CN101985629A - 一种表达载体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备表达载体的方法，其包括基因重组的步骤，该基因重组的步骤将含有小鼠Musashi1基因启动子的目的DNA片段插入到基础载体中含有或者插入的报告基因的上游，该报告基因由小鼠Musashi1基因启动子调控表达。采用本发明的表达载体的制备方法，得到的表达载体含有小鼠Musashi1基因启动子和报告基因，根据报告基因的表达信号，便于在保证细胞活性的情况下分选出Musashi1阳性表达细胞。

Description

一种表达载体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种含有小鼠Musashi1基因启动子和报告基因的表达载体的制备方法。

背景技术

Musashi蛋白是一种高度保守的RNA结合蛋白，最早在果蝇体内发现，并被证明是果蝇神经干细胞的标志之一，大量表达在神经系统中。现已知Musashi是果蝇神经干细胞不对称分裂的关键调节子，它促使干细胞分裂后，一个细胞保留自我更新能力，另一个细胞具有进一步分化能力，因而被认为在干细胞状态的维持、干细胞分化和肿瘤形成中扮演重要角色。Musashi1基因是其在小鼠的同类基因，在胚胎阶段Musashi1选择性在神经前体细胞高表达，在成体神经干细胞中同样可以检测到Musashi1基因表达。随后研究表明Musashi1在神经干细胞的干性保持和分化中有关键作用，因此Musashi1被认为是小鼠神经干细胞的标志之一。

小肠黏膜是除中枢神经系统外另一个高表达Musashi1的组织，提示了Musashi1基因和肠上皮细胞的关系密切。肠黏膜上皮由无数单层柱状上皮组成，肠黏膜上皮细胞终身不断快速自我更新，更新周期平均4-6天。因为肠黏膜上皮的快速更新，很早就已经有人推测肠道上皮干细胞的存在。目前认为小肠上皮干细胞位于小肠隐窝的基底部，距隐窝底部2-7个细胞的位置，每个隐窝大约有4-6个；结肠上皮干细胞位于结肠腺体的基底部，每个隐窝大约有1-4个。肠上皮干细胞持续增殖、分化，并向绒毛顶端迁移(潘氏细胞向下迁移)，逐渐取代外层终末分化黏膜上皮细胞，迁移到绒毛顶端的外层细胞凋亡脱落落入肠腔，而外层细胞的死亡脱落与干细胞的分裂之间又维持一定的平衡。

虽然肠上皮干细胞的存在得到研究者的共识，但是肠上皮干细胞的标志的研究却进展不大。2003年，Nishimura等发现正常的人结肠标本的结肠隐窝Musashi1阳性表达区域位于隐窝的基底部，与肠上皮干细胞的位置一致。在成年小鼠小肠隐窝，Musashi1表达于潘氏细胞之上并紧连于潘氏细胞的几个细胞，Musashi1阳性细胞在肠上皮隐窝的普遍表达以及合适的数目都暗示Musashi1阳性细胞是小肠黏膜上皮干细胞或者祖细胞。肠上皮干细胞在Musashi1基因作用下，一个细胞维持干细胞性质，停留于肠上皮干细胞的位置，分裂产生的另一个细胞作为肠上皮的前体细胞-短暂扩增细胞，这些短暂扩增细胞继续增殖并逐渐分化，产生潘氏细胞、吸收上皮细胞、神经内分泌细胞和杯状细胞。通过对信号通路的研究，研究者发现作为一种转录抑制因子，Musashi1调节Notch信号，最终调节Hairy and enhancer of split 1(Hes1)基因的表达，这种调节最终影响到杯状细胞、内分泌细胞、潘氏细胞的形成，暗示Musashi1和Hes1的共表达细胞可能就是肠上皮干细胞。

新近的一些研究虽然使研究者对Musashi1基因作为肠上皮干细胞的标志提出疑问，并报道了leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5(Lgr5)、Acheate-scute like 2(ASCL-2)、Doublecortin and CaM kinase-like-1(DCAMK-1)等候选肠上皮干细胞的标志基因，但是无论是Lgr5还是ASCL-2，都不是仅局限表达于肠黏膜上皮，在其它组织中均有发现，这些新的候选基因也没有得到基因敲除实验的支持。作为较早作为候选肠上皮干细胞的标志基因，Musashi1仍然是肠上皮干细胞或者祖细胞的候选基因之一。Musashi1阳性细胞新出现的部位是位于潘氏细胞间，且多呈长柱状，这些细胞本身就是另一些新出现的候选肠上皮干细胞标志基因(例如Lgr5)的阳性部位，并且也有研究者认为肠上皮干细胞是位于潘氏细胞之间的长柱状细胞。因此，Musashi1基因仍可以作为肠上皮干细胞或者至少是祖细胞的候选标志基因。

肠上皮干细胞处在一个微环境“niche”中。“niche”由肠上皮干细胞周围间质细胞和基质组成，提供维持肠上皮干细胞增殖和自我更新所需信号。肠上皮干细胞具有增生、自我稳定特性(即数量保持相对稳定)，又可产生大量肠黏膜功能细胞，在肠壁损伤后能再生修复肠黏膜，因此，从理论上讲肠上皮干细胞是肠道疾病基因治疗的首选靶细胞。已有研究证实体外存活生长的肠上皮干细胞可以被外来基因所转染，因此肠道上皮干细胞可以成为基因技术治疗肠道疾病的理想基因载体细胞。而对于肠上皮干细胞的严重损失，干细胞移植可能是唯一能够用于治疗的方法。要实现肠上皮干细胞的移植治疗首选是要获取足够的肠上皮干细胞，而目前无法从肠黏膜大量获得肠上皮干细胞。

对于骨髓干细胞和胚胎干细胞两类常见的干细胞在肠道功能修复中的利用的研究也不断深入。其中，骨髓干细胞易于获取，但因为存在免疫排斥、感染、GVHD等并发症，大大限制了造血干细胞(Allo-HSCT)在肠道功能修复中的利用随着自体外周血造血干细胞移植(Auto-PBSCT)的普及。而且由于Allo-HSCT在肠道功能修复过程中有效成分、病情恢复的机制和治疗的有效性等方面均不能完全确定。因此，骨髓干细胞目前还不能作为肠上皮干细胞损伤移植治疗和肠上皮干细胞研究的理想来源细胞。对于胚胎干细胞，其作为一种全能性干细胞，在个体发育过程中可分化各种组织器官的细胞系，为移植医学奠定了理论基础。胚胎干细胞的分离成功及体外诱导分化研究成果显示了其在干细胞移植具有较好的应用前景。研究表明体外培养的肠上皮干细胞移植到小肠后，仍可以继续存活、增生和分化，为肠上皮干细胞移植提供了实验依据。但是如果要从胚胎干细胞衍生的细胞中分离出肠上皮干细胞，重要的一环是找到肠上皮干细胞标志。目前候选的肠上皮干细胞标志有：Musashi1、Lgr5、ASCL-2等。而其中研究历史最久，最深入的候选肠上皮干细胞标志基因是Musashi1，获取足够的Musashi1阳性细胞能够促进肠上皮干细胞的研究，为肠道难治性疾病的干细胞移植治疗或者基因治疗提供重要研究基础和细胞来源。同时因为Musashi1和多种肿瘤的增殖有关，获取Musashi1阳性细胞有利于对Musashi1基因的研究，从而更好地理解肿瘤的生物学特性。但是Musashi1蛋白存在于细胞核和细胞质，在细胞膜表面不表达，无法根据Musashi1蛋白表达情况采用流式细胞仪(FACS)或磁珠细胞分选(MACS)的方法进行Musashi1蛋白阳性细胞的分选。而现有的方法需要对细胞进行化学固定或细胞膜打孔，才能使用Musashi1抗体结合细胞内的Musashi1蛋白，进而实现Musashi1细胞的标记或分选，但经过固定或打孔的细胞均已死亡，失去了细胞的活性，难以进行后续细胞功能的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备表达载体的方法，采用该方法制备得到的表达载体含有小鼠Musashi1基因启动子和报告基因，该报告基因由小鼠Musashi1基因启动子调控表达，根据报告基因的表达信号，便于在保证细胞活性的情况下分选出Musashi1阳性表达细胞。

为实现上述本发明的目的，本发明提供了一种表达载体的制备方法，其包括基因重组的步骤，该基因重组步骤将含有小鼠Musashi1基因启动子的目的DNA片段插入到基础载体中含有或者插入的报告基因的上游，该报告基因由小鼠Musashi1基因启动子调控表达。

优选地，含有小鼠Musashi1基因启动子的目的DNA片段包含小鼠Musashi1基因翻译起始点(ATG)。

作为本发明的优选实施方式，小鼠Musashi1基因启动子的目的DNA片段为包含小鼠Musashi1基因翻译起始点(ATG)上游5′非翻译区的823bp序列，以及翻译起始点(ATG)下游的316bp基因片段。

作为本发明的优选实施方式，含有小鼠Musashi1基因启动子的目的DNA片段具有SEQ ID NO：1的序列。

优选地，报告基因为绿色荧光蛋白(GTP)报告基因。

优选地，基因重组步骤之前包括含有小鼠Musashi1基因启动子的目的DNA片段的获取，该获取步骤包括：(1)分析小鼠Musashi1基因启动子序列的位置和长度；(2)设计所要克隆的小鼠Musashi1基因启动子片段的引物对；(3)PCR扩增，纯化扩增产物，即获得小鼠Musashi1基因启动子目的片段。

优选地，引物对为SEQ ID NO：2-3所示的寡核苷酸：

SEQ ID NO：2：5′-cttcttcgagagtgctctgctgactta-3′；

SEQ ID NO：3：5′-gcactctcgaggaaggagatgactacatga-3′；

或者SEQ ID NO：2～3所示的寡核苷酸的互补链。

优选地，基础载体为pAcGFP1-1质粒载体；含有小鼠Musashi1基因启动子的目的DNA片段和小鼠Musashi1基因启动子在该质粒载体的插入区域均含有多克隆酶切位点。

优选地，基因重组步骤包括以下步骤：

(1)将含有Musashi1基因启动子的目的DNA片段和pAcGFP1-1质粒载体的双酶切；

(2)酶切后将含有Musashi1基因启动子的目的DNA片段和pAcGFP1-1质粒载体的酶连；

(3)筛选酶连后的重组质粒转化到宿主细胞进行大量扩增。

优选地，多克隆酶切位点为Ecl136II和BamHI双酶切位点。

本发明的表达载体的制备方法，在基因重组步骤将含有小鼠Musashi1基因启动子的目的DNA片段插入到基础载体中含有或者插入的报告基因的上游，得到的表达载体含有小鼠Musashi1基因启动子和报告基因，该报告基因在小鼠Musashi1基因启动子调控表达，由于载体中Musashi1启动子序列和内源性Musashi1启动子的结构一致，使结合蛋白启动内源性Musashi1启动子的同时也启动转染入细胞的外源性Musashi1启动子，在小鼠Musashi1基因启动子调控下报告基因得到表达，根据报告基因的表达信号，便于在不影响细胞活性的情况下分选出Musashi1阳性表达细胞。在本发明的一种优选实施方式中，以pAcGFP1-1质粒为基础，将包含小鼠Musashi1基因翻译起始点(ATG)的目的DNA片段插入至绿色荧光(GTP)报告基因编码序列的上游，调控GFP报告基因的表达，构建重组质粒pMsi1-GFP，转染细胞后，表达产生的GFP发出绿色荧光，根据这个信号表达特点，应用流式细胞仪可以直接分选出Musashi1阳性表达细胞，不影响细胞的活性。另外，由于分离后的Musashi1阳性细胞仍具有活性，能发挥其多向分化的能力，可以继续增殖、分化；另外，在该优选实施方式中，报告基因是GFP基因，表达不受生物类型、基因型和细胞组织类型的限制，适用范围广，且能通过荧光强度的变化反映目的基因表达水平，便于Musashi1阳性表达细胞分选和细胞特性的研究。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体附图和具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

附图说明

图1是质粒pMsi1-GFP结构：(A)空载体pAcGFP1-1的结构图；(B)所插入的Musashi1启动子片段示意图。

图2(A)是mESCs不同时期分化细胞转染pMsi1-GFP和pPAcGFP1-1的荧光表达示意图。分别转染mESCs、第7天分化细胞、第10天分化细胞。以Hochest染细胞核，转染24小时后在荧光显微镜下观察。Bars＝25μm。(B，C)是将pMsi1-GFP(上组)和pAcGFP1-1(下组)转染mESCs、第7天分化细胞、第10天分化细胞。转染24小时后以流式细胞仪检测转染后GFP阳性细胞率。

图3是pMsi1-GFP转染入mESCs第10天分化细胞24小时后流式细胞仪分选出的GFP阳性细胞。

图4是pMsi1-GFP转染入mESCs第10天分化细胞24小时后流式细胞仪分选图。

图5是pMsi1-GFP转染入mESCs第10天分化细胞，24小时后流式细胞仪分选出的GFP阳性细胞、阴性细胞组中Musashi1蛋白的western blot检测。

具体实施方式

下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实施手册中所述的条件。

在本发明的说明书和权利要求书中，术语“基础载体”是指在未经过本发明中的基因重组步骤的分子生物学载体，在基础载体载体中可以包含报告基因，也可以通过常用的基因工程方法将报告基因预先插入到基础载体中。如在本发明的一种具体实施方式中，优选pAcGFP1-1质粒载体作为基础载体，在进行本发明中的基因重组步骤步骤前，pAcGFP1-1质粒载体就已经含有GFP基因片段。

本发明的以下实施方式中，以含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的pAcGFP1-1质粒为基础载体，在GFP编码序列的上游插入小鼠Musashi1基因启动子，构建由小鼠Musashi1基因特异启动子调控表达的GFP报告基因重组质粒pMsi1-GFP。

在该实施方式中，采用PCR的方法，以小鼠基因组DNA为模版，在成功克隆出含有Musashi1启动子目的DNA片段后，经纯化、测序鉴定，而后以报告基因载体质粒pAcGFP1-1为基本质粒骨架，运用酶切、连接等基因重组手段，在GFP编码序列的上游插入小鼠Musashi1基因启动子，构建由小鼠Musashi1基因特异启动子调控表达的GFP报告基因重组质粒pMsi1-GFP(重组质粒pMsi1-GFP结构如图1所示)。然后将pMsi1-GFP转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞扩增，制备出含有Musashi1基因启动子和GFP报告基因的重组质粒。

另外，为了说明本发明技术效果，在本发明的实施例中，将构建得到的重组质粒转染入小鼠胚胎干细胞分化而来的细胞群(表达Musashi1)，使其能在细胞中表达，然后用流式细胞仪分选表达GFP报告基因的阳性细胞。得到的Musashi1阳性细胞进一步检测其细胞增殖能力、Musashi1蛋白和mRNA表达水平，从而评价利用上述方法所构建的pMsi1-GFP能否用于Musashi1阳性细胞的活性分离。

本发明涉及的小鼠胚胎干细胞、大肠杆菌DH5α感受态细胞、含有GFP报告基因的pAcGFP1-1质粒载体及其他试剂盒和生化材料均可通过市购取得，而且在下列实施例中对实验中采用的实验材料来源均有说明。

实施例1、重组质粒pMsi1-GFP的构建及获取

1、小鼠Musashi1启动子的扩增、纯化：

利用Takara公司的Universal Genomic DNA Extraction Kit从小鼠胚胎干细胞中提取DNA。

根据小鼠Musashi1基因结构，分析出其可能的启动子序列位置，设计两端引物：

Primer1：5’-CTT CTT CGA GAG TGC TCT GCT GAC TTA-3’

Primer2：5’-GCA CTC TCG AGG AAG GAG ATG ACT ACA TGA-3’

利用Takara公司的Premix PrimeSTAR^TM HS试剂盒进行PCR扩增，反应条件：95℃，预变性5min，94℃，40s；60℃，1min；72℃，1min；在PCR仪上进行30个循环，72℃延伸7min。取PCR产物，琼脂糖凝胶电泳后，切胶，利用Omega公司的Agarose Gel DNAPurification Kit回收PCR产物。

2、Musashi1基因启动子和pAcGFP1-1质粒载体的双酶切和酶连：

回收到的产物和pAcGFP1-1质粒载体用Ecl136II和BamHI双酶切后通过琼脂糖凝胶电泳回收，然后利用Takara公司的DNA Ligation Kit LONG将酶切回收的pAcGFP1-1质粒载体和Musashi1基因启动子序列进行酶连反应。

3、重组质粒转化肠杆菌DH5α感受态细胞及扩增：

(1)大肠杆菌DH-5α冷冻保存的菌种，挑取一环，划线接种在LB固体培养基平板上(活化菌种)，37℃培养过夜(约16小时)。

(2)从长好的平板上挑取一个单菌落，转接在含有3ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜(约16小时)。

(3)取0.3ml菌液接种于20ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养2～3小时，待OD₆₀₀值达到0.3～0.4时，取下三角瓶，立即置冰浴10～15分钟。

(4)将细菌转移到一个灭菌的50ml离心管中，4℃3000r/min离心10分钟，弃去上清液(尽可能将所有的上清液去净)，收集菌体。

(5)加入20ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，重新悬浮菌体，使菌体分散均匀，置冰浴中30分钟。

(6)4℃3000r/min离心10分钟，弃去上清液(尽可能将所有的上清液去净)。

(7)再加入2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，小心重新悬浮菌体(操作要轻)。在4℃冰箱中放置12～24小时，即可应用于DNA转化。

(8)取大肠杆菌DH-5α新鲜感受态细胞100μl于1.5ml Eppendorf管中，加入50～100ng质粒pMsiI1-GFP DNA，轻轻旋转以混合内容物，在冰浴中放置30分钟。

(9)42℃热休克120秒，不要摇动Eppendorf管。

(10)加入LB液体培养基900μl，37℃保温60分钟。

(11)LB固体培养基划菌：在无菌操作台中，用接种环将100μl转化液划菌于1.5％含卡那霉素(50μg/ml)的LB固体培养基上，37℃恒温倒置，至单菌落出现(约14-16小时)；

(12)在无菌操作台中，挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于3.0mlLB(含50μg/ml的卡那霉素)液体培养基中，37℃，250rpm振荡培养过夜，至OD 600nm为0.4-0.5时停止培养。

(13)在无菌操作台中，取100ml LB培养基(含50μg/ml的卡那青霉素)移入500ml无菌锥形瓶中，再往LB培养基中加入0.2ml菌液(1％接种量)，37℃，250rpm振荡培养过夜，至OD 600nm为0.4-0.5时停止培养(约12-16小时)；

(14)摇菌结束后，将100ml LB培养基分次放入50ml无菌离心管中，加入室温10000rpm离心，5min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。

4、pMsiI1-GFP重组质粒的提取：

步骤简述如下：

(1)柱平衡步骤：向吸附柱CP5中(吸附柱放入50ml收集管中)加入2.5ml的平衡液BL，10,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(2)取100ml过夜培养的菌液加入离心管，室温10,000rpm离心3分钟收集细菌，尽量吸除上清；

(3)尽量吸除上清，为确保上清液全部吸取，请用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴；

(4)向留有菌体沉淀的离心管中加入7ml溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀；

(5)向离心管中加入7ml溶液P2，立即温和地上下翻转6-8次，室温放置5分钟；

(6)向离心管中加入7ml溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。然后室温放置10分钟左右。10,000rpm离心5-10分钟，将溶液全部倒入过滤器CS中，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50ml的管中；

(7)向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP5中(吸附柱放入50ml收集管中)；

(8)室温10,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(9)向吸附柱中加入10ml漂洗液PW，10,000rpm离心2分钟，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(10)重复操作步骤9。

(11)向吸附柱中加入3ml无水乙醇，室温10,000rpm离心2分钟，倒掉废液；

(12)将吸附柱CP5重新放回收集管中，将吸附柱CP5开盖，置于室温放置5分钟，10,000rpm离心5分钟；

(13)将吸附柱CP5置于一个干净的50ml收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1.5ml洗脱缓冲液TB，室温放置5分钟，然后室温10,000rpm离心2分钟。将50ml离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5ml离心管，-20℃保存。

5、质粒浓度的检测和质粒DNA的初步鉴定：

通过以下测试：

(1)取质粒测序；

(2)取质粒在分光光度仪上测OD 260nm及OD 280nm；

(3)1％琼脂糖凝胶电泳。

鉴定质粒的浓度，分子量大小和纯度。

实施例2、重组质粒的转染及转染后细胞的观察

1、质粒载体转染：

在诱导第3天时接种细胞至6孔培养板中，每孔接种2×105个细胞。24小时后细胞贴壁，进行脂质体介导下的载体质粒转染，使用LipofectamineTM2000试剂按以下步骤进行：

(1)弃去待转染细胞的旧液，用0.1M PBS洗一遍，弃去PBS；

(2)在6孔板的细胞中加入0.5ml 0pti-MEM I，同时用无菌1.5ml离心管配制：

A剂：pMSI1-GFP质粒载体DNA 2μg，用Opti-MEM I补充至体积为250μl；

B剂：LipofectamineTM2000转染试剂8μl十Opti-MEM I 242μl；

5分钟后使A剂和B剂混合，再过20分钟后一起加入6孔板细胞中，与既有的0.5ml Opti-MEM I组成1ml的转染体系。

(3)在37℃，5％CO2的细胞培养箱中孵育6h；

(4)去除转染试剂，0.1M PBS洗1遍，加入2ml培养基继续培养。

2、转染后细胞形态的观察：

(1)用荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光的表达情况；

以pMsi1-GFP和基础质粒pAcGFP1-1转染mESCs不同时期的分化细胞。根据mESCs分化细胞的Musashi1 mRNA表达规律，选择mESCs、第7天分化细胞、第10天分化细胞进行转染。为了更好观察绿色荧光，在转染细胞24小时后，以Hochest染色细胞核，然后在荧光显微镜下观察转染细胞。如图2、3所示，转染24小时后，在第8天分化细胞中可以看到少量的绿色荧光表达，而第11天分化细胞看到更多绿色荧光；而在空质粒转染组，3种细胞均未见荧光表达。将各组转染后细胞进行流式细胞仪检测GFP阳性细胞率，可见转染pMsi1-GFP的第11天分化细胞GFP阳性细胞率最高。

(2)采用流式细胞仪分选GFP阳性组分；

将pMsi1-GFP转染入mESCs第10天分化细胞，24小时后以流式细胞仪进行分选。如图4所示，分选后的GFP阳性细胞仍表达绿色荧光。如图5所示，流式细胞仪分选后1小时，细胞尚未贴壁，细胞呈小圆形，全部细胞出现绿色荧光。

(3)使用实时定量PCR及western blots测定GFP阳性细胞中Musashi1的表达情况，并与GFP阴性细胞比较。

mESCs第10天分化细胞转染pMsi1-GFP 24小时后，流式细胞仪分选出的GFP阳性细胞、GFP阴性细胞和未分选的转染后的mESCs第11天分化细胞中(简称未分选细胞)的Musashi1 mRNA相对表达量，和未分选细胞中的Musashi1 mRNA相对表达量比较，GFP阳性细胞和GFP阴性细胞的Musashi1mRNA相对表达量分别为15.9±3.40和0.8±0.20。分选出的GFP阳性细胞中的Musashi1 mRNA相对表达量明显高于未分选细胞组和GFP阴性细胞组。

提取分选出的GFP阳性和GFP阴性细胞的总蛋白，经BCA定量后以westernblot方法检测Musashi1蛋白在分选出的2组细胞中的表达差异。结果显示，在GFP阳性细胞中可以检测到Musashi1蛋白表达，而在GFP阴性细胞中未见Musashi1蛋白表达(如图6所示)。进一步验证了所构建的pMsi1-GFP表达能够同步反映细胞内源Musashi1蛋白的表达。可以认为分选出的GFP阳性细胞是Musashi1阳性细胞。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种制备表达载体的方法，其包括基因重组的步骤，该基因重组的步骤将含有小鼠Musashi1基因启动子的目的DNA片段插入到基础载体中含有或者插入的报告基因的上游，所述报告基因由小鼠Musashi1基因启动子调控表达。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述含有小鼠Musashi1基因启动子的目的DNA片段包含小鼠Musashi1基因翻译起始点。

3.如权利要求2所述的方法，其中，所述小鼠Musashi1基因启动子的目的DNA片段为包含小鼠Musashi1基因翻译起始点上游5′非翻译区的823bp序列，以及翻译起始点下游的316bp基因片段。

4.如权利要求1所述的方法，其中，所述含有小鼠Musashi1基因启动子的目的DNA片段具有SEQ ID NO：1的序列。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述报告基因为绿色荧光蛋白报告基因。

6.如权利要求1所述的方法，其中，所述基因重组步骤之前包括含有小鼠Musashi1基因启动子的目的DNA片段的获取，该获取步骤包括：(1)分析小鼠Musashi1基因启动子序列的位置和长度；(2)设计所要克隆的小鼠Musashi1基因启动子片段的引物对；(3)PCR扩增，纯化扩增产物，即获得小鼠Musashi1基因启动子目的片段。

7.如权利要求6所述的方法，其中，所述引物对为SEQ ID NO：2-3所示的寡核苷酸：

SEQ ID NO：2：5′-cttcttcgagagtgctctgctgactta-3′；

SEQ ID NO：3：5′-gcactctcgaggaaggagatgactacatga-3′；

或者SEQ ID NO：2～3所示的寡核苷酸的互补链。

8.如权利要求1～6所述的方法，其中，所述基础载体为pAcGFP1-1质粒载体，所述含有小鼠Musashi1基因启动子的目的DNA片段和小鼠Musashi1基因启动子在该质粒载体的插入区域均含有多克隆酶切位点。

9.如权利要求8所述的方法，其中，所述基因重组步骤包括以下步骤：

(1)将含有Musashi1基因启动子的目的DNA片段和pAcGFP1-1质粒载体的双酶切；

(2)酶切后将含有Musashi1基因启动子的目的DNA片段和pAcGFP1-1质粒载体的酶连；

(3)筛选酶连后的重组质粒转化到宿主细胞进行大量扩增。

10.如权利要求8所述的方法，其中，所述多克隆酶切位点为Ecl136II和BamHI双酶切位点。

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