CN102002029B - 模拟移动床吸附分离提取大豆异黄酮的方法 - Google Patents
模拟移动床吸附分离提取大豆异黄酮的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102002029B CN102002029B CN2010105335997A CN201010533599A CN102002029B CN 102002029 B CN102002029 B CN 102002029B CN 2010105335997 A CN2010105335997 A CN 2010105335997A CN 201010533599 A CN201010533599 A CN 201010533599A CN 102002029 B CN102002029 B CN 102002029B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- isoflavone
- soybean isoflavones
- soybean meal
- soybean
- simulated moving
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
本发明的模拟移动床吸附分离提取大豆异黄酮的方法涉及一种具有药用和食用价值的大豆异黄酮的分离提取方法，是通过以下步骤实现的：脱脂豆粕在80℃下干燥1-3h，粉碎，将脱脂豆粕粉于85-90℃恒温下，加入脱脂豆粕粉总质量6-10倍的75%乙醇回流提取3次，时间依次为2、2、1h，滤过，3次提取滤液合并；乙醇提取液在45-50℃、0.1Pa条件下减压浓缩，制得大豆异黄酮粗提物；将大豆异黄酮粗提物制成进样液进入模拟移动床分离纯化，即制得质量百分比浓度5-15%，纯度60-90%的大豆异黄酮液体； 将大豆异黄酮液体进行喷雾干燥，即制得大豆异黄酮粉。本发明方法产品收率可达到90%，产品纯度达到92%以上，模拟移动床连续式的生产方式完全克服了柱层析间歇式方法的不足，其生产自动化程度高、工作效率高，生产环境安全环保，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有药用和食用价值的大豆异黄酮的分离提取方法，特别是涉及到一种模拟移动床吸附分离提取大豆异黄酮的方法。
背景技术
大豆异黄酮是大豆的次生代谢产物，具有很强的生物活性，素有“植物雌激素”的美称。根据化学结构的不同，大豆异黄酮可分为游离型的苷元和结合型的糖苷两大类。主要化学成分为染料木素、大豆苷元、染料木苷、大豆苷。研究表明，大豆异黄酮具有改善妇女更年期综合症，降低血液胆固醇，防止骨质疏松及抑制癌细胞生长等作用，还具有抗菌、抗氧化、抑制酪氨酸蛋白激酶活性等功能。大豆异黄酮已经广泛应用于医药、食品等行业。近年来日本相继开发出大豆异黄酮的系列产品，产品包括颗粒剂、粉剂、片剂、口服液和饮料等。澳大利亚用4种异黄酮以特定的比例混合制成植物雌激素的食品补充剂。经调查，市场对大豆异黄酮的年需求量在1500吨，而目前的年生产量为500吨。大豆异黄酮的价格相当可观，无疑是大豆增值的好产品。
关于大豆异黄酮的制备，国内外文献报道的多是实验室工艺。在国内，比较常见的是使用乙醇萃取、树脂吸附的方法来制备，此方法报道较多，工艺也比较成熟，但产品纯度和收率参差不齐，相差较大。在国外，关于大豆异黄酮的制备工艺，很多都申请了专利。主要的方法有稀碱液法、溶剂分步萃取法和树脂吸附法等。大豆异黄酮的精制方法有超滤膜法、吸附法、柱层析法、高效液相色谱法、重结晶和溶剂萃取等多种方法。但上述提取精制路线都存在一些缺点:酸水解法需用强酸，反应剧烈，容易造成环境污染，而这些方法还需配合有机溶剂萃取，还涉及到有机溶剂毒性问题；铅盐在沉淀过程中会包络一些有效成分，使有效成分损失很大；用三氧化二铝柱色谱法和正丁醇萃取法都涉及到正丁醇毒性和不易回收溶剂的问题；高速逆流色谱法分离效率高，但生产量太少；葡聚糖凝胶较贵且影响了其在大规模生产中的应用；硅胶柱样品上样量少，洗脱多用有毒的有机溶剂；聚酰胺柱吸附特异性高，上样量大，洗脱剂无毒，但大豆异黄酮回收率不高，最近还被认为其可能在产品中有残余而不适宜于工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种模拟移动床吸附分离提取大豆异黄酮的方法，旨在提高其产量和纯度，降低成本，提供规模化分离技术。
模拟移动床色谱，是规模化色谱分离技术的一种新发展，它是模拟移动床技术与色谱技术的结合，它既保留了色谱精细分离的优点，又将化工中的连续逆流、精馏、回流等因素集约进去，使系统具有规模化精细分离的能力。与传统的制备色谱技术相比，模拟移动床技术采用连续操作手段，这一点有利于实现自动化操作，制备效率高，每克填料每天制备量可达1克以上，制备量大，大型模拟移动床制备仪器每年制备量可达百万吨级水平。同时试剂的消耗量很少，可以节约试剂高达90%以上，在石油、精细化工、食品工业、药物工业(特别是手性药物工业)等诸多领域已经发挥很大作用，应用前景广阔。
本发明模拟移动床吸附分离提取大豆异黄酮的方法，是通过以下步骤实现的：
a、将脱脂豆粕在80℃下干燥1-3h，粉碎，备用；
b、将经a步骤处理的脱脂豆粕粉于85-90℃恒温下，加入脱脂豆粕粉总质量6-10倍的75%乙醇回流提取3次，时间依次为2、2、1h，滤过，3次提取滤液合并；乙醇提取液在45-50℃、0.1Pa条件下减压浓缩，制得大豆异黄酮粗提物；
c、将经b步骤制得的大豆异黄酮粗提物加水或乙醇制成质量百分比浓度为5-20%的进样液、进入模拟移动床分离纯化，即制得质量百分比浓度5-15%，纯度60-90%的大豆异黄酮液体；
d、将经c步骤制得的大豆异黄酮液体在蠕动泵进料量50-150Ml/h、进风口温度180-240℃、出风口温度60-90℃、气流式雾化条件下进行喷雾干燥，即制得大豆异黄酮粉。
本发明的模拟移动床连续吸附分离中吸附剂为大孔吸附树脂，吸附区原料流量为5-15BV/h（BV为吸附剂的柱床体积，下同）；解析剂为50%-80%的乙醇溶液，解析剂流量为10-25BV/h；冲洗剂为去离子水，冲洗剂流量为5-20BV/h；树脂吸附再生剂是2%-4%的NaOH溶液，再生剂流量为4-10BV/h；切换时间为600-800S；温度控制在25-60℃；全程压力控制范围为0.3-1.0MPa。
所述的大孔吸附树脂为AB-8弱极性大孔吸附树脂、ADS-8弱极性大孔吸附树脂、NKA-9极性大孔吸附树脂、X-5非极性大孔吸附树脂、DM301中极性大孔吸附树脂或ADS-7强极性大孔吸附树脂中的任何一种。
本发明方法产品收率可达到90%，产品纯度达到92%以上，模拟移动床连续式的生产方式完全克服了柱层析间歇式方法的不足，其生产自动化程度高、工作效率高，生产环境安全环保，适合工业化生产。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
本发明模拟移动床色谱分离提取大豆异黄酮的方法是以脱脂豆粕为原料通过以下步骤实现的：
(1)、将脱脂豆粕80℃干燥2h，粉碎，备用；
(2)、将经(1)步骤处理的0.5Kg脱脂豆粕粉于85℃恒温下，加入脱脂豆粕粉总质量6倍的、浓度为75%的乙醇回流提取3次，时间依次为2h、2h、1h，滤过，3次提取滤液合并；乙醇提取液在45℃，0.1Pa条件下减压浓缩，得大豆异黄酮粗提物；
(3)、将经(2)步骤制得的大豆异黄酮粗提物加水制成质量百分比浓度为5%的进样液、进入模拟移动床分离纯化，即制得质量百分比浓度5-15%，纯度60-90%大豆异黄酮液体；
(4)、将经(3)步骤制得的大豆异黄酮液体在蠕动泵进料量50Ml/h、进风口温度190℃、出风口温度68℃、气流式雾化条件下进行喷雾干燥，即制得大豆异黄酮粉。
其中步骤(3)模拟移动床吸附剂为AB-8弱极性大孔吸附树脂；解析剂为50%-80%的乙醇溶液；冲洗剂为去离子水；树脂吸附再生剂是2%-4%的NaOH溶液； 吸附区原料流量为6BV/h（BV为吸附剂的柱床体积，下同）；解析剂流量为12BV/h；冲洗剂流量8BV/h；再生剂流量为5BV/h；切换时间为600S；温度控制在26℃；压力控制为0.7MPa。
实施例2
本发明模拟移动床色谱分离提取大豆异黄酮的方法是以脱脂豆粕为原料通过以下步骤实现的：
(1)、将脱脂豆粕80℃干燥2h，粉碎，备用；
(2)、将经(1)步骤处理的1Kg脱脂豆粕粉于85℃恒温下，加入脱脂豆粕粉总质量8倍的75%乙醇回流提取3次，时间依次为2h、2h、1h，滤过，3次提取滤液合并；乙醇提取液在45℃，0.1Pa条件下减压浓缩，得大豆异黄酮粗提物；
(3)、将经(2)步骤制得的大豆异黄酮粗提物加水制成质量百分比浓度为15%的进样液、进入模拟移动床分离纯化，即制得质量百分比浓度5-15%，纯度60-90%大豆异黄酮液体；
(4)、将经(3)步骤制得的大豆异黄酮液体在蠕动泵进料量90Ml/h、进风口温度200℃、出风口温度70℃、气流式雾化条件下进行喷雾干燥，即制得大豆异黄酮粉。
其中步骤(3)模拟移动床吸附剂为ADS-8弱极性大孔吸附树脂；解析剂为50%-80%的乙醇溶液；冲洗剂为去离子水；树脂吸附再生剂是2%-4%的NaOH溶液；吸附区原料流量为7BV/h（BV为吸附剂的柱床体积，下同）；解析剂流量为10BV/h；冲洗剂流量5BV/h；再生剂流量为8BV/h；切换时间为650S；温度控制在35℃；压力控制为1.0MPa。
实施例3
本发明模拟移动床色谱分离提取大豆异黄酮的方法是以脱脂豆粕为原料通过以下步骤实现的：
(1)、将脱脂豆粕80℃干燥3h，粉碎，备用；
(2)、将经(1)步骤处理的1.5Kg脱脂豆粕粉于90℃恒温下，加入脱脂豆粕粉总质量10倍的75%乙醇回流提取3次，时间依次为2h、2h、1h，滤过，3次提取滤液合并；乙醇提取液在50℃，0.1Pa条件下减压浓缩，得大豆异黄酮粗提物；
(3)、将经(2)步骤制得的大豆异黄酮粗提物加水制成质量百分比浓度为20%的进样液、进入模拟移动床分离纯化，即制得质量百分比浓度5-15%，纯度60-90%大豆异黄酮液体；
(4)、将经(3)步骤制得的大豆异黄酮液体在蠕动泵进料量150Ml/h、进风口温度240℃、出风口温度90℃、气流式雾化条件下进行喷雾干燥，即制得大豆异黄酮粉。
其中步骤(3)模拟移动床吸附剂为NKA-9极性大孔吸附树脂；解析剂为50%-80%的乙醇溶液；冲洗剂为去离子水；树脂吸附再生剂是2%-4%的NaOH溶液；吸附区原料流量为15BV/h（BV为吸附剂的柱床体积，下同）；解析剂流量为25BV/h；冲洗剂流量20BV/h；再生剂流量为10BV/h；切换时间为800S；温度控制在60℃；压力控制为0.8MPa。
实施例4
本发明模拟移动床色谱分离提取大豆异黄酮的方法是以脱脂豆粕为原料通过以下步骤实现的：
(1)、将脱脂豆粕80℃干燥1.5h，粉碎，备用；
(2)、将经(1)步骤处理的0.8Kg脱脂豆粕粉于88℃恒温下，加入脱脂豆粕粉总质量7倍的75%乙醇回流提取3次，时间依次为2h、2h、1h，滤过，3次提取滤液合并；乙醇提取液在47℃，0.1Pa条件下减压浓缩，得大豆异黄酮粗提物；
(3)、将经(2)步骤制得的大豆异黄酮粗提物加入浓度为50%的乙醇制成质量百分比浓度为15%的进样液、进入模拟移动床分离纯化，即制得质量百分比浓度5-15%，纯度60-90%大豆异黄酮液体；
(4)、将经(3)步骤制得的大豆异黄酮液体在蠕动泵进料量120Ml/h、进风口温度210℃、出风口温度75℃、气流式雾化条件下进行喷雾干燥，即制得大豆异黄酮粉。
其中步骤(3)模拟移动床吸附剂为X-5非极性大孔吸附树脂；解析剂为50%-80%的乙醇溶液；冲洗剂为去离子水；树脂吸附再生剂是2%-4%的NaOH溶液；吸附区原料流量为9BV/h（BV为吸附剂的柱床体积，下同）；解析剂流量为15BV/h；冲洗剂流量13BV/h；再生剂流量为6BV/h；切换时间为700S；温度控制在30℃；压力控制为0.9MPa。
实施例5
本发明模拟移动床色谱分离提取大豆异黄酮的方法是以脱脂豆粕为原料通过以下步骤实现的：
(1)、将脱脂豆粕80℃干燥2h，粉碎，备用；
(2)、将经(1)步骤处理的1.2Kg脱脂豆粕粉90℃恒温下，加入脱脂豆粕粉总质量9倍的75%乙醇回流提取3次，时间依次为2h、2h、1h，滤过，3次提取滤液合并；乙醇提取液在48℃，0.1Pa条件下减压浓缩，得大豆异黄酮粗提物；
(3)、将经(2)步骤制得的大豆异黄酮粗提物加入浓度为50%的乙醇制成质量百分比浓度为10%的进样液、进入模拟移动床分离纯化，即制得质量百分比浓度5-15%，纯度60-90%大豆异黄酮液体；
(4)、将经(3)步骤制得的大豆异黄酮液体在蠕动泵进料量100Ml/h、进风口温度190℃、出风口温度85℃、气流式雾化条件下进行喷雾干燥，即制得大豆异黄酮粉。
其中步骤(3)模拟移动床吸附剂为DM301中极性大孔吸附树脂；解析剂为50%-80%的乙醇溶液；冲洗剂为去离子水；树脂吸附再生剂是2%-4%的NaOH溶液；吸附区原料流量为12BV/h（BV为吸附剂的柱床体积，下同）；解析剂流量为16BV/h；冲洗剂流量15BV/h；再生剂流量为4BV/h；切换时间为750S；温度控制在30℃；压力控制为0.3MPa。
实施例6
本发明模拟移动床色谱分离提取大豆异黄酮的方法是以脱脂豆粕为原料通过以下步骤实现的：
(1)、将脱脂豆粕80℃干燥2h，粉碎，备用；
(2)、将经(1)步骤处理的1Kg脱脂豆粕粉于89℃恒温下，加入脱脂豆粕粉总质量8倍的75%乙醇回流提取3次，时间依次为2h、2h、1h，滤过，3次提取滤液合并；乙醇提取液在48℃，0.1Pa条件下减压浓缩，得大豆异黄酮粗提物；
(3)、将经(2)步骤制得的大豆异黄酮粗提物加入浓度为50%的乙醇制成质量百分比浓度为10%的进样液、进入模拟移动床分离纯化，即制得质量百分比浓度5-15%，纯度60-90%大豆异黄酮液体；
(4)、将经(3)步骤制得的大豆异黄酮液体在蠕动泵进料量130Ml/h、进风口温度220℃、出风口温度85℃、气流式雾化条件下进行喷雾干燥，即制得大豆异黄酮粉。
其中步骤(3)模拟移动床吸附剂为ADS-7强极性大孔吸附树脂；解析剂为50%-80%的乙醇溶液；冲洗剂为去离子水；树脂吸附再生剂是2%-4%的NaOH溶液；吸附区原料流量为12BV/h（BV为吸附剂的柱床体积，下同）；解析剂流量为20BV/h；冲洗剂流量12BV/h；再生剂流量为8BV/h；切换时间为800S；温度控制在29℃；压力控制为0.5MPa。
Claims (2)
1.模拟移动床吸附分离提取大豆异黄酮的方法，是以脱脂豆粕为原料通过以下步骤实现的：
a、将脱脂豆粕在80℃下干燥1-3h，粉碎，备用；
b、将经a步骤处理的脱脂豆粕粉于85-90℃恒温下，加入脱脂豆粕粉总质量6-10倍的75%乙醇回流提取3次，时间依次为2h、2h、1h，滤过，3次提取滤液合并；乙醇提取液在45-50℃、0.1Pa条件下减压浓缩，制得大豆异黄酮粗提物；
c、将经b步骤制得的大豆异黄酮粗提物加水或乙醇制成质量百分比浓度为5-20%的进样液、进入模拟移动床分离纯化，即制得质量百分比浓度5-15%，纯度60-90%的大豆异黄酮液体；
d、将经c步骤制得的大豆异黄酮液体在蠕动泵进料量50-150ml/h、进风口温度180-240℃、出风口温度60-90℃、气流式雾化条件下进行喷雾干燥，即制得大豆异黄酮粉。
2.如权利要求1所述的模拟移动床吸附分离提取大豆异黄酮的方法，其特征在于c步骤中模拟移动床分离纯化为模拟移动床连续吸附分离，其中，所用吸附剂为大孔吸附树脂，吸附区原料流量为5-15BV/h；解析剂为50%-80%的乙醇溶液，解析剂流量为10-25BV/h；冲洗剂为去离子水，冲洗剂流量为5-20BV/h；树脂吸附再生剂是2%-4%的NaOH溶液，再生剂流量为4-10BV/h；切换时间为600-800s；温度控制在25-60℃；全程压力控制范围为0.3-1.0MPa。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010105335997A CN102002029B (zh) | 2010-11-06 | 2010-11-06 | 模拟移动床吸附分离提取大豆异黄酮的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010105335997A CN102002029B (zh) | 2010-11-06 | 2010-11-06 | 模拟移动床吸附分离提取大豆异黄酮的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102002029A CN102002029A (zh) | 2011-04-06 |
| CN102002029B true CN102002029B (zh) | 2012-01-11 |
Family
ID=43809763
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010105335997A Expired - Fee Related CN102002029B (zh) | 2010-11-06 | 2010-11-06 | 模拟移动床吸附分离提取大豆异黄酮的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102002029B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102688266A (zh) * | 2012-06-15 | 2012-09-26 | 通化师范学院 | 一种模拟移动床色谱分离提纯藤梨根黄酮的方法 |
| CN107569535A (zh) * | 2017-09-22 | 2018-01-12 | 右江民族医学院 | 一种提取地枫皮有效成分的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1552703A (zh) * | 2003-06-04 | 2004-12-08 | 清华同方股份有限公司 | 一种从大豆乳清废水中提取大豆异黄酮的方法 |
| CN1680357A (zh) * | 2005-01-31 | 2005-10-12 | 重庆工学院 | 提取大豆异黄酮和大豆浓缩蛋白、大豆低聚糖的工艺 |
| CN101085768A (zh) * | 2007-07-11 | 2007-12-12 | 广东药学院 | 一种大豆异黄酮苷元的制备方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7524526B2 (en) * | 2002-04-10 | 2009-04-28 | Archer-Daniels-Midland Company | Process for producing high purity isoflavones |
-
2010
- 2010-11-06 CN CN2010105335997A patent/CN102002029B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1552703A (zh) * | 2003-06-04 | 2004-12-08 | 清华同方股份有限公司 | 一种从大豆乳清废水中提取大豆异黄酮的方法 |
| CN1680357A (zh) * | 2005-01-31 | 2005-10-12 | 重庆工学院 | 提取大豆异黄酮和大豆浓缩蛋白、大豆低聚糖的工艺 |
| CN101085768A (zh) * | 2007-07-11 | 2007-12-12 | 广东药学院 | 一种大豆异黄酮苷元的制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 阮洪生等.大豆异黄酮纯化方法研究进展.《粮食与油脂》.2009,(第10期),8-10. * |
| 黄才欢等.大孔树脂分离纯化大豆胚芽中异黄酮的研究.《中国食品学报》.2006,第6卷(第1期),334-337. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102002029A (zh) | 2011-04-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103570664B (zh) | 一种从越橘中提取原花青素的方法 | |
| CN101381363B (zh) | 一种碱水提取大孔吸附树脂分离水飞蓟素的方法 | |
| CN109232346B (zh) | 一种叶黄素和万寿菊黄酮的工业化制备方法 | |
| CN103333067B (zh) | 一种高纯度绿原酸的提取方法 | |
| CN102516325B (zh) | 一种以栀子为原料生产纯度大于95%的藏红花素的方法 | |
| CN1974527B (zh) | 从杜仲叶制备高纯度绿原酸和总黄酮的方法 | |
| CN109394811B (zh) | 一种工业化提取万寿菊黄酮的方法及其万寿菊黄酮 | |
| CN104585651B (zh) | 一种标准化红枣提取物及其制备和分析方法 | |
| CN110372554A (zh) | 一种快速高效地提取叶黄素和槲皮万寿菊素的工业化方法 | |
| CN107325138A (zh) | 一种从黑加仑果渣中提取分离纯化四种主要花色苷的方法 | |
| CN113754518A (zh) | 一种从工业大麻花叶中高效提纯大麻二酚的方法 | |
| CN110724589A (zh) | 一种制备大麻二酚联产大麻全谱油的方法 | |
| CN107098942B (zh) | 一种亚临界水萃取萝卜叶中山奈苷的方法 | |
| CN104447941B (zh) | 一种油茶果壳中低聚原花青素和茶皂素同步提取的方法 | |
| CN101928273A (zh) | 从大豆中提取分离异黄酮的方法 | |
| CN102002029B (zh) | 模拟移动床吸附分离提取大豆异黄酮的方法 | |
| CN101974577A (zh) | 一种新型提取大豆异黄酮苷元的生产工艺 | |
| CN102020544A (zh) | 一种明日叶中查耳酮类成分的提取工艺 | |
| CN107382943B (zh) | 一种亚临界水萃取高粱麸皮中二氢槲皮素的方法 | |
| CN104356105A (zh) | 一种高含量egcg的制备方法 | |
| CN104193711A (zh) | 一种从芹菜中提取芹菜素的新方法 | |
| CN103289969A (zh) | 一种从植物茎叶中提取超氧化物歧化酶的方法 | |
| CN103833805A (zh) | 一种甘草中甘草酸的精制工艺 | |
| CN103396461B (zh) | 一种亚麻木酚素的分离提纯方法 | |
| CN108997359A (zh) | 一种从甜菊糖生产废渣中提取叶绿素的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120111 Termination date: 20161106 |