CN102007220A - 表皮生长因子受体基因拷贝数 - Google Patents

Abstract

提供了预测抗表皮生长因子受体(“EGFr”)特异性结合剂治疗在癌症治疗中是否将是有效的方法，以及用抗EGFr特异性结合剂治疗患者的方法。

Description

表皮生长因子受体基因拷贝数

本申请要求2005年4月1日提交的美国临时申请60/667,827的利益。美国临时申请60/667,827为了任何目的整体引入本文作为参考。

领域

本申请涉及预测抗表皮生长因子受体(“EGFr”)特异性结合剂治疗在癌症治疗中是否将是有效的方法，以及用抗EGFr特异性结合剂治疗患者的方法。提供了测定治疗功效的方法。

背景

癌症治疗中单克隆抗体的某些应用依赖于抗体特异性递送至癌性组织细胞毒性效应子功能例如免疫增强同种型、毒素或药物的能力。可替代的方法是使用单克隆抗体通过使肿瘤细胞丧失基本细胞外增殖信号直接影响其存活，例如通过生长因子经由其细胞受体介导的那些。这种方法中有吸引力的靶之一是结合EGF和转化生长因子α(TGFα)的表皮生长因子受体(EGFr)(参见，例如，Ullrich等人，Cell61：203-212，1990；Baselga等人，Pharmacol.Ther.64：127-154，1994；Mendelsohn等人，in Biologic Therapy of Cancer 607-623，Philadelphia：J.B.Lippincott Co.，1995；Fan等人，Curr.Opin.Oncol.10：67-73，1998)。EGF或TGFα与EGFr-170 kDa的跨膜细胞表面糖蛋白的结合触发了细胞生物化学事件级联，包括EGFr自身磷酸化和内在化，这以细胞增殖为终结(参见，例如，Ullrich等人，Cell 61：203-212，1990)。

几个观察暗示EGFr支持人实体瘤的发展和进展。EGFr已被证实在许多类型的人实体瘤上超表达(参见，例如，Mendelsohn CancerCells 7：359(1989)，Mendelsohn Cancer Biology 1：339-344(1990)，Modjtahedi和Dean Int’l J.Oncology 4：277-296(1994))。例如，EGFr超表达已在某些肺、乳房、结肠、胃、脑、膀胱、头与颈、卵巢和前列腺癌中观察到(参见，例如，Modjtahedi和Dean Int’l J.Oncology 4：277-296(1994))。某些组已报道受体水平的增加与临床预后差有关(参见，例如，Baselga等人，Pharmacol.Ther.64：127-154，1994；Mendelsohn等人，Biologic Therapy of Cancer第607-623页，Philadelphia：J.B.Lippincott Co.，1995；Modjtahedi等人，Intl.J.of Oncology 4：277-296，1994；Gullick，Br.Medical Bulletin，47：87-98，1991；Salomon等人，Crit.Rev.Oncol.Hematol.19：183-232，1995)。然而，其他研究暗示预后不能直接与EGFr超表达相关(参见，例如Rusch等人，Clin.Cancer Res.3：515-522，1997；Pfeiffer等人，Br.J.Cancer 74：86-91，1996；Fontanini等人，Clin.Cancer Res.4：241-249，1998；Greatens等人，Am.J.Respir.Crit.Care.Med.157：1093-1097，1998；D’Amico等人，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.117：736-743，1999；Pastorino等人，J.Clin.Oncol.15：2858-2865，1997)。表皮生长因子(EGF)和转化生长因子α(TGF-α)已被证实结合EGFr并导致细胞增殖和肿瘤生长。在许多情况下，表面EGFr表达增加伴随肿瘤细胞的TGFα或EGF生产，从而暗示自分泌生长控制牵涉于这些肿瘤的进展(参见，例如，Baselga等人，Pharmacol.Ther.64：127-154，1994；Mendelsohn等人，Biologic Therapy of Cancer第607-623页，Philadelphia：J.B.Lippincott Co.，1995；Modjtahedi等人，Intl.J.of Oncology 4：277-296，1994；Salomon等人，Crit.Rev.Oncol.Hematol.19：183-232，1995)。

因此，某些组已建议针对EGF、TGF-α和EGFr的抗体可能在表达或超表达EGF-r的肿瘤治疗中有用(参见，例如，Mendelsohn CancerCells 7：359(1989)，Mendelsohn Cancer Biology 1：339-344(1990)，Modjtahedi和Dean Int’l J.Oncology 4：277-296(1994)，Tosi等人，Int’l J.Cancer 62：643-650(1995))。事实上，已证实抗EGFr抗体阻断EGF和TGF-α与受体的结合看起来抑制肿瘤细胞增殖。然而，同时抗EGFr抗体看起来不抑制不依赖于EGF和TGF-α的细胞生长(Modjtahedi和Dean Int’l J.Oncology 4：277-296(1994))。

能够中和EGF和TGF-α与肿瘤细胞的结合并在体外抑制配体介导的细胞增殖、对人EGFr特异的单克隆抗体已从小鼠和大鼠中产生(参见，例如，Baselga等人，Pharmacol.Ther.64：127-154，1994；Mendelsohn等人，in Biologic Therapy of Cancer 607-623，Philadelphia：J.B.Lippincott Co.，1995；Fan等人，Curr.Opin.Oncol.10：67-73，1998；Modjtahedi等人，Intl.J.Oncology 4：277-296，1994)。这些抗体中的一些，例如小鼠108、225(参见，例如Aboud-Pirak等人，J.Natl.Cancer Inst.80：1605-1611，1988)和528(参见，例如Baselga等人，Pharmacol.Ther.64：127-154，1994；Mendelsohn等人，in Biologic Therapy of Cancer 607-623，Philadelphia：J.B.LippincottCo.，1995)或大鼠ICR16、ICR62和ICR64(参见，例如，Modjtajedi等人，Intl.J.Oncology 4：277-296，1994；Modjtahedi等人，Br.J.Cancer67：247-253，1993；Modjtahedi等人，Br.J.Cancer 67：254-261，1993)单克隆抗体，被广泛评估其影响异种移植物小鼠模型中的肿瘤生长的能力。大多数抗EGFr单克隆抗体当与人肿瘤细胞一起施用时在预防无胸腺小鼠中的肿瘤形成中是有效的(Baselga等人，Pharmacol.Ther.64：127-154，1994；Modjtahedi等人，Br.J.Cancer 67：254-261，1993)。当注射到荷有确立的人肿瘤异种移植物的小鼠内时，小鼠单克隆抗体225和528引起部分肿瘤消退并且需要化学治疗剂例如阿霉素或顺铂的共施用，以用于根除肿瘤(Baselga等人，Pharmacol.Ther.64：127-154，1994；Mendelsohn等人，in Biologic Therapy of Cancer 607-623，Philadelphia：J.B.Lippincott Co.，1995；Fan等人，Cancer Res.53：4637-4642，1993；Baselga等人，J.Natl.Cancer Inst.85：1327-1333，1993)。其中小鼠抗体可变区连接至人恒定区的嵌合形式的225单克隆抗体(C225)，显示改善的体内抗肿瘤活性，但只在高剂量时(参见，例如，Goldstein等人，Clinical Cancer Res.1：1311-1318，1995；Prewett等人，J.Immunother.Emphasis Tumor Immunol.19：419-427，1996)。大鼠ICR16、ICR62，和ICR64抗体引起确立的肿瘤消退，但不能导致其完全根除(Modjtahedi等人，Br.J.Cancer 67：254-261，1993)。这些结果确定EGFr是用于针对EGFr表达性实体瘤的抗体治疗的有希望的靶，并导致在多重人实体癌中使用C225单克隆抗体的人临床试验(参见，例如Baselga等人，Pharmacol.Ther.64：127-154，1994；Mendelsohn等人，Biologic Therapy of Cancer第607-623页，Philadelphia：J.B.Lippincott Co.，1995；Modjtahedi等人，Intl.J.ofOncology 4：277-296，1994)。

生物学领域中的某些进展使得可能生产全人抗EGFr抗体。使用对于人免疫球蛋白基因转基因的小鼠(Xenomouse^TM technology，Abgenix，Inc.)，开发了对于人EGFr特异的人抗体(参见，例如，Mendez，Nature Genetics，15：146-156，1997；Jakobovits，AdvancedDrug Delivery Reviews，31(1-2)：33-42，1998；Jakobovits，ExpertOpinion on Investigational Drugs，7(4)：607-614，1998；Yang等人，Crit.Rev.Oncol.Hematol.38(1)：17-23，2001；WO98/24893；WO98/50433)。一种此类抗体帕尼单抗(panitumumab)-对于人EGFr具有5×10^-11M的亲和力的人IgG2单克隆抗体-已显示阻断EGF与EGFr的结合，阻断受体信号传导，并在体外抑制肿瘤细胞激活和增殖(参见，例如WO98/50433；美国专利号6,235,883)。无胸腺小鼠中的研究已证实帕尼单抗还具有体内活性，不仅预防无胸腺小鼠中人表皮样癌A431异种移植物的形成，还根除已确立的大A431肿瘤异种移植物(参见，例如Yang等人，Crit.Rev.Oncol.Hematol.38(1)：17-23，2001；Yang等人，Cancer Res.59(6)：1236-43，1999)。帕尼单抗也已考虑用于治疗肾癌、结肠直肠腺癌、前列腺癌和非小细胞鳞状肺癌以及其他癌症(参见，例如，美国专利公开号2004/0033543)，并且使用那种抗体的临床试验正在进行中。

在某些细胞类型中，生长因子例如EGFr的结合防止经由磷脂酰肌醇3-激酶(“PI3K”)和B-Raf刺激的细胞凋亡。PI3K激活触发了分子级联，从而导致控制程序性细胞死亡的中枢途径的下调(Yao，R.，Science 267：2003-2006，1995)。Raf家族成员还已被鉴别为哺乳动物中程序性细胞死亡的调节剂(Hunter，Cell 80：225-236，1995)。在Raf敲除中，缺乏B-Raf的小鼠显示细胞存活中的紊乱，而缺乏Raf-1或A-Raf的小鼠则不显示此类紊乱(参见，例如Pritchard，Curr.Biol.6：614-617，1996；Wojnowski，Nat.Genet.16：293-297，1997)，从而表明B-Raf在细胞死亡调节中可能具有特定功能。PI3K和B-Raf两者在细胞增殖病症特别是癌症中具有重要性。

概述

在某些实施方案中，提供了预测EGFr特异性结合剂治疗在受试者的EGFr相关癌症治疗中是否将是有效的方法，其包括测定来自受试者样品中的EGFr基因拷贝数，其中样品中的EGFr基因拷贝数存在增加预示EGFr特异性结合剂治疗在受试者的EGFr相关癌症治疗中将是有效的。

在某些实施方案中，提供了治疗患有EGFr相关癌症的受试者的方法，其包括：(a)测定来自受试者样品中的EGFr基因拷贝数；(b)测定样品中的EGFr基因拷贝数是否增加；和(c)如果样品中的EGFr基因拷贝数增加，那么给受试者施用药学有效量的EGFr特异性结合剂。

在某些实施方案中，提供了测定患者中的治疗功效的方法，其包括：(a)测定从患者获得的第一种样品中的EGFr基因拷贝数，以获得第一种EGFr基因拷贝数水平；(b)给患者施用治疗；(c)测定来自治疗施用后某时的患者的第二种样品中的EGFr基因拷贝数，从而产生第二种EGFr基因拷贝数水平；和(d)比较第一种和第二种EGFr基因拷贝数水平，其中第二种EGFr基因拷贝数水平中的EGFr基因拷贝数相对于第一种EGFr基因拷贝数水平降低表明治疗在患者中是有效的。

附图简述

图1A-1D是根据实施例3中描述的工作，如通过荧光显微镜所见来自双色FISH测定分析的图像。在所有4个图中，EGFr基因显示为红色并且CEP7序列显示为绿色。图1A显示正常结肠直肠粘膜细胞的染色模式。图1B显示来自患者7的肿瘤细胞的染色模式。图1C显示来自患者4的肿瘤细胞的染色模式。图1D显示来自患者1的肿瘤细胞的染色模式。

图2A的蛋白质印迹显示根据实施例4中描述的工作，不同结肠直肠癌细胞系中EGFr的表达水平。图2B是根据实施例4中描述的工作，如通过荧光显微镜所见来自DiFi结肠直肠癌细胞的双色FISH测定分析的图像。EGFr基因显示为红色并且CEP7序列显示为绿色。

某些优选实施方案的详述

本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等，以及其中引用的参考文献都在此整体引入本文作为参考，其程度至它们以前未引入的程度。本文使用的章节标题仅用于组织目的并且不应解释为限制所描述的主题。

定义

除非另有限定，关于本发明使用的科学和技术术语应当具有本领域技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。

一般地，关于本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、以及蛋白质和寡或多核苷酸化学和杂交使用的术语和其技术是本领域众所周知且通常使用的那些。对于重组DNA、寡核苷酸合成、以及组织培养和转化使用标准技术(例如电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书或如本领域通常完成或如本文描述的进行。前述技术和操作一般根据本领域众所周知的常规方法以及如本说明书自始至终引用和讨论的各种一般和较具体的参考文献中描述的进行。参见，例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989))，其引入本文作为参考。关于本文描述的分析化学、合成有机化学、以及医学和药物化学使用的术语，以及其实验室操作和技术是本领域众所周知且通常使用的那些。对于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送、以及患者治疗使用标准技术。

在本申请中，除非另有说明，“或”的使用指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式如“包括(includes)”和“包括的(included)”的使用不是限制性的。同样，除非另有具体说明，术语例如“要素”或“组分”包含包括一种单位的要素和组分，以及包括超过一种亚单位的要素和组分。

如依照本公开内容使用的，除非另有说明，下列术语应当理解为具有下列含义：

术语“分离的多核苷酸”和“分离的核酸”可互换使用，并且如本文使用的应当指基因组、cDNA或合成起源的多核苷酸，或其某些组合，由于其起源所述多核苷酸(1)与其中在自然界中发现“分离的多核苷酸”的多核苷酸的全部或部分不结合，(2)可操作地连接至其在自然界中不连接的多核苷酸，或(3)在自然界中不作为较大序列的部分存在。

术语“分离的蛋白质”和“分离的多肽”可互换使用，并且如本文提及的指cDNA、重组RNA或合成起源的蛋白质，或其某些组合，由于其起源或衍生来源所述蛋白质(1)与在自然界中发现的蛋白质不结合，(2)不含来自相同来源的其他蛋白质，例如不含鼠类蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)在自然界中不存在。

术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用并且在本文中用作总称，指多肽序列的天然蛋白、片段、肽或类似物。因此，天然蛋白、片段和类似物是多肽类的种类。

术语“EGFr多肽”包含天然蛋白，以及天然蛋白的片段、类似物和突变体。因此，天然EGFr蛋白，以及天然EGFr蛋白的片段、类似物和突变体是EGFr多肽类的种类。

在多肽序列突变上下文中的术语“X#Y”是领域公认的，其中“#”指按照多肽的氨基酸数目的突变位置，“X”指在野生型氨基酸序列中那个位置上发现的氨基酸，并且“Y”指在那个位置上的突变氨基酸。例如，关于Ras多肽的符号“G13D”指在野生型Ras序列的氨基酸数目13上是甘氨酸，并且那个甘氨酸替换为突变Ras序列中的天冬氨酸。

如本文使用的，术语“天然存在的”当应用于对象时指对象可以在自然界中发现的事实。例如，在生物(包括病毒)中存在、可以从自然界中的来源分离以及仍未通过人类在实验室或以其他方式有意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。

如本文使用的，术语“可操作地连接”指组分的定位，从而使得它们的关系允许它们以其预期的方式起作用。与编码序列“可操作地连接”的控制序列以这样的方式连接，从而使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下完成。

如本文使用的，术语“控制序列”指实现它们与之连接的编码序列的表达和加工所需的多核苷酸序列。此类控制序列的特性取决于宿主生物而不同；在原核生物中，此类控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，一般地，此类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”预期最低限度地包括其存在对于表达和加工必需的所有组分，并且还可以包括其存在是有利的另外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。

如本文提及的，术语“多核苷酸”指长度为至少10个碱基的聚合形式的核苷酸，为核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式。该术语包括单和双链形式的DNA。

本文提及的术语“寡核苷酸”包括通过天然存在和非天然存在的寡核苷酸键连接在一起的天然存在和修饰的核苷酸。寡核苷酸是一般包括长度为200个或更少碱基的多核苷酸的子集。优选地，寡核苷酸长度为10-60个碱基，并最优选长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20-40个碱基。寡核苷酸通常是单链的，例如对于探针，尽管寡核苷酸可以是双链的，例如对于在基因突变体的构建中使用。本发明的寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。

本文提及的术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文提及的术语“修饰的核苷酸”包括具有修饰或取代的糖基团等的核苷酸。本文提及的术语“寡核苷酸键”包括寡核苷酸键，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate、氨基磷酸酯等。参见，例如LaPlanche等人，Nucl.Acids Res.14：9081(1986)；Stec等人，J.Am.Chem.Soc.106：6077(1984)；Stein等人，Nucl.Acids Res.16：3209(1988)；Zon等人，Anti-Cancer Drug Design6：539(1991)；Zon等人，Oligonucleotidesand Analogues：A Practical Approach，第87-108页(F.Eckstein，Ed.，Oxford University Press，Oxford England(1991))；Stec等人，美国专利号5,151,510；Uhlmann和Peyman Chemical Reviews 90：543(1990)，其公开内容在此引入作为参考。需要时寡核苷酸可以包括用于检测的标记。

核酸的“拷贝数”指在给定样品中那种核酸的个别实例的数目。样品中的“EGFr基因拷贝数”指那种样品中的EGFr基因的个别拷贝的数目。样品中的“EGFr基因拷贝数增加”指样品中的EGFr基因的个别拷贝的数目对于参考是增加的。在某些此类实施方案中，参考是另一种样品。在某些此类实施方案中，参考是取自相同个体的另一种样品。在某些此类实施方案中，参考是取自不同个体的另一种样品。在某些此类实施方案中，参考是特定群体特有的EGFr基因拷贝数。

本文提及的术语“选择性杂交”指可检测且特异性结合。多核苷酸、寡核苷酸及其片段与核酸链在杂交和洗涤条件下选择性杂交，所述条件最小化与非特异性核酸的可检测结合的可评估量。如本领域已知和本文讨论的，高严格性条件可以用于达到选择性杂交条件。一般地，多核苷酸、寡核苷酸和片段与目的核酸序列之间的核酸序列同源性将为至少80％，并且更一般优选至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的增加的同源性。2个氨基酸序列是同源的，如果它们的序列之间存在部分或完全同一性的话。例如，85％的同源性指当2个序列对于最大匹配比对时，85％的氨基酸是相同的。缺口(匹配的2个序列的任何一个中)在最大化匹配中是允许的；5或更小的缺口长度是优选的，且2或更小的缺口长度是更优选的。可替代地且优选地，如这个术语在本文中使用的，2个蛋白质序列(或来源于其长度为至少30个氨基酸的多肽序列)是同源的，如果使用具有突变数据矩阵和6或更大的缺口罚分的程序ALIGN它们具有超过5的比对得分(以标准差的单位)的话。参见，Dayhoff，M.O.，Atlas of Protein Sequence and Structure，第101-110页(第5卷，NationalBiomedical Research Foundation(1972))以及那一卷的增刊2，第1-10页。2个序列或其部分更优选是同源的，如果当使用ALIGN程序最佳比对时它们的氨基酸大于或等于50％同一的话。术语“与……一致”在本文中用于指多核苷酸序列与参考多核苷酸序列的全部或部分同源(即，相同，非严格进化相关)，或多肽序列等同于参考多肽序列。相对地，术语“与……互补的”在本文中用于指互补序列与参考多核苷酸序列的全部或部分同源。为了举例说明，核苷酸序列“TATAC”与参考核苷酸序列“TATAC”一致并且与参考核苷酸序列“GTATA”互补。

下列术语用于描述2个或更多个多核苷酸或氨基酸序列之间的序列关系：“参考序列”、“比较窗”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“相当大同一性”。“参考序列”是用作序列比较基础的限定序列；参考序列可以是较大序列的子集，例如，作为序列表中给出的全长cDNA或基因序列的区段，或可以包括完整cDNA或基因序列。一般地，参考序列长度为至少18个核苷酸或6个氨基酸，长度通常为至少24个核苷酸或8个氨基酸，并且长度经常为至少48个核苷酸或16个氨基酸。因为2个多核苷酸或氨基酸序列可以各自(1)包括在2个分子之间相似的序列(即完整多核苷酸或氨基酸序列的部分)，和(2)可以进一步包括在2个多核苷酸或氨基酸序列之间不同的序列，所以2个(或更多个)分子之间的序列比较一般通过在“比较窗”上比较2个分子的序列来进行，以鉴别和比较序列相似性的局部区域。如本文使用的，“比较窗”指至少18个邻接核苷酸位置或6个氨基酸的概念区段，其中多核苷酸序列或氨基酸序列可以与至少18个邻接核苷酸或6个氨基酸的参考序列比较，并且其中对于2个序列的最佳比对，比较窗中的多核苷酸序列的部分与参考序列(其不包括添加或缺失)比较可以包括20％或更少的添加、缺失、置换等(即缺口)。关于比较窗比对的序列的最佳比对可以通过下列来进行：通过Smith和Waterman A dv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85：2444(1988)的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，(Genetics ComputerGroup，575 Science Dr.，Madison，Wis.)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Geneworks或Mac Vector软件包)，或通过检查，并且选择通过各种方法产生的最佳比对(即，在比较窗上产生的最高同源性百分比)。

术语“序列同一性”指2个多核苷酸或氨基酸序列在比较窗上是相同的(即，在逐核苷酸，或逐残基的基础上)。术语“序列同一性百分比”通过下述方法来计算：在比较窗上比较2个最佳比对的序列，测定在2个序列中出现相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)或残基的位置数目以产生匹配位置的数目，用比较窗中的位置总数目(即，窗口大小)除匹配位置的数目，并且将结果乘以100以产生序列同一性百分比。如本文使用的，术语“相当大同一性”指多核苷酸或氨基酸序列的特征，其中多核苷酸或氨基酸包括的序列在至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置的比较窗上，通常在至少24-48个核苷酸(8-16个氨基酸)位置的窗口上，与参考序列比较具有至少85％序列同一性，优选至少90-95％序列同一性，更通常为至少96、97、98或99％序列同一性，其中序列同一性的百分比通过在比较窗上比较参考序列与可能包括参考序列的总共20％或更少的缺失或添加的序列来计算。参考序列可以是较大序列的子集。

如本文使用的，20种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology-A Synthesis(2^nd Edition，E.S.Golub和D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，其引入本文作为参考。如本文使用的，术语“氨基酸”或“氨基酸残基”指天然存在的L氨基酸或D氨基酸。关于氨基酸的常用的单和3字母缩写在本文中使用(Bruce Alberts等人，Molecular Biology of the Cell，GarlandPublishing，Inc.，New York(4th ed.2002))。20种常规氨基酸的立体异构体(例如，D氨基酸)，非天然的氨基酸例如α-，α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸以及其他非常规氨基酸也可以是对于本发明多肽的合适组分。非常规氨基酸的例子包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸，以及其他类似氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。在本文使用的多肽符号中，依照标准用法和常规，左手方向是氨基末端方向，并且右手方向是羧基末端方向。

类似地，除非另有说明，单链多核苷酸序列的左手末端是5’末端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5’方向。新生RNA转录物的5’到3’添加的方向称为转录方向。在DNA链上具有与RNA相同的序列且位于RNA转录物5’末端的5’的序列区称为“上游序列”。在DNA链上具有与RNA相同的序列且位于RNA转录物3’末端的3’的序列区称为“下游序列”。

当应用于多肽时，术语“相当大同一性”指2个肽序列当最佳比对，例如通过程序GAP或BESTFIT使用缺省缺口权重时，共有至少80％序列同一性，优选至少90％序列同一性，更优选至少95、96、97或98％序列同一性，且最优选至少99％序列同一性。优选地，不同的残基位置经由保守氨基酸置换而不同。如本文讨论的，抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的较小变化预期包含在本发明内，前提是氨基酸序列中的变化维持至少75％，更优选至少80％、90％、95％，且最优选99％。保守氨基酸置换是在其侧链方面相关的氨基酸家族内发生的那些。遗传编码的氨基酸一般分成家族：(1)酸性氨基酸(例如，天冬氨酸和谷氨酸)；(2)碱性氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)；(3)非极性氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)；和(4)无电荷极性氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸)。其他氨基酸家族包括但不限于：丝氨酸和苏氨酸是脂族羟基家族；天冬酰胺和谷氨酰胺是含酰胺的家族；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸是脂族家族；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是芳族家族；并且半胱氨酸和甲硫氨酸是含硫侧链家族。例如，预期用异亮氨酸或缬氨酸单独取代亮氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸、用丝氨酸取代苏氨酸，或使用结构上相关的氨基酸的类似氨基酸取代对所得到的分子的结合或特性将没有较大作用是合理的，特别是当取代不涉及构架位点内的氨基酸时。示例性保守氨基酸置换组包括但不限于：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、半胱氨酸-甲硫氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。

优选的氨基酸置换是：(1)减少对蛋白酶解的易感性，(2)减少对氧化的易感性，(3)改变对于形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(5)赋予或修饰此类类似物的其他物理化学或功能特性的那些。类似物可以包括除天然存在的肽序列之外的序列的各种突变蛋白质。例如，单或多重氨基酸置换(优选保守氨基酸置换)可以在天然存在的序列中进行(优选在形成分子间接触的结构域外的多肽部分中。保守氨基酸置换应当基本上不改变亲本序列的结构特征(例如，取代氨基酸应不趋于打破亲本序列中存在的螺旋，或破坏表征亲本序列的其他类型的二级结构)。领域公认的多肽二级和三级结构的例子在Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton，Ed.，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；

Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze，eds.，GarlandPublishing，New York，N.Y.(1991))；和Thornton等人Nature 354：105(1991)中描述，其引入本文作为参考。

如本文使用的，术语“类似物”指包括至少25个氨基酸的区段的多肽，其与天然存在的多肽的氨基酸序列的部分具有相当大同一性，并且具有天然存在的多肽的至少一种活性。一般地，多肽类似物包括相对于天然存在的序列的保守氨基酸置换(或添加和缺失)。类似物一般为至少20个氨基酸的长度，优选至少50个氨基酸的长度或更长，并且通常可长达全长天然存在的多肽。

肽类似物通常在药学工业中用作具有类似于模板肽的那些的特性的非肽药物。那些类型的非肽化合物称为“肽模拟物(peptidemimetics)”或“拟肽(peptidomimetics)”。Fauchere，J.Adv.DrugRes.15：29(1986)；Veber和Freidinger TINS第392页(1985)；和Evans等人，J.Med.Chem.30：1229(1987)，其引入本文作为参考。此类化合物通常借助于计算机化的分子建模来开发。结构上类似于治疗上有用的肽的肽模拟物可以用于产生等价的治疗或预防作用。一般地，拟肽在结构上类似于范例多肽(即，具有生物化学特性或药理学活性的多肽)，例如，人抗体，但通过本领域众所周知的方法任选由选自下列的键取代一个或多个肽键：--CH₂NH--、--CH₂S--、--CH₂-CH₂--、--CH＝CH--(顺式和反式)、--COCH₂--、--CH(OH)CH₂--和-CH₂SO--。用相同类型的D氨基酸系统置换共有序列的一个或多个氨基酸(例如D赖氨酸代替L赖氨酸)可以用于产生更稳定的肽。另外，包括一致序列或基本上相同的一致序列变化的约束肽可以通过本领域已知的方法产生(Rizo和Gierasch Ann.Rev.Biochem.61：387(1992)，引入本文作为参考)；例如，通过添加能够形成环化肽的分子内二硫键的内部半胱氨酸残基。

片段或类似物的优选的氨基和羧基末端存在于功能结构域的边界附近。结构和功能结构域可以通过比较核苷酸和/或氨基酸序列数据与公众可得或私有的序列数据库来鉴别。优选地，计算机化的比较法用于鉴别序列基序或预测的具有已知结构和/或功能的其他蛋白质中存在的蛋白质构象结构域。鉴别折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的(参见Bowie等人，Science 253：164(1991))。本领域技术人员可以识别可以依照本发明用于限定结构和功能结构域的序列基序和结构构象。

术语“特异性结合剂”指特异性结合靶的天然或非天然分子。特异性结合剂的例子包括但不限于，蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、脂质和小分子化合物。在某些实施方案中，特异性结合剂是抗体。在某些实施方案中，特异性结合剂是抗体的抗原结合区。

术语“EGFr特异性结合剂”指特异性结合EGFr多肽的任何部分的特异性结合剂。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂是特异性结合EGFr多肽的抗体。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂是特异性结合EGFr多肽的人抗体。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂是帕尼单抗。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂是对于EGFr多肽特异的抗体的抗原结合区。

术语“特异性结合”指特异性结合剂以比其结合非靶更大的亲和力结合靶的能力。在某些实施方案中，特异性结合指对于靶的结合亲和力为对于非靶的亲和力的至少10、50、100、250、500或1000倍。在某些实施方案中，亲和力通过亲和ELISA测定来测定。在某些实施方案中，亲和力通过BIAcore测定来测定。在某些实施方案中，亲和力通过动力学方法测定。在某些实施方案中，亲和力通过平衡/溶解法测定。在某些实施方案中，当抗体与一种或多种其识别的表位之间的解离常数≤1μM，优选≤100nM且最优选≤10nM时，抗体被说成特异性结合抗原。

“天然抗体和免疫球蛋白”通常是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由2个相同的轻(L)链和2个相同的重(H)链组成。每条轻链通过1个共价二硫键连接至重链，而二硫键数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间不同。每条重和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一个末端具有可变结构域(VH)，随后为多个恒定结构域。每条轻链在一个末端具有可变结构域(VL)并在其另一末端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一个恒定结构域对准，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对准。特定氨基酸残基被认为形成轻和重链可变结构域之间的界面(Chothia等人，J.Mol.Biol.186：651(1985；Novotny和Haber，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：4592(1985)；Chothia等人，Nature 342：877-883(1989))。

术语“抗体”指完整的抗体及其与完整抗体竞争特异性结合的抗原结合片段。“其抗原结合片段”指完整抗体分子的部分或片段，其中片段保留抗原结合功能。结合片段通过重组DNA技术，或通过完整抗体的酶促或化学切割例如通过用木瓜蛋白酶切割产生。结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fv、单链抗体(“scFv”)、Fd′和Fd片段。用于从单克隆抗体产生各种片段的方法是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，Pluckthun，1992，Immunol.Rev.130：151-188)。除“双特异性”或“双功能”抗体以外的抗体应当理解为其每个结合部位都是相同的。当过量抗体使与反受体结合的受体量减少至少约20％、40％、60％或80％时，并更通常大于约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％(如在体外竞争结合测定中测量的)时，抗体大大抑制受体与反受体的附着。

“分离的”抗体是已鉴别和分离和/或从其天然环境的组分中回收的抗体。其天然环境的污染物组分是可干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素及其他蛋白性(proteinaceous)或非蛋白性的溶质。在优选实施方案中，抗体将被纯化至(1)如通过Lowry法，以及通过使用转杯式测序仪的末端或内部氨基酸测序测定的，大于抗体的95重量％，或(2)通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染色至同质。分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。

术语“可变的”指可变结构域的某些部分在抗体序列中广泛不同并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的事实。然而，可变性在抗体的可变结构域各处不是平衡分布的。它集中在轻链和重链可变结构域中称为互补性决定区(CDRs)或高变区的3个区段内。可变结构域的较高度保守的部分称为构架(FR)。天然重和轻链的可变结构域各自包括由3个CDRs连接的4个FR结构，所述FR结构大部分采用β折叠构型，所述CDRs形成环连接，且在某些情况下形成β折叠结构的部分。每条链中的CDRs由FR区紧密保持在一起，并且与来自其他链的CDRs一起促成抗体的抗原结合部位的形成(参见，Kabat等人，(1991))。恒定结构域不直接涉及抗体与抗原的结合，但显示各种效应子功能，例如使抗体参与依赖抗体的细胞毒性。

“Fv”是包含完整抗原识别和结合部位的最小抗体片段。在双链Fv种类中，这个区域由一个重链和一个轻链可变结构域以紧密的非共价结合的二聚体组成。在单链Fv种类中，一个重链和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接，从而使得轻和重链可以以类似于双链Fv种类那种的“二聚”结构结合。正是这种构型使得每个可变结构域的3个CDRs相互作用以限定VH-VL二聚体表面上的抗原结合部位。总的来说，6个CDRs赋予抗体上的抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或只包括对抗原特异的3个CDRs的一半Fv)也具有识别并结合抗原的能力，尽管亲和力比完整结合部位低。

术语“高变区”在本文中使用时指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区一般包括来自“互补性决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-62(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的31-55(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5^th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的26-32((H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk J.Mol.Biol 196：901-917(1987))。“构架区”或“FR”残基如本文限定的是除高变区残基以外的那些可变结构域残基。

术语“互补性决定区”或“CDRs”在本文中使用时指免疫受体的部分，其使得与特异性配体接触并决定其特异性。免疫受体的CDRs是受体蛋白的最可变部分，从而给予受体其多样性，并且维持在受体可变结构域的远端的6个环上，3个环来自受体的2个可变结构域中的每一个。

“依赖抗体的细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcRs)的非特异性细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体并随后使靶细胞发生裂解。用于介导ADCC的原代细胞-NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的Fc表达概括于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol9：457-92(1991)第464页上的表3中。为了评估目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，例如美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的那种。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，目的分子的ADCC活性可以在体内评估，例如在动物模型中，例如Clynes等人，PNAS(USA)95：652-656(1988)中公开的那种。

术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白和/或T细胞受体的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由化学活性表面分子组例如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特异性三维结构特征，以及比电荷特征。

术语“试剂”在本文中用于指化合物、化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制成的提取物。

如本文使用的，术语“标记”或“标记的”指可检测标记的掺入，例如通过掺入放射性标记的氨基酸或附着至生物素部分的多肽，其可以通过标记的抗生物素蛋白检测(例如，包含可以通过光学或比色法检测的荧光标记或酶促活性的链霉抗生物素蛋白)。在某些情况下，标签或标记还可以是治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知且可以使用的。用于多肽的标记的例子包括但不限于下列：放射性同位素或放射性核素(例如，³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I)，荧光标记(例如，FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)，酶促标记(例如辣根过氧化物酶、β半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)，化学发光基团，生物素基，以及由次级报道分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、关于第二抗体的结合部位、金属结合结构域、附加表位)。在某些实施方案中，标记通过各种长度的间隔臂附着以减少潜在的空间位阻。

如本文使用的，术语“药物试剂或药物”指当适当地施用于患者时能够诱导所需治疗作用的化合物或组合物。如通过The McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(Parker，S.，Ed.，McGraw-Hill，SanFrancisco(1985))，引入本文作为参考)所例示的，本文的其他化学术语根据本领域常规用法使用。

术语“抗癌剂”在本文中用于指具有抑制人中的肿瘤发展或进展的功能特性的试剂，所述肿瘤特别是恶性(癌性)损害，例如癌、肉瘤、淋巴瘤或白血病。转移的抑制通常是抗癌剂的特性。

如本文使用的，“基本上纯的”指目标种类是存在的占优势种类(即，在摩尔基础上它比组合物中的任何其他个别种类更丰富)，并且优选地基本上纯的级分是其中目标种类构成存在的所有大分子种类的至少约50％(在摩尔基础上)的组合物。一般地，基本上纯的组合物将构成组合物中存在的所有大分子种类的超过约80％，更优选超过约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。最优选地，目标种类纯化至基本上同质(通过常规检测方法在组合物中不能检测到污染物种类)，其中组合物基本上由单个大分子种类组成。

术语“患者”和“受试者”包括人和动物受试者。

对治疗而言的术语“哺乳动物”和“动物”指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物，以及动物园、运动或宠物动物，例如狗、马、猫、母牛等。优选地，哺乳动物是人。

术语“疾病状态”指细胞或整个哺乳动物的生理学状态，其中细胞或身体功能、系统或器官的中断、停止或紊乱已发生。

术语“处理”或“治疗”指治疗性处理和预防性或防止性措施，其中目的是防止或减慢(减轻)不希望的生理学变化或紊乱，例如癌症的发展或扩散。对本发明而言，有利的或所需的临床结果包括但不限于，症状减轻、病变程度缩小、疾病状态稳定(即、不恶化)、疾病进展延迟或减慢、疾病状态改善或缓和、以及减轻(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可以指与如果不接受治疗的预期存活比较存活延长。需要治疗的那些包括已具有状况或病症的那些，以及易于具有状况或病症的那些，或其中状况或病症要被预防的那些。

治疗是“有效的”陈述指治疗对于治疗对其施用的疾病或状况治疗是有用的。

“病症”是将从一种或多种治疗获益的任何状况。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患正讨论的病症的那些病理学条件。本文要治疗的病症的非限制性例子包括良性和恶性肿瘤、白血病、和淋巴恶性肿瘤，特别是乳房、直肠、卵巢、胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、甲状腺、胰、前列腺或膀胱癌。依照本发明要治疗的优选病症是恶性肿瘤，包括结肠直肠癌、子宫颈癌(例如，子宫颈上皮内鳞状和腺状瘤形成)、肺癌、肾细胞癌(RCC)、食管瘤、上皮恶性肿瘤、和癌衍生的细胞系。

“与EGFr多肽相关的疾病或状况”包括选自下列的至少一种疾病或状况：由EGFr多肽引起的疾病或状况；由EGFr多肽加剧的疾病或状况；由EGFr多肽促成的疾病或状况；以及与EGFr多肽存在相关的疾病或状况。在某些实施方案中，与EGFr多肽相关的疾病或状况可以在不存在EGFr多肽的情况下存在。在某些实施方案中，EGFr多肽量的增加或减少引起与EGFr多肽相关的疾病或状况。在某些实施方案中，与EGFr多肽相关的疾病或状况可以由EGFr多肽量的增加或减少加剧。在某些实施方案中，与EGFr多肽相关的疾病或状况是癌症。“EGFr相关癌症”包括选自下列的至少一种癌症：由EGFr多肽引起的癌症，由EGFr多肽加剧的癌症，由EGFr多肽促成的癌症，以及与EGFr多肽相关的癌症。示例性EGFr相关癌症包括但不限于，结肠直肠癌、肺癌(包括但不限于，非小细胞肺癌)、乳癌、肾癌、结肠癌、胃癌、脑癌、膀胱癌、头与颈癌、卵巢癌和前列腺癌。

在“组合疗法”或“联合疗法”中，患者用EGFr特异性结合剂与化学治疗或抗癌剂和/或放射疗法组合治疗。在某些实施方案中，EGFr相关癌症在向标准第一和第二线疗法添加针对EGFr多肽的特异性结合剂的方案下治疗。在某些实施方案中，方案设计将致力于如通过肿瘤块的减少以及减少标准化学疗法的常用剂量的能力评估效力。在某些实施方案中，这些剂量减少将通过减少化学治疗剂的剂量相关毒性来允许另外和/或延长的疗法。

“单一疗法”指通过给患者施用EGFr特异性结合剂而不伴随化学治疗或抗癌剂或放射疗法来治疗病症。

某些示例性实施方案

测定EGFr基因拷贝数的某些示例性方法

在各种实施方案中，样品的EGFr基因拷贝数可以以本领域已知的多种方式进行测定。示例性方法包括但不限于，基于杂交的测定、基于扩增的测定、以及通过检测基因转录和蛋白质表达。

在某些实施方案中，基于杂交的测定用于测定样品中的EGFr基因拷贝数。在某些实施方案中，基于杂交的测定是荧光原位杂交(“FISH”)(参见，例如Angerer，Meth.Enzymol.152：649(1987)；Pinkel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：9138-42(1988))。在某些此类实施方案中，样品是固定的。在某些此类实施方案中，样品被处理以增加一种或多种靶核酸的易接近性。在某些此类实施方案中，样品暴露于特异性结合EGFr基因的一种或多种探针。在某些实施方案中，特异性结合EGFr基因的一种或多种探针是标记的。在某些实施方案中，样品也暴露于特异性结合至少一种参考核苷酸序列的一种或多种探针。在某些实施方案中，特异性结合至少一种参考核苷酸序列的一种或多种探针是标记的。在某些实施方案中，特异性结合EGFr基因的一种或多种探针用与特异性结合至少一种参考核苷酸序列的一种或多种探针的标记不同的标记进行标记。在某些实施方案中，至少一种参考核苷酸序列位于染色体7上。在某些实施方案中，至少一种参考核苷酸序列的2个拷贝存在于样品的每个细胞中。在某些实施方案中，至少一种参考核苷酸序列是着丝粒序列。在某些实施方案中，标记的探针通过荧光显微镜术检测。在某些实施方案中，EGFr基因拷贝数与至少一种参考核苷酸序列的拷贝数进行比较。在某些实施方案中，测试样品中的EGFr基因拷贝数相对于至少一种参考核苷酸序列的拷贝数增加预示EGFr特异性结合剂治疗在受试者的EGFr相关癌症治疗中将是有效的。

在某些实施方案中，测定样品中存在的核数目。在某些实施方案中，样品中存在的核数目通过荧光显微镜术测定。在某些实施方案中，EGFr基因拷贝数与样品中的核数目进行比较。在某些实施方案中，EGFr基因拷贝数与核数目的比率在正常样品中预期为2。在某些实施方案中，EGFr基因拷贝数与核数目的比率大于2预示EGFr特异性结合剂治疗在受试者的EGFr相关癌症治疗中将是有效的。

在某些实施方案中，基于杂交的测定是DNA印迹(参见，例如Sambrook和Russell，“Southern Hybridization”in Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3d ed.，Cold Spring Harbor Lab.Press：Cold SpringHarbor(2001))。在某些此类实施方案中，来自样品的核酸通过电泳分离。在某些实施方案中，将分离的核酸转移至固体支持体。示例性固体支持体包括但不限于，硝酸纤维素；尼龙；玻璃；石英；重氮化膜，包括但不限于，纸或尼龙；硅氧烷；聚甲醛；纤维素；乙酸纤维素；塑料，包括但不限于，聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯；纸；陶瓷；金属；准金属；半导体材料；以及形成凝胶的物质，包括但不限于，明胶、脂多糖、硅酸盐、琼脂糖和聚丙烯酰胺。在某些此类实施方案中，在固体支持体上分离的核酸暴露于特异性结合EGFr基因的一种或多种探针。在某些实施方案中，特异性结合EGFr基因的一种或多种探针是标记的。在某些实施方案中，在固体支持体上分离的核酸也暴露于特异性结合至少一种参考核苷酸序列的一种或多种探针。在某些实施方案中，特异性结合至少一种参考核苷酸序列的一种或多种探针是标记的。在某些实施方案中，特异性结合EGFr基因的一种或多种探针用与特异性结合至少一种参考核苷酸序列的一种或多种探针的标记不同的标记进行标记。在某些实施方案中，至少一种参考核苷酸序列位于染色体7上。在某些实施方案中，至少一种参考核苷酸序列的2个拷贝存在于样品的每个细胞中。在某些实施方案中，至少一种参考核苷酸序列是着丝粒序列。在某些实施方案中，标记的探针是检测的。在某些实施方案中，EGFr基因拷贝数与至少一种参考核苷酸序列的拷贝数进行比较。在某些实施方案中，测试样品中的EGFr基因拷贝数相对于至少一种参考核苷酸序列的拷贝数增加预示EGFr特异性结合剂治疗在受试者的EGFr相关癌症治疗中将是有效的。

在某些实施方案中，基于杂交的测定是夹心测定(参见，例如Hames和Higgins，Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，IRL Press(1985)；Gall等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.63：378-383(1969)；和John等人，Nature 223：582-587(1969))。在某些实施方案中，特异性结合EGFr基因的核酸固定化至固体支持体。示例性固体支持体包括但不限于，硝酸纤维素；尼龙；玻璃；石英；重氮化膜，包括但不限于，纸或尼龙；硅氧烷；聚甲醛；纤维素；乙酸纤维素；塑料，包括但不限于，聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯；纸；陶瓷；金属；准金属；半导体材料；以及形成凝胶的物质，包括但不限于，明胶、脂多糖、硅酸盐、琼脂糖和聚丙烯酰胺。示例性固定化类型包括但不限于，经由一个或多个官能团的共价结合或连接，包括但不限于，羧酸、醛、氨基、氰基、烯基、羟基和巯基。

在某些实施方案中，特异性结合EGFr基因的固定化核酸暴露于来自样品的核酸。在某些实施方案中，一种或多种EGFr基因与特异性结合EGFr基因的固定化核酸杂交。在某些实施方案中，洗涤步骤从固定化核酸中去除未杂交和/或误杂交的样品核酸。在某些实施方案中，EGFr基因：固定化核酸复合物暴露于EGFr基因特异性探针。在某些实施方案中，探针是标记的。在某些实施方案中，标记被定量检测。在某些实施方案中，样品中的EGFr基因拷贝数与那种样品中的至少一种参考序列拷贝数进行比较。在某些实施方案中，致瘤样品中的EGFr基因拷贝数与正常样品中的EGFr基因拷贝数进行比较。在某些实施方案中，恶性样品中的EGFr基因拷贝数与正常样品中的EGFr基因拷贝数进行比较。

在某些实施方案中，样品的EGFr基因拷贝数通过基于扩增的测定来测定。示例性基于扩增的测定包括但不限于，定量PCR(参见，例如Poropat等人，Clinical Chem.44：724-730，1998)，连接酶链反应(参见，例如，Wu等人，Genomics 4：560(1989)；Landegren等人，Science 241：1077(1988)；和Barringer等人，Gene89：117(1990))，转录扩增(参见，例如，Kwoh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：1173(1989))；竞争性PCR(参见，例如，Honda等人，J.Exp.Botany 53：1515-20(2002))；和自动维持序列扩增(参见，例如，Guatelli等人，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.87：1874(1990))。

在某些实施方案中，样品的EGFr基因拷贝数通过使用上文描述的任何方法定量样品中的EGFr基因转录物的量来测定。

在某些实施方案中，样品的EGFr基因拷贝数通过使用本领域已知的方法定量EGFr多肽表达来测定。示例性多肽定量方法包括但不限于，光吸收分析，包括但不限于，测量280nm处的吸光度；将样品提取物与标记的抗EGFr抗体温育，随后定量特异性结合的抗EGFr抗体；和层析，包括但不限于，电泳随后为光密度测定法或蛋白质印迹分析，以及与检测装置偶联的柱层析。

在某些实施方案中，基于阵列的系统用于测定样品的EGFr拷贝数。示例性基于阵列的系统包括但不限于，涉及基于杂交的测定、基于扩增的测定、基因转录定量和蛋白质表达定量的基于阵列的系统。某些示例性阵列方法在下文描述。

某些示例性阵列

在某些实施方案中，来自一个或多个受试者的样品中的EGFr基因拷贝数如本领域已知的使用微阵列技术测定(参见，例如，Pollack等人，Nature Genetics 23：41-46(1999)；Pastinen，Genome Res.7：606-614(1997)；Jackson，Nature Biotechnology 14：1685(1996)；Chee，Science 274：610(1995)；和Pinkel等人，Nature Genetics 20：207-211(1998))。在某些实施方案中，来自一个或多个受试者的2种或更多种样品中的EGFr基因拷贝数使用微阵列技术测定。在某些此类实施方案中，2种或更多种样品取自单个受试者。在某些此类实施方案中，2种或更多种样品中的一种来自EGFr相关肿瘤，并且2种或更多种样品中的另一种来自非致瘤性正常组织。

在某些实施方案中，样品在测定EGFr基因拷贝数之前不处理。在某些实施方案中，样品在测定EGFr基因拷贝数之前进行处理。在某些实施方案中，样品中的EGFr基因拷贝数在样品处理前后进行测定。

在某些实施方案中，提供了包括特异性结合EGFr基因的一种或多种分子的微阵列。在某些实施方案中，提供了包括与EGFr基因互补的一种或多种核酸的微阵列。在某些此类实施方案中，核酸从来自一个或多个受试者的一种或多种样品中提取，并且提取的核酸暴露于微阵列中与EGFr基因互补的一种或多种核酸，以形成EGFr基因杂交复合物。在某些此类实施方案中，定量微阵列中的EGFr基因杂交复合物的量。在某些此类实施方案中，定量通过使标记分子与EGFr基因杂交复合物结合并定量检测标记。在某些此类实施方案中，EGFr基因是标记的并且在EGFr基因杂交复合物形成后定量检测。

在某些实施方案中，使用微阵列技术筛选用于EGFr相关癌症的候选治疗。在某些此类实施方案中，测定在给患者施用治疗之前从患者获得的第一种样品中的EGFr基因拷贝数，并测定在治疗施用后某时从患者获得的第二种样品中的EGFr基因拷贝数。在某些此类实施方案中，比较第一种样品和第二种样品的EGFr基因拷贝数，其中第二种样品中的EGFr基因拷贝数相对于第一种样品的EGFr基因拷贝数减少表明治疗在患者中是有效的。

在某些实施方案中，使用微阵列技术评估一种或多种样品中的一种或多种EGFr多肽的存在或不存在。在某些此类实施方案中，首先从细胞或组织样品中提取mRNA并随后转换成cDNA，所述cDNA与微阵列杂交。在某些此类实施方案中，特异性结合微阵列的cDNA的存在或不存在是EGFr多肽的存在或不存在的指示。在某些此类实施方案中，一种或多种EGFr多肽的表达水平通过定量特异性结合微阵列的cDNA的量来评估。在某些此类实施方案中，细胞或组织在评估之前进行处理，并且还评估治疗影响一种或多种EGFr多肽表达的能力。

在某些实施方案中，提供了包括一种或多种EGFr多肽的微阵列(参见，例如，McBeath等人，Science，289：1760-1763，2000)。在某些实施方案中，使用EGFr多肽微阵列筛选针对一种或多种EGFr多肽的候选特异性结合剂。在某些实施方案中，提供了包括针对EGFr多肽的一种或多种特异性结合剂的微阵列。在某些实施方案中，评估一种或多种样品中的EGFr多肽的量。

某些示例性特异性结合剂和抗体

在某些实施方案中，提供了EGFr特异性结合剂。在某些此类实施方案中，EGFr特异性结合剂是抗体或其抗原结合片段。

在某些实施方案中，单克隆抗体可以使用由Kohler等人，Nature256：495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备。在某些实施方案中，单克隆抗体可以使用重组DNA方法制备(美国专利号4,816,567)。

在杂交瘤方法的某些实施方案中，免疫小鼠或其他合适的宿主动物，包括但不限于仓鼠或猕猴，以引出产生或能够产生抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫接种的蛋白质。在某些实施方案中，淋巴细胞可以被体外免疫。在某些实施方案中，淋巴细胞或富含B细胞的淋巴细胞通过电促细胞融合方法或通过使用合适的融合剂例如聚乙二醇与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103页，[AcademicPress，1996])。

在某些实施方案中，杂交瘤细胞在合适的培养基中接种并生长，所述培养基优选包括抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。在某些实施方案中，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的培养基一般将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。

在某些实施方案中，选择有效融合、通过选择的抗体产生性细胞支持抗体的稳定高水平生产、且对培养基例如HAT培养基敏感的骨髓瘤细胞。示例性骨髓瘤细胞系包括但不限于，鼠类骨髓瘤系，例如来源于从索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell DistributionCenter)，San Diego，California USA可获得的MOP-21和MC.-11小鼠肿瘤的那些，以及从美国典型培养物保藏中心，Rockville，MarylandUSA可获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。在某些实施方案中，人骨髓瘤和/或小鼠-人杂骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系用于生产人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63页，Marcel Dekker，Inc.，New York，[1987])。

在某些实施方案中，评估其中生长杂交瘤细胞的培养基针对抗原的单克隆抗体的生产。在某些实施方案中，由杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定进行测定。示例性结合测定包括但不限于，放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和Munson等人，Anal.Biochem.107：220(1980)的斯卡查德分析。

在某些实施方案中，在鉴别生产具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，细胞可以通过有限稀释操作亚克隆并通过标准方法生长(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles andPractice，第59-103页，Academic Press，1996)。用于这个目的的示例性培养基包括但不限于DMEM和RPMI-1640培养基。在某些实施方案中，杂交瘤细胞可以在动物中作为腹水瘤体内生长。

在某些实施方案中，由亚克隆分泌的单克隆抗体通过常规免疫球蛋白纯化操作从培养基、腹水或血清中适当地分离，所述纯化操作例如A蛋白-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。

在某些实施方案中，编码单克隆抗体的核酸使用常规操作容易地分离和测序(例如，通过使用能够特异性结合编码单克隆抗体的重和轻链的基因的寡核苷酸探针)。在某些此类实施方案中，杂交瘤细胞充当此类核酸的优选来源。在某些实施方案中，分离的多核苷酸可以置于表达载体内。在某些此类实施方案中，将表达载体转移至宿主细胞内，以获得重组宿主细胞中的单克隆抗体合成。示例性宿主细胞包括但不限于大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不以其他方式生产免疫球蛋白的骨髓瘤细胞。在某些实施方案中，核酸可以是修饰的，例如通过将免疫球蛋白编码序列共价结合至非免疫球蛋白多肽的所有或部分编码序列，从而生成“嵌合”或“杂交”抗体。

在某些实施方案中，用非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定结构域。在某些实施方案中，用非免疫球蛋白多肽取代抗体的一个抗原结合部位的可变结构域，以生成包括具有对于靶抗原的特异性的一个抗原结合部位和具有对于不同抗原的特异性的另一个抗原结合部位的嵌合二价抗体。

在某些实施方案中，嵌合或杂交抗体可以使用合成蛋白质化学中的已知方法体外制备，包括但不限于，涉及交联剂的那些。在某些此类实施方案中，免疫毒素可以使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建。用于这个目的的示例性试剂包括但不限于，亚氨基硫羟酸盐(iminothiolate)和4-巯基丁亚胺酸甲酯。

在某些实施方案中，提供了针对靶抗原的人抗体。在某些实施方案中，杂交瘤技术扩展至使用杂骨髓瘤(小鼠x人杂交骨髓瘤)作为融合配偶体来生成人抗体(参见，例如Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur，等人，Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications，第51-63页，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。在某些实施方案中，人抗体分泌性细胞可以通过用EB病毒(EBV)感染来无限增殖化(James和Bell，J.Immunol.Methods 100：5-40[1987])。在某些实施方案中，人B细胞的无限增殖化可以通过引入转化基因的限定组合完成(Hahn等人，Nature 400：464-468[1999])。

在某些实施方案中，在免疫接种后在不存在内源性免疫球蛋白生产的情况下能够生产人抗体谱的转基因动物(例如小鼠)用于制备人抗体(参见，例如，Jakobovits等人，Nature 362：255-258[1993]；Lonberg和Huszar，Int.Rev.Immunol.13：65-93[1995]；Fishwild等人，Nat.Biotechnol.14：845-851[1996]；Mendez等人，Nat.Genet.15：146-156[1997]；Green，J.Immunol.Methods 231：11-23[1999]；Tomizuka等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727[2000]；在Little等人，Immunol.Today 21：364-370[2000]中综述)。嵌合和种系突变型小鼠中抗体重链连接区(J_H)基因的纯合缺失导致内源性抗体生产的完全抑制已得到描述(Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2551-2555[1993])。此类种系突变型小鼠中人种系免疫球蛋白基因排列的转移导致在抗原攻击后产生人抗体(Jakobovits等人，Nature362：255-258[1993])。

Mendez等人，(Nature Genetics 15：146-156[1997])已生产了命名为“Xenomouse

II”的转基因小鼠品系，当其用抗原攻击时产生高亲和力的全人抗体。这通过将兆碱基人重链和轻链基因座种系整合到具有内源性J_H区段缺失的小鼠内达到。XenoMouse

II包含1,020kb人重链基因座，其含有大约66个V_H基因、完整D_H和J_H区以及3个不同的恒定区(μ、δ和γ)，并且还包含800kb人κ基因座，其包含32个Vκ基因、Jκ区段和Cκ基因。在某些实施方案中，在那些小鼠中生产的抗体在所有方面非常类似在人中可见的那些，包括基因重排、装配和谱。在某些实施方案中，由于阻止鼠类基因座中的基因重排的内源性J_H区段缺失，人抗体超过内源性抗体优先表达。

在某些实施方案中，包括人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如，XenomouseII(Abgenix，Inc.))可以用特定目的抗原例如EGFr多肽免疫。在某些实施方案中，筛选来自那些免疫动物的血清针对最初抗原的抗体反应性。在某些实施方案中，淋巴细胞从淋巴结或脾细胞中分离，并且可以通过选择CD 138阴性和CD19+细胞对于B细胞进一步浓缩。在某些实施方案中，如上文详述的，那些B细胞培养物(BCCs)与骨髓瘤细胞融合，以产生杂交瘤。在某些实施方案中，进一步筛选那些B细胞培养物针对最初抗原的反应性。此类筛选包括但不限于，ELISA、使用结合目的抗原的已知抗体的竞争测定以及体外结合表达抗原的瞬时转染的CHO细胞。在某些实施方案中，分泌目的抗体的单一B细胞通过特异性溶血噬斑测定鉴别。在某些此类实施方案中，靶向裂解的细胞是用抗原包被的羊红细胞(SRBCs)。在某些此类实施方案中，噬斑的形成表明靶细胞的特异性抗原介导的裂解，并且因此表明分泌目的免疫球蛋白和补体的B细胞培养物的存在。在某些此类实施方案中，噬斑中心的单个抗原特异性浆细胞可以分离并用于分离mRNA。

在某些实施方案中，编码分泌的抗体可变区的核酸可以使用逆转录酶PCR进行克隆。在某些实施方案中，克隆的核酸被进一步插入合适的表达载体内，例如载体盒例如pcDNA，或包含免疫球蛋白重和轻链的恒定结构域的pcDNA载体。在某些实施方案中，将产生的载体转染到宿主细胞内(即CHO细胞)，并在适当修饰的常规营养培养基中培养用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。

在某些实施方案中，使用噬菌体展示技术从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因谱体外生产人抗体和抗体片段(参见，例如McCafferty等人，Nature 348：552-553[1990]；在Kipriyanov和Little，Mol.Biotechnol.12：173-201[1999]中综述；Hoogenboom和Chames，Immunol.Today 21：371-378[2000])。在某些此类实施方案中，抗体V结构域基因符合读框地克隆到丝状噬菌体例如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因内，并在噬菌体颗粒表面上作为功能性抗体片段展示。在某些实施方案中，丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，并且基于抗体功能特性的选择还导致编码显示那些特性的抗体的基因的选择。噬菌体展示还可以各种形式进行，包括但不限于在下列文件中鉴别的那些：Johnson和Chiswell，Current Opinion inStructural Biology 3：564-571[(1993)]；Winter等人，Annu.Rev.Immunol.12：433-455[1994]；Dall′Acqua和Carter，Curr.Opin.Struct.Biol.8：443-450[1998]；和Hoogenboom和Chames，Immunol.Today21：371-378[2000]。用于噬菌体展示的V基因区段的来源包括但不限于，来源于免疫小鼠脾的V基因小型随机组合文库(Clackson等人，(Nature 352：624-628[1991])和来自未免疫人供体的V基因谱(Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffiths等人，EMBO J.12：725-734(1993))。

在某些实施方案中，在天然免疫应答中，抗体基因以高速率积聚突变(体细胞高变)。在某些实施方案中，引入的某些变化赋予较高的亲和力。在某些实施方案中，显示高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞在后续抗原攻击中优先复制并分化。在某些实施方案中，那个天然过程可以通过采用被称为“链改组”的技术(Marks等人，Bio/Technol.10：779-783[1992])模拟。在某些此类实施方案中，通过噬菌体展示获得的“第一”人抗体的亲和力可以通过下述方法改善：用从未免疫供体获得的V结构域基因的天然存在变体(谱)谱顺次替换重和轻链V区基因，允许生产具有nM范围内的亲和力的抗体和抗体片段。在某些实施方案中，如Waterhouse等人，Nucl.Acids Res.21：2265-2266(1993)所述构建非常大型的噬菌体抗体谱(也称为“所有文库之母(mother-of-all libraries)”)。在某些此类实施方案中，高亲和力人抗体直接从大型噬菌体文库中分离(参见，例如Griffiths等人，EMBOJ.13：3245-3260(1994))。在某些实施方案中，可以使用基因改组从啮齿类动物抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与原始啮齿类动物抗体类似的亲和力和特异性。在某些此类实施方案中，通过噬菌体展示技术获得的啮齿类动物抗体的重或轻链V结构域基因替换为人V结构域基因谱，从而生成啮齿类动物-人嵌合体(也称为“表位印记”)。在某些实施方案中，通过抗原选择可变区导致能够恢复功能性抗原结合部位的人可变区的分离，即表位支配(印记)配偶体的选择。在某些实施方案中，当重复该过程以替换剩余的啮齿类动物V结构域时，获得没有啮齿类动物来源的构架或CDR残基的人抗体(参见，例如PCR专利申请WO 93/06213)。

某些示例性治疗

在某些实施方案中，抗EGFr特异性结合剂通过包含在EGFr特异性结合剂治疗中可以具有治疗用途。在本申请中，当讨论EGFr特异性结合剂治疗疾病或状况的用途时，此类用途可以包括EGFr特异性结合剂自身；包括EGFr特异性结合剂的组合物；和/或包括EGFr特异性结合剂以及一种或多种另外活性成分的组合治疗的用途。当EGFr特异性结合剂用于“治疗”疾病或状况时，此类治疗可以包括或不包括疾病或状况的预防。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂可以阻断EGFr受体与其配体EGF的相互作用。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂可以激活EGF受体。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂可以组成型地激活EGF受体。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂可以阻断EGF受体的激活。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂可以组成型地阻断EGF受体的激活。

在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂单独施用。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂在至少一种其他治疗剂施用之前施用。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂与至少一种其他治疗剂施用同时施用。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂在至少一种其他治疗剂施用之后施用。示例性治疗剂包括但不限于至少一种其他的癌症治疗剂。示例性癌症治疗剂包括但不限于放射疗法和化学疗法。

在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂药物组合物可以在组合治疗中施用，即，与其他试剂组合。在某些实施方案中，组合治疗包括与至少一种抗血管生成剂组合的EGFr特异性结合剂。示例性试剂包括但不限于，体外合成制备的化学组合物、抗体、抗原结合区、放射性核素及其组合和缀合物。在某些实施方案中，试剂可以充当激动剂、拮抗剂、变构调节剂或毒素。在某些实施方案中，试剂可以用于抑制或刺激其靶(例如，受体或酶激活或抑制)，并且从而促进细胞死亡或使细胞生长停滞。

示例性化学治疗处理包括但不限于，抗癌剂，包括但不限于，烷化剂包括但不限于：氮芥，包括但不限于，双氯乙基甲胺，环磷酰胺，异磷酰胺，美法仑和苯丁酸氮芥；亚硝基脲，包括但不限于，卡莫司汀BCNU，罗莫司汀，CCNU和司莫司汀，甲基-CCNU；Temodal^TM，替莫唑胺(temozolamide)；氮丙啶/甲基蜜胺，包括但不限于，三乙撑蜜胺(thriethylenemelamine)(TEM)，三乙烯硫代磷酰胺，噻替派，三胺硫磷，六甲三聚氰胺(HMM)，和六甲蜜胺；烷基磺酸酯，包括但不限于白消安；三嗪，包括但不限于氮烯咪胺(DTIC)；抗代谢物，包括但不限于，叶酸类似物例如氨甲蝶呤和曲美沙特；嘧啶类似物，包括但不限于，5-氟尿嘧啶(5FU)，氟尿脱氧核苷，吉西他滨，阿糖胞苷(AraC，阿糖胞嘧啶)，5-氮杂胞苷，和2，2′-双氟脱氧胞苷；嘌呤类似物，包括但不限于6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，硫唑嘌呤，2’-去氧助间型霉素(喷司他丁)，红羟基壬基腺嘌呤(erythrohydroxynonyladenine)(EHNA)，磷酸氟达拉滨，克拉利平，和2-氯脱氧腺苷(2-CdA)；自然产物，包括但不限于，抗有丝分裂药物例如紫杉醇；长春花生物碱，包括但不限于长春碱(VLB)，长春新碱和长春烯碱；泰索帝；磷雌氮芥和磷酸雌二醇氮芥；足叶草乙甙(ppipodophylotoxins)，包括但不限于，依托泊苷和替尼泊苷；抗生素，包括但不限于，放线菌素D，道诺霉素，柔红霉素，阿霉素，米托蒽醌，伊达比星，博来霉素，普卡霉素，光辉霉素，丝裂霉素C，和放线菌素；酶，包括但不限于，L-天冬酰胺酶；生物应答调节剂，包括但不限于，干扰素-α，IL-2，G-CSF和GM-CSF；脱氧土霉素(doxycyckine)；盐酸依立替康；混杂试剂，包括但不限于，铂配位络合物例如顺铂和卡铂；蒽二酮，包括但不限于米托蒽醌；取代的脲，包括但不限于，羟基脲；甲肼衍生物，包括但不限于，N-甲肼(MIH)和甲基苄肼；肾上腺皮质抑制剂，包括但不限于，米托坦(邻，对′-DDD)和氨鲁米特；激素和拮抗剂，包括但不限于，肾上腺皮质类固醇拮抗剂例如强的松和等价物，地塞米松和氨鲁米特；Gemzar^TM，吉西他滨；黄体酮，包括但不限于，己酸羟孕酮，乙酸甲羟孕酮和乙酸甲地孕酮；雌激素，包括但不限于，己烯雌酚和乙炔雌二醇等价物；抗雌激素，包括但不限于，他莫昔芬；雄激素，包括但不限于，丙酸睾丸酮和氟甲睾酮/等价物；抗雄激素物质，包括但不限于，氟他胺，促性腺激素释放激素类似物和醋酸亮丙瑞林；奥沙利铂，Eloxatin，卡培他滨，Xeloda，培美曲塞(pemetrexed)，Alimta

，来曲唑，Femara，阿纳托唑，Arimidex

，和非类固醇抗雄激素物质，包括但不限于，氟他胺。

可以与EGFr特异性结合剂一起施用的示例性癌症治疗包括但不限于，靶向疗法。靶向治疗的例子包括但不限于，治疗性抗体的使用。示例性治疗性抗体包括但不限于，小鼠、小鼠-人嵌合、CDR-嫁接的、人源化和人抗体，以及合成抗体，包括但不限于，通过筛选抗体文库选择的那些。示例性抗体包括但不限于，结合细胞表面蛋白Her2、CDC20、CDC33和黏蛋白样糖蛋白的那些，并任选对显示这些蛋白质的肿瘤细胞诱导抑制细胞和/或细胞毒性作用。示例性抗体还包括但不限于，HERCEPTIN^TM-曲妥珠单抗(trastuzumab)，其可以用于治疗乳癌和其他形式的癌症；RITUXAN^TM-利妥昔单抗(rituximab)，ZEVALIN^TM-替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)，和LYMPHOCIDE^TM-依帕珠单抗(epratuzumab)，其可以用于治疗非何杰金氏淋巴瘤和其他形式的癌症；GLEEVEC^TM-甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)，其可以用于治疗慢性髓细胞样白细胞和胃肠道间质瘤；和BEXXAR^TM-碘131托西莫单抗(tositumomab)，其可以用于治疗非何杰金氏淋巴瘤。某些示例性抗体还包括ERBITUX^TM；IMC-C225；lressa^TM；吉非替尼(gefitinib)；TARCEVA^TM-ertinolib；KDR(激酶结构域受体)抑制剂；抗VEGF抗体和拮抗剂(例如Avastin^TM和VEGAF-TRAP)；抗VEGF受体抗体和抗原结合区域；抗Ang-1和Ang-2抗体和抗原结合区域；针对Tie-2以及其他Ang-1和Ang-2受体的抗体；Tie-2配体；针对Tie-2激酶抑制剂的抗体；和Campath

-阿仑单抗(alemtuzumab)。在某些实施方案中，癌症治疗剂是选择性诱导肿瘤细胞中细胞凋亡的其他多肽，包括但不限于，TNF相关多肽例如TRAIL。

在某些实施方案中，癌症治疗剂是减少血管发生的抗血管生成剂。某些此类试剂包括但不限于，ERBITUX^TM-IMC-C225；KDR(激酶结构域受体)抑制剂(例如，特异性结合激酶结构域受体的抗体和抗原结合区域)；抗VEGF剂(例如，特异性结合VEGF的抗体或抗原结合区域，或可溶性VEGF受体或其配体结合区域)例如AVASTIN^TM或VEGF-TRAP^TM；抗VEGF受体剂(例如，与其特异性结合的抗体或抗原结合区域)；EGFR抑制剂例如IRESSA^TM-吉非替尼，TARCEVA^TM-埃罗替尼(erlotinib)，抗Ang-1和Ang-2剂(例如，与其或其受体特异性结合的抗体或抗原结合区域，例如Tie2/Tek)；以及抗Tie-2激酶抑制剂(例如，与其特异性结合的抗体或抗原结合区域)。在某些实施方案中，药物组合物还可以包括特异性结合并抑制生长因子活性的一种或多种试剂(例如，抗体、抗原结合区域或可溶性受体)，例如肝细胞生长因子(HGF，也称为分散因子)拮抗剂，以及特异性结合其受体“c-met”的抗体或抗原结合区域。

示例性抗血管生成剂包括但不限于，Campath、IL-8、B-FGF、Tek拮抗剂(Ceretti等人，美国专利申请公开号2003/0162712；美国专利号6,413,932)；抗TWEAK剂(例如，特异性结合抗体或抗原结合区域，或可溶性TWEAK受体拮抗剂；参见，例如Wiley，美国专利号6,727,225)；拮抗整联蛋白与其配体结合的ADAM解联蛋白结构域(Fanslow等人，美国专利申请公开号2002/0042368)；特异性结合抗eph受体和/或抗肝配蛋白抗体或抗原结合区域(美国专利号5,981,245；5,728,813；5,969,110；6,596,852；6,232,447；6,057,124；及其专利家族成员)；抗PDGF-BB拮抗剂(例如，特异性结合抗体或抗原结合区域)以及特异性结合PDGF-BB配体的抗体或抗原结合区域，和PDGFR激酶抑制剂(例如，与其特异性结合的抗体或抗原结合区域)。

示例性抗血管生成/抗肿瘤剂包括但不限于，SF-7784(Pfizer，USA)；西仑吉肽(cilengitide)(Merck KgaA，Germany，EPO 770622)；pegaptanib octasodium(Gilead Sciences，USA)；Alphastatin(BioActa，UK)；M-PGA(Celgene，USA，美国专利号5,712,291)；伊洛马司他(ilomastat)(Arriva，USA，美国专利号5,892,112)；emaxanib(Pfizer，USA，美国专利号5,792,783)；伐他拉尼(vatalanib)(Novartis，Switzerland)；2-甲氧雌二醇(EntreMed，USA)；TLC ELL-12(Elan，Ireland)；乙酸阿奈可他(anecortave acetale)(Alcon，USA)；α-D148 Mab(Amgen，USA)；CEP-7055(Cephalon，USA)；抗-Vn Mab(Crucell，Netherlands)；DAC：抗血管生成(ConjuChem，Canada)；Angiocidin(InKine Pharmaceutical，USA)；KM-2550(KyowaHakko，Japan)；SU-0879(Pfizer，USA)；CGP-79787(Novartis，Switzerland，EP 970070)；ARGENT技术(Ariad，USA)；YIGSR-Strealth(Johnson&Johnson，USA)；纤维蛋白原-E片段(BioActa，UK)；血管发生抑制剂(Trigen，UK)；TBC-1635(Encysive Pharmaceuticals，USA)；SC-236(Pfizer，USA)；ABT-567(Abbott，USA)；Metastatin(EntreMed，USA)；血管发生抑制剂(Tripep，Sweden)；乳腺丝抑蛋白(Sosei，Japan)；2-甲氧雌二醇(Oncology Sciences Corporation，USA)；ER-68203-00(IVAX，USA)；Benefin(Lane Labs，USA)；Tz-93(Tsumura，Japan)；TAN-1120(Takeda，Japan)；FR-111142(Fujisawa，Japan，JP 02233610)；血小板因子4(RepliGen，USA，EP 407122)；血管内皮生长因子拮抗剂(Borean，Denmark)；temsirolimus(CCI-779)(University of South Carolina，USA)；贝伐单抗(bevacizumab)(pINN)(Genentech，USA)；血管发生抑制剂(SUGEN，USA)；XL 784(Exelixis，USA)；XL 647(Exelixis，USA)；Mab，α5β3整联蛋白，Vitaxin和第二代Vitaxin(AppliedMolecular Evolution，USA和MedImmune USA)；Retinostat

基因治疗(Oxford BioMedica，UK)；盐酸恩扎妥林(enzastaurin)(USAN)(Lilly，USA)；CEP 7055(Cephalon，USA和Sanofi-Synthelabo，France)；BC1(Genoa Institute of Cancer Research，Italy)；血管发生抑制剂(Alchemia，Australia)；VEGF拮抗剂(Regeneron，USA)；rBPI21和BPI-衍生的抗血管生成剂(XOMA，USA)；PI88(Progen，Australia)；西仑吉肽(pINN)(Merck KgaA，Germany；Munich TechnicalUniversity，Germany；Scripps Clinic and Research Foundation，USA)；西妥昔单抗(cetuximab)(INN)(Aventis，France)；AVE 8062(Ajinomoto，Japan)；AS 1404(Cancer Research Laboratory，NewZealand)；SG 292(Telios，USA)；内皮抑制素(Boston Children’sHospital，USA)；2-甲氧雌二醇(Boston Childrens Hospital，USA)；ZD 6474(AstraZeneca，UK)；ZD 6126(Angiogene Pharmaceuticals，UK)；PPI 2458(Praecis，USA)；AZD 9935(AstraZeneca，UK)；AZD 2171(AstraZeneca，UK)；伐他拉尼(pINN)(Novartis，Switzerland和Schering AG，Germany)；组织因子途径抑制剂(EntraMed，USA)；pegaptanib(Pinn)(Gilead Sciences，USA)；xanthorrhizol(YonseiUniversity，South Korea)；基于基因的疫苗，VEGF-2(Scripps Clinicand Research Foundation，USA)；SPV5.2(Supratek，Canada)；SDX103(University of California at San Diego，USA)；PX 478(Pro1X，USA)；Metastatin(EntreMed，USA)；肌钙蛋白I(Harvard University，USA)；SU 6668(SUGEN，USA)；OXI 4503(OXiGENE，USA)；o-胍(Dimensional Pharmaceuticals，USA)；motuporamine C(BritishColumbia University，Canada)；CDP 791(Celltech Group，UK)；阿替莫德(atiprimod)(pINN)(GlaxoSmithKline，UK)；E 7820(Eisai，Japan)；CYC 381(Harvard University，USA)；AE 941(Aeterna，Canada)；FGF2癌症疫苗(EntreMed，USA)；尿激酶纤溶酶原激活物抑制剂(Dendreon，USA)；oglufanide(pINN)(Melmotte，USA)；HIF-1α抑制剂(Xenova，UK)；CEP 5214(Cephalon，USA)；BAY RES 2622(Bayer，Germany)；Angiocidin(InKine，USA)；A6(Angstrom，USA)；KR 31372(Korean ResearchInstitute of Chemical Technology，South Korea)；GW 2286(GlaxoSmithKline，UK)；EHT 0101(ExonHit，France)；CP 868596(Pfizer，USA)；CP 564959(OSI，USA)；CP 547632(Pfizer，USA)；786034(GlaxoSmithKline，UK)；KRN 633(Kirin Brewery，Japan)；药物递送系统，眼内，2-甲氧雌二醇(EntreMed，USA)；anginex(Maastricht University，Netherlands，和Minnesota University，USA)；ABT 510(Abbott，USA)；AAL 993(Novartis，Switzerland)；VEGI(ProteomTech，USA)；肿瘤坏死因子α抑制剂(National Instituteon Aging，USA)；SU 11248(Pfizer，USA和SUGEN USA)；ABT518(Abbott，USA)；YH16(Yantai Rongchang，China)；S-3APG(Boston Childrens Hospital，USA和EntreMed，USA)；Mab，KDR(ImClone Systems，USA)；Mab，α5β1(Protein Design，USA)；KDR激酶抑制剂(Celltech Group，UK，和Johnson & Johnson，USA)；GFB 116(South Florida University，USA和Yale University，USA)；CS 706(Sankyo，Japan)；考布他汀(combretastatin)A4前体药物(Arizona State University，USA)；软骨素酶AC(IBEX，Canada)；BAY RES 2690(Bayer，Germany)；AGM 1470(Harvard University，USA，Takeda，Japan，和TAP，USA)；AG 13925(Agouron，USA)；四硫钼酸盐(University of Michigan，USA)；GCS 100(Wayne StateUniversity，USA)；CV 247(Ivy Medical，UK)；CKD 732(ChongKun Dang，South Korea)；Mab，血管内皮生长因子(Xenova，UK)；伊索拉定(INN)(Nippon Shinyaku，Japan)；RG 13577(Aventis，France)；WX 360(Wilex，Germany)；角鲨胺(squalamine)(pINN)(Genaera，USA)；RPI 4610(Sirna，USA)；半乳岩藻聚糖硫酸盐(galacto fucan sulphate)(Marinova，Australia)；类肝素酶抑制剂(InSight，Israel)；KL 3106(Kolon，South Korea)；和厚朴酚(EmoryUniversity，USA)；ZK CDK(Shering AG，Germany)；ZK Angio(Schering AG，Germany)；ZK 229561(Novartis，Switzerland，和Schering AG，Germany)；XMP 300(XOMA，USA)；VGA 1102(Taisho，Japan)；VEGF受体调节剂(Pharmacopeia，USA)；VE-钙粘着蛋白-2拮抗剂(ImClone Systems，USA)；血管形成抑制素(National Institutesof Health，USA)；疫苗，Flk-1(ImClone Systems，USA)；TZ 93(Tsumura，Japan)；TumStatin(Beth Israel Hospital，USA)；截短的可溶性FLT1(血管内皮生长因子受体1)(Merck & Co，USA)；

Tie-2配体(Regeneron，USA)；和血小板反应蛋白1抑制剂(AlleghenyHealth，Education and Research Foundation，USA)。

某些癌症治疗剂包括但不限于：沙立度胺和沙立度胺类似物(N-(2，6-二氧-3-哌啶基)苯邻二甲酰亚胺)；tecogalan sodium(硫酸化多糖肽聚糖)；TAN 1120(8-乙酰基-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-1-甲氧基-10-[[八氢-5-羟基-2-(2-羟丙基)-4，10-二甲基吡喃[3，4-d]-1，3，6-dioxazocin-8-基]氧]-5，1 2-并四苯二酮)；suradista(7，7′-[羰基二[亚氨基(1-甲基-1H-吡咯-4，2-二基)羰基亚氨基(1-甲基-1 H-吡咯-4，2-二基)羰基亚氨基]]二-1，3-萘二磺酸四钠盐)；SU 302；SU 301；SU 1498((E)-2-氰基-3-[4-羟基-3，5-二(1-甲基乙基)苯基]-N-(3-苯丙基)-2-丙烯酰胺(pro penamide))；SU 1433(4-(6，7-二甲基-2-喹喔啉基)-1，2-苯二醇)；ST 1514；SR 25989；可溶性Tie-2；SERM衍生物；Pharmos；司马沙尼(semaxanib)(pINN)(3-[(3，5-二甲基-1H-吡咯-2-基)亚甲基]-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮)；S 836；RG 8803；RESTIN；R 440(3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-4-(1-甲基-6-硝基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2，5-二酮)；R 123942(1-[6-(1，2，4-噻二唑-5-基)-3-哒嗪基]-N-[3-(三氟甲基)苯基]-4-哌啶胺)；脯氨酰羟化酶抑制剂；进展升高的基因；普马司他(prinomastat)(INN)((S)-2，2-二甲基-4-[[对-(4-吡啶氧)苯基]磺酰]-3-硫代吗啉羧肟酸(thiomorpholinecarbohyd roxamic acid))；NV 1030；NM 3(8-羟基-6-甲氧基-α-甲基-1-氧-1H-2-苯并吡喃-3-乙酸)；NF 681；NF 050；MIG；METH 2；METH 1；manassantin B(α-[1-[4-[5-[4-[2-(3，4-二甲氧基苯基)-2-羟基-1-甲基乙氧基]-3-甲氧基苯基]四氢-3，4-二甲基-2-呋喃基]-2-甲氧基苯氧基]乙基]-1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-甲醇)；KDR单克隆抗体；α5β3整联蛋白单克隆抗体；LY 290293(2-氨基-4-(3-吡啶基)-4H-萘并[1，2-b]吡喃-3-腈)；KP 0201448；KM 2550；整联蛋白-特异性肽；INGN 401；GYKI 66475；GYKI 66462；greenstatin(101-354-纤溶酶原(人))；关于类风湿性关节炎、前列腺癌、卵巢癌、神经胶质瘤、内皮抑制素、结肠直肠癌、ATF BTPI、抗血管发生基因、血管发生抑制剂或血管发生的基因治疗；明胶酶抑制剂，FR111142(4，5-二羟基-2-己烯酸5-甲氧基-4-[2-甲基-3-(3-甲基-2-丁烯基)环氧乙烷]-1-氧杂螺[2.5]辛-6-基酯)；伏芬尼美司(pINN)(S)-α-氨基-3-羟基-4-(羟甲基)苯乙酸)；纤连蛋白拮抗剂(1-乙酰基-L-脯氨酰-L-组氨酰-L-丝氨酰-L-半胱氨酰-L-天冬酰胺(aspartamide))；成纤维细胞生长因子受体抑制剂；成纤维细胞生长因子拮抗剂；FCE 27164(7，7′-[羰基二[亚氨基(1-甲基-1H-吡咯-4，2-二基)羰基亚氨基(1-甲基-1H-吡咯-4，2-二基)羰基亚氨基]]二-1，3，5-萘三磺酸六钠盐)；FCE 26752(8，8′-[羰基二[亚氨基(1-甲基-1H-吡咯-4，2-二基)羰基亚氨基(1-甲基-1H-吡咯-4，2-二基)羰基亚氨基]]二-1，3，6-萘三磺酸)；内皮单核细胞激活多肽II；VEGFR反义寡核苷酸；抗血管生成和营养因子；ANCHOR血管生成抑制(angiostatic)剂；内皮抑制素；Del-1血管生成蛋白质；CT 3577；contortrostatin；CM 101；软骨素酶AC；CDP 845；CanStatin；BST 2002；BST 2001；BLS 0597；BIBF 1000；ARRESTIN；apomigren(1304-1388-XV型胶原(人基因COL15A1α1-链前体))；血管生长抑制剂(angioinhibin)；aaATIII；A36；乙酸9α-氟甲羟孕酮((6-α)-17-(乙酰氧基)-9-氟-6-甲基-孕-4-烯-3，20-二酮)；2-甲基-2-苯并[c]吡咯酮(phthalimidino)-戊二酸(2-(1，3-二氢-1-氧-2H-异吲哚-2-基)-2-甲基戊二酸)；钇90标记的单克隆抗体BC-1；司马沙尼(3-(4，5-二甲基吡咯-2-基亚甲基)吲哚满-2-酮)(C15 H14 N2O)；PI 88(磷酸甘露戊糖硫酸酯)；Alvocidib(4H-1-苯并吡喃-4-酮，2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-(3-羟基-1-甲基-4-哌啶基)-顺式-(-)-)(C21 H20Cl NO5)；E7820；SU 11248(5-[3-氟-2-氧-1，2-二氢二氢亚吲哚-(3Z)-基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基乙基)酰胺)(C22H27 F N4 O2)；角鲨胺(胆甾烷-7，24-二醇，3-[[3-[(4-氨丁基)氨丙基]氨基]-，24-(硫酸氢)，(3.β.，5.α.，7.α.)-)(C34 H65 N3 O5S)；铬黑T；AGM 1470(氨基甲酸，(氯乙酰基)-，5-甲氧基-4-[2-甲基-3-(3-甲基-2-丁烯基)环氧乙烷]-1-氧杂螺[2，5]辛-6-基酯，[3R-[3α，4α(2R，3R)，5β，6β]])(C19 H28 Cl NO6)；AZD 9935；BIBF1000；AZD 2171；ABT 828；KS-白细胞介素-2；子宫珠蛋白；A6；NSC 639366(1-[3-(二乙氨基)-2-羟丙基氨基]-4-(环氧乙烷-2-基甲基氨基)蒽醌延胡索酸酯(fumerate))(C24 H29 N3 O4.C4 H4 O4)；ISV 616；抗-ED-B融合蛋白；HUI 77；肌钙蛋白I；BC-1单克隆抗体；SPV 5.2；ER 68203；CKD 731(3-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2(E)-丙烯酸(3R，4S，5S，6R)-4-[2(R)-甲基-3(R)-3(R)-(3-甲基-2-丁烯基)环氧乙烷-2-基]-5-甲氧基-1-氧杂螺[2.5]辛-6-基酯)(C28 H38O8)；IMC-1C11；aaATIII；SC7；CM 101；Angiocol；Kringle 5；CKD 732(3-[4-[2-(二甲氨基)乙氧基]苯基]-2(E)-丙烯酸)(C29H41 N O6)；U 995；Canstatin；SQ 885；CT 2584(1-[11-(十二烷基氨基)-10-羟基十一烷基]-3，7-二甲基黄嘌呤)(C30 H55 N5 O3)；Salmosin；EMAP II；TX 1920(1-(4-甲基哌嗪)-2-(2-硝基-1H-1-咪唑基)-1-乙酮(ethanone))(C10 H15 N5 O3)；α-vβ-x抑制剂；CHIR 11509(N-(1-丙炔基)甘氨酰-[N-(2-萘基)]甘氨酰-[N-(氨甲酰甲基)]甘氨酸二(4-甲氧基苯基)甲基酰胺)(C36 H37 N5O6)；BST 2002；BST 2001；B 0829；FR 111142；4，5-二羟基-2(E)-己烯酸(3R，4S，5S，6R)-4-[1(R)，2(R)-环氧-1，5-二甲基-4-己烯基]-5-甲氧基-1-氧杂螺[2.5]辛-6-基酯(C22 H34 O7)；和激酶抑制剂，包括但不限于，N-(4-氯苯基)-4-(4-吡啶甲基)-1-酞嗪胺(phthalazinamine)；4-[4-[[[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基]羰基]氨基]苯氧基]-N-甲基-2-吡啶羧酰胺；N-[2-(二乙氨基)乙基]-5-[(5-氟-1，2-二氢-2-氧-3H-二氢亚吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酰胺；3-[(4-溴-2，6-二氟苯基)甲氧基]-5-[[[[4-(1-吡咯烷基)丁基]氨基]羰基]氨基]-4-异噻唑羧酰胺；N-(4-溴-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[(1-甲基-4-哌啶基)甲氧基]-4-喹唑啉胺；3-[5，6，7，13-四氢-9-[(1-甲基乙氧基)甲基]-5-氧-12H-茚并[2，1-a]吡咯并[3，4-c]咔唑-12-基]丙基酯N，N-二甲基-甘氨酸；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-

唑基]甲基]硫代]-2-噻唑基]-4-哌啶羧酰胺；N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]-6-[5-[[[2-(甲磺酰)乙基]氨基]甲基]-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺；4-[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-苯基]苯甲酰胺；N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-4-喹唑啉胺；N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺；N-(3-((((2R)-1-甲基-2-吡咯烷基)甲基)氧)-5-(三氟甲基)苯基)-2-((3-(1，3-

唑-5-基)苯基)氨基)-3-吡啶羧酰胺；2-(((4-氟苯基)甲基)氨基)-N-(3-((((2R)-1-甲基-2-吡咯烷基)甲基)氧)-5-(三氟甲基)苯基)-3-吡啶羧酰胺；N-[3-(氮杂环丁烷-3-基甲氧基)-5-三氟甲基-苯基]-2-(4-氟-苄氨基)-烟酰胺；6-氟-N-(4-(1-甲基乙基)苯基)-2-((4-吡啶基甲基)氨基)-3-吡啶羧酰胺；2-((4-吡啶基甲基)氨基)-N-(3-(((2S)-2-吡咯烷基甲基)氧)-5-(三氟甲基)苯基)-3-吡啶羧酰胺；N-(3-(1，1-二甲基乙基)-1 H-吡唑-5-基)-2-((4-吡啶基甲基)氨基)-3-吡啶羧酰胺；N-(3，3-二甲基-2，3-二氢-1-苯并呋喃-6-基)-2-((4-吡啶基甲基)氨基)-3-吡啶羧酰胺；N-(3-((((2S)-1-甲基-2-吡咯烷基)甲基)氧)-5-(三氟甲基)苯基)-2-((4-吡啶基甲基)氨基)-3-吡啶羧酰胺；2-((4-吡啶基甲基)氨基)-N-(3-((2-(1-吡咯烷基)乙基)氧)-4-(三氟甲基)苯基)-3-吡啶羧酰胺；N-(3，3-二甲基-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基)-2-((4-吡啶基甲基)氨基)-3-吡啶羧酰胺；N-(4-(五氟乙基)-3-(((2S)-2-吡咯烷基甲基)氧)苯基)-2-((4-吡啶基甲基)氨基)-3-吡啶羧酰胺；N-(3-((3-氮杂环丁烷基甲基)氧)-5-(三氟甲基)苯基)-2-((4-吡啶基甲基)氨基)-3-吡啶羧酰胺；N-(3-(4-哌啶氧)-5-(三氟甲基)苯基)-2-((2-(3-吡啶基)乙基)氨基)-3-吡啶羧酰胺；N-(4，4-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-7-基)-2-(1H-吲唑-6-基氨基)-烟酰胺；2-(1H-吲唑-6-基氨基)-N-[3-(1-甲基吡咯烷-2-基甲氧基)-5-三氟甲基-苯基]-烟酰胺；N-[1-(2-二甲氨基-乙酰基)-3，3-二甲基-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基]-2-(1H-吲唑-6-基氨基)-烟酰胺；2-(1H-吲唑-6-基氨基)-N-[3-(吡咯烷-2-基甲氧基)-5-三氟甲基-苯基]-烟酰胺；N-(1-乙酰基-3，3-二甲基-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基)-2-(1H-吲唑-6-基氨基)-烟酰胺；N-(4，4-二甲基-1-氧-1，2，3，4-四氢-异喹啉-7-基)-2-(1 H-吲唑-6-基氨基)-烟酰胺；N-[4-(叔-丁基)-3-(3-哌啶基丙基)苯基][2-(1H-吲唑-6-基氨基)(3-吡啶基)]羧酰胺；N-[5-(叔-丁基)异唑-3-基][2-(1H-吲唑-6-基氨基)(3-吡啶基)]羧酰胺；和N-[4-(叔-丁基)苯基][2-(1H-吲唑-6-基氨基)(3-吡啶基)]羧酰胺以及下列专利中公开的激酶抑制剂：美国专利号6,258,812；6,235,764；6,630,500；6,515,004；6,713,485；5,521,184；5,770,599；5,747,498；5,990,141；美国专利申请公开号US2003/0105091；以及专利合作条约公开号WO01/37820；WO01/32651；WO02/68406；WO02/66470；WO02/55501；WO04/05279；WO04/07481；WO04/07458；WO04/09784；WO02/59110；WO99/45009；WO98/35958；WO00/59509；WO99/61422；WO00/12089；和WO00/02871，每种公开物各自为了任何目的在此引入作为参考。

在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂可以单独或与至少一种另外的治疗剂一起用于治疗EGFr相关癌症。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂与治疗有效量的另外治疗剂结合使用。可以与EGFr特异性结合剂一起施用的示例性治疗剂包括但不限于，anisamycin抗生素的格尔德霉素家族成员；Pro-HGF；NK2；c-Met肽抑制剂；Grb2 Src同源性2拮抗剂；Gab 1调节剂；显性阴性Src；von-Hippel-Landau抑制剂，包括但不限于，渥曼青霉素；P13激酶抑制剂，其他抗受体疗法，COX-2抑制剂，Celebrex^TM，塞来考昔(celecoxib)，Vioxx^TM，罗非克西；血管内皮生长因子(VEGF)，VEGF调节剂，成纤维细胞生长因子(FGF)，FGF调节剂，表皮生长因子(EGF)；EGF调节剂；角质形成细胞生长因子(KGF)，KGF相关分子，KGF调节剂；和基质金属蛋白酶(MMP)调节剂。

在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂与特定治疗剂一起用于治疗各种癌症。在某些实施方案中，考虑到治疗条件和所需水平，可以施用2种、3种或更多种试剂。当化合物与一种或多种其他组分一起使用时，化合物以及一种或多种其他组分可以一起、分开或顺次(例如，以药物的形式)施用。在某些实施方案中，此类试剂可以通过包含在相同制剂中一起提供。在某些实施方案中，此类试剂和EGFr特异性结合剂可以通过包含在相同制剂中一起提供。在某些实施方案中，此类试剂可以分开配制并通过包含在治疗试剂盒中一起提供。在某些实施方案中，此类试剂和EGFr特异性结合剂可以分开配制并通过包含在治疗试剂盒中一起提供。在某些实施方案中，此类试剂可以分开提供。

在某些实施方案中，当通过基因治疗施用时，编码蛋白质试剂和/或EGFr特异性结合剂的基因可以包括在相同载体中。在某些实施方案中，编码蛋白质试剂和/或EGFr特异性结合剂的基因可以在相同启动子区的控制下。在某些实施方案中，编码蛋白质试剂和/或EGFr特异性结合剂的基因可以在分开的载体中。

在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂可以用于治疗非人动物，例如宠物(狗、猫、鸟、灵长类等)，以及驯养农场动物(马、牛、羊、猪、鸟等)。在某些此类情况下，合适的剂量可以根据动物体重来确定。例如，在某些实施方案中，可以使用0.2-1mg/kg的剂量。在某些实施方案中，剂量可以根据动物的表面积来确定，示例性剂量为0.1-20mg/in²，或5-12mg/m²。对于小动物，例如狗或猫，在某些实施方案中，合适的剂量是0.4mg/kg。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂通过注射或其他合适途径每周施用一次或多次，直至动物状况改善，或者它可以无限期地施用。

应当理解个别患者对前述药物或组合疗法的应答可能有变化，并且对于每个患者的合适有效组合可以由其医生决定。

猕猴提供了关于某些疾病的有用模型。示例性疾病包括但不限于，移植排斥综合征和炎性肠病样疾病。当在猕猴人疾病模型中测试人单克隆抗体的功效时，在某些实施方案中，确定EGFr特异性结合剂在人和猕猴中是否以可比较的水平结合EGFr是有用的。

在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂可以是缀合分子的部分，所述缀合分子包括全部或部分EGFr特异性结合剂和细胞毒性剂。术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。该术语包括但不限于，放射性同位素(例如，I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰和Re¹⁸⁶)，化学治疗剂，和毒素，例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段。示例性细胞毒性剂包括但不限于，羟基柔红霉素、阿霉素、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、环磷酰胺、三胺硫磷、泰索帝(多西他赛)、白消安、Cytoxin、紫杉酚、氨甲蝶呤、顺铂、美法仑、长春碱、博来霉素、依托泊苷、异磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春烯碱、卡铂、替尼泊苷、道诺霉素、去甲柔红霉素、氨基蝶呤、更生霉素、丝裂霉素、埃斯波霉素、美法仑和其他相关氮芥。

在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂可以是缀合分子的部分，所述缀合分子包括全部或部分EGFr特异性结合剂和前体药物。在某些实施方案中，术语“前体药物”指药学活性物质的前体或衍生形式。在某些实施方案中，前体药物与母体药物比较对细胞的细胞毒性较小，并且能够酶促激活或转换成更有活性的细胞毒性母体形式。示例性前体药物包括但不限于，含磷酸盐的前体药物、含硫代磷酸盐的前体药物、含硫酸盐的前体药物、含肽的前体药物、D氨基酸修饰的前体药物、糖基化的前体药物、含β内酰胺的前体药物、含任选取代的苯氧基乙酰胺的前体药物和含任选取代的苯乙酰胺的前体药物、5-氟胞嘧啶和其他5-氟尿嘧啶前体药物，其可以转换成更有活性的细胞毒性游离药物。可以衍生成前体药物形式的细胞毒性药物的例子包括但不限于上文描述的那些细胞毒性剂。参见，例如美国专利号6,702,705。

在某些实施方案中，抗体缀合物通过使分子的抗体部分将分子的细胞毒性部分或前体药物部分靶向患者中的特定细胞群体来起作用。在EGFr特异性结合剂的情况下，在某些实施方案中，此类缀合分子可以例如用于破坏异常增殖的细胞，例如癌细胞。

在某些实施方案中，提供了包括施用治疗有效量的EGFr特异性结合剂的治疗患者的方法。在某些实施方案中，提供了包括施用治疗有效量的抗体缀合物的治疗患者的方法。在某些实施方案中，如上文讨论的，抗体与治疗有效量的至少一种另外的治疗剂结合使用。

如上文讨论的，在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂可以与施用于相同患者的一种或多种其他药物同时施用，每种药物根据适合于那种药物的方案施用。此类治疗包括预治疗、同时治疗、顺次治疗和交替方案。此类药物的另外例子包括但不限于，抗病毒剂、抗生素、止痛剂、皮质类固醇、炎性细胞因子拮抗剂、DMARDs、非类固醇抗炎药、化学治疗剂和血管发生刺激剂。

在某些实施方案中，各种医学病症用EGFr特异性结合剂与细胞凋亡刺激剂组合治疗。例如，在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂可以在还包含刺激一种或多种细胞的细胞凋亡的化合物的组合物中施用。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂和细胞凋亡刺激剂可以作为分开的组合物施用，并且这些可以通过相同或不同途径施用。

在某些实施方案中，提供了包括治疗有效量的EGFr特异性结合剂和药学可接受的稀释剂、载体、加溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的药物组合物。

在某些实施方案中，提供了包括治疗有效量的EGFr特异性结合剂和治疗有效量的至少一种另外治疗剂、以及药学可接受的稀释剂、载体、加溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的药物组合物。

在某些实施方案中，可接受的制剂材料优选在采用的剂量和浓度上对受体无毒。

在某些实施方案中，药物组合物可以包含用于修饰、维持或保持例如，pH、渗透性、粘性、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、组合物的吸附或渗透的制剂材料。在某些实施方案中，合适的制剂材料包括但不限于，氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲液(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；填充剂(例如甘露糖醇或甘氨酸)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(例如，咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填料；单糖、二糖和其他碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(例如，血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色、调味和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐平衡离子(例如钠)；防腐剂(例如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、氯已定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或湿润剂(例如普朗尼克类(pluronics)、PEG、山梨糖醇酐酯、聚山梨醇酯例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、triton、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、四丁酚醛(tyloxapal)；稳定性增强剂(例如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(例如碱金属卤化物，优选氯化钠或钾、甘露糖醇山梨糖醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药学佐剂。(Remington′sPharmaceutical Sciences，18^th Edition，A.R.Gennaro，ed.，MackPublishing Company(1990)。

在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂和/或另外的治疗分子连接至本领域已知的半衰期延长性媒介物。此类媒介物包括但不限于，Fc结构域、聚乙二醇和葡聚糖。此类媒介物在例如美国专利号6,660,843和公开的PCT申请号WO 99/25044中描述。

在某些实施方案中，最佳药学组合物将由本领域技术人员取决于例如预期施用途径、递送形式和所需剂量来决定。参见，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，同上。在某些实施方案中，此类组合物可以影响EGFr特异性结合剂的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除率。

在某些实施方案中，药物组合物中的主要媒介物或载体在性质上可以是水性的或非水性的。例如，在某些实施方案中，合适的媒介物或载体可以是注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液，可能补加有在用于肠胃外施用的组合物中常见的其他材料。在某些实施方案中，中性缓冲盐水或与血清清蛋白混合的盐水是进一步的示例性媒介物。在某些实施方案中，药物组合物包括约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液，或约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，这可以进一步包括山梨糖醇或对此合适的取代物。在某些实施方案中，药物组合物是包括约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液、多元醇(聚醇)和任选地表面活性剂的水性或液体制剂，其中组合物不包括盐，例如氯化钠，并且其中组合物对于患者是等渗的。示例性多元醇包括但不限于，蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇和甘露糖醇。示例性表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯。在某些实施方案中，药物组合物是包括约pH 5.0的乙酸盐缓冲液、山梨糖醇和聚山梨醇酯的水性或液体制剂，其中组合物不包括盐，例如氯化钠，并且其中组合物对于患者是等渗的。某些示例性组合物在例如美国专利号6,171,586中找到。另外的药学载体包括但不限于，油，包括石油润滑油、动物油、植物油、花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。在某些实施方案中，水性葡萄糖和甘油溶液还可以用作液体载体，特别是对于可注射溶液。在某些实施方案中，包括抗体，含或不含至少一种另外治疗剂的组合物可以通过使具有所需纯度的所选组合物与任选的配制剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences，同上)混合以以冷冻干燥的块或水性溶液的形式制备用于贮存。此外，在某些实施方案中，包括抗体，含或不含至少一种另外治疗剂的组合物可以使用合适的赋形剂溶液(例如，蔗糖)作为稀释剂配制为冷冻干燥物(lyophilizate)。

在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂以生理学可接受组合物的形式施用，所述组合物包括纯化的重组蛋白质连同生理学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。在某些实施方案中，此类载体在采用的剂量和浓度上对受体无毒。在某些实施方案中，此类组合物的制备可以涉及组合EGFr特异性结合剂与缓冲液，抗氧化剂例如抗坏血酸，低分子量多肽(例如少于10个氨基酸的那些)，蛋白质，氨基酸，碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖或糊精，螯合剂例如EDTA，谷胱甘肽和/或其他稳定剂以及赋形剂。在某些实施方案中，合适的剂量在标准给药试验中测定，并且可以根据所选施用途径而变。在某些实施方案中，依照合适的工业标准，还可以添加防腐剂，这包括但不限于苯甲醇。在某些实施方案中，施用量和频率可以基于此类因素，如待治疗疾病的性质和严重性，所需应答，患者年龄和条件等等来决定。

在某些实施方案中，药物组合物可以被选择用于肠胃外递送。某些此类药学可接受组合物的制备在本领域技术内。

在某些实施方案中，制剂组分以适合于施用部位的浓度存在。在某些实施方案中，缓冲液用于使组合物维持在生理学pH或略微更低的pH上，一般在约5-约8的pH范围内。

在某些实施方案中，当预期肠胃外施用时，治疗组合物可以是在药学可接受媒介物中的无致热原、肠胃外可接受的水性溶液的形式，其包括所需抗体，含或不含另外的治疗剂。在某些实施方案中，用于肠胃外注射的媒介物是无菌蒸馏水，其中抗体，含或不含至少一种另外的治疗剂，配制为无菌等渗溶液，适当保存。在某些实施方案中，制剂可以涉及用试剂例如可注射微球体、可生物侵蚀颗粒、聚合化合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠或脂质体配制所需分子，所述试剂可以提供产物的受控或持续释放，所述产物随后可以经由贮存注射液递送。在某些实施方案中，还可以使用透明质酸，并且其可以具有促进在循环中的持续时间段的作用。在某些实施方案中，可移植的药物递送装置可以用引入所需分子。

在某些实施方案中，药物组合物可以配制用于吸入。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂，含或不含至少一种另外的治疗剂，可以配制为用于吸入的干粉。在某些实施方案中，包括EGFr特异性结合剂，含或不含至少一种另外的治疗剂的吸入溶液可以用推进剂配制用于气溶胶递送。在某些实施方案中，溶液可以被雾化。肺施用在PCT公开号WO94/20069中进一步描述，所述专利描述了化学改性蛋白质的肺递送。

在某些实施方案中，预期制剂可以经口施用。在某些实施方案中，以这种方式施用的EGFr特异性结合剂，含或不含至少一种另外的治疗剂，可以用或不用在固体剂型例如片剂和胶囊配制中常规使用的那些载体配制。在某些实施方案中，胶囊可以设计为在胃肠道的点上释放制剂的活性部分，此时生物利用率最大化并且系统前降解最小化。在某些实施方案中，可以包括至少一种另外的试剂以促进EGFr特异性结合剂和/或任何另外的治疗剂的吸收。在某些实施方案中，还可以使用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和/或粘合剂。

在某些实施方案中，药物组合物可以涉及有效量的EGFr特异性结合剂，含或不含至少一种另外的治疗剂，其与适合于制备片剂的无毒赋形剂混合。在某些实施方案中，通过将片剂溶解于无菌水或另一种合适媒介物中，可以制备单位剂型的溶液。合适的赋形剂包括但不限于，惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；和粘合剂，例如淀粉、明胶和阿拉伯胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸和滑石。

另外的药物组合物对于本领域技术人员将是显而易见的，包括涉及EGFr特异性结合剂，含或不含至少一种另外的治疗剂，在持续或受控递送制剂中的制剂。某些示例性持续或受控递送制剂包括但不限于，脂质体载体、可生物侵蚀微粒、多孔珠和贮存注射液。用于制备某些制剂的某些示例性技术是本领域技术人员已知的。参见例如，PCT公开号WO93/15722，其描述了用于递送药物组合物的多孔聚合微粒的受控释放。在某些实施方案中，持续释放制剂可以包括成形物体形式的半透性聚合体基质，例如膜或微胶囊。持续释放基质包括但不限于，聚酯、水凝胶、聚交酯(美国专利号3,773,919和EP 058,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人，Biopolymers，22：547-556(1983))、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.，15：167-277(1981)和Langer，Chem.Tech.，12：98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上)和聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。在某些实施方案中，持续释放组合物还可以包括脂质体，其在某些实施方案中可以通过本领域已知的几种方法中的任何一种进行制备。参见，例如Eppstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688-3692(1985)；EP 036,676；EP 088,046和EP 143,949。

在某些实施方案中，用于体内施用的药物组合物是无菌的。在某些实施方案中，用于体内施用的药物组合物通过经由无菌过滤膜过滤制成无菌的。在某些实施方案中，当组合物是冷冻干燥的时，使用无菌过滤膜的灭菌可以在冷冻干燥和重构之前或之后进行。在某些实施方案中，用于肠胃外施用的组合物可以以冷冻干燥或溶液的形式贮存。在某些实施方案中，肠胃外组合物一般置于含有无菌入口的容器内，例如含有通过皮下注射针可穿透的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。

在某些实施方案中，在药物组合物已配制后，它可以作为溶液、悬浮液、凝胶、乳状液、固体，或作为脱水或冷冻干燥粉末贮存于无菌小瓶中。在某些实施方案中，此类制剂可以以即用的形式或以使用前重构的形式(例如冷冻干燥形式)贮存。

在某些实施方案中，提供了用于产生单剂施用单位的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒可以各自包含含有干燥蛋白质的第一种容器和含有水性制剂的第二种容器。在某些实施方案中，包括了包含单和/或多室预装填注射器(例如液体注射器和分散注射器(lyosyringes))的试剂盒。

在某些实施方案中，要在治疗上使用，包括EGFr特异性结合剂，含或不含至少一种另外治疗剂的药物组合物的有效量将取决于例如治疗背景和目的。本领域技术人员将理解根据某些实施方案用于治疗的合适剂量水平因此将依递送的分子，EGFr特异性结合剂含或不含至少一种另外的治疗剂对于其使用的适应症，施用途径，以及患者的大小(体重、体表面或器官大小)和/或状态(年龄和一般健康)而变。在某些实施方案中，临床医生可以逐步滴定剂量并修改施用途径以获得最佳疗效。在某些实施方案中，取决于上文提及的因素，一般剂量可以为约0.1μg/kg-最高达约100mg/kg或更多。在某些实施方案中，剂量可以为0.1μg/kg直到最高约100mg/kg；或1μg/kg直到最高约100mg/kg；或5μg/kg直到最高约100mg/kg。

在某些实施方案中，给药频率将考虑使用的制剂中的EGFr特异性结合剂和/或任何另外的治疗剂的药物代谢动力学参数。在某些实施方案中，临床医生将施用组合物直至达到实现所需作用的剂量。在某些实施方案中，组合物因此可以作为单剂施用，或作为2剂或更多剂(其可以包含或不包含相同量的所需分子)随着时间过去施用，或作为连续输注经由植入装置或导管施用。进一步改进合适剂量的某些方法在本领域技术内。在某些实施方案中，合适剂量可以通过使用合适的剂量应答数据确定。

在某些实施方案中，药物组合物的施用途径依照已知方法，例如经口，通过经由静脉内、腹膜内、大脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门脉内(intraportal)或损伤内(intralesional)途径注射；通过持续释放系统或通过植入装置。在某些实施方案中，组合物可以通过单次快速静脉注射或连续输注，或通过植入装置施用。

如上文讨论的，在各种实施方案中，任何有效的施用途径都可以用于施用EGFr特异性结合剂。如果注射，则在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂可以例如经由关节内、静脉内、肌内、损伤内、腹膜内、颅内、鼻内、吸入或皮下途径通过单次快速静脉注射或通过连续输注施用。示例性施用方法包括但不限于，从植入物持续释放，气溶胶吸入，滴眼剂，经口制剂，包括丸剂、糖浆、糖锭和口香糖，和局部用制剂例如洗剂、凝胶、喷雾剂、软膏，以及其他合适技术。

在某些实施方案中，当治疗与肺部病症相关的疾病时，通过吸入施用是有利的。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂可以通过植入表达EGFr特异性结合剂的培养细胞施用。在某些实施方案中，通过使用编码EGFr特异性结合剂的一种或多种载体体内或先体外后体内转染来诱导患者自己的细胞来生产。在某些实施方案中，这种载体可以引入患者细胞内，例如通过注射编码EGFr特异性结合剂的裸DNA或脂质体被囊化的DNA，或通过其他转染方法。当EGFr特异性结合剂与一种或多种其他生物学活性化合物组合施用时，在某些实施方案中，这些可以通过相同或不同途径施用，并且可以一起、分开或顺次施用。

在某些实施方案中，组合物可以经由植入膜、海绵或在其上已吸收或被囊化所需分子的另一种合适的材料局部施用。在某些实施方案中，当使用植入装置时，装置可以植入任何合适的组织或器官内，并且所需分子的递送可以经由扩散、定时释放大丸剂或连续施用。

在某些实施方案中，可能希望以先体外后体内方式使用包括EGFr特异性结合剂，含或不含至少一种另外的治疗剂的药物组合物。在此类实施方案中，已从患者取出的细胞、组织和/或器官暴露于包括抗体，含或不含至少一种另外的治疗剂的药物组合物，这之后细胞、组织和/或器官随后移植回到患者内。

在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂和任何另外的治疗剂可以通过植入某些细胞递送，所述细胞已使用例如本文描述的那些方法基因工程改造以表达并分泌多肽。在某些实施方案中，此类细胞可以是动物或人细胞，并且可以是自体、异源或异种的。在某些实施方案中，细胞可以是无限增殖化的。在某些实施方案中，为了减少免疫应答的机会，细胞可以是被囊化的以避免渗入周围组织。在某些实施方案中，被囊化材料一般是生物相容的半渗透性聚合外壳或膜，其允许释放蛋白质产物但防止细胞被患者的免疫系统或被来自周围组织的其他有害因素破坏。

某些示例性方法

在某些实施方案中，提供了预测EGFr特异性结合剂治疗在受试者的EGFr相关癌症治疗中是否将是有效的方法。在某些实施方案中，该方法包括测定来自受试者的样品中的EGFr基因拷贝数。在某些实施方案中，样品中的EGFr基因拷贝数存在增加预示EGFr特异性结合剂治疗在受试者的EGFr相关癌症治疗中将是有效的。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂治疗包括抗EGFr抗体。在某些实施方案中，抗EGFr抗体是人抗EGFr抗体。在某些实施方案中，抗EGFr抗体是帕尼单抗。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂治疗包括EGFr特异性结合剂和至少一种化学治疗剂。在某些实施方案中，EGFr相关癌症是实体瘤。在某些实施方案中，实体瘤包括选自结肠直肠癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌以及头与颈癌的至少一种癌症。

在某些实施方案中，测定样品中的EGFr基因拷贝数包括比较样品中的EGFr基因拷贝数与正常参考样品中的EGFr基因拷贝数。在某些实施方案中，正常参考样品来自与样品相同的受试者。在某些实施方案中，正常参考样品不是来自与样品相同的受试者。在某些实施方案中，正常参考样品来自与样品相同的组织。在某些此类实施方案中，正常参考样品来自非致瘤性组织并且样品来自致瘤性组织。在某些此类实施方案中，正常参考样品来自非恶性组织并且样品来自恶性组织。在某些实施方案中，测定EGFr基因拷贝数包括荧光原位杂交分析。在某些实施方案中，测定EGFr基因拷贝数包括定量PCR。在某些实施方案中，测定EGFr基因拷贝数包括DNA印迹分析。在某些实施方案中，测定EGFr基因拷贝数包括本文描述的另一种基因拷贝数测定方法。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂治疗包括抗EGFr抗体。在某些实施方案中，抗EGFr抗体是人抗EGFr抗体。在某些实施方案中，抗EGFr抗体是帕尼单抗。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂治疗包括EGFr特异性结合剂和至少一种化学治疗剂。在某些实施方案中，EGFr相关癌症是实体瘤。在某些实施方案中，实体瘤包括选自结肠直肠癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌以及头与颈癌的至少一种癌症。

在某些实施方案中，测定样品中的EGFr基因拷贝数包括测定来自受试者肿瘤的测试样品中的EGFr基因拷贝数，测定测试样品中的至少一种参考核苷酸序列的拷贝数，和比较测试样品中的EGFr基因拷贝数与测试样品中的至少一种参考核苷酸序列的拷贝数。在某些实施方案中，测试样品中的EGFr基因拷贝数相对于至少一种参考核苷酸序列的拷贝数增加预示EGFr特异性结合剂治疗在受试者的EGFr相关癌症治疗中将是有效的。在某些实施方案中，至少一种参考核苷酸序列位于与EGFr基因相同的染色体上。在某些实施方案中，至少一种参考核苷酸序列位于与其中EGFr定位的染色体不同的另一染色体上。在某些实施方案中，至少一种参考核苷酸序列的拷贝数是每个细胞2个拷贝。在某些实施方案中，至少一种参考核苷酸序列是着丝粒序列。在某些实施方案中，正常样品中EGFr基因拷贝数与至少一种参考核苷酸序列的拷贝数的比率是1。在某些实施方案中，测定EGFr基因拷贝数和至少一种参考核苷酸序列的拷贝数包括荧光原位杂交分析。在某些实施方案中，测定EGFr基因拷贝数和至少一种参考核苷酸序列的拷贝数包括定量PCR。在某些实施方案中，测定EGFr基因拷贝数和至少一种参考核苷酸序列的拷贝数包括DNA印迹分析。在某些实施方案中，测定EGFr基因拷贝数和至少一种参考核苷酸序列的拷贝数包括本文描述的另一种基因拷贝数测定方法。在某些实施方案中，EGFr相关癌症是实体瘤。在某些实施方案中，实体瘤包括选自结肠直肠癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌以及头与颈癌的至少一种癌症。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂治疗包括抗EGFr抗体。在某些实施方案中，抗EGFr抗体是人抗EGFr抗体。在某些实施方案中，抗EGFr抗体是帕尼单抗。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂治疗包括EGFr特异性结合剂和至少一种化学治疗剂。

在某些实施方案中，测定EGFr基因拷贝数包括：测定来自受试者的测试样品中的EGFr基因拷贝数；测定测试样品中的核数目；和比较EGFr基因拷贝数与核数目。在某些此类实施方案中，EGFr基因拷贝数和核数目之间大于2的比率预示EGFr特异性结合剂治疗在受试者的EGFr相关癌症治疗中将是有效的。在某些实施方案中，正常样品中的EGFr基因拷贝数和核数目的比率是2。在某些实施方案中，样品中的EGFr基因拷贝数增加由EGFr基因拷贝数与核数目的比率大于2指示。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂治疗包括抗EGFr抗体。在某些实施方案中，抗EGFr抗体是人抗EGFr抗体。在某些实施方案中，抗EGFr抗体是帕尼单抗。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂治疗包括EGFr特异性结合剂和至少一种化学治疗剂。在某些实施方案中，EGFr相关癌症是实体瘤。在某些实施方案中，实体瘤包括选自结肠直肠癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌以及头与颈癌的至少一种癌症。

在某些实施方案中，测定EGFr基因拷贝数和核数目包括荧光原位杂交分析。在某些实施方案中，测定EGFr基因拷贝数和核数目包括定量PCR。在某些实施方案中，测定EGFr基因拷贝数和核数目包括DNA印迹分析。在某些实施方案中，测定EGFr基因拷贝数和核数目包括本文描述的另一种基因拷贝数测定方法。在某些实施方案中，EGFr相关癌症是实体瘤。在某些实施方案中，实体瘤包括选自结肠直肠癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌以及头与颈癌的至少一种癌症。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂治疗包括抗EGFr抗体。在某些实施方案中，抗EGFr抗体包括人抗EGFr抗体。在某些实施方案中，抗EGFr抗体是帕尼单抗。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂治疗包括EGFr特异性结合剂和至少一种化学治疗剂。

在某些实施方案中，提供了治疗患有EGFr相关癌症的受试者的方法，其包括：测定来自受试者样品中的EGFr基因拷贝数；测定样品中的EGFr基因拷贝数是否增加；和如果样品中的EGFr基因拷贝数增加，那么给受试者施用药学有效量的EGFr特异性结合剂。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂治疗是抗EGFr抗体。在某些实施方案中，抗EGFr抗体是人抗EGFr抗体。在某些实施方案中，抗EGFr抗体是帕尼单抗。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂治疗包括EGFr特异性结合剂和至少一种化学治疗剂。在某些实施方案中，测定EGFr基因拷贝数包括荧光原位杂交分析。在某些实施方案中，测定EGFr基因拷贝数包括定量PCR。在某些实施方案中，测定EGFr基因拷贝数包括DNA印迹分析。在某些实施方案中，测定EGFr基因拷贝数包括本文描述的另一种基因拷贝数测定方法。在某些实施方案中，EGFr相关癌症是实体瘤。在某些实施方案中，实体瘤包括选自结肠直肠癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌以及头与颈癌的至少一种癌症。

在某些实施方案中，提供了测定患者中的治疗功效的方法，其包括：(a)测定从患者获得的第一种样品中的EGFr基因拷贝数，以获得第一种EGFr基因拷贝数水平；(b)给患者施用治疗；(c)在治疗施用后的某时测定来自患者的第二种样品中的EGFr基因拷贝数，从而产生第二种EGFr基因拷贝数水平；和(d)比较第一种和第二种EGFr基因拷贝数水平，其中第二种EGFr基因拷贝数水平中的EGFr基因拷贝数相对于第一种EGFr基因拷贝数水平降低表明治疗在患者中是有效的。在某些实施方案中，测定EGFr基因拷贝数包括荧光原位杂交分析。在某些实施方案中，测定EGFr基因拷贝数包括定量PCR。在某些实施方案中，测定EGFr基因拷贝数包括DNA印迹分析。在某些实施方案中，测定EGFr基因拷贝数包括本文描述的另一种基因拷贝数测定方法。在某些实施方案中，治疗包括EGFr特异性结合剂。在某些实施方案中，EGFr特异性结合剂治疗是抗EGFr抗体。在某些实施方案中，抗EGFr抗体是人抗EGFr抗体。在某些实施方案中，抗EGFr抗体是帕尼单抗。在某些实施方案中，治疗包括EGFr特异性结合剂和至少一种化学治疗剂。在某些实施方案中，治疗是对于EGFr相关癌症。在某些实施方案中，EGFr相关癌症是实体瘤。在某些实施方案中，实体瘤包括选自结肠直肠癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌以及头与颈癌的至少一种癌症。

提供下列实施例包括进行的实验和达到的结果，仅用于举例说明目的并且不应解释为将本发明限制于其上。

实施例

实施例1

CRC肿瘤样品的分离以及与帕尼单抗治疗的关联

从在Ospedale Niguarda Ca’Granda入选帕尼单抗(针对EGFr的人IgG2单克隆抗体；Amgen Inc.)临床实验用于治疗表达EGFr的结肠直肠癌(“CRC”)的患者中选择10名患者。治疗方案由InstitutionalEthics Committee批准。患者给出关于接受帕尼单抗以及关于分析肿瘤表达的EGFr以及EGFr激活中涉及的分子的书面知情同意书。所有10名患者对先前化学治疗方案都有抵抗力。那些先前化学治疗方案显示于下表1中。使用EGFRPharmDX试剂盒(DAKO Corp.)根据制造商的说明书评估患者肿瘤样品的EGFr表达。对于该研究选择的所有患者都具有表达EGFr的转移CRC，通过至少1％恶性细胞中存在EGFr染色确定。患者以6mg/kg的剂量每2周用帕尼单抗静脉内治疗直至观察到疾病进展。

通过计算机断层显象成像(“CT扫描”)采用实体瘤应答评价标准(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)(RECIST)标准经由机构以及独立放射学家根据临床方案评估针对帕尼单抗治疗的肿瘤应答。RECIST提供了基于肿瘤大小鉴别改善、稳定疾病或进行性疾病的指导方针(参见Therasse等人，February 2000，“NewGuidelines to Evaluate the Response to Treatment in Solid Tumors，”J.Natl.Cancer Inst.92(3)：205-216)。用帕尼单抗治疗的患者的RECIST分析结果显示于表1中。

表1：用帕尼单抗治疗的患者的相关临床特征

患者	性别	年龄	先前化学治疗方案的数目和类型	针对帕尼单抗的肿瘤应答	应答持续时间(周)
						1--30824793	M	59	3：FOLFOX，卡培他滨FOLFIRI	部分应答	33
2--2350661	F	62	2：FOLFOX，FOLFIRI	部分应答	24
						3--30640715	M	57	2：FOLFjRJ，FOLFOX	部分应答	16
4--30398321	F	78	3：FOLFOX，卡培他滨，FOLFIRI	部分应答	12+

5--10015851	F	52	4：FOLFOX，依立替康，卡培他滨，FOLFIRI	稳定疾病	32
						6--30656334	M	71	2：FOLFOX，FOLFIRI	稳定疾病	16+
7--30667900	M	56	1：奥沙利铂依立替康-5-FU/FA	进行性疾病	(无应答)
						8--30384032	F	67	2：FOLFOX，FOLFIRI	进行性疾病	(无应答)
9--30692441	M	54	2：FOLFOX，FOLFIRI	进行性疾病	(无应答)
						10--30685324	F	65	3：5-FU/FA，FOLFOX，FOLFIRI	进行性疾病	(无应答)

^*FOLF0X是5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸和奥沙利铂的组合

FOLFIRI是5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸和依立替康的组合

因此，10名患者中的6名对帕尼单抗治疗阳性应答，从而显示稳定疾病或部分应答。

实施例2

在CRC肿瘤样品中的EGFR、PI3K、RAS和RAF的突变分析

在实施例1中讨论的帕尼单抗治疗开始前，将来自每名患者的CRC肿瘤样品包埋在石蜡中。由每名患者的样品制备10微米切片。显示肿瘤组织的切片区域进行标记并用0.2M NaOH/1mM EDTA提取组织。样品随后用100mM Tris-TE中和。提取和中和后，来自每种样品的DNA使用PCR Purification Kit(Qiagen)根据制造商的说明书进行纯化。

外显子特异性PCR引物和测序引物使用程序Primer3(Rozen S，Skaletsky H(2000)Primer3 on the WWW for general users and forbiologist programmers.In：Krawetz，S.，Misener，S.(eds)BioinformaticsMethods and Protocols：Methods in Molecular Biology.Humana Press，Totowa，NJ，第365-386页)设计。设计的引物由Invitrogen^TM(Carlsbad，CA)合成。关于EGFr外显子18的正向PCR引物是GCTGAGGTGACCCTTGTCTC(SEQ ID NO：1)，关于EGFr外显子18的反向PCR引物是ACAGCTTGCAAGGACTCTGG(SEQ ID NO：2)，并且关于EGFr外显子18的测序引物是TGGAGCCTCTTACACCCAGT(SEQ ID NO：3)。关于EGFr外显子19的正向PCR引物是CCCAGTGTCCCTCACCTTC(SEQ ID NO：4)，关于EGFr外显子19的反向PCR引物是CCACACAGCAAAGCAGAAAC(SEQ ID NO：5)，并且关于EGFr外显子19的测序引物是GCTGGTAACATCCACCCAGA(SEQ IDNO：6)。关于EGFr外显子21的正向PCR引物是TGATCTGTCCCTCACAGCAG(SEQ ID NO：7)，关于EGFr外显子21的反向PCR引物是TCAGGAAAATGCTGGCTGAC(SEQ ID NO：8)，并且关于EGFr外显子21的测序引物是TTCAGGGCATGAACTACTTGG(SEQ ID NO：9)。关于PI3K外显子9的正向PCR引物是GGGAAAAATATGACAAAGAAAGC(SEQ IDNO：10)，关于PI3K外显子9的反向PCR引物是CTGAGATCAGCCAAATTCAGTT(SEQ ID NO：11)，并且关于PI3K外显子9的测序引物是TAGCTAGAGACAATGAATTAAGGGAAA(SEQ ID NO：12)。关于PI3K外显子20的正向PCR引物是CTCAATGATGCTTGGCTCTG(SEQ ID NO：13)，关于PI3K外显子20的反向PCR引物是TGGAATCCAGAGTGAGCTTTC(SEQ IDNO：14)，并且关于PI3K外显子20的测序引物是TTGATGACATTGCATACATTCG(SEQ ID NO：15)。关于Ras外显子2的正向PCR引物是GGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAAC(SEQID NO：16)，关于Ras外显子2的反向PCR引物是AGAATGGTCCTGCACCAGTAA(SEQ ID NO：17)，并且关于Ras外显子2的测序引物是TCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTG(SEQID NO：18)。关于B-Raf外显子15的正向PCR引物是TGCTTGCTCTGATAGGAAAATG(SEQ ID NO：19)，关于B-Raf外显子15的反向PCR引物是AGCATCTCAGGGCCAAAAAT(SEQ IDNO：20)，并且关于B-Raf外显子15的测序引物是TGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCA(SEQ ID NO：21)。

EGFr外显子18、19和21，PI3K外显子9和20，Ras外显子2以及B-Raf外显子15通过PCR从纯化的肿瘤基因组DNA使用上文描述的PCR引物扩增。PCR在20μL的总体积中使用递降PCR程序进行。扩增程序如下：94℃2分钟；94℃30秒，64℃30秒，70℃30秒的3个循环；94℃30秒，58℃30秒，70℃30秒的3个循环；94℃30秒，57℃30秒和70℃30秒的35个循环；以及70℃5分钟的1个循环。反应完成后，扩增子使用AMPure PCR纯化系统(Agencourt BioscienceCorp.)纯化。纯化的扩增子使用BigDyeTerminator v.3.1 CycleSequencing Kit(Applied Biosystems)根据制造商的说明书进行测序并使用3730 ABI毛细血管电泳系统进行分析。将来自特定患者的肿瘤DNA的每个外显子序列与来自相同患者的正常DNA的野生型外显子序列比较，以鉴别任何突变的存在。那种分析的结果显示于表2中。

表2：CRC患者样品中某些EGFr、PI3K和Ras外显子的突变分析

患者

EGFr外显子18

EGFr外显子19

EGFr外显子21

PI3K外显子9

PI3K外显子20

Ras外显子2

B-Raf外显子15

1--30624793

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

2--2350661

WT

WT

WT

WT

WT

G13D

WT

3--30640715

WT

WT

WT

WT

WT

G12D

WT

4--3039832

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

5--10015851

WT

WT

WT

WT

WT

G13D

WT

6--30656334

WT

WT

WT

WT

WT

G12V

WT

7--30667900

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

8--30384032

WT

WT

WT

WT

WT

G13D

WT

9--30692441

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

10--30685324

WT

WT

WT

WT

H1047R

WT

E599V

表1和2中的结果显示EGFr催化结构域(外显子18、19和21)中的突变，以及Ras外显子1、PI3K外显子9和20中的突变，以及B-Raf外显子15中的突变与10名测试的CRC患者中帕尼单抗治疗的功效无关。

实施例3

在CRC肿瘤样品中的EGFR拷贝数和定位分析

患者肿瘤样品中的EGFr基因拷贝数以2种方式测定：通过荧光原位杂交(“FISH”)和通过定量PCR。FISH分析使用Her1 FISH检测试剂盒(Dakocytomation，Denmark)根据制造商的说明书进行。该试剂盒允许差别荧光标记样品中存在的每种EGFr基因、每个染色体7α-着丝粒序列(“CEP7”)以及每个核。患者样品于96℃置于预处理溶液(试剂盒中提供)30分钟并随后于室温用胃蛋白酶溶液(试剂盒中提供)消化30分钟。双色、双靶FISH测定使用LSI EGFR SpectrumOrange探针(Vysis，Downers Grove，IL)和CEP7 Spectrum Green探针(Vysis，Downers Grove，IL)进行。组织切片用10μL探针溶液(试剂盒中提供)覆盖并于75℃温育5分钟以使EGFr和CEP7探针共变性。允许切片与变性探针于37℃杂交过夜。共变性和杂交步骤在微处理器控制的系统(Hybridizer，Dakocytomation，Denmark)中顺次进行。杂交后，切片于65℃洗涤2次每次10分钟，洗涤使用试剂盒中提供的洗涤缓冲液，并于室温干燥15分钟。组织切片用4’6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI II，Vysis)覆盖用于染色质复染色并通过荧光显微镜术检查。

配备Chromowin工作站(Amplimedical，Italy)的荧光显微镜(ZeissAxioskop，Germany)用于FISH显色。EGFr基因使用四甲基若丹明异硫氰酸盐(TRITC)滤色片观察为红色信号。CEP7序列使用异硫氰酸荧光素(FITC)滤色片观察为绿色信号。细胞核使用DAPI滤色片观察为蓝色信号。每种样品的代表图像用Hamamatsu C5895激冷(chilled)CCD照相机(Upstate Technical Equipment Co.，New York)以单色层拍摄，其随后通过Casti Imaging FISH Multicolor软件(Amplimedical)合并。与每名患者样品中的肿瘤细胞邻近的培养的视网膜色素上皮细胞和正常结肠直肠粘膜细胞用作正常细胞对照。A431人表皮样癌细胞用作EGFr基因拷贝数增加的对照。来自患者5的样品只作为10微米切片可获得，并且尽管多次尝试，但都由于过度的组织厚度FISH分析无法得出结论。

2名独立的观察者使用预先确定的评分指导方针对来自每种样品的至少200个无重叠间期核评分。观察者对于患者的临床特征以及另一名观察者的评分和评估不知情。在每个核内，独立评估EGFr基因和CEP7序列的拷贝数。记录EGFr基因拷贝数与核数目(EGFr∶核)以及EGFr基因拷贝数与CEP7序列数目(EGFr∶CEP7)的比率。结果显示于表3中。

表3：EGFr基因拷贝数的FISH分析结果

患者	针对帕尼单抗的应答	EGFr基因：CEP7	EGFr基因：核
				1--30624793	部分应答	2.50	4.80
2--2350661	部分应答	2.13	6.80
				3--30640715	部分应答	3.27	8.20
4--3039832	部分应答	1.19	3.38
				5--10015851	稳定疾病	n/a	n/a
6--30656334	稳定疾病	1.04	1.88
				7--30667900	进行性疾病	0.91	1.70
8--30384032	进行性疾病	1.02	2.00
				9--30692441	进行性疾病	1.03	2.00
10--30685324	进行性疾病	1.18	2.10

EGFr基因通常位于染色体7上，并因此EGFr基因数目：CEP7序列数目的预期比率是1。EGFr基因数目：核的预期比率是2，假定核中通常存在染色体7的2个拷贝。EGFr基因拷贝数增加可以由染色体7多体性和EGFr基因扩增引起。因此正常二体性由EGFr基因：CEP7为1的比率和EGFr基因：核为2的比率指示。平衡的多体性由EGFr基因：CEP7为1的比率和EGFr基因：核大于2的比率指示。伴随EGFr基因扩增的正常二体性由EGFr基因：CEP7大于1的比率和EGFr基因：核大于2的比率指示。EGFr基因拷贝数增加任意定义为EGFr基因数目：核的比率≥3的值。

图1显示某些二色FISH测定图像，其中EGFr基因以红色出现，并且CEP7序列以绿色出现。图1A显示正常结肠直肠粘膜细胞的染色模式，其中观察到平衡的二体性。图1B显示来自患者7的肿瘤细胞的染色模式，同样显示平衡的二体性。图1C显示来自患者4的肿瘤细胞的染色模式，显示平衡的多体性。图1D显示来自患者1的肿瘤细胞的染色模式，显示伴随EGFr基因扩增的二体性。

关于每名患者的EGFr基因拷贝数还使用定量PCR测定。实时PCR使用ABI PRISM

7900HT设备和SYBR

Green(MolecularProbes，Inc.)检测系统(Applied Biosystems)根据制造商的说明书进行。正向引物GAATTCGGATGCAGAGCTTC(SEQ ID NO：22)和反向引物GACATGCTGCGGTGTTTTC(SEQ ID NO：23)用于扩增EGFr基因的小(100-200bp)非重复区。还从每名患者样品扩增对于其拷贝数/二倍体基因组在所有人细胞中相似的重复元件Line-1，以允许标准化EGFr基因结果。对于Line-1重复元件的正向和反向引物分别是AAAGCCGCTCAACTACATGG(SEQ ID NO：24)和TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG(SEQ ID NO：25)。扩增条件如下：95℃10分钟的1个循环，随后为95℃15秒和60℃1分钟的45个循环。阈值循环数使用ABI PRISM7900HT Sequence Detection System软件获得。扩增反应一式三份进行并平均阈值循环数。拷贝数变化通过使用式s^{(Dt-Dline)-(Nt-Nline)}计算。在那个式中，Dt是对于患者样品中的EGFr基因序列观察到的平均阈值循环数，Dline是对于患者样品中的Line-1序列观察到的平均阈值循环数，Nt是对于来自视网膜色素上皮细胞(“RPE”)的DNA中的EGFr基因序列观察到的平均阈值循环数，并且Nline是对于来自RPE细胞的DNA中的Line-1序列观察到的平均阈值循环数。

实施例4

细胞增殖抑制测定

研究了帕尼单抗对EGFr基因拷贝数正常或EGFr基因拷贝数增加的细胞系的作用。首先，测定实验性CRC细胞系中的EGFr拷贝数。研究了8种不同的CRC细胞系：DiFi(Jose Baselga，Vall d’HebronUniversity，Barcelona，Spain)、DLD-1、HCT-116、HT-29、LoVo、SW48、SW480和SW620(全都来自ATCC)。每种CRC细胞系的EGFr拷贝数使用FISH方法如上文实施例3中所述进行测定。每种细胞系(除DiFi细胞以外)在补加了10％胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM中生长。DiFi细胞在补加了10％FCS和抗生素的F-12培养基中生长。关于DiFi细胞的示例性FISH荧光染色图像显示于图2B中。从FISH分析获得的值显示于表4中。

表4：CRC细胞系中的EGFr基因拷贝数

细胞系	EGFr基因：CEP7	EGFr基因：核
			DiFi	＞20	＞20
SW48	1.10	3.19
			SW480	0.94	3.08
SW620	1.05	3.00

HT-29	0.97	2.52
			LoVo	0.98	2.41
HCT-116	0.93	1.79
			DLD-1	0.93	1.68

如表4中所示，DiFi细胞具有非常高的EGFr基因拷贝数。

在每种细胞系中通过蛋白质印迹分析细胞EGFr蛋白质检查EGFr基因表达(参见图2A)。对蛋白质提取物经由SDS-PAGE实施电泳并通过高强度湿式印迹(wet blot)转移至聚偏二氟乙烯膜。滤色片用指示的抗体探测，并使用增强的化学发光系统(Amersham)检测特异性结合。如从上文FISH数据预期的，DiFi细胞具有非常高的EGFr蛋白质水平。除SW620以外，其他细胞系显示可变的EGFr蛋白质水平。SW260细胞不包含EGFr蛋白质，尽管EGFr基因拷贝数很高。

帕尼单抗对每种CRC肿瘤细胞系增殖的作用使用溴脱氧尿苷(“BrdU”)掺入测定测量。细胞在补加了2％FBS的DMEM中在96孔黑色板(Culture Plate^TM 96F(Packard Bioscience))中生长。铺平板的细胞与0.01-100nM的各种浓度的帕尼单抗(Amgen Inc.)温育5天。细胞增殖通过测定BrdU掺入的化学发光ELISA方法(Roche)测量。对于每种细胞系的每孔细胞接种密度如下：DiFi：4000；LoVo：4000；DLD：500；HCT116：1000；HT29：1000；SW480：1000；SW387：4000；SW48：500；和SW620：500。BrdU测定在3次分开的一式三份实验中根据制造商的说明书进行并且在添加标记溶液后20小时终止。每种帕尼单抗浓度上的细胞增殖百分比使用下式计算：[(测试样品-空白样品)/(对照样品-空白样品)×100]，其中对照样品是在缺乏帕尼单抗的培养基中生长的细胞，并且空白样品由在溶于DMEM的0.02％Triton X中生长的细胞组成(即，无生长)。

序列表

<110>Amgen Inc.

     Siena，Salvatore

     Moroni，Mauro

     Bardelli，Alberto

 

<120>表皮生长因子受体基因拷贝数

 

<130>6843.106-304

 

<150>60/667,827

<151>2005-04-01

 

<160>25

 

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>1

gctgaggtga cccttgtctc                                                            20

 

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>2

acagcttgca aggactctgg                                                            20

 

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>3

tggagcctct tacacccagt                                                            20

 

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>4

cccagtgtcc ctcaccttc                                                             19

 

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>5

ccacacagca aagcagaaac                                                            20

 

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>6

gctggtaaca tccacccaga                                                            20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>7

tgatctgtcc ctcacagcag                                                            20

 

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>8

tcaggaaaat gctggctgac                                                            20

 

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>9

ttcagggcat gaactacttg g                                                          21

 

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>10

gggaaaaata tgacaaagaa agc                                                        23

 

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>11

ctgagatcag ccaaattcag tt                                                         22

 

<210>12

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>12

tagctagaga caatgaatta agggaaa                                                    27

 

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>13

ctcaatgatg cttggctctg                                                            20

 

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>14

tggaatccag agtgagcttt c                                                          21

 

<210>15

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>15

ttgatgacat tgcatacatt cg                                                         22

 

<210>16

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>16

ggtggagtat ttgatagtgt attaac                                                     26

 

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>17

agaatggtcc tgcaccagta a                                                          21

<210>18

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>18

tcattatttt tattataagg cctgctg                                                    27

 

<210>19

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>19

tgcttgctct gataggaaaa tg                                                         22

 

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>20

agcatctcag ggccaaaaat                                                            20

 

<210>21

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>21

tgttttcctt tacttactac acctca                                                     26

 

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>22

gaattcggat gcagagcttc                                                            20

 

<210>23

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>23

gacatgctgc ggtgttttc                                                             19

 

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>24

aaagccgctc aactacatgg                                                            20

 

<210>25

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>寡核苷酸引物

 

<400>25

tgctttgaat gcgtcccaga g                                                          21

Claims (37)

1. 一种预测EGFr特异性结合剂治疗在受试者的EGFr相关癌症治疗中是否将是有效的方法，其包括测定来自所述受试者样品中的EGFr基因拷贝数，其中所述样品中的EGFr基因拷贝数存在增加预示EGFr特异性结合剂治疗在所述受试者的EGFr相关癌症治疗中将是有效的。

2. 权利要求1的方法，其中所述EGFr特异性结合剂治疗包括抗EGFr抗体。

3. 权利要求2的方法，其中所述抗EGFr抗体是人抗EGFr抗体。

4. 权利要求3的方法，其中所述人抗EGFr抗体是帕尼单抗。

5. 权利要求1的方法，其中所述EGFr特异性结合剂治疗包括EGFr特异性结合剂和至少一种化学治疗剂。

6. 权利要求1的方法，其中所述EGFr相关癌症是实体瘤。

7. 权利要求6的方法，其中所述实体瘤是选自结肠直肠癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌以及头与颈癌的至少一种癌症。

8. 权利要求1的方法，其中测定所述样品中的EGFr基因拷贝数包括比较所述样品中的EGFr基因拷贝数与正常参考样品中的EGFr基因拷贝数。

9. 权利要求8的方法，其中测定所述EGFr基因拷贝数包括荧光原位杂交分析。

10. 权利要求8的方法，其中测定所述EGFr基因拷贝数包括定量PCR分析。

11. 权利要求8的方法，其中测定所述EGFr基因拷贝数包括DNA印迹分析。

12. 权利要求1的方法，其中测定所述EGFr基因拷贝数包括：

(a)测定来自所述受试者肿瘤的测试样品中的EGFr基因拷贝数；

(b)测定所述测试样品中的至少一种参考核苷酸序列的拷贝数；和

(c)比较所述EGFr基因拷贝数与所述至少一种参考核苷酸序列的拷贝数，其中所述测试样品中的所述EGFr基因拷贝数相对于所述至少一种参考核苷酸序列的拷贝数增加预示EGFr特异性结合剂治疗在所述受试者的EGFr相关癌症治疗中将是有效的。

13. 权利要求12的方法，其中所述至少一种参考核苷酸序列的拷贝数是每个细胞2个拷贝。

14. 权利要求12的方法，其中所述至少一种参考核苷酸序列是着丝粒序列。

15. 权利要求12的方法，其中测定所述EGFr基因拷贝数和所述至少一种参考核苷酸序列的拷贝数包括荧光原位杂交分析。

16. 权利要求12的方法，其中测定所述EGFr基因拷贝数和所述至少一种参考核苷酸序列的拷贝数包括定量PCR分析。

17. 权利要求12的方法，其中测定所述EGFr基因拷贝数和所述至少一种参考核苷酸序列的拷贝数包括DNA印迹分析。

18. 权利要求12的方法，其中所述EGFr相关癌症是实体瘤。

19. 权利要求18的方法，其中所述实体瘤是选自结肠直肠癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、肾癌以及头与颈癌的至少一种癌症。

20. 权利要求12的方法，其中所述EGFr特异性结合剂治疗包括抗EGFr抗体。

21. 权利要求20的方法，其中所述抗EGFr抗体是人抗EGFr抗体。

22. 权利要求21的方法，其中所述人抗EGFr抗体是帕尼单抗。

23. 权利要求12的方法，其中所述EGFr特异性结合剂治疗包括EGFr特异性结合剂和至少一种化学治疗剂。

24. 权利要求1的方法，其中测定所述EGFr基因拷贝数包括：

(a)测定来自所述受试者的测试样品中的EGFr基因拷贝数；

(b)测定所述测试样品中的核数目；和

(c)比较所述EGFr基因拷贝数与所述核数目，其中大于2的比率预示EGFr特异性结合剂治疗在所述受试者的EGFr相关癌症治疗中将是有效的。

25. 权利要求24的方法，其中测定所述EGFr基因拷贝数和所述核数目包括荧光原位杂交分析。

26. 权利要求24的方法，其中所述EGFr相关癌症是实体瘤。

27. 权利要求26的方法，其中所述实体瘤是选自结肠直肠癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、肾癌以及头与颈癌的至少一种癌症。

28. 权利要求24的方法，其中所述EGFr特异性结合剂治疗包括抗EGFr抗体。

29. 权利要求28的方法，其中所述抗EGFr抗体是人抗EGFr抗体。

30. 权利要求29的方法，其中所述人抗EGFr抗体是帕尼单抗。

31. 权利要求24的方法，其中所述EGFr特异性结合剂治疗包括EGFr特异性结合剂和至少一种化学治疗剂。

32. 一种治疗患有EGFr相关癌症的受试者的方法，其包括：

(a)测定来自所述受试者样品中的EGFr基因拷贝数；

(b)测定所述样品中的EGFr基因拷贝数是否增加；和

(c)如果所述样品中的EGFr基因拷贝数增加，那么给所述受试者施用药学有效量的EGFr特异性结合剂。

33. 权利要求32的方法，其中所述EGFr特异性结合剂是抗EGFr抗体。

34. 权利要求33的方法，其中所述抗EGFr抗体是人抗EGFr抗体。

35. 权利要求34的方法，其中所述人抗EGFr抗体是帕尼单抗。

36. 权利要求32的方法，其中所述EGFr特异性结合剂与至少一种化学治疗剂一起施用。

37. 一种测定患者中的治疗功效的方法，其包括：

(a)测定从患者获得的第一种样品中的EGFr基因拷贝数，以获得第一种EGFr基因拷贝数水平；

(b)给所述患者施用所述治疗；

(c)测定来自所述治疗施用后某时的所述患者的第二种样品中的所述EGFr基因拷贝数，从而产生第二种EGFr基因拷贝数水平；和

(d)比较所述第一种和第二种EGFr基因拷贝数水平，其中所述第二种EGFr基因拷贝数水平中的所述EGFr基因拷贝数相对于所述第一种EGFr基因拷贝数水平降低表明所述治疗在所述患者中是有效的。

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