CN102001996A

CN102001996A - 一种抑制结核杆菌生长的化合物及其制备方法

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Publication number: CN102001996A
Application number: CN2009101951056A
Authority: CN
Inventors: 王洪海; 张雪莲; 郑保富; 陆静宁
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2009-09-03
Filing date: 2009-09-03
Publication date: 2011-04-06
Anticipated expiration: 2029-09-03
Also published as: CN102001996B

Abstract

本发明属化学合成领域，涉及一种抑制结核杆菌生长的化合物及其制备方法。本发明的针对日益严重的结核病疫情以及耐药结核病的出现，提供具有通式(I)结构的1-乙基-4-羟基-2-氧-N’-十三甲酰基-1，2-二氢喹啉-3-甲酰肼或其药学可接受的无毒盐。本发明的化合物经体外结核杆菌抑制试验证实，可以有效地抑制结核杆菌的生长MIC范围0.4-2ug/ml，而且对临床耐药结核杆菌的生长也有明显的抑制效果。

Description

一种抑制结核杆菌生长的化合物及其制备方法

技术领域

本发明属化学合成领域，涉及一种抑制结核杆菌生长的化合物及其制备方法。

背景技术

肺结核是由结核分枝杆菌引起的慢性呼吸道传染病，据调查，目前由结核病引起死亡人数占全球单一感染因素死亡人数的第一位。随着化疗药物的应用，结核病曾得到有效控制。但是受人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的流行、多重耐药结核分枝杆菌感染增多的影响，结核病疫情出现明显回升。

当前我国结核病的疫情十分严重。在全球仅次于印度而居世界第二位。根据最新全国结核病流行病学抽样调查结果分析：全国有5.5亿人感染结核菌，患活动性肺结核者达450万，其中传染性肺结核病人达200万，75％肺结核病人年龄在15-50岁，严重影响劳动生产力。

调查显示，由于耐药结核病的出现，引发了全球第三次结核病的回升。全球5000万人感染的耐药菌中20％为耐多药结核菌，全球2000万肺结核病人中至少有2/3发展为耐多药肺结核。WHO/IUATLD的最新耐药监测估计，在新病人中，10.2％的病人至少对一种抗结核药物耐药，MDR-TB耐药率1.1％；在复治病人中，18.4％的病人至少对一种抗结核药物耐药，MDR-TB耐药率7.0％。由此估计全球每年新出现30-60万MDR-TB病人(World Health Organization Tuberculosis Programme.http://www.who.int/tb/en/)。我国2000年全国结核病调查总耐药率为27.8％，异烟肼、利福平(HR)的耐药率为10.7％。治疗时间显示，耐多药肺结核(MDR-TB)的治愈率仅为敏感病例的50％～60％，死亡率高达37％-89％(金周德，于关成，曹洪顺.吉林医学，2008，29(1)：72-74.)。研发出针对耐药菌株的药物已是迫在眉睫。

目前国内外聚焦于研究开发新型抗结核药物，当前国际上取得较好研究进展的新药有：

(1)新型氟喹诺酮类药物

具有强有力的杀灭结核分枝杆菌的作用，可进一步缩短结核病的化疗疗程，治疗耐多药结核，对潜伏结核感染(LTBI)也有良好效果。在众多的新型氟喹诺酮类药物中目前最为引人关注的是莫西沙星和加替沙星(Alvirez-Freites EJ，Carter JL，Cynamon MH.Antimicrob.Agents Chemother，2002，46，1022-1025.

(2)二芳基喹啉类药物

最具代表性的是R207910，化学名为1-(6-溴基-2-甲氧基-喹啉-3-基)-4-二甲氨基-2-萘-1-基-1-苯基-丁烷-2-苯，分子式为C₃₂H₃₁BrN₂O₂，分子质量为555.51。R207910在体外具有选择性的抗分枝杆菌的作用，它对药物敏感株和耐药株都具有活性，MIC值为0.03～0.12μg/ml。它的作用靶点是ATP合成酶的质子泵(Andries K，Verhasselt P，Guillemont J，et al.Science，2005，307：223-7)，研究表明它比现有的药物更有效，并且具有较长的半衰期和针对ATP合成酶的独特的作用机制。临床前和I期临床实验数据显示药物没有明显的毒性，在小鼠的感染模型中，R207910、利福平和吡嗪酰胺联合或R207910、异烟肼和吡嗪酰胺联合治疗一个月所得到的杀菌效果与异烟肼、利福平和吡嗪酰胺联合治疗两个月的效果相媲美，显示了该药物可以有效缩短治疗时间(Andries K，Verhasselt P，Guillemont J，et al Science，2005，307：223-227)。此外，小鼠和健康人群对此药有很好的耐受性。R207910目前现在正进行II期临床实验。

(3)硝基咪唑吡喃类药物

该类药物中研究较为深入的为PA-824。PA-824是一种新的硝基咪唑吡喃类药物，分子质量为359，自2002年起全球结核联盟就对PA-824抗结核分枝杆菌的作用开展了研究。其抗各种结核分枝杆菌敏感菌株的MIC值为≤0.015～0.25μg/ml，与INH相仿(0.03～0.06μg/ml)，在众多的分枝杆菌中该药仅对结核分枝杆菌复合群具有抗菌活性，对革兰阳性和阴性菌无明显作用。PA-824对非繁殖期结核分枝杆菌或持存菌和耐药菌株均有较强的抗菌活性，它是通过与F420共因子，抑制蛋白和细胞壁脂类的合成而发挥作用的(Stover CK，Warrener P，VanDevanter DR，et al.Nature，2000，405：962-6；Tyagi S，Nuermberger E，Yoshimatsu T，et al.Antimicrob AgentsChemother，2005，49：2289-93；Lenaerts AJ，Gruppo V，Marietta KS，et al.Antimicrob Agents Chemother，2005，49：2294-301)，其与传统的抗结核药物之间无交叉耐药性。

(4)二胺类药物

其中SQ109最具代表性，SQ109是在EMB的基础上发展起来的第二代抗生素，但由于其结构和细胞内作用靶位均与EMB有所不同，因此，它是一种全新的抗分枝杆菌药物，而非EMB的类似物。SQ109的化学名为N-金刚烷基-2-基-N′-(3，7-二甲基辛-2，6-二烯)-乙烷-1，2-二胺，其作用机制可能作为一种细胞壁的抑制剂，诱导启动子Rv0341，但其作用的特异性靶位还不清楚。SQ109抗结核分枝杆菌的MIC值为0.1～0.63μg/ml。SQ109在体外、体内和药代动力学上都显示了很好的前景，目前正进入临床实验(Jia L，Tomaszewski JE，HanrahanC，et al.Pharmacol，2005，144：80-87.)。

(5)Tetrahydrobenzothiophene(AX20017)

显示抑制结核分枝杆菌pknG激酶活性。pknG的化学靶点导致了BCG在溶酶体的定位，消除巨噬细胞内的菌体(Walburger A，Koul A，Ferrari G，et al.Science，2004，304：1800-4)。AX20017代表一类靶向胞内持留分枝杆菌的新药的发展。

(6)OPC-67683

在体外对药物敏感株和耐药株都显示了极好的活性，与当前一线药物没有交叉耐药性(Matsumoto M.PLoS Med，2006，3：2131-2144)，且低剂量更有效。OPC-67683具有较长的半衰期，CYP酶作用的缺失和其在免疫功能受损小鼠体内的作用显示该药也许可以治疗结核与HIV共感染的病人。

发明内容

本发明的目的是针对日益严重的结核病疫情以及耐药结核病的出现，提供一种抑制结核杆菌生长的化合物。

所述的化合物是具有通式(I)结构的1-乙基-4-羟基-2-氧-N’-十三甲酰基-1，2-二氢喹啉-3-甲酰肼或其药学可接受的无毒盐。

本发明另一个目的是提供上述1-乙基-4-羟基-2-氧-N’-十三甲酰基-1，2-二氢喹啉-3-甲酰肼的制备合成方法。

本发明的化合物通过下述方法制备：

(1)将仪器无水无氧处理，N2保护，化合物A 16.3g在搅拌下加入200ml DMF中，冰浴下加入NaH 4.4g，有大量气泡产生，然后加入EtI 31.2g，搅拌反应30min，撤去冰浴，体系控制在20-30℃，搅拌过夜。溶液减压蒸馏至2/3体积，加入冰水，有大量固体析出，过滤得粗产品B(17.13g，90％)。

(2)仪器无水无氧处理，N2保护。搅拌下将丙二酸二乙酯61.7g溶于200ml DMF中，加入NaH 6g，有大量H2产生，加入化合物B 31.3g，温度升至110℃，保温4h。将DMF蒸出，加NH4Cl aq.，将体系用HCl调成酸性，有白色固体析出，过滤得产品C(23g，53％)。

(3)将化合物C 26.3g溶于100ml EtOH，搅拌下加入N2H4·H2O 15ml，温度升至EtOH回流，反应3小时后以TLC检测反应结束。先将体系温度降至室温，有大量固体析出，过滤得产品，将溶液旋干得大极性杂质。直接旋干得粗品D(78％)。

(4)冰浴下加入化合物D 2g和十三酸2.1g，加入50ml CH2Cl2搅拌。体系温度平衡后，加1.9g EDC·HCl和0.2g DMAP，撤掉冰浴，在室温下反应。加入稀HCl淬灭反应。收集CH2Cl2层，水相用CHCl3萃取。合并有机相，以NaHCO3饱和水溶液、NaCl饱和水溶液洗涤。有机相以Na2SO4干燥，抽滤，旋干得产品E。即得产品1-乙基-4-羟基-2-氧-N’-十三甲酰基-1，2-二氢喹啉-3-甲酰肼(3.3g，90％)。

本发明的进一步目的是提供含1-乙基-4-羟基-2-氧-N’-十三甲酰基-1，2-二氢喹啉-3-甲酰肼或者其药学可接受的无毒盐用于治疗由结核杆菌(包括耐药菌)引起的结核病。

本发明进行了1-乙基-4-羟基-2-氧-N’-十三甲酰基-1，2-二氢喹啉-3-甲酰肼体外抑制结核杆菌生长测定，经体外结核杆菌抑制试验证实，本发明所述的化合物可以有效地抑制结核杆菌的生长(MIC范围0.4-2ug/ml)，而且对临床耐药结核杆菌的生长也有明显的抑制效果。本发明对日益严重的结核病疫情以及耐药结核病的出现提供了一种能有效抑制结核杆菌生长的1-乙基-4-羟基-2-氧-N’-十三甲酰基-1，2-二氢喹啉-3-甲酰肼。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发现作进一步阐述，但不限制本发明。

实施例1：制备1-乙基-4-羟基-2-氧-N’-十三甲酰基-1，2-二氢喹啉-3-甲酰肼

步骤一：

将仪器无水无氧处理，N2保护，化合物A 16.3g在搅拌下加入200ml DMF中，冰浴下加入NaH 4.4g，有大量气泡产生，然后加入EtI 31.2g，搅拌反应30min，撤去冰浴，体系控制在20-30℃，搅拌过夜。溶液减压蒸馏至2/3体积，加入冰水，有大量固体析出，过滤得粗产品B(17.13g，90％)。

步骤二：

仪器无水无氧处理，N2保护。搅拌下将丙二酸二乙酯61.7g溶于200ml DMF中，加入NaH 6g，有大量H2产生，加入化合物B 31.3g，温度升至110℃，保温4h。将DMF蒸出，加NH4Cl aq.，将体系用HCl调成酸性，有白色固体析出，过滤得产品C(23g，53％)。

步骤三：

将化合物C 26.3g溶于100ml EtOH，搅拌下加入N2H4·H2O 15ml，温度升至EtOH回流，反应3小时后以TLC检测反应结束。先将体系温度降至室温，有大量固体析出，过滤得产品，将溶液旋干得大极性杂质。直接旋干得粗品D(78％)。

步骤四：

冰浴下加入化合物D 2g和十三酸2.1g，加入50ml CH2Cl2搅拌。体系温度平衡后，加1.9g EDC·HCl和0.2g DMAP，撤掉冰浴，在室温下反应。加入稀HCl淬灭反应。收集CH2Cl2层，水相用CHCl3萃取。合并有机相，以NaHCO3饱和水溶液、NaCl饱和水溶液洗涤。有机相以Na2SO4干燥，抽滤，旋干得产品E。即得产品1-乙基-4-羟基-2-氧-N’-十三甲酰基-1，2-二氢喹啉-3-甲酰肼(3.3g，90％)。

产品1-乙基-4-羟基-2-氧-N’-十三甲酰基-1，2-二氢喹啉-3-甲酰肼的检测方法为：C18柱，5um，15×4.6；流动相：20％CH3CN---80％CH3CN从0min-15min；流速为0.8ml/min；检测波长为215nm。

实施例2：1-乙基-4-羟基-2-氧-N’-十三甲酰基-1，2-二氢喹啉-3-甲酰肼体外抑制结核杆菌生长测定：

(1)结核杆菌的接种：取制备的1mg/ml结核杆菌H37Ra株菌悬液5ul，含菌数量1-5×10⁵，分别接种于每支含500ul7H9的液体培养基(7H9干粉4.7g/L，含2ml/L(v/v)甘油和10％ADC，)中。

(2)1-乙基-4-羟基-2-氧-N’-十三甲酰基-1，2-二氢喹啉-3-甲酰肼体外最小抑菌浓度(MIC)的测定：将1-乙基-4-羟基-2-氧-N’-十三甲酰基-1，2-二氢喹啉-3-甲酰肼进行倍比梯度稀释(100ug/ml，75ug/ml，50ug/ml，37.5ug/ml，25ug/ml，18.25ug/ml，12.5ug/ml，6.25ug/ml，3ug/ml，1.5ug/ml，0.75ug/ml)，于按上述方法接种的结核杆菌的培养管中添加各浓度梯度的化合物。接种完毕后，置37℃恒温孵箱内培养，3周观察结果。

本发明中，将能抑制培养基中细菌生长的最低浓度定为该化合物的最小抑菌浓度(MIC)。

本发明中，体外抗菌活性所测定的菌株范围包括无毒株H37Ra，H37Rv以及10株临床耐药分离菌株。

所述的化合物的体外抑菌活性结果显示，最小抑菌浓度的范围为0.4-2ug/ml。

实施例3：啮齿类鼠的急毒试验

实验动物为昆明鼠种，清洁级ICR小鼠，雌雄各半，体重为18-22g。实验饲养环境为温度为25±2℃，相对湿度为30％-70％，在生物二级环境中实验。小鼠实验实验前一周放置在此条件下以适应环境。

急毒实验前，小鼠禁食16h，小鼠采用单次灌胃给药，每组10只小鼠，雌雄各半，给药后继续禁食2h，整个实验过程中不禁水。通式(I)化合物的给药剂量为(mg/kg)：3200，4000，5000，6250，7812，给药后小鼠观察7天。给药7天后，对所有小鼠进行解剖，高于或等于5000mg/kg剂量组的小鼠中，部分小鼠脏器显示了一定的药物毒性，低于这一剂量的小鼠脏器没有明显的毒性反应。经分析，通式(I)化合物灌胃的半数致死量LD₅₀在5000mg/kg左右。

上述实施例中，所用的试验材料及其来源包括：

H37Ra菌株标准株为本实验室保存菌种，所有有毒株和耐药菌株购自上海市肺科医院检验科惠赠；7H9干粉和7H10干粉购自DIFCO公司；其他涉及的化学试剂均为分析纯，并从化学试剂公司购得。

Claims

1.一种抑制结核杆菌生长的化合物，其特征是，所述的化合物是如通式(I)结构的1-乙基-4-羟基-2-氧-N’-十三甲酰基-1，2-二氢喹啉-3-甲酰肼化合物或其药学可接受的无毒盐，

2.制备权利要求1所述的抑制结核杆菌生长的化合物的方法，其特征是通过下述反应式：

3.按权利要求2所述的方法，其特征是包括下述步骤：

(1)无水无氧处理仪器，N2保护，化合物A在搅拌下加入200ml DMF中，冰浴下加入NaH，气泡产生后，加入EtI，搅拌反应30min，撤去冰浴，体系控制在20-30℃，搅拌过夜；溶液减压蒸馏至2/3体积，加入冰水，固体析出，过滤得粗产品B；

(2)仪器无水无氧处理，N2保护，搅拌下将丙二酸二乙酯溶于DMF中，加入NaH，产生H2，加入化合物B，温度升至110℃，保温4h，将DMF蒸出，加NH4Cl aq.，将体系用HCl调成酸性，有白色固体析出，过滤得产品C；

(3)将化合物C溶于EtOH，搅拌下加入N2H4·H2O，温度升至EtOH回流，反应3小时后以TLC检测反应结束，将体系温度降至室温，固体析出，过滤得产品，将溶液旋干得大极性杂质，直接旋干得粗品D；

(4)冰浴下加入化合物D和十三酸，加入50ml CH2Cl2搅拌，体系温度平衡后，加EDC·HCl和DMAP，撤掉冰浴，室温下反应，加入稀HCl淬灭反应，收集CH2Cl2层，水相用CHCl3萃取，合并有机相，以NaHCO3饱和水溶液、NaCl饱和水溶液洗涤，有机相以Na2SO4干燥，抽滤，旋干得产品E。

4.式(I)的1-乙基-4-羟基-2-氧-N’-十三甲酰基-1，2-二氢喹啉-3-甲酰肼化合物或其药学可接受的无毒盐在制备治疗结核病药物中的用途。

5.按权利要求4的用途，其中所述的结核病由结核杆菌或耐药菌所引起。