CN102000346A - 一种纳米核酸导向药物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种纳米核酸导向药物及其制备方法和应用。该纳米核酸导向药物以纳米材料为载体，其中包含导向物和核酸药物；并且，所述的复合物的表面修饰有亲水性的化合物。本发明的纳米核酸导向药物靶向特异性好，对于血浆蛋白、血管壁以及其他组织的非特异性吸附低。

Description

一种纳米核酸导向药物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种纳米核酸导向药物及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，分子靶向药物在肿瘤治疗中显示出其价值。本领域中，把针对细胞受体、基因、调控分子等信号转导为靶点的治疗，称为“靶向治疗”。

靶向治疗是肿瘤治疗的趋势，其毒副作用低于细胞毒性药物，所以尽管目前靶向药物疗效不甚明显，但也已经为肿瘤患者带来希望，为肿瘤治疗提供了新的思路与方法。

许多核酸药物目前在临床应用上最大的难题就是在体内易于被降解的问题，难以到达靶点部位，这是本领域难以克服的技术难题，大大限制了其临床应用。例如，大量的研究已经证明microRNA可以诱导癌细胞的凋亡，抑制癌细胞的生长，分裂。并且，microRNA是一种100％人源性的RNA，不会产生免疫反应，安全性好。然而，microRNA在进入到体内后易于被降解，大大降低了其临床应用效果。

目前，核酸药物治疗癌症大都处在研究阶段，单纯的寡核苷酸进入人体内，在很短的时间(几分钟至十几分钟就被体内血液核酸酶完全分解，无法有效到达病灶，由于分子量小，并且容易随经肾脏尿液排出，非特异性药物代谢，大大限制了核酸药物的效果。

C32是一种体内输送基因的聚合体，其颗粒大小在纳米级，毒副作用小。其可通过一种叫做内吞作用的过程进入细胞。然而，其在进入到体内后，受到体内环境的影响，易于发生膨胀，从而在未到达给药靶点前就释放出其包裹的药物。

因此，本领域迫切需要解决核酸药物的高效给药问题，使得药物尽可能多地到达需要用药的部位，不被体内其它机制降解。

发明内容

本发明的目的在于提供一种纳米核酸导向药物及其制备方法和应用。

在本发明的第一方面，提供一种纳米核酸导向药物，所述药物是C32粒子、导向物、核酸药物的复合物；

所述的复合物的表面修饰有聚乙二醇。

在一个优选例中，所述的聚乙二醇结合于复合物表面的氨基基团上。

在另一优选例中，所述的导向物是特异性靶向药物作用位点(如哺乳动物的组织、器官或细胞)的核酸或多肽。

在另一优选例中，所述的多肽选自：SEQ ID NO：11-14中的一种或几种。

在另一优选例中，所述的核酸药物是干扰分子。

在另一优选例中，所述的干扰分子选自：SEQ ID NO：1-10的寡核苷酸中的一种或几种。

在另一优选例中，所述的干扰分子是SEQ ID NO：1-10的寡核苷酸的混合物；更佳地，是SEQ ID NO：1-10的寡核苷酸等比例的混合物。

在另一优选例中，所述的纳米核酸导向药物是治疗肝癌的药物。

在另一优选例中，所述的纳米核酸导向药物的粒径的平均值约170±20纳米。

在本发明的另一方面，提供一种制备纳米核酸导向药物的方法，所述方法包括：

(1)将C32粒子、导向物、核酸药物混合，形成复合物；

(2)将(1)获得的复合物进行聚乙二醇修饰，获得纳米核酸导向药物。

在另一优选例中，所述的导向物是多肽，且步骤(1)包括：

(a)将C32与导向物进行酯化反应，形成C32-导向物复合物；以及

(b)将C32-导向物复合物与核酸药物混合，形成C32-导向物-核酸药物复合物。

在另一优选例中，步骤(a)中，C32与导向物的摩尔比是1∶(2-3)；较佳地是1∶2.4。

在另一优选例中，步骤(a)中，酯化反应的催化剂是SO₄ ^2-/SiO₂。

在另一优选例中，步骤(a)中，酯化反应的时间是4±2小时；较佳地是4±1小时。

在另一优选例中，聚乙二醇修饰的方法是：将C32-导向物-miRNA(较佳地溶于碳酸钠溶液)与过量的mPEG-SPA(较佳地溶于乙腈中)反应。

在本发明的另一方面，提供所述的纳米核酸导向药物的用途，用于制备靶向治疗疾病的组合物。

在本发明的另一方面，提供一种组合物，含有：

有效量的所述的纳米核酸导向药物；以及

药学上可接受的载体。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了利用透射电镜(TEM)对获得的药物的结构及大小进行鉴定。右图是对颗粒粒径的统计分析。

图2显示了通过动态光散射(DLS)技术测定颗粒尺寸，采用BrookhavenZetaPALS，BI-9000AT数字自相关器，波长656nm。

图3显示了流式细胞仪鉴定纳米药物的结合特异性。可见其特异性结合在肝癌细胞上，而不结合在其他的细胞上。

图4显示了采用Confocal显微镜鉴定纳米药物的结合特异性，转染特异性及效率。左侧图为未用纳米药物处理的对照，右侧图为用纳米药物处理的细胞。图中，DAPI染色，细胞核用蓝色荧光显示，纳米核酸药物用红色显示。

具体实施方式

针对核酸药物在给药后易于被体内降解的问题，本发明人经过广泛的研究，首次揭示了一种纳米核酸导向药物。该纳米核酸导向药物以纳米材料(C32聚合体颗粒)为载体，其中包含导向物和核酸药物；并且，所述的复合物的表面修饰有亲水性的化合物(较佳地为：聚乙二醇，PEG)。由于进行了修饰，药物表面的电荷属性发生改变，靶向特异性更好，可减少最终获得的药物对于血浆蛋白、血管壁以及其他组织的非特异性吸附。

纳米核酸导向药物

本发明提供了一种纳米核酸导向药物，以纳米材料(C32聚合体颗粒)为载体，其中包含导向物和核酸药物；并且，所述的复合物的表面修饰有亲水性的化合物(PEG)。

(a)C32聚合体

所述的C32是一种体内输送基因的聚合体，其颗粒大小在纳米级，毒副作用小。其可通过一种叫做内吞作用的过程进入细胞。

制备C32聚合体的方法是本领域技术人员所熟知的，一种常规的制法是将5-氨基-1-戊醇与1，4-丁二醇二丙烯酸酯在合适的条件下聚合获得。制备C32聚合体的这些材料均可通过商业途径购买获得。

本发明采用的C32聚合体，其是可降解的纳米粒子，其能够有效阻止人体内自身的核酸酶降解核酸药物，保护核酸药物不会随尿液排出，使药物的半衰期大为增长。随着纳米粒子缓慢分解，核酸药物也被缓慢释放，而不是瞬间释放，所以作用比较温和。

本发明采用的C32聚合体可以在哺乳动物体内被降解，并且没有发现任何毒副作用。

(b)导向物

所述的导向物是特异性靶向药物作用位点(如哺乳动物的组织、器官或细胞)的核酸或多肽。任何对于识别药物靶点有用的核酸或多肽都是有用的，一些具有导向作用的核酸或多肽在现有文献中已有报导，它们也被包含在本发明中。在实际应用中，可以根据所需靶向的药物靶点的不同(如药物靶点可以是选自：肝脏、肺、脾脏、胰脏等等)，选择不同的导向物。

作为本发明的一种优选方式，所述的导向物是靶向肝脏的多肽，所述的多肽选自：SEQ ID NO：11-14中的一种或几种。

导向物的应用，增强了纳米药物与作用位点的特异性结合，利于核酸药物到达病灶。

(c)核酸药物

所述的核酸药物是一些对于疾病发挥治疗作用的活性物质。可根据所需治疗的疾病的不同，选择合适的核酸药物。例如，所述的疾病是肝癌或肺癌，则所述的核酸药物是对于治疗肝癌或肺癌有用的药物。

作为本发明的优选方式，所述的核酸药物是干扰分子(如siRNA，miRNA，反义核苷酸)或在体内能够形成干扰分子的核酸(如shRNA)。所述的干扰分子能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。

作为本发明的优选方式，所述的干扰分子选自：SEQ ID NO：1-10的寡核苷酸中的一种或几种。应用这些寡核苷酸制备的纳米核酸导向药物是治疗肝癌的药物。较佳地，所述的干扰分子是SEQ ID NO：1-10的寡核苷酸的混合物；更佳地，是SEQ ID NO：1-10的寡核苷酸等比例的混合物。本发明人优化选择到了这些miRNA，它们的混合物具有良好的肝癌治疗效果。

(d)PEG修饰

本发明的纳米核酸药物的表面修饰有PEG。PEG的化学结构式为：HO(CH₂CH₂O)_nH，由环氧乙烷聚合而成。其分子式为：

作为本发明的一个优选方式，所述的PEG修饰于纳米核酸导向药物表面的氨基基团上，较佳地pEG的分子量为10-25KDa，更佳地，分子量为20kDa左右。

本发明还提供了一种制备纳米核酸导向药物的方法，所述方法包括：(1)将C32粒子、导向物、核酸药物混合，形成复合物；(2)将(1)获得的复合物进行PEG修饰，获得纳米核酸导向药物。较佳地，步骤(1)包括：(a)将C32与导向物进行酯化反应，形成C32-导向物复合物；以及(b)将C32-导向物复合物与核酸药物混合，形成C32-导向物-核酸药物复合物。所述的酯化反应是C32粒子中的羟基与导向物中的羧基之间发生酯化反应。C32-导向物复合物与核酸药物混合是基于正电荷与负电荷相互作用形成聚合的原理。

PEG修饰的方法是：将C32-导向物-miRNA(较佳地溶于碳酸钠溶液)与过量的mPEG-SPA(较佳地溶于乙腈中)反应。

PEG或多肽修饰，可有效降低给药后体内诱导的免疫反应，以及阻止药物与血浆蛋白，血管壁的非特异性结合。

本发明的纳米核酸药物可用于制备靶向治疗疾病的组合物，其毒性小(或者无毒)，专一性强，效果好。

肝癌、肺癌的防治

作为本发明的一个优选方式，提供了一种治疗肝癌、肺癌的纳米核酸导向药物，该药物以纳米材料为载体，用microRNA和shRNA作为肝癌基因和肺癌基因表达的抑制剂，以aptamer(寡核苷酸链)或者特异小肽为为靶向配基介导该纳米核酸药物，特异性的将该药物结合到肝癌或者肺癌细胞上或者细胞内，抑制关键癌症基因的表达，从而诱导癌症细胞死亡，来治疗癌症。该药物与传统的抗癌药物相比，有无可比拟的优势。首先，大量的研究已经证明microRNA可以诱导癌细胞的凋亡，抑制癌细胞的生长，分裂。第二，microRNA是一种100％人源性的RNA，不会产生免疫反应，安全性好。第三，本发明使用的纳米材料是一种无毒、可降解的材料，可将microRNA运送到肺癌细胞内缓慢降解，与传统的容易致癌的病毒、不可以降解的纳米载体相比，有很大改进。第四，肺癌的特异性受体结合物能靶向识别肺癌细胞，对正常细胞无影响或者影响很小，这就最大程度程度上的避免了副作用的产生。第五，与抗体药物相比，价格低廉，效能相当，专一性强。

本发明首次将C32纳米粒子同针对肝癌和肺癌的寡核苷酸链(microRNA和shRNA)连接制成具有特异性治疗功能的纳米核酸药物。本发明首次将C32用亲水性的化合物poly(ethyleneglycol)(PEG)和/或带有负电荷的寡肽进行表面修饰(PEGylation)，以减少该纳米粒子同血液蛋白或者血管壁等的非特异性结合。本发明首次采用特定寡核酸链aptamer和特定肽链为介导信号，将C32寡核酸链纳米核酸药物特异性的引导到肝癌和肺癌的病灶(特定细胞)，作用并抑制或者杀死癌症细胞，达到治疗癌症的效果。

现有的肝癌，肺癌治疗药物有着很大的副作用，特异性差，杀死癌细胞的同时，也损伤了正常细胞的功能。本发明的药物采用的寡核苷酸有效成分为为病人人体自身也产生的抗癌物质，属于机体的一部分，所以不会引起自身免疫反应。现有的以金属粒子为载体的纳米药物其载体大多不能在人体内被降解，经过长期积累，毒性很大，可以诱导体内蛋白质变性。本发明采用的C32已经被证明可以被人体缓慢降解代谢掉而且没有发现任何毒副作用。纳米粒子由于采用了PEG修饰和寡肽修饰，也有效降低了可能引起的免疫反应，降低同血浆蛋白或者血管壁的结合，由于体积的增大，不会被肾小球渗出，所以不会被泌尿系统的排出，增长了药物的在血液中循环的时间，从而增强了药物的效果。本发明是首次采用分别专一性结合肝癌和肺癌的特定肽链为介导信号，将由C32携带的寡核酸链构成的纳米核酸药物特异性的引导到肝癌和肺癌的病灶(特定癌变细胞)，作用并抑制或者杀死癌症细胞，而不会损伤正常细胞，达到治疗癌症的效果，这种设计大大增强了该药物的专一性。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的纳米核酸导向药物，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于靶向治疗疾病。任何前述的纳米核酸导向药物均可用于组合物的制备。

如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。

在得知了所述纳米核酸导向药物的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的纳米核酸导向药物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

本发明所述的纳米核酸导向药物的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的纳米核酸导向药物的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的纳米核酸导向药物每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、C32的合成

1、用400ul的5-氨基-1-戊醇在40℃水浴锅中，使其溶化；

2、用移液器吸取356ul 5-氨基-1-戊醇，吸取651ul的1，4-丁二醇二丙烯酸酯，5-氨基-1-戊醇和1，4-丁二醇二丙烯酸酯的摩尔比为1.2∶1.0，充分混匀，放入离心管内；

3、在94℃让其反应24h，在合适的条件下聚合成C32；

4、用DMSO将上述反应完成的C32溶解配制成10ml的溶液(浓度为100mg/ml)；

5、用0.22um的滤膜将溶液无菌过滤，分装在10个1.5ml的小离心管里；

6、-20℃保存，备用。

实施例2、MicroRNA

有效核酸链见表1。包括：Mir-34，miR-122，miR-125，miR-130a，miR-150，miR-199，miR-200和let-7家族成员。

表1

实施例3、包含导向肽的核酸药物的制备

采用的导向多肽(参见Lee，et al，cancer research 2007：67(22)，Jia et alCancer Letters 247(2007)234-242；Du et al，Mol Cancer Res.2010；8(2)：135-144)见表2。

表2

多肽名称

SEQ ID NO：

氨基酸序列

SP5-52	11	SVSVGMKPSPRP
				12	AWYPLPP
	13	AQYPLPP
			A54	14	AGKGTPSLETTP

(a)C32-A54导向肽修饰

将5毫升含有1.9克的C32的DMSO溶液中加入摩尔比1.0∶2.4(C32∶A54)的A54(AGKGTPSLETTP)进行酯化反应，合成反应的最佳工艺条件为：C32与A54的摩尔比为1.0∶2.4，催化剂SO₄ ^2-/SiO₂的用量为0.19g，反应温度为60℃，反应时间为4h，此时酯化产率为94.4％，产品可以用反相高效液相进行分离，纯化。

(b)C32-A54-miRNA的制备

1、配制2.5M的乙酸钠溶液，PH5.2，过滤除菌。

2、取1ul的乙酸钠储液，加无菌水至100ul，配成25mM的乙酸钠溶液。

3、将表中所列的10种miRNA按照浓度为1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1的比例混合，混合物的浓度为10ug/ul的混合液。取1ug的miRNA的混合液，与25ul的25mM的乙酸钠溶液混合，再加入25ul的2mM的C32-A54液(C32-A54存在于25mM的乙酸钠溶液中)，10秒钟内充分混匀。室温放置10分钟，这样就制成了DNA纳米粒。

(c)PEGylation

首先配制2mM(在乙酸钠中的终浓度)的带有氨基的C32-A54-miRNA溶于100mM、pH8.5的碳酸钠溶液，体积为10毫升。然后加入10毫升含大过量的100mM的methoxy-polyethylene glycol succinimidyl propionic acid(mPEG-SPA，MW 20kDa)的乙腈溶液，常温下反应，反应时间为1小时，然后加入ε-氨基乙酸(大过量于mPEG5K-SPA)以终止反应，产品经反相高效液相(RP-HPLC，C18液相柱)层析分离鉴定，洗脱液为含50mM三乙基乙酸铵(TEAA)的乙腈溶液。PEG修饰后的核酸药物进一步用还原条件下的SDS-PAGE检测，大规模的合成产物可以用分子筛柱层析方法(Superose 12，GE health care)进行纯化。

以上制备的药物采用的导向肽为a54，纳米材料为c32，包裹的药物为miRNA的混合物，外层经由PEG修饰。

实施例4、纳米药物的大小鉴定

通过透射电镜(TEM)以及动态光散射(DLS)技术，对以上制备的包含导向肽A54的核酸药物的结构及大小进行鉴定。

透射电镜(TEM)的扫描结果见图1左图。由图1右图以及图2(DLS)显示，合成后的核酸药物大小平均值约170纳米。

实施例5、细胞培养、转染

细胞培养：

细胞培养于特定的生长培养基中(Dulbecco’s modified Eagle Medium (Gibco，Gaithersburg，MD，USA)supplemented with 10％fetal bovine serum (Gibco)，100mM sodium pyruvate and 100U penicillin and 100μg ml-1streptomycin)，在37℃，5％(v/v)CO₂的培养箱中细胞连续传代7次，以备下一步的实验。

细胞转染：

在进行转染的24小时之前，将上述细胞按照75000个细胞/孔接种到24孔板上进行培养(1毫升/孔)，将合成好的，并且N端由传统方法进行了生物素修饰的核酸药物加入上述培养的细胞中(液体培养基中含有10％(v/v)的小牛血清)，培养4小时，将含有未转染进去的纳米药物的培养基全部吸走，换成1毫升/孔新的液体生长培养基。

实施例6、药物的结合特异性，转染效率和特异性分析

流式细胞仪鉴定(结合特异性)：

转染72小时以后，将转染的细胞按照传统的生物素，亲和素方法进行标记，标记后的细胞进行碘化丙啶标记去除死细胞。然后，将HepG2细胞(肝癌细胞系)(5×10⁵/试验)和PCS-100-01(人脐静脉内皮细胞)(5×10⁵/试验)孵育在100μl包含1mM MgCl₂和0.1％(V/V)BSA的细胞结合缓冲液中(PBS，pH 7.4))，室温孵育20分钟，然后用不含牛血清白蛋白(BSA)的结合缓冲液洗涤一次。之后细胞在流式细胞仪LSRII flow cytometer(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)上(用FlowJo(v7.0)软件)进行分析。

细胞试验结果见图3。结果显示，纳米药物专一结合在肝癌细胞上，而不结合在其他的细胞上。

Confocal显微镜鉴定：

采用Confocal显微镜鉴定结合特异性，转染特异性及效率。

药物染色步骤：首先在暗室内将10ul的纳米药物和10ul的cy5荧光染料(GEHealthcare)涡旋混合，10秒钟离心，然后用铝箔纸包裹，37℃孵育2小时，然后用G-50微型凝胶柱离心分离。

实验方法：将0.5ml的HepG2(细胞数75000)和Hela细胞(细胞数75000)分别培养在confocal专用2-孔塑料细胞培养皿中，在37℃，5％(v/v)二氧化碳的培养箱中培养24小时，然后用纳米核酸药物进行转染，转染的方法同上述。4小时后，吸除旧的液体培养基，用换上新的1ml液体培养基洗去未被转染的纳米药物，重复5次，将贴壁生长的细胞用甲醛固定并将细胞核用DAPI染色，然后置于Carl Zeiss LSM510META Confocal显微镜下观察。

实验结果见图4。由图可知，纳米药物可以专一性地进入到肝癌细胞内部，转染效率大于70％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种纳米核酸导向药物，其特征在于，所述药物是C32粒子、导向物、核酸药物的复合物；

所述的复合物的表面修饰有聚乙二醇。

2.如权利要求2所述的纳米核酸导向药物，其特征在于，所述的导向物是特异性靶向药物作用位点的核酸或多肽。

3.如权利要求2所述的纳米核酸导向药物，其特征在于，所述的多肽选自：SEQ ID NO：11-14中的一种或几种。

4.如权利要求1所述的纳米核酸导向药物，其特征在于，所述的核酸药物是干扰分子。

5.如权利要求4所述的纳米核酸导向药物，其特征在于，所述的干扰分子选自：SEQ ID NO：1-10的寡核苷酸中的一种或几种。

6.如权利要求5所述的纳米核酸导向药物，其特征在于，所述的纳米核酸导向药物是治疗肝癌的药物。

7.一种制备纳米核酸导向药物的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)将C32粒子、导向物、核酸药物混合，形成复合物；

(2)将(1)获得的复合物进行聚乙二醇修饰，获得纳米核酸导向药物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的导向物是多肽，且步骤(1)包括：

(a)将C32与导向物进行酯化反应，形成C32-导向物复合物；以及

(b)将C32-导向物复合物与核酸药物混合，形成C32-导向物-核酸药物复合物。

9.权利要求1所述的纳米核酸导向药物的用途，用于制备靶向治疗疾病的组合物。

10.一种组合物，其特征在于，含有：

有效量的权利要求1所述的纳米核酸导向药物；以及

药学上可接受的载体。

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