CN102002476A - 一种体外培养人体黏膜活组织模型及其建立方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属生物医学技术领域，涉及传染性疾病的体外感染模型，具体涉及性传播疾病预防、以及粘膜免疫中感染模型及其建立方法，尤其涉及一种体外培养人体黏膜活组织模型及其建立方法和应用。本发明通过对离体组织样本预处理，采用不同组织培养方式及观察不同培养天数的组织形态变化、检测组织存活力、评价组织对药物浓度变化的敏感性和采用假病毒感染粘膜组织提供一种体外培养人体黏膜活组织模型。本发明模型适用于离体人体活组织的体外感染，为探索高活性长期体外培养，再现HIV-1感染人体靶细胞的真实轨迹，为HIV-1粘膜感染机制研究以及新型生物预防技术的安全性和有效性的临床前评价研究提供技术平台。本发明方法可在生物安全二级实验室中开展。

Description

一种体外培养人体黏膜活组织模型及其建立方法和应用

技术领域

本发明属生物医学技术领域，涉及传染性疾病的体外感染模型，具体涉及性传播疾病预防、以及粘膜免疫中感染模型及其建立方法，尤其涉及一种体外培养人体黏膜活组织模型及其建立方法和应用

背景技术

据报道，我国男性接触人群(Men who have sex with men，MSM)艾滋病病毒(Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)感染的比例迅速地增长。2009年新发感染者中，MSM感染者的比例已高达30％。诸多研究显示，MSM间无保护的肛肠性行为发生感染HIV的风险是生殖道性行为的十几倍甚至数十倍之多。此外，异性之间也有采用直肠性接触的报告，该种行为方式，明显促进了HIV的粘膜感染与传播。因此，阻断HIV粘膜的传播和局部生殖道播撒是预防感染和最终遏制HIV流行的关键。目前，完成这个目标的最佳策略是通过设计和实施有效的疫苗与局部微生物杀菌剂，抑或暴露后预防用药的时机与时效的研究，而这些均要求深刻理解HIV粘膜感染的机制，准确评价生物预防技术的安全性。

目前，国内外粘膜感染研究所采用的动物模型绝大多数是HIV和猴免疫缺陷病毒SIV的嵌和病毒SHIV/非人类灵长类(猴子)模型，实验需要在大动物生物安全三级实验室(P3)进行，成本较高，而且动物的来源与实验设施的可及性均受到很大限制。近年来，有学者开始探索建立新型粘膜活组织模型如女性生殖道组织以及肠道粘膜活组织模型等，但是培养组织结构完整性与高活性一般维持3-7天，时间较短，无法满足模拟HIV感染生物轨迹需求(一般细胞培养7-10天以上，才会观察到明显的病毒复制增加)。此外，国外在研究中采用的病毒株绝大多数具有多重复制周期(包括HIV-1病毒临床分离株或实验室构建的感染性克隆)，相关实验需要在普通的P3实验室中完成，实验仍然受到一定限制。假病毒感染体系由编码病毒包膜蛋白的质粒与病毒骨架质粒共同转染哺乳动物细胞系而制备的单一感染周期的病毒，感染靶细胞之后不具有复制能力，不形成子代感染性病毒颗粒，因此，相关实验可以在生物安全二级实验室(P2)中进行。迄今为止，国内尚无有关采用假病毒感染体系进行此类研究的报告。

发明内容

本发明的目的在于针对HIV-1感染宿主研究的适宜动物模型的局限性，提供一种体外培养人体黏膜活组织模型，尤其是建立一种HIV粘膜感染活组织模型及其建立方法和应用

本发明建立的HIV粘膜感染活组织模型可再现HIV-1感染人体靶细胞的真实轨迹，为HIV-1粘膜感染机制研究、以及阻断粘膜感染的新型生物预防技术和粘膜局部应用的抗病毒药物的安全性和有效性的临床前评价研究提供技术平台。

本发明的一种体外培养人体黏膜活组织模型，其特征在于，通过病毒感染离体后体外培养的粘膜组织，模拟病毒粘膜感染的生物学轨迹，建立了体外培养人体黏膜活组织模型。该模型可作为研究艾滋病病毒(HIV)粘膜免疫的体外模型。

本发明中，所述的离体粘膜组织包括但不限于HIV性传播途径的生殖道/器或消化道组织如肠道粘膜等；

本发明中，所述的病毒包括但不限于HIV的单一感染周期的假病毒、感染性克隆、实验室株、临床分离株或其他种类病毒。

具体而言，本发明的体外培养人体黏膜活组织模型，通过下述方法和步骤制备：

1、对离体组织样本预处理

对离体的临床手术标本组织进行预处理，本发明中(以肠粘膜为例)，肠道手术男性患者控制年龄范围在40-60岁之间(与MSM的HIV性传播高危人群年龄段之一近似)，如为肿瘤患者则选取行mills术且病理诊断所取标本无癌细胞转移及其他异常病变的癌旁组织；非肿瘤患者(如直肠脱垂、肠梗阻等)则取离体标本病灶远端的正常组织；标本离体后尽快取下组织块，浸入器官移植保护液，1-2小时内运至实验室。用含高剂量抗生素(青链霉素：2000U/ml)的DMEM培养基冲击并清除组织块中附着的细菌、真菌等污染物，保证培养期间无污染现象发生。以上取材要求及培养环节均是延长组织高活性培养时间并保持组织结构完整的重要条件。

2、组织培养：

采用下述培养方式：

(1)Transwell小室培养(如图1所示)：将预处理的组织钻取成块，粘膜面向上置于transwell上室中孔径为3.0μm的滤膜上，用含3％琼脂糖的培养基将组织四周封闭，露出粘膜面，使之形成上下相对独立的空间(即当向上室内加入病毒液时，HIV-1只能通过粘膜层进入下室)，上室加入50-100ulDMEM培养液，下室中液面高于上室底部滤膜，使粘膜底部与培养基能充分接触。37℃，5％ CO2培养；

或，

(2)海绵筏支撑培养：将预处理的组织钻取成块，粘膜面向上置于预先在DMEM培养基中浸泡的海绵筏上，放入12孔板中，培养基液面不超过海绵筏。37℃，5％ CO2培养；

或，

(3)浸入培养：将预处理的组织钻取成块，直接浸入DMEM培养基中培养。

以上方法，均每2-3天更换半量新鲜DMEM培养基。

或，采用本领域公知组织培养方法。

3、观察组织形态变化

取培养后不同天数的组织块，经甲醛固定，石蜡包埋，通过苏木精一伊红(HE)染色法，在显微镜下观察组织结构。

4、噻唑蓝(MTT)法检测组织存活力.

取培养不同天数的组织块置于干净的48孔板中，每孔含一个组织块，并加入400ul含0.5mg/ml MTT的DMEM培养基，37℃，5％CO2培养3小时，弃去上清液，用PBS冲洗组织块，加入等体积的溶解液过夜浸泡，将组织块中的甲瓒溶出，570nm波长处测定吸光度值，以新鲜组织的MTT值为基数，计算组织活力百分数。

5、病毒感染粘膜组织

本发明中，采用的感染病毒株包括HIV-1病毒株(多复制周期)与假病毒株(单一感染周期)，向粘膜培养孔中接种病毒，37℃，5％CO2孵育过夜，次日用PBS清洗粘膜组织，充分去除游离病毒，换新鲜培养基继续培养，假病毒株感染者在实验结束时收集组织进行P24核酸检测；HIV病毒株感染者在实验中定期收集培养上清，ELISA法检测p24含量。

6.评价组织对药物浓度变化的敏感性.

取离体的直径6mm新鲜的组织块，分别放入48孔培养板中，对照组和每个药物浓度均设3复孔，将待测药物(以阻断HIV粘膜感染的第一代微生物杀菌剂N-9为例)10倍梯度稀释，加入孔中，与组织块孵育过夜。次日用PBS洗去粘膜上残留药物，换干净培养板及新鲜400ul含0.5mg/ml MTT的培养基，37℃，5％CO2培养3小时，弃去上清液，用PBS冲洗组织块，更换成等体积的溶解液将组织块中的甲瓒溶出，570nm波长处测定吸光度值，以不加药物的孔作为对照，计算组织活力百分数。

结果显示，本发明的体外粘膜感染模型能成功培养人肠粘膜组织，并保持完整结构和高活性近14天。本发明的模型可被HIV病毒株及其假病毒感染，其中浸入法较海绵筏支撑培养法更为易感。同时，该模型可敏感的反映出粘膜用药物浓度的变化；已知N-9临床实验评价浓度为4％，本模型实验结果显示，当使用的药物浓度为0.5％时，本发明所建立的活组织模型的活性已降到10％以下，能灵敏地反映出N-9对组织的毒性，提示N9不是一种安全的粘膜用药物，该一结论与N-9临床实验结果一致。证明本发明的体外培养人体黏膜活组织模型可以作为粘膜用药的安全评价技术平台之一。

本发明所建立的模型其应用范围包括但不限于HIV粘膜感染机制的研究、待测药物临床前安全性与有效性评价、粘膜局部免疫学研究等。

本发明中，所述的待测药物包括但不局限于化学合成药物、生物药物、微生物杀菌剂与粘膜疫苗等。

本发明中，所述的待测药物临床前安全性包括但不限于药物对直接施用部位粘膜以及非直接施用部位的毒性、对粘膜免疫系统的激活与致病作用、以及粘膜被致病原感染的敏感性增加作用等。

本发明所采用的离体组织可在普通的P3实验室中开展感染实验，明显降低了实验成本。当感染的病毒采用假病毒体系时，可显著降低实验的生物安全风险，在P2实验室即可完成。同时，采用单一感染周期的假病毒，病毒进入首感细胞后不再扩散，有利于HIV粘膜感染机制的研究；

本发明在维持活组织的结构完整性与组织活性的前提下，显著延长了人体黏膜组织体外培养的时间。

本发明克服了现有技术的不足，解决下述技术问题：

1)活组织体外培养模型的建立：控制组织内源性或外源性污染并在体外培养过程中保持较为完整的组织结构，尽可能维持较高的组织活性；

2)活组织模型对再现HIV粘膜感染的适用性：采用HIV-1病毒株(多复制周期)与假病毒株(单一感染周期)，接种活组织模型；在感染后不同培养时间，或通过报告基因或直接检测病毒P24蛋白/核酸水平的增长变化。提供一种HIV体外粘膜感染模型的建立方法；

3)所建立的组织模型对粘膜外用药物的敏感性：系列药物浓度下，MTT法检测组织活力的变化，可提供一种粘膜局部用药的安全性评价方法；

若同时结合2)和3)中提供的粘膜感染方法和粘膜局部用药的方法，还可提供一种粘膜局部用药的有效性的评价方法。

本发明的有益效果在于：

1、与现有技术的细胞模型相比：本活组织模型具有局部组织完整的粘膜表皮及下层复杂的细胞构成，可从多细胞综合作用的角度来观测病毒感染轨迹以及对药物的敏感性，弥补了细胞系种类单一的不足；

2、与现有技术的动物模型相比：由于HIV-1对小动物不敏感的特殊情况，目前常用动物模型仅限于非人灵长类猴子模型，成本昂贵，来源有限，同时必须在大动物P3实验室中进行。本发明的离体组织直接来源于人体，可更为真实的反映病毒感染的体内情况；同时实验可在普通的P3实验室进行，有效降低了实验的成本；

3、同时模型采用的假病毒体系进行感染，在P2实验室中即可进行，操作更加便利，成本也大幅降低；假病毒具有单轮感染周期特性，当其进入首个靶细胞后不会发生进一步的传播，因此，利用假病毒来定位HIV粘膜感染的首感靶细胞较病毒株更为可信。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的HIV体外感染模型的建立方法进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1：不同培养天数的结肠粘膜(HE染色，100x)，

其中，D0-D13分别代表培养第0天至第13天。

图2：MTT法检测结肠粘膜组织活性。

图3：结直肠粘膜活组织模型的N9反应性。(A)为10倍浓度稀释的初筛；(B)为精细分析。

图4：ELISA检测培养上清中p24含量，

其中，A两种培养方式的比较，B同一方式不同剂量的比较，T为TCID50。

具体实施方式

实施例1

采用本发明所述方法和步骤，以肠道粘膜组织培养为例，采用海绵筏支撑培养方式；药物敏感性实验中选择药物为第一代微生物杀菌剂粘膜微生物杀菌剂壬苯醇醚(N-9)；感染实验采用CCR5嗜性包膜的假病毒，同上述步骤操作：

取离体的肠道手术肠粘膜标本组织取下组织块，浸入器官移植保护液，1-2小时内用含青链霉素：2000U/ml的DMEM培养基冲击并清除组织块中附着的细菌、真菌等污染物，保证无污染发生；

将预处理的组织钻取成块，粘膜面向上置于预先在DMEM培养基中浸泡的海绵筏上，放入12孔板中，培养基液面不超过海绵筏。37℃，5％ CO2培养；

取培养后不同天数的组织块，经甲醛固定，石蜡包埋，通过苏木精一伊红(HE)染色法，在显微镜下观察组织结构形态变化；

噻唑蓝(MTT)法检测组织存活力：取培养不同天数的组织块置于干净的48孔板中，每孔含一个组织块，并加入400ul含0.5mg/ml MTT的DMEM培养基，37℃，5％CO2培养3小时，弃去上清液，用PBS冲洗组织块，加入等体积的溶解液过夜浸泡，将组织块中的甲瓒溶出，570nm波长处测定吸光度值，以新鲜组织的MTT值为基数，计算组织活力百分数；

向粘膜培养孔中接种CCR5嗜性包膜的假病毒，37℃，5％CO2孵育过夜，次日用PBS清洗粘膜组织，充分去除游离病毒，换新鲜培养基继续培养，实验结束时收集组织进行P24核酸检测；

取离体的直径6mm新鲜的组织块，分别放入48孔培养板中，对照组和每个药物浓度均设3复孔，将待测药物第一代微生物杀菌剂粘膜微生物杀菌剂壬苯醇醚(N-9)10倍梯度稀释，加入孔中，与组织块孵育过夜。次日用PBS洗去粘膜上残留药物，换干净培养板及新鲜400ul含0.5mg/ml MTT的培养基，37℃，5％CO2培养3小时，弃去上清液，用PBS冲洗组织块，更换成等体积的溶解液将组织块中的甲瓒溶出，570nm波长处测定吸光度值，以不加药物的孔作为对照，计算组织活力百分数，评价组织对药物浓度变化的敏感性。

结果显示：

1)培养中结肠粘膜的组织形态与活力：

通过HE染色观察培养第0天可见清晰肠粘膜上皮腺体及粘膜固有层结构，培养5天时组织结构依然良好，13天时粘膜组织结构依然可见(如图1所示)。经MTT法检测粘膜培养10天内组织活性，结果显示培养4天时组织活性高于80％，7天的活性可保持在50％左右(如图2所示)。

2)结肠粘膜模型对不同浓度药物的毒性反应：

以第一代粘膜微生物杀菌剂壬苯醇醚(N-9)为例，本发明检测了粘膜活组织模型对外用药物的浓度依赖性反应。如图3A所示，采用10倍稀释药物浓度梯度(从0.5％开始稀释，计5个浓度点)，对本发明模型的药物反应性进行分析。结果显示，随着N-9的浓度变化，组织模型的活性也呈现明显的变化。N-9浓度在0.005％以下时，组织模型维持良好的活性(90％以上)，高于该浓度时，对组织模型产生毒性。当N-9浓度超过0.05％时，粘膜组织的活性急剧降低，N-9浓度为0.5％时，组织活性降至10％以下。本发明在组织活性急剧下降的浓度区间(0.005％至0.05％)，进一步稀释了3个药物浓度(0.01625％/0.0275％/0.03875％)以探索N-9影响该模型组织活性的精细浓度范围(图3B)，结果显示，所培养的结肠粘膜组织的安全性(维持90-100％的组织活性)N-9药物浓度上限为0.01625％，50％的组织活性浓度点为0.03875％。

3)结肠粘膜模型对HIV病毒的易感性：

本发明检测了浸入法和海绵筏法培养方式建立的模型的HIV-1病毒的易感性。因为HIV-1性途径感染的病毒多为辅助受体CCR5嗜性的病毒(R5病毒)，故本实验所采用的病毒株亦为R5病毒包膜蛋白构建的单一感染周期的假病毒。初始感染剂量为4500个TCID50，通过检测感染后第1，4和8天的培养上清中p24的含量，监测粘膜活组织模型感染的建立。如图4A所示，采用浸入法培养的粘膜活组织在第一天的培养上清中即可检测到P24的浓度在80pg/ml以上，随着培养天数的增加，一直维持在100pg/ml的水平。而采用海绵伐的培养方法，在4500个TCID50的感染剂量下，直至至第8天时培养基中p24含量仅为10pg/ml以下。当增加感染剂量10倍(45000个TCID50)对海绵伐培养法的活组织进行感染(如图4B所示)，结果显示，在感染后第一天的培养上清中即检测到较高的P24表达(约75pg/ml以上)，其后一直保持与浸入法培养的活组织在4500个TCID50感染剂量下相似的趋势。上述结果提示，活组织模型培养的浸入法比海绵筏法相对易感。

Claims (8)

1.一种体外培养人体黏膜活组织模型，其特征在于，通过病毒感染离体后体外培养的粘膜组织，模拟病毒粘膜感染的生物学轨迹，建立体外培养人体黏膜活组织模型。

2.按权利要求1所述的体外培养人体黏膜活组织模型，其特征在于，所述的离体粘膜组织包括但不限于涉及HIV性传播途径的生殖道/器或消化道组织粘膜。

3.按权利要求1或2所述的体外培养人体黏膜活组织模型，其特征在于，所述的离体粘膜组织是离体肠道粘膜。

4.按权利要求1所述的体外培养人体黏膜活组织模型，其特征在于，所述的病毒包括但不限于HIV的单一感染周期的假病毒、感染性克隆、实验室株、临床分离株或其他种类病毒。

5.权利要求1的体外培养人体黏膜活组织模型的建立方法，其特征在于，其包括步骤：

1)对离体组织样本预处理

离体后组织块，浸入器官移植保护液，1-2小时内用含高剂量抗生素的DMEM培养基冲击并清除组织块中附着的细菌、真菌污染物，保证无污染发生；

2)组织培养：

采用Transwell小室培养，或海绵筏支撑培养，或浸入培养方式，37℃，5％ CO2培养培养上述预处理的组织块；

3)观察组织形态变化

取培养后不同天数的组织块，经甲醛固定，石蜡包埋，通过苏木精一伊红(HE)染色法，在显微镜下观察组织结构。

4)噻唑蓝法检测组织存活力.

取培养不同天数的组织块分别置48孔板中，加入含0.5mg/ml MTT的DMEM培养基，37℃，5％CO2培养3小时，弃上清，PBS冲洗组织块，加溶解液过夜浸泡，溶出甲瓒，570nm波长处测定吸光度值，，计算组织活力百分数；

5)病毒感染粘膜组织

采用HIV-1病毒株与假病毒株，接种于粘膜培养孔，37℃，5％CO2孵育过夜，次日用PBS清洗粘膜组织，去除游离病毒，换培养基培养，实验结束时收集组织进行P24核酸检测；HIV病毒株实验中定期收集培养上清，ELISA法检测p24含量。

6.权利要求1的体外培养人体黏膜活组织模型在制备HIV粘膜感染机制研究、待测药物临床前安全性与有效性评价或粘膜局部免疫学研究平台中的用途。

7.按权利要求6所述的用途，其特征在于所述的待测药物包括但不局限于化学合成药物、生物药物或微生物杀菌剂与粘膜疫苗。

8.按权利要求6所述的用途，其特征在于所述的待测药物临床前安全性包括但不限于药物对直接施用部位粘膜以及非直接施用部位的毒性、对粘膜免疫系统的激活与致病作用、以及粘膜被致病原感染的敏感性增加作用。

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