-39(2005)]作为模板，使用引物225VH-NdeI-FOR和225VH-NheI-REV，通过PCR，回收VH可变结构域。用NdeI和NheI消化PCR产物，并克隆进使用相同酶线性化的pHAK-IgH-T427载体(上述)。得到的质粒命名为pHAK-IgH-225(重链SEQ ID NO：5，6)。
轻链载体：如下将含有人C-κ区的抗CD30抗体T427的轻链从pMAZ-IgL-T427(上述)亚克隆进基于T7的、IPTG-可诱导的细菌表达载体：使用质粒pMAZ-IgL-T427作为模板，使用引物CMV-Seq和CMV-antiseq-EcoRI-REV，通过PCR，扩增整个轻链。用PstI和EcoRI消化PCR产物，并克隆进使用相同酶线性化的pRB98Amp-T427VL(C105)质粒载体。得到的质粒pHAK-IgL-T427可以用于在大肠杆菌中以嵌合IgG1形式表达T427的轻链。VL结构域可以交换进该质粒，作为NdeI-BsiWI片段。T427 inclonal轻链的DNA序列与由哺乳动物表达载体pMAZ-IgL编码的轻链序列(同上)相同。
如下构建用于在大肠杆菌中表达抗EGFR抗体225的轻链的类似质粒：使用质粒pCMV/H6myc/cyto-225(Fv)[Shaki-Loewenstein，S.，Zfania，R.，Hyland，S.，Wels，W.S.& Benhar，I.A universal strategy for stable intracellular antibodies.J Immunol Methods 303，19-39(2005)]作为模板，使用引物225VK-NdeI-FOR和225VK-BsiWI-REV，通过PCR，回收V-κ可变结构域。用NdeI和BsiWI消化PCR产物，并克隆进使用相同酶线性化的pHAK-IgL-T427载体(上述)。得到的质粒命名为pHAK-IgL-225(SEQ ID NO：7和8)。
用于表达IgG-PE38融合蛋白的载体的构建——如下在通过在抗体恒定区的3`末端插入HindIII和EcoRI克隆位点予以修饰的pHAK载体(同上)的主链上，构建重链或轻链-PE38融合蛋白表达载体：对于重链载体，使用质粒pHAK-IgH作为模板，使用引物RGD/TAT-BsrGI-FOR和CH3-HindIII-EcoRI-REV，通过PCR，插入克隆位点。对于重链载体，使用pHAK-IgL作为模板，使用引物BsiWI-Back-IgL和Cκ-HindIII-EcoRI-REV。分别用BsrGI和EcoRI(对于重链)和SacI-EcoRI(对于轻链)消化PCR产物，并分别克隆进使用相同酶线性化的pHAK-IgH载体和pHAK-IgL载体。用HindIII和EcoRI将得到的载体线性化，并与使用相同酶从质粒pRB98Amp-T427VH(C44)-PE38回收的PE38DNA片段连接。得到的载体命名为pHAK-IgH-PE38和pHAK-IgL-PE38。
嵌合的IgG在哺乳动物细胞中的表达——在HEK293细胞中表达嵌合的T427 IgG1，所述HEK293细胞基本上如(Mazor等人，同上)所述用质粒pMAZ-IgH-T427和pMAZ-IgL-T427共转染，并用G418和潮霉素进行选择。选择高表达克隆后，在添加了10％FBS谷氨酰胺和抗生素的DMEM中扩增。在收获前72小时，将细胞转入DCCM1(无血清)培养基(Beit-Haemek，以色列)。以48-72h间隔，收集培养基数次。通过如(Mazor等人，同上)所述的蛋白-A色谱法，从条件培养基纯化IgG。通过Bradford测定法(Coomassie Plus；Pierce，Rockford，IL)，用BSA作为标准品，测定纯化的蛋白的蛋白浓度，或通过测定在280nm的吸光度，并基于它的消光系数，计算蛋白浓度。在4℃保藏纯化的IgG。西妥昔单抗
Figure BPA00001251288700261
购自Merck。
Inclonal在大肠杆菌中的表达——在用表达载体转化的大肠杆菌BL21(DE3)pUBS500细胞中表达Inclonal和inclonal-PE38融合蛋白[Brinkmann，U.，Mattes，R.E.& Buckel，P.High-level expression of recombinant genes in Escherichia coli is dependent on the availability of the dnaY gene product.Gene 85，109-114(1989)]。为了生产IgG，用pHAK-IgH和pHAK-IgL转化细胞。为了生产IgG-(二)PE38，用pHAK-IgH-PE38和pHAK-IgL转化细胞。为了生产IgG-(四)PE38，用pHAK-IgH-PE38和pHAK-IgL-PE38转化细胞。在37℃，在250RPM摇动下，在添加了100μg/ml氨苄西林和50μg/ml卡那霉素的SB培养基(35gr/L胰蛋白胨(Difco，USA)，20gr/L酵母提取物(Difco，USA)，5gr/L NaCl，6.3gr/L甘油(Frutarom，以色列)，12.5gr/L K2HPO4，3.8gr/L KH2PO4，0.48gr/L MgSO4，0.4％(w/v)葡萄糖)中培养细胞。在37℃，用1mM异丙基-1-硫代-β-D-吡喃型半乳糖苷诱导处于指数生长期晚期(OD6002.5)的细菌培养物3h用于蛋白表达。通过离心，从裂解的细菌细胞分离作为不溶包涵体积累的重组蛋白。从500ml培养物，收集到约3gr湿细胞糊。使用组织匀浆器(tissuemizer)，将细胞悬浮于50mM Tris(HCl)pH 8.0，20mM EDTA。为了裂解细胞，以500mg/L的终浓度加入溶菌酶，将细胞在25℃放置1h。将细胞裂解物调至300mM NaCl和1.5％(v/v)triton X100(SIGMA，以色列)，并使用组织匀浆器破碎。通过在4℃在10000RPM、GSA转子(Sorvall)离心30min，收集不溶的级分。通过在相同缓冲液(含有1％v/v TritonX100)中的2个额外的匀浆周期，然后离心，进一步纯化该粗包涵体制品。最后，再在不含有去污剂的相同缓冲液中处理包涵体一次，通过离心进行收集。在6M盐酸胍、50mM Tris(HCl)pH 8.0、20mM EDTA中彻底溶解包涵体，并以1∶2的重链-轻链摩尔比进行混合。从1升摇瓶培养物，通常得到200-300mg溶解的包涵体蛋白。然后在25℃，用10mg/ml二硫赤藓糖醇(SIGMA，以色列)(65mM)还原包涵体混合物2h。
具体而言，将50mg溶解的重链蛋白(50kDa分子量)与50mg溶解的轻链蛋白(25kDa分子量)相混合，然后作为重新折叠混合物进行还原。在PE38融合蛋白的情况下，将相对比例调整成分子量。例如，将约70mg溶解的重链-PE38融合蛋白(68kDa分子量)与约30mg溶解的轻链(25kDa分子量)相混合。
通过在8℃在含有还原-氧化重排(shuffling)和预防聚集的添加剂的重新折叠溶液(0.1M Tris(HCl)pH 9.5，2mM EDTA，0.9mM氧化谷胱甘肽和105gr/L L-精氨酸)中1∶100稀释36h，重新折叠溶解的还原的蛋白。重新折叠后，在磷酸盐/尿素缓冲液(20mM，含有Na2HPO4和NaH2PO4和100mM尿素)中充分透析蛋白至最终pH7.4。然后使用0.45μm过滤器，将重新折叠的活性蛋白过滤除菌，并通过蛋白-A色谱法，与污染细菌蛋白、多余的轻链和不适当折叠的蛋白分离。在4℃保藏纯化的IgG。通常，从混合50mg重链和50mg轻链蛋白开始的重新折叠，可以得到最高达15mg纯的Inclonal。
使用携带pHAK-IgH-225和pHAK-IgL-225的细胞培养物，以相同方式生产抗EGFR 225 Inclonal。
IgG-ZZ-PE38免疫复合物的制备——基本上如(Mazor等人，同上)所述，通过混合IgG与ZZ-PE38融合蛋白，并通过Superdex 200(Amersham Pharmacia Biotech，现在的GE healthcare，USA)凝胶过滤色谱仪纯化免疫复合物，制备chT427或ch225 IgG与ZZ-PE38融合蛋白的免疫复合物。
凝胶过滤色谱法——根据供应商的推荐，使用30ml TSK3000柱(TosoHaas，日本)进行快速蛋白液相色谱法(FPLC)(Pharmacia LKB-Pump-P500)，通过凝胶过滤色谱法进行嵌合IgG的分析分离。以0.5ml/min的流速，在500μl PBS缓冲液中装载约200微克样品。
通过ELISA和全细胞ELISA评价抗原结合——如下在ELISA中测试嵌合的IgG与抗原的结合：给ELISA平板包被4℃的5μg/mlMBP-CD30在PBS中的溶液20h，并在37℃用在PBS中的3％(v/v)脱脂乳封闭1-2h。所有后续步骤都在室温(25℃)进行。将蛋白-A纯化的IgG或IgG-PE38融合蛋白以5倍稀释系列应用于平板上，并测试它们的结合MBP-CD30的亲和力。温育后，用PBST洗涤平板3次。将HRP-缀合的山羊抗人抗体(对于IgG)或与HRP-缀合的山羊抗小鼠抗体混合的小鼠抗PE血清(对于IgG-PE38融合蛋白)用作第二抗体，在PBST中×5,000稀释。使用发色HRP底物TMB，使ELISA显色，并用1M H2SO4终止显色。将结果绘制成在450nm的吸光度，将结合亲合力粗略估计为产生最大信号的50％的IgG浓度。
如下通过全细胞ELISA测试225 Inclonal和西妥昔单抗
Figure BPA00001251288700281
对细胞EGFR的结合：在添加了10％FBS的DMEM中，以2X104细胞/孔的密度，将人表皮样癌A431细胞接种进96-孔板16h。抽吸出培养基，在25℃用3％戊二醛固定细胞15分钟。在37℃，用在PBS中的3％(v/v)脱脂乳封闭孔1-2h。接着，以在PBS+3％BSA中的5倍稀释系列，将IgG加入孔中，并在25℃温育1.5h。用PBS+3％BSA洗涤细胞3次后，在25℃加入100μl HRP-缀合的山羊抗人(×5000稀释，在PBS+3％BSA中)1h。另一个洗涤周期后，通过向每个孔中加入发色HRP底物TMB，进行细胞结合的抗体的检测，并用1M H2SO4终止显色。使用微板读数器在450nm测量吸光度。
流式细胞术——通过流式细胞术，用细菌或哺乳动物生产的chT427 IgG1，测试基于T427的分子对在A431/CD30转染的细胞上表达的CD30的结合分析[Rozemuller，H.，Chowdhury，P.S.，Pastan，I.& Kreitman，R.J.Isolation of new anti-CD30 scFvs from DNA-immunized mice by phage display and biologic activity of recombinant immunotoxins produced by fusion with truncated pseudomonas exotoxin.Int J Cancer 92，861-870(2001)]。在每个实验中，使用在免疫试管(5ml聚苯乙烯试管，Nunc，瑞典)中的约5×105细胞。胰蛋白酶消化后，在2％的于PBS(FACS缓冲液)中的胎牛血清中洗涤细胞一次。接着，以在PBS+3％BSA中10nM的终浓度，加入嵌合的IgG，在4℃温育细胞1.5h。然后用FACS缓冲液洗涤细胞3次，将FITC-标记的山羊抗人抗体(×50稀释，在PBS+3％BSA中)加入适当试管中，在4℃维持45min。通过FACS-Calibur(Becton Dickinson，CA)上的流式细胞术，检测结合的抗体，用CELLQuest程序(Becton Dickinson)分析结果。为了证实特异性，在1.5h温育时段中，用或不用×30倍过量的竞争蛋白温育抗体。
以相同的方式，进行基于225的分子对在A431细胞上表达的EGFR的结合分析。
细胞存活力测定——通过MTT测定法，测量嵌合的IgG-ZZ-PE38免疫复合物和IgG-PE38融合蛋白的体外细胞杀伤活性。以1×104细胞/孔的密度，在添加了10％FBS的DMEM中，将测试的细胞接种进96-孔平板。以10倍稀释系列，加入免疫复合物、IgG-PE38融合蛋白或对照蛋白(一式三份)，在37℃、在5％CO2气氛中温育细胞48h。48h后，将培养基替换为含有1mg/ml MTT(噻唑蓝Tetrazoliam溴化物，溶于PBS中)试剂的新鲜培养基(100μl/孔)，温育细胞另外4h。通过加入20％SDS、50％DMF、pH 4.7(100μl/孔)并在37℃温育16h，溶解MTT-甲晶体。在自动化的微量滴定板读数器上，记录在570nm的吸光度。使用下述方程，将结果表达为活细胞相对于同时处置的未处理对照的百分比：(处理的样品的OD570/未处理的样品的OD570)×100。将IC50值定义为使细胞生长抑制50％的免疫复合物或IgG-PE38融合蛋白浓度。
血清中IgG稳定性的评价
为了对比Inclonal IgG T427的稳定性和在哺乳动物细胞培养物中生产的对应chT427 IgG的稳定性，如下进行血清稳定性测试：在100％牛血清(Beit Haemek，以色列)中，将IgG稀释至30μg/ml的终浓度，并在37℃温育指示的时间段。通过上述的ELISA，评价每个级分的残余结合MBP-CD30的活性。
结果
本发明的教导提供了在大肠杆菌中高效率地生产全长IgG和IgG-毒素融合蛋白(在本文中也命名为″Inclonal″)的方法。该方法包含，表达作为不溶包涵体的蛋白，然后重新折叠。构建了基于T7的载体系统，用于分开表达IgG重链、轻链或融合于假单胞菌外毒素A的截短形式(PE38)的对应重链或轻链。表达载体含有人γ1重链的恒定区和人κ轻链，它们与用于构建哺乳动物细胞IgG表达系统的那些相同[Mazor，Y.，Barnea，I.，Keydar，I.& Benhar，I.Antibody internalization studied using a novel IgG binding toxin fusion.J Immunol Methods 321，41-59(2007)，图1]。
模型抗体是抗CD30抗体T427[Nagata，S.等人Rapid grouping of monoclonal antibodies based on their topographical epitopes by a label-free competitive immunoassay.J Immunol Methods 292，141-155(2004)]。将T427克隆进表达载体，并如上所述生产。得到嵌合的T427Inclonal的高度纯化的制品的高产率(图2a-b)。为了对比，基本上如[Mazor等人2007，同上]所述，制备一批哺乳动物细胞生产的嵌合的T427 IgG(T427 chIgG)。通过凝胶过滤色谱法、抗原结合性质和细胞杀伤活性，对比细菌生产的Inclonal和哺乳动物细胞生产的IgG。通过TSK3000柱上的凝胶过滤色谱法，分析纯化的T427 Inclonal的等分试样。如图3所示，T427 Inclonal(计算分子量147,500)作为单体从柱洗脱。对照哺乳动物细胞生产的mAb西妥昔单抗
Figure BPA00001251288700301
(计算分子量151800)作为稍微更大的单体蛋白移动，这可能是由于在大肠杆菌生产的IgG中缺少翻译后修饰(糖基化)。通过ELISA和流式细胞术，研究抗原结合。如图4a所示，在ELISA中，T427 Inclonal以与在哺乳动物细胞培养物中生产的对应T427 chIgG相似的亲合力，结合可溶抗原。类似地，在CD30表达细胞上的流式细胞术分析中，观察到相同的结合性质(图4b1)。如图4b2所示，通过T427(dsFv)-PE38重组免疫毒素(如上所述制备)对T427 Inclonal结合信号的竞争，可以证实结合特异性。通过与抗体-结合毒素融合蛋白(ZZ-PE38)形成复合物(如Mazor等人2007，同上所述)，体外评价Inclonal抗体的靶向肿瘤细胞的能力。细胞毒性评价也揭示，T427 Inclonal与哺乳动物细胞生产的抗体的性能相当(图4c)。
因而，本发明的教导提供了生产遗传地与细胞毒素部分融合的全长IgG、并从而开发IgG-酶融合蛋白的机会。制备了T427 Inclonal的假单胞菌外毒素融合蛋白。制备了2种衍生物：T427(二)-PE38衍生物，其含有与抗体重链融合的PE38；和T427(四)-PE38，其含有与抗体重链和轻链融合的PE38。Inclonal-毒素融合衍生物的差别在于它们的分子量(二毒素是～225kDa，四毒素是～300kDa)和为每个结合事件递送的毒素分子有效负载的数目(图5a)。以类似于对IgG Inclonal得到的高纯度(图5b-c)和高产率生产T427(二)-PE38和T427(四)-PE38。评价了这些新颖的蛋白的结合性质和细胞杀伤活性。如图6a所示，从ELISA信号评价的T427(二)-PE38和T427(四)-PE38的表观结合亲合力是约0.2nM，这类似于T427 Inclonal和T427 chIgG(显示在图4a中)。两种IgG以为对应的单价重组免疫毒素T427(dsFv)-PE38的亲和力10倍的表观亲合力进行结合。
在培养的CD30表达细胞上，测试了T427(二)-PE38和T427(四)-PE38 inclonal-毒素融合蛋白的细胞杀伤潜力。如图6b所示，两种分子以～30pM的IC50抑制靶细胞的生长，而单价免疫毒素T427(dsFv)-PE38具有～60pM的IC50。
作为另一个实例，生产了抗EGF受体抗体225的Inclonal衍生物。MAb 225是亲代小鼠单克隆抗体，从它衍生出治疗抗体西妥昔单抗
Figure BPA00001251288700311
[Rowinsky，E.K.The erbB family：targets for therapeutic development against cancer and therapeutic strategies using monoclonal antibodies and tyrosine kinase inhibitors.Annu Rev Med 55，433-457(2004)]。对比了225 Inclonal和西妥昔单抗
Figure BPA00001251288700312
的抗原结合性质(图7a-b)，和作为ZZ-PE38免疫复合物的细胞杀伤活性(图8a-c)。如图7a-b所示，225 Inclonal以为西妥昔单抗
Figure BPA00001251288700313
的约1/10的亲和力特异性地结合表达EGFR的细胞。类似地，225 Inclonal-ZZ-PE38免疫复合物对高表达EGFR的A431细胞系和低表达EGFR的293细胞系具有细胞毒素活性，其效力为西妥昔单抗-ZZ-PE38免疫复合物的约1/10(图8a-c)。该差异与报道的西妥昔单抗
Figure BPA00001251288700315
与225mAb相比亲和力增加至10倍相一致[Rowinsky等人，同上]。
为了进一步对比Inclonal IgG T427的质量和在哺乳动物细胞培养物中生产的对应chT427 IgG的质量，如下进行血清稳定性测定：在100％牛血清(Beit Haemek，以色列)中，将IgG稀释至30μg/ml的终浓度，并在37℃温育指示的时间段。通过图4a所述的ELISA，评价每个级分的残余结合MBP-CD30的活性。如图9a，b所示，哺乳动物细胞生产的chT427 IgG和T427 Inclonal同样稳定，在37℃4天的测试阶段中没有损失结合活性。
本发明的实施方案证实了为生产全长IgG和IgG-毒素融合蛋白开发的表达和纯化方法，其通过重新折叠大肠杆菌生产的抗体重链和轻链的包涵体。使用该方法，可以得到高达50mg纯的IgG/1升摇瓶培养物的产率和高度纯化的产物。在结合性质以及它们的向培养的靶细胞递送毒素的潜力方面，Inclonal与使用常规哺乳动物细胞培养物生产的相同IgG的表现相同。
本文所述的Inclonal技术，会提供快速的、普遍适用的且潜在廉价的生产全长抗体的方法。可以潜在地用于治疗、诊断或研究目的大部分抗体(例如病毒中和抗体，用于将负载运送到靶细胞的抗体，或双特异性抗体)的有效性不依赖于Fc糖基化。此外，本发明的实施方案解决了缀合物异质性的问题，可适用于广范围的细胞毒素蛋白。对于研究目的，目前非常需要生产蛋白特异性的亲和试剂来开发人蛋白质组。生产可恢复的抗体的高流通量方法仍然不成熟[Uhlen，M.，Graslund，S.& Sundstrom，M.A pilot proj ect to generate affinity reagents to human proteins.Nat Methods 5，854-855(2008)]。通过″Inclonal ″技术可以生产的抗体-酶或抗体-荧光团融合蛋白，对于这样的目的可能非常有用。据信，该快速的且节省成本的IgG和IgG-融合蛋白生产方法和得到的高质量产物，可以使全长IgG和IgG-融合蛋白的细菌生产成为抗体生产的可行的且有吸引力的选择。
本发明的实施方案证实，改良的表达-重新折叠系统能在大肠杆菌中有效地生产全长IgG。通过使用该新颖的系统，可以得到2种不同的抗体：抗-CD30 T427抗体和抗-EGFR 225抗体(和更多，未显示数据)。从包涵体生产抗体链的方法，得到大量相对纯的蛋白。整个重新折叠和纯化方法最终从1升摇瓶培养物得到最高达50mg IgG蛋白，这是以前使用细菌表达系统在低密度培养物中进行抗体生产所未报道过的产率。这些生产产率有益于研究实验室，后者不同于工业实验室，通常不配有高密度发酵罐。该系统的另一个重要益处是终产物的纯度：在蛋白-A纯化后，抗体的单体形式显著地是得到的主要形式。纯化的蛋白几乎不含有部分地装配的物质(它们在以前的研究中观察到，Simmons 2002和Mazor 2007，同上)。在耗时方面，大肠杆菌生产系统的优点很大。在哺乳动物系统中，从转染、经过选择高表达克隆、经过扩增克隆、至IgG纯化的整个过程，最好需要约8周，而在细菌系统中，从转化、经过重新折叠、至IgG纯化，只需要约8-9天。
尽管已经结合其具体实施方案描述了本发明，显然，许多替代方案、修饰和变动是本领域技术人员显而易见的。因此，意在包括落入所附权利要求的精神和宽广范围内的所有这样的替代方案、修饰和变动。
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请，都通过参考引用整体并入本说明书中，其程度如同具体地且单个地说明每篇单独的出版物、专利和专利申请通过参考引用并入本文。另外，在本申请中对任意参考文献的引用或标识，不应理解为承认这样的参考文献可用作本发明的现有技术。在使用小标题的情况下，它们不应理解为必要的限制。
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Claims (20)

1.在细菌培养物中生产免疫球蛋白的方法，该方法包含：
(a)在第一种细菌宿主细胞中表达包含免疫球蛋白轻链的第一种多肽，从而形成包含所述免疫球蛋白轻链的包涵体；
(b)在第二种细菌宿主细胞中表达包含免疫球蛋白重链的第二种多肽，从而形成包含所述免疫球蛋白重链的包涵体；
(c)从所述包涵体回收所述第一种多肽和所述第二种多肽，从而得到重建的重链和重建的轻链；和
(d)在允许所述重建的轻链和所述重建的重链主要重新折叠为完整免疫球蛋白的条件下，重新折叠所述重建的重链和重建的轻链。
2.权利要求1的方法，其中所述条件包含约1∶2的重链-轻链摩尔比。
3.权利要求1的方法，其中所述第一种细菌宿主和所述第二种细菌宿主各自是革兰氏阴性细菌。
4.权利要求3的方法，其中所述革兰氏阴性细菌是大肠杆菌。
5.权利要求1的方法，另外包含，在蛋白A/G/L上纯化所述免疫球蛋白分子。
6.权利要求1的方法，其具有每1升重链细菌培养物至少50mg纯化的免疫球蛋白分子的产率，在诱导时具有2.5的O.D.600。
7.权利要求1的方法，其中所述第一种多肽和所述第二种多肽中的至少一种包含治疗部分。
8.权利要求1的方法，其中所述第一种多肽和所述第二种多肽中的至少一种包含可鉴别部分。
9.权利要求1的方法，其中所述主要重新折叠为所述完整免疫球蛋白包含至少80％的免疫球蛋白作为所述完整免疫球蛋白。
10.权利要求1的方法，其中所述重链属于γ家族。
11.权利要求1的方法，其中所述轻链属于κ家族。
12.权利要求1的方法，其中所述轻链属于λ家族。
13.根据权利要求1-12中任一项的方法生产的免疫球蛋白。
14.物质组合物，其包含革兰氏阴性制品残余物和至少90％免疫球蛋白。
15.权利要求14的物质组合物，其包含不超过10％免疫球蛋白片段。
16.权利要求1的方法或权利要求14或15的组合物，其中所述免疫球蛋白选自：IgA，IgD，IgE和IgG。
17.权利要求16的方法或组合物，其中所述IgG包含IgG1，IgG2，IgG3或IgG4。
18.权利要求1的方法或权利要求14或15的组合物，其中所述免疫球蛋白选自：嵌合抗体，人源化抗体和全人抗体。
19.权利要求1的方法或权利要求14或15的组合物，其中所述免疫球蛋白是双特异性抗体。
20.权利要求1的方法或权利要求14或15的组合物，其中所述免疫球蛋白选自：灵长类动物免疫球蛋白，猪免疫球蛋白，鼠免疫球蛋白，牛免疫球蛋白，山羊免疫球蛋白和马免疫球蛋白。
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Meyer-Tamaki Preclinical development of monoclonal antibodies

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