CN101987866A

CN101987866A - 金黄色葡萄球菌Efb蛋白C端抗原表位及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN101987866A
Application number: CN 201010518148
Authority: CN
Inventors: 杨光; 高亚萍; 张鑫; 董洁; 刘玉
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Priority date: 2010-10-25
Filing date: 2010-10-25
Publication date: 2011-03-23
Anticipated expiration: 2030-10-25
Also published as: CN101987866B

Abstract

本发明属于蛋白质工程和分子生物学及免疫学领域，涉及金黄色葡萄球菌来源的蛋白Efb抗原表位及其制备方法和用途。通过体外重组表达Efb蛋白结合噬菌体筛选技术，获得一条抗原表位肽EC1。进而，通过CH50试验、C3/Fibrinogen捕获ELISA，及构建相应突变体蛋白等试验，确定了EC1肽具有补体抑制功能。因此，EC1肽在治疗自身免疫性疾病药物和抗炎症药物的研发中具有良好的应用前景。

Description

金黄色葡萄球菌Efb蛋白C端抗原表位及其制备方法和用途

技术领域：

本发明涉及蛋白质工程和分子生物学及免疫学领域，具体而言，本发明涉及金黄色葡萄球菌来源的蛋白Efb(Excelluar fibrinogen-binding protein)抗原表位及其制备方法和用途。

背景技术：

金黄色葡萄球菌(金葡菌，Staphylococcus aureus)是一种广泛存在的革兰氏阳性致病菌，能够引起多种化脓性炎症，甚至引发危及生命的败血症、心内膜炎、肺炎、脑膜炎等[Foster T J(2005)Nat Rev Microbiol 1289(3)：948-958]。金葡菌的持续感染，与其能够产生多种与宿主的免疫系统相互作用的免疫调节分子有关，其中超抗原与Protein A蛋白是研究较为清楚的免疫调节蛋白，其分别能够影响T细胞介导的细胞免疫和抗体介导的体液免疫反应[Fanklin D et al(1998)N.Engl.J.Med 339：520-532]。

补体系统属于机体天然免疫系统的重要组成部分。补体激活通过三条途径即经典途径、替代途径和凝集素途径，最终形成攻膜复合物(Membrane AttackComplex，MAC)导致靶细胞的裂解。金黄色葡萄球菌来源的蛋白Efb(Excelluarfibrinogen-binding protein)，其分子量大小约为15.3KDa，由N端和C端两个功能结构域组成。据文献报道，其N端能够与纤维蛋白原结合，从而抑制血小板的聚集[Palma M et al(1998)J Biol Chem 273：13177-13181]；Lawrence Y L等报道了Efb蛋白的C端能够抑制补体激活的经典途径、替代途径[Lawrence Y.L.Lee etal(2004)J Biol Chem 279：50710-50716]。由此可知，Efb是金黄色葡萄球菌所分泌的一个重要的毒力因子，在金黄色葡萄球菌的致病性中发挥关键的作用。Efb蛋白对于补体的抑制作用，使其可能成为一种新型的治疗自身免疫性疾病和抗炎症药物[Foster T J(2005)Nat Rev Microbiol 1289(3)：948-958；Shnnon O etal(2005)Thromb Haemost93：927-931]。

通常，天然蛋白是由多个抗原表位组成，而主要的抗原决定簇通常存在于蛋白抗原表面，它们能够特异结合针对该蛋白抗原的大部分抗体，因此被称为“免疫显性基团”。这些免疫显性基团常由极性或带电荷的氨基酸残基组成，并具有高亲水性，而这样的氨基酸序列也是蛋白质与蛋白质间相互作用位点的特征，如补体与免疫球蛋白的结合位点在其Fc段中亲水性最强的区域。由于天然蛋白分子中往往含有可能对机体造成损伤的毒性、抑制性、病理性及自身抗原交叉反应性等表位，因此应用于机体时，可产生严重的不良反应；而且，这些生物大分子，制备、保存困难，所需剂量大，易引起副作用[Deroo S et al(2001)Comb Chem High Throughput Screen4：75-115]。因此，目前生物药物研发的一个重要策略就是，通过筛选天然蛋白分子的功能性抗原表位，获得其发挥生物学作用的关键结构域，以作为合成先导小分子的基础。由于Efb蛋白具有补体抑制作用，使其有望成为一种新型的治疗自身免疫性疾病和抗炎症药物，而以Efb蛋白的功能结构域作为相关药物研发的先导分子，目前还未见相关报道。

基于以上研究及目前的现状，申请人进行了多方面的研究及探索，通过下述实验策略获得了Efb的抗原表位。具体而言，申请人用rEfb免疫动物，制备和纯化得到抗rEfb的多克隆抗体，然后以线性十二肽库与抗体孵育，经筛选获得了与抗体特异结合的噬菌体克隆。之后通过竞争ELISA确定阳性噬菌体克隆，测定阳性噬菌体克隆展示肽序列。通过比对这些结合肽序列，发现其与rEfb的120-131位氨基酸序列相似性很高且具有共有序列。然后申请人合成了该区段氨基酸序列(序列为RIDNVLKQGLVK，SEQ ID NO：1)，并将其与KLH耦联免疫动物检测其抗原表位的功能，即是否可以制备得到抗rEfb多抗。结果，通过ELISA及Western印迹结果表明，制备的抗血清能够与rEfb发生交叉免疫反应，提示此多肽为rEfb的模拟表位，命名为EC1肽，与之相对应的rEfb区段可能是一个抗原表位。

进一步地，申请人通过构建rEfb中缺少该抗原表位的突变体蛋白，通过补体激活实验及捕获ELISA实验表明，突变体蛋白的补体抑制活性及捕获纤维蛋白原(Fibrinogen)的活性显著下降，提示所获得的抗原表位是rEfb的重要功能结构域。

至此，申请人不仅通过体外重组表达Efb结合噬菌体筛选技术，获得一条功能性抗原表位肽，而且通过检测补体经典激活通路的CH50试验、C3/Fibrinogen捕获ELISA等试验检测所获得的表位肽的功能。进一步通过构建相对应表位肽的突变体蛋白，进一步确定了EC1肽的功能，由此完成了本发明。

发明内容

具体地，本发明提供了：

1.一种金黄色葡萄球菌来源的蛋白Efb的抗原表位，其具有下述通式(I)所示的氨基酸序列：

A₁A₂A₃A₄A₅A₆A₇A₈A₉A₁₀A₁₁A₁₂

其中

A₁表示氨基酸R，

A₂表示氨基酸I，

A₃表示氨基酸D，

A₄表示氨基酸N，

A₅表示氨基酸V，

A₆表示氨基酸L，

A₇表示氨基酸K，

A₈表示氨基酸Q，

A₉表示氨基酸G，

A₁₀表示氨基酸L，

A₁₁表示氨基酸V，

A₁₂表示氨基酸K。

2.一种核苷酸序列，其特征在于编码权利要求1所述的氨基酸序列。

3.权利要求1所述的氨基酸序列，其特征在于，其可作为组合物的一种组分。

4.权利要求3的组合物，其特征在于，还可以包含药学上可接受的载体。

5.权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，其可作为组合物的一种组分。

6.权利要求5的组合物，其特征在于，还可以包含药学上可接受的载体。

7.权利要求1所述的抗原表位在制备抗炎症药物中的用途。

8.权利要求1所述的抗原表位在制备治疗自身免疫性疾病药物中的用途。

9.权利要求2所述的核苷酸序列在制备抗炎症药物中的用途。

10.权利要求2所述的核苷酸序列在制备治疗自身免疫性疾病药物中的用途。

附图说明

图1：表示阳性噬菌体克隆的竞争ELISA结果。

图2：表示不同噬菌体展示肽之间的序列比对。

图3：表示噬菌体展示肽与Efb的序列比对。

图4：表示EC1合成表位肽的补体活化实验结果，其中*表示P＜0.05。

图5：表示突变体蛋白EmC1与rEfb的补体活化实验结果，其中*表示P＜0.05。

图6：表示突变体蛋白EmC1与rEfb的纤维蛋白原(Fibrinogen，Fg)捕获ELISA的实验结果，其中*表示P＜0.01。

图7：表示突变体蛋白EmC1与抗rEfb及EfbC端抗体结合的ELISA实验结果。

图8：表示抗EC1-KLH与rEfb，EmC1，EfbN端，EfbC端交叉免疫反应的WesternBlot结果，其中1表示EmC1，2表示EfbC端，3表示EfbN端，4表示rEfb。

具体实施方式

为了更清楚地阐述本发明，具体提供了下述阐述性的实施方案，本领域的技术人员应该理解，本发明并不仅仅限定于下述实施例，任何与本发明的实施例等同的变体也包括在本发明中。

实施例

1、噬菌体展示肽库筛选抗rEfb的抗体结合肽

Ph.D.-12肽库试剂盒购自NEB公司，库容量为2.7×10⁹，滴度为1.5×10¹³/μl.。Escherichia coli ER2537为肽库的宿主菌。筛选过程参见噬菌体展示肽库使用说明书。每轮筛选以抗rEfb抗体包被(每孔10μg)，每孔投入1×10¹¹噬菌体。噬菌体富集程度通过“投入/产出比”计算。经过三轮筛选，挑取阳性克隆测序。阳性噬菌体克隆与抗rEfb抗体的特异性结合通过ELISA测定。抗rEfb抗体(每孔10μg)包被96孔板(Nunc公司)4℃过夜。倾去不结合的抗体，3％BSA 37℃封闭1小时。每孔投入1×10⁹噬菌体37℃孵育2小时。洗涤液(PBS-0.05％Tween 20)洗板5次，共3分钟。HRP标记的抗M13单抗(1∶1000稀释，Amersham Biosciences公司)37℃孵育1小时。洗涤方法同上，以TMB(Sigma)为底物检测结合的抗M13单抗，450nm检测光吸收，结果见图1。通过竞争ELISA确定阳性噬菌体克隆，即抗rEfbC抗体(每孔1μg)包被96孔板(Nunc公司)，加入10μg的rEfbC蛋白与1×10⁹噬菌体混合物孵育，抗M13单抗(1∶1000稀释，Amersham Biosciences公司)检测结合的噬菌体，结果见图1。由图1可知，这12个克隆均为阳性克隆。

2、rEfb抗原表位的获得及其活性验证

对挑取的20个噬菌体克隆进行测序，获得了7条阳性克隆的展示肽序列(见表1)。通过比对这些结合肽序列，申请人发现其与rEfb的120-131位氨基酸序列相似性很高(见图2，3)。申请人据此合成了该肽段，其具体的氨基酸序列为：RIDNVLKQGLVK(SEQ ID NO：1)，并将其与KLH偶联以制备多抗。Western blot结果表明，制备的抗血清能够与rEfb发生交叉免疫反应(见图8)，提示此多肽可能是一个抗原表位。

3、EC1表位肽的功能检测

对于合成的表位肽EC1进行补体抑制功能的检测。具体地，将EC1(8mg/ml)与正常人血清孵育，生理盐水补齐至200μl，37℃共孵育30min。同时，1∶4000稀释将溶血素加入2％绵羊红细胞，37℃共孵育30min。将血清与蛋白混合物1∶20生理盐水稀释后150μl加入致敏绵羊红细胞500μl，生理盐水补齐至1250μl。37℃孵育30min后，3000rpm离心3分钟后，取上清200μl测定其405nm处吸光值。以重组rEfb(10mg/ml)蛋白作为阳性对照，生理盐水为空白对照。补体活化实验显示，EC1表位肽能够抑制补体活化的经典途径(见图4)。

表1噬菌体展示肽序列测定结果

4、rEfb突变体蛋白EmC1的构建

进一步地，申请人将Efb蛋白中表位肽所在的区域进行缺失突变，获得不含表位肽区段的突变体蛋白，并将之命名为EmC1。具体地，根据Efb蛋白的上下游引物设计，并引入EcoR I，Xho I酶切位点。引物序列见表2，由Invitrogen公司合成。将合成后的引物以重组Efb载体质粒为模板进行PCR扩增。循环参数为95℃10min，94℃30s变性，55℃30s退火，72℃40s延伸。将上述PCR产物经酶切回收后连接入pET-28a(Novagen公司)表达载体，转化E.coli BL21(DE3)。重组菌的序列测定结果表明，EmC1基因序列(SEQ IDNO：8)以正确的阅读框架插入载体pET 28a中，故重组蛋白的氨基酸序列也应与EmC1蛋白一致(SEQ ID NO：9)。重组菌经IPTG诱导表达EmC1蛋白，Ni-NTA螯合树脂(QIEGEN公司)纯化，获得了较高纯度的EmC1蛋白。

表2Efb及其突变体EmC1的引物

注：下划线对应的为酶切位点及保护碱基。

5、EmC1的功能检测

进一步地，申请人对于上述表达纯化后的重组EmC1蛋白进行了一系列功能检测。

补体激活实验(CH50实验)检测了EmC1蛋白对于补体激活经典途径的抑制作用。具体地，将重组EmC1蛋白25μg与正常人血清50μl混合，生理盐水补齐至200μl，37℃共孵育30min。同时，溶血素1∶4000稀释，加入2％绵羊红细胞，37℃共孵育30min，使绵羊红细胞致敏。将血清与蛋白混合物1∶20生理盐水稀释，取150μl加入500μl的致敏绵羊红细胞中，生理盐水补齐至1250μl。37℃孵育30min后，3000rpm离心3分钟后，取上清200μl测定其405nm处吸光值。以rEfb蛋白作为阳性对照，生理盐水为空白对照。CH50实验结果显示，与rEfb蛋白相比，突变体蛋白EmC1对于补体抑制的能力显著下降(图5)，提示EC1可能为rEfb蛋白的功能性表位，对于rEfb蛋白发挥补体抑制功能起着重要作用。

捕获ELISA结果检测EmC1蛋白对于纤维蛋白原的结合。具体地，分别包被EmC1及Efb蛋白(每孔0.1μg)，37℃包被2h后，5％脱脂奶粉封闭，37℃1h。加入等摩尔的纤维蛋白原(Fg)，置于37℃1h。0.05％PBST洗涤三次后，加入抗Fg抗体(1∶1000，公司)，置于37℃1h。洗涤后加入显色液，避光显色3分钟，2N H₂SO₄终止显色，酶联仪测定450nm波长处的吸光值。Fg捕获ELISA结果显示，缺失了EC1区段的突变体蛋白EmC1与Fg的结合能力显著下降(图6)。以上结果表明EC1可能为rEfb蛋白的功能性表位，对于Efb蛋白与纤维蛋白原的结合发挥重要作用。

6、EmC1与抗rEfb/EfbC端抗体的结合检测

分别包被EmC1及rEfb(阳性对照)，每孔100ng。将抗rEfb、抗EfbC端的抗体分别加入，置于37℃1h。0.05％PBST洗涤三次后加入二抗，置于37℃30min。洗涤后加入显色液，避光显色3分钟，2N H₂SO₄终止显色，酶联仪测定450nm波长处的吸光值。结果显示，EmC1与抗rEfb的抗体结合，但与抗EfbC端的抗体结合能力显著下降(图7)，提示所缺失的肽段为功能性表位肽。

7、抗EC1的抗体与rEfb及其突变体蛋白EmC1的结合验证

将免疫动物所获得的抗EC1肽的抗体，分别与rEfb、EfbN、EfbC、EmC1等蛋白反应。Western印迹结果显示，抗EC1肽的抗体能够特异的与rEfb、EfbC蛋白结合，但不能与EfbN、EmC1结合(图8)。

综上可知，本申请的金黄色葡萄球菌细胞外纤维蛋白原结合蛋白(Efb)抗原表位肽EC1，具有补体抑制功能，本申请提供了如式(I)所示的抗原表位。

序列表

核苷酸或氨基酸序列表

序列表

<110>军事医学科学院基础医学研究所

<120>金黄色葡萄球菌Efb蛋白C端抗原表位及其制备方法和用途

<160>12

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>Staphylococcus aureus

<400>1

Arg Ile Asp Asn Val Leu Lys Gln Gly Leu Val Lys

1 5 10

<210>2

<211>12

<212>PRT

<213>Staphylococcus aureus

<400>2

Ser Asn His Trp His Ser Gln Gly Leu Val Pro Arg

1 5 10

<210>3

<211>12

<212>PRT

<213>Staphylococcus aureus

<400>3

Gly Ser Pro Leu Thr Gly Leu Val Pro Arg Trp Ala

1 5 10

<210>4

<211>12

<212>PRT

<213>Staphylococcus aureus

<400>4

Ala Asn Leu Thr Pro Thr Gly Leu Val Pro Arg Pro

1 5 10

<210>5

<211>12

<212>PRT

<213>Staphylococcus aureus

<400>5

Gln Leu Tyr Asp His Leu Gly Leu Val Pro Arg Leu

1 5 10

<210>6

<211>12

<212>PRT

<213>Staphylococcus aureus

<400>6

Lys Ile His Thr Gly Leu Ile Pro Pro Thr Pro His

1 5 10

<210>7

<211>12

<212>PRT

<213>Staphylococcus aureus

<400>7

Phe Pro Asn His Tyr Ala Leu Leu Gly Leu Leu Pro

1 5 10

<210>8

<211>360

<212>DNA

<213>Staphylococcus aureus

<400>8

ccaagagaaa agaaaccagt gagtattaat cacaatatcg tagagtacaa tgatggtact 60

tttaaatatc aatctagacc aaaatttaac tcaacaccta aatatattaa attcaaacat 120

gactataata ttttagaatt taacgatggt acattcgaat atggtgcacg tccacaattt 180

aataaaccag cagcgaaaac tgatgcaact attaaaaaag aacaaaaatt gattcaagct 240

caaaatcttg tgagagaatt tgaaaaaaca catactgtca gtgcacacag aaaagcacaa 300

aaggcagtca acttagtttc gtttgaatac aaagtgaaga aaatggtctt acaagagcga 360

<210>9

<211>120

<212>PRT

<213>Staphylococcus aureus

<400>9

Pro Arg Glu Lys Lys Pro Val Ser Ile Asn His Asn Ile Val Glu Tyr

1 5 10 15

Asn Asp Gly Thr Phe Lys Tyr Gln Ser Arg Pro Lys Phe Asn Ser Thr

20 25 30

Pro Lys Tyr Ile Lys Phe Lys His Asp Tyr Asn Ile Leu Glu Phe Asn

35 40 45

Asp Gly Thr Phe Glu Tyr Gly Ala Arg Pro Gln Phe Asn Lys Pro Ala

50 55 60

Ala Lys Thr Asp Ala Thr Ile Lys Lys Glu Gln Lys Leu Ile Gln Ala

65 70 75 80

Gln Asn Leu Val Arg Glu Phe Glu Lys Thr His Thr Val Ser Ala His

85 90 95

Arg Lys Ala Gln Lys Ala Val Asn Leu Val Ser Phe Glu Tyr Lys Val

100 105 110

Lys Lys Met Val Leu Gln Glu Arg

115 120

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>Staphylococcus aureus

<400>10

ccggaattcc caagagaaaa gaaa 24

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>Staphylococcus aureus

<400>11

ccgctcgagt tatttaacta atcc 24

<210>12

<211>32

<212>DNA

<213>Staphylococcus aureus

<400>12

catgacatct cgagttactc ttgtaagacc at 32

Claims

A₁A₂A₃A₄A₅A₆A₇A₈A₉A₁₀A₁₁A₁₂

其中

A₁表示氨基酸R，

A₂表示氨基酸I，

A₃表示氨基酸D，

A₄表示氨基酸N，

A₅表示氨基酸V，

A₆表示氨基酸L，

A₇表示氨基酸K，

A₈表示氨基酸Q，

A₉表示氨基酸G，

A₁₀表示氨基酸L，

A₁₁表示氨基酸V，

A₁₂表示氨基酸K。

7.权利要求1所述的抗原表位在制备抗炎症药物中的用途。

9.权利要求2所述的核苷酸序列在制备抗炎症药物中的用途。