CN101984069A - 一种快速检测dna甲基化的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测DNA甲基化的试剂盒及方法。本发明与传统方法相比做了以下四个方面的改进：1.DNA提取和DNA修饰同步完成；2.修饰液中添加硫化促进剂MBT和异硫氰酸胍，快速完成DNA提取和修饰过程；3.修饰反应采用短时间高温处理方法，使DNA呈解链状态，以充分暴露碱基，将未甲基化修饰的胞嘧啶转化为磺化尿嘧啶；4.对修饰后繁琐的透析脱盐步骤进行简化处理：将修饰处理后的产物转到核酸纯化柱中，再用清理液处理后洗脱，得到检测基因的甲基化PCR的DNA模板。本发明方法成本低廉、省时、重复性好，可直接用于检测各种组织细胞基因的甲基化水平，在早临床诊断等生物医学检测技术方面具有重要的使用价值。

Description

一种快速检测DNA甲基化的试剂盒及方法

技术领域：

本发明涉及生物医学检测技术领域，具体是一种快速检测DNA甲基化的试剂盒及方法。

背景技术：

DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，是在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变为5’甲基胞嘧啶。哺乳动物中，CpG序列在基因组中出现的频率仅有1％，但在基因组的某些区域中，通常位于基因的启动子区或是第一个外显子区，CpG序列密度很高，可以达均值的5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，形成所谓的CpG岛。DNA甲基化在人的正常发育、X染色体失活、衰老以及许多人类疾病(如发育畸形、癌症、心血管疾病、糖尿病和神经心理失调等)发生过程中发挥重要作用。

甲基化的研究热点之一是甲基化与肿瘤的关系。甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素，这种变化包括基因组整体甲基化水平降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高，从而导致基因组的不稳定(如染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达)和抑癌基因的不表达。目前肿瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。这是因为人们发现肿瘤的发生可能与抑癌基因启动子区的CpG岛甲基化造成抑癌基因关闭有关。由于CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此甲基化的诊断可以用于肿瘤发生的早期预测。如Uhlmann等发现不同病理类型及不同恶性程度的神经胶质瘤细胞的7种肿瘤标志基因存在着不同程度的甲基化[Uhlmann K，Rohde K，Zeller C，etal.Distinct methylationprofiles of glioma subtypes.[J]Int Cancer，2003，Aug.10，106(1)：52-59]，因此，甲基化的研究，为肿瘤的早期预测、分类、分级及预后评估提供了新的依据。

基因甲基化检测主要分为：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测，两种水平检测方法有多种，绝大多数方法检测原理都要通过重亚硫酸氢盐对DNA样品的修饰，使未甲基化修饰的胞嘧啶发生脱氨基反应，变为磺化尿嘧啶，最后在氢氧化钠的作用下转变为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不发生脱氨基反应，胞嘧啶保持不变。通过PCR或其它方法就能对甲基化与非甲基化的CpG岛进行检测加以区别。

重亚硫酸氢盐的修饰效果和效率直接影响到甲基化检测的准确性和效率，传统的重亚硫酸氢盐对DNA样品的修饰过程包括：

1.DNA提取：按常规方法，酚氯仿法(详见莎姆布鲁克著，分子克隆实验指南)需要1～2天时间，或试剂盒法(见本公司产品，植物：SK1203、SK1207、SK1209；动物：SK1205；血液：SK1260；通用：SK1251)，需要2～5小时。

2.重亚硫酸氢盐修饰：

(1)将约2ug DNA于1.5ml EP管中使用DDW稀释至50ul；

(2)加5.5ul新鲜配制的3M NaOH，42℃水浴30min；

(3)加30ul 10mM对苯二酚(氢醌)至上述水浴后混合液中；

(4)加520ul 3.6M亚硫酸氢钠PH 5.0，至上述水浴后溶液中，EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液；

(5)加200ul石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。50℃避光水浴16～18h；

(6)将上述DNA修饰混合在4℃下用DDW透析过夜法纯化或使用PromegaWizard Cleanup DNA纯化回收系统(Promega，A7280)纯化(约还需操作5步，用时1小时以上)；

(7)加10M的氢氧化钠至透析纯化产物，使其终浓度为0.3M室温放置20分钟，再加入等当量的1M的HCl和NaOH，使磺化尿嘧啶转变为尿嘧啶。

(8)加入1/4体积的10M乙酸铵和2倍的无水乙醇-20℃沉淀过夜。

(9)12000rpm离心5分钟，去上清，75％的乙醇洗涤2次，干燥20分钟，加20ul DDW或TE就得到需要的重亚硫酸氢盐修饰过的DNA模板。

这种传统的DNA修饰方法主要存在几个方面的不足：

(1)DNA需要量在1～2ug，在临床诊断中需要较大量的待测人血液或组织，给待测人带来不必要的痛苦。

(2)操作繁锁，必须先提取DNA，再进行DNA修饰，特别是在亚硫酸氢盐修饰过程需要16～18h；纯化和脱磺基步骤也很长时间，严重影响了工作效率，并且，容易造成污染。

(3)50℃低温修饰16～18h，并不能充分地进行修饰，因为此温度下，DNA超螺旋结构不可能打开，造成修饰不完成，实验的重复性不高。

(4)目前，市场上有各类的甲基化检测试剂盒，如美国GENMED SCIENTIFICSINC生产的试剂盒有14种溶液，操作步骤多达30多步，相当繁琐；Zymo公司生产的EZ DNA Methylation-Gold Kit虽然操作简便，但价格昂贵，并且每次处理的DNA量只够做2～3次PCR。

发明内容：

本发明公开了一种快速检测DNA甲基化的试剂盒及方法，具有灵敏度更高，处理更快捷的特点。

本发明实行DNA提取和DNA修饰同步完成，省略了DNA提取和DNA修饰过程中的多步分离、纯化步骤，整个过程在2个小时内完成。

本发明与传统方法相比做了以下四个方面的改进：1.DNA提取和DNA修饰同步完成；2.修饰液中添加硫化促进剂MBT和异硫氰酸胍，快速完成DNA提取和修饰过程；3.修饰反应采用短时间高温处理方法，使DNA呈解链状态，以充分暴露碱基，将未甲基化修饰的胞嘧啶转化为磺化尿嘧啶；4.对修饰后繁琐的透析脱盐步骤进行简化处理：将修饰处理后的产物转到核酸纯化柱中，再用清理液(去磺化)处理后洗脱，得到检测基因的甲基化PCR的DNA模板。

本发明首先提供了一种检测DNA甲基化的试剂盒，包括修饰液、清理液和洗涤液。

所述修饰液包括如下组分：亚硫酸氢钠4-6M，亚硫酸氢铵3-7M，氢醌3-7mM，硫化促进剂1-5mM，异硫氰酸胍2.5-5.5M和缓冲液。

较佳的，所述硫化促进剂为MBT(2-硫醇基苯骈噻唑)，所述缓冲液为pH5-6的40-60mM Tris-HCl。

所述清理液包括如下组分：乙醇30-50％(体积百分比浓度)、氢氧化钠300-500mM和氯化钠200-400mM。

所述洗涤液包括如下组分：pH 6.8的5-15mM Tris，乙醇65-85％(体积百分比浓度)。

所述修饰液、清理液和洗涤液的溶剂均为水。

本发明的检测DNA甲基化的试剂盒可用于从样本细胞中提取DNA，并将未甲基化修饰的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化修饰的胞嘧啶保持不变。

利用本发明检测DNA甲基化的试剂盒同步完成DNA提取和亚硫酸氢盐修饰，回收产物可用作为测序法或甲基化特异性的PCR法的PCR模板。

本发明还提供了一种检测DNA甲基化的方法，包括下列步骤：

1.将适当数量的样本细胞与前述修饰液混合完成细胞裂解后高温处理；

2.将修饰液处理的产物转到核酸纯化柱中；

3.先用清理液去磺化处理，再用前述洗涤液洗涤核酸纯化柱后洗脱，收集洗脱液；

4.以洗脱液中的DNA为模板，采用亚硫酸氢盐修饰后测序法(bisulfite-PCR，BSP)或甲基化特异性的PCR法(Methylation-Specific PCR，MSP)检测DNA甲基化。

所述核酸纯化柱优选UNIQ-10核酸纯化柱(SD5005)。

所述洗脱液选自双蒸水或TE。

所述步骤1修饰反应过程采用短时间高温处理方法，使DNA呈解链状态，以充分暴露碱基，将未甲基化修饰的胞嘧啶转化为磺化尿嘧啶。步骤3将磺化尿嘧啶去磺化转变为尿嘧啶。

所述步骤1中的高温处理方法为：

98℃ 20秒→90℃ 20分钟→70℃ 5分钟→4℃保温。

所述步骤4可使用10次以上。

所述的亚硫酸氢盐修饰后测序法和甲基化特异性的PCR法是用于甲基化检测最为广泛的方法。BSP法是以亚硫酸氢盐修饰后的DNA为模板在待测CpG岛两端设计引物，通过PCR扩出目的序列，直接测序或克隆测序，克隆测序可用于定量检测；MSP法也是以亚硫酸氢盐修饰后的DNA为模板做PCR，但引物设计位置不一样，在待测CpG岛甲基化区域设计两对引物，分别是甲基化特异性的(primer I)和非甲基化的引物(primerII)。如果甲基化引物能扩增出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化，若用针非甲基化DNA链的引物扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化，MSP法用于定性检测，对于单个位点的甲基化区域容易出现假阳性。

具体的，所述检测DNA甲基化的方法可包括下列步骤：

(1)收集的细胞10³～10⁵个直接加入修饰液按前述高温处理方法处理；

(2)将修饰液处理的产物转到UNIQ-10核酸纯化柱，离心，弃收集管废液。

(3)加清理液到UNIQ柱中，室温静置10min，离心，弃收集管废液。

(4)加入洗涤液UNIQ柱中，离心，弃收集管废液。重复洗涤一次

(5)加入双蒸水或TE，离心收集洗脱液。

本发明的基因甲基化检测试剂盒及方法价廉、高效、快速、高重复性，相比传统方法的不足，做了多方面的改进：

1、试剂盒组成更加简单，只有3种配制的溶液：

2、试剂盒操作更加简便，实行DNA提取和修饰同步进行，节省DNA提取的耗时耗材，同时，减少操作步骤，可以极大程度地避免交叉污染。本试剂盒修饰液既是DNA修饰液，也是细胞裂解和DNA提取液。修饰液中添加了4M异硫氰酸胍，起到溶解蛋白、裂解细胞作用，并促进修饰的DNA与UNIQ柱中硅胶膜结合。

3、操作方案采用高温物理变性来取代以传统方案中使用氢氧化钠的化学变性，在高温条件下，DNA呈解链状态，以充分暴露碱基，并采用高浓度亚硫酸氢盐取代低浓度的亚硫酸氢盐将未甲基化修饰的胞嘧啶充分转化为磺化尿嘧啶。

4、为使DNA修饰在短时间内更加充分，在修饰液中添加硫化促进剂MBT，化学名称2-硫醇基苯骈噻唑剂(2-Mercaptobenzothiazole)，分子式C₇H₅NS₂，可促进DNA的快速修饰转化。

5、针对DNA修饰后繁琐的纯化和去磺化步骤，采用UNIQ-10柱，直接在UNIQ柱中完成脱盐和去磺化，节省大量时间，同时减少因操作步骤过多而导致修饰过的DNA回收的损失，提高回收率。

本发明方法成本低廉、大大节省DNA提取和脱盐时间、重复性好，可直接用于检测血细胞、口腔上皮细胞及各种组织细胞基因的甲基化水平，在早临床诊断等生物医学检测技术方面具有重要的使用价值。

附图说明

图1：PCR产物凝胶电泳图

条带从左到右依次为Marker，HOXC9，CRABP1和IGFBP7

图2：实施例5PCR产物凝胶电泳图

条带从左到右依次为Marker，IGFBP7

图3：实施例2测序比对图

图4：实施例3测序比对图

图5：实施例4、实施例5测序比对图

具体实施方式：

下面结合BSP法实例来充分说明本发明试剂盒修饰效果和详细的操作过程。

实施例1试剂盒的制备

三种溶液按常规方法配制。

配方1如下：

(1)修饰液：5M亚硫酸氢钠，5M亚硫酸氢铵，5mM氢醌，2mM MBT(2-硫醇基苯骈噻唑)，4M异硫氰酸胍，50mM Tris-HCl pH 5.5；

(2)清理液：35％乙醇，400mM氢氧化钠，200mM氯化钠；

(3)洗涤液：10mM Tris pH 6.8，80％乙醇。

三种溶液的溶剂均为水。

将修饰液、清理液和洗涤液分装后装配试剂盒。

配方2如下：

(1)修饰液：4M亚硫酸氢钠，3M亚硫酸氢铵，7mM氢醌，5mM MBT(2-硫醇基苯骈噻唑)，2.6M异硫氰酸胍，40mM Tris-HCl pH 6.0；

(2)清理液：30％乙醇，500mM氢氧化钠，200mM氯化钠；

(3)洗涤液：5mM Tris pH 6.8，85％乙醇。

三种溶液的溶剂均为水。

将修饰液、清理液和洗涤液分装后装配试剂盒。

配方3如下：

(1)修饰液：6M亚硫酸氢钠，7M亚硫酸氢铵，3mM氢醌，1mM MBT(2-硫醇基苯骈噻唑)，5.5M异硫氰酸胍，60mM Tris-HCl pH 5.0；

(2)清理液：50％乙醇，300mM氢氧化钠，400mM氯化钠；

(3)洗涤液：15mM Tris pH 6.8，65％乙醇。

三种溶液的溶剂均为水。

将修饰液、清理液和洗涤液分装后装配试剂盒。

实施例2：检测口腔上皮细胞HOXC9基因启动子区

1、采样：采样前，先用清水簌口，然后一手持消毒的医用棉签，伸进口腔，从口腔内侧颊粘膜处反复擦拭5分钟左右，取出棉签，把棉签放入盛有1ml TE的EP管中清洗，12000rpm离心3分钟，去上清，收集口腔上皮细胞。

2、细胞裂解：取500ul的实施例1配方1的修饰液放入1.5ml的EP管中，将少于或等于20ul的收集的口腔上皮细胞加入盛有修饰液EP管中，颠倒混匀、轻微震荡30秒，细胞裂解变澄清。

3、修饰：将上述修饰液体平均分成4份分装到4个PCR管中，在PCR仪中高温修饰处理：98℃20秒→90℃20分钟→70℃5分钟→4℃保温。

4、上柱：将修饰液处理的产物转到UNIQ-10核酸纯化柱，室温静置1分钟，8000rpm离心2分钟，弃收集管废液。

5、脱磺化：加入实施例1配方1的清理液500ul甩动数次，使清理完全浸入UNIQ柱的硅胶膜中，室温放置15～20分钟，8000rpm离心2分钟，弃收集管废液。

6、纯化：加入实施例1配方1的洗涤液500ul于UNIQ柱中，12000rpm离心2分钟，弃收集管废液。重复洗涤一次。55℃烘箱放置10分钟，加30ul DDW或TE，12000rpm离心2分钟，得到重亚硫酸氢盐修饰过的DNA模板。

7、PCR：

(1)引物设计

上游引物：5’TGGAGGGGTATGAGGAGTTTAG 3’(SEQ ID NO：1)

下游引物：5’CCTTTAACTATAAAACCCCCATAAC 3’(SEQ ID NO：2)

PCR产物大小：316bp

(2)50μl体系的配制

(3)PCR反应条件

(4)电泳与回收

1％糖凝胶电泳观察结果(附图1)，PCR产物用试剂盒SK1261回收。

8、克隆测序

PCR纯化产物连接到pUC18-T载，转化感受态细胞(制备方法SK2301)，将细菌涂布在含有IPTG/X-gal的氨苄青霉素平板上，37℃培养过夜。用牙签挑白色单菌落至含氨苄青霉素的液体培养基，37℃培养过夜。提取质粒(SK1191)，M13+引物测序(附图3)。

从图3中可看出所有C都转化成U转化率为100％，经PCR克隆测序后变为T，PCR扩增区域的16个CpG岛的C全部转变为T，说明该克隆没有甲基化的CpG岛。

实施例3：检测肿瘤组织切片与肿瘤转移相关的CRABP1基因启动子区

组织切片脱蜡：用灭菌小镊子将石蜡组织切片约30～100mm²夹入1.5ml的EP管中，加入100ul二甲苯，轻弹EP管，室温放置3min，然后13000rpm离心5min，用移液器吸弃上清。加入100ul无水乙醇，12000rpm离心2min，用移液器吸弃上清。加入100ul 75％乙醇，12000rpm离心2min，小心弃上清，将样品晾干。

细胞裂解：取500ul的实施例1配方1的修饰液放入装有样品的EP管中，颠倒混匀、轻微震荡30秒，细胞裂解变澄清。

以下按实施例2中步骤3-6操作。

PCR：

上游引物：5’TTGAGAAGATGAGGAATGGTGA 3’(SEQ ID NO：3)

下游引物：5’CATACTCTCTATACCAACTTACCCAAC 3’(SEQ ID NO：4)

扩增长度365bp，检测30个CpG岛

PCR反应体系、反应条件及克隆测序同实施例1，电泳图见附图1，M13+引物测序见附图4。

从图4中可看30个CpG岛中144、154、164位C仍然还是C，没的转化为T，说明该三个位点存在甲基化。其它27个CpG岛的C及所有非CpG岛的C都转变为T，转化率为100％。可以推断144、154、164位CpG的甲基化可能与肿瘤发生有关。

实施例4：检测胃癌细胞株胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)基因启动子区

用0.25％胰蛋白酶消化贴壁生长的胃癌细胞，EP管离心收集细胞1×10⁵个，PBS或生理盐水洗涤2次，去上清。

至PCR前的步骤同实施例3。

PCR：

上游引物：5’GAGAAATTAGAGGGTGGAAGAGT 3’(SEQ ID NO：5)

下游引物：5’CTCCATAACRAAATACRATAACAAC 3’(SEQID NO：6)

扩增长度353bp，检测45个CpG岛。

PCR反应体系、反应条件及克隆测序同实施例1，电泳图见附图1，M13+引物测序见附图5。

从图5中可看出45个CpG岛中只有103位都转变为T，其它44个CpG岛的C仍然还是C，没有转化为T，说明该胃癌细胞株IGFBP7基因启动子区存在高甲基化现象。所有非CpG岛的C都转变为T，转化率为100％。

实施例5：EZ DNA Methylation-Gold Kit检测胃癌细胞株胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)基因启动子区

为验证实例4本试剂盒的检测结果的可靠性，采用Zymo公司生产的EZ DNAMethylation-Gold Kit法处理DNA样品。

1、DNA提取，采用Bio Basic INC公司试剂盒(BS473)提取。

2、在PCR管中添加130μl的CT Conversion Reagent，再加入20μl、约500ng的DNA样品，通过轻弹试管或移液器操作来混合样品。

3、将样品管放到PCR仪中并按以下步骤操作：

98℃10分钟→64℃2.5小时→4℃下存储(最多20小时)。

4、添加600μl的M-Binding Buffer到Zymo-Spin IC Column中，把步骤2样品装填到Zymo-Spin IC Column中，盖上盖将柱颠倒数次来混合样品。10000rpm离心30秒，去除流出液。

5、添加200μl的M-Wash Buffer到柱中，12000rpm离心30秒。添加200μl的M-Desulphonation Buffer到柱中，在室温下放置15-20分钟。全速12000rpm离心30秒，去除流出液。

6、添加200μl的M-Wash Buffer到柱中，全速离心30秒，去除流出液。重复一次。

7、直接添加10μl的M-Elution Buffer到柱基质中，将柱放置在1.5ml的管中，12000rpm离心30秒，洗脱DNA。DNA可立刻进行PCR分析或储存在低于-20℃下以备用。

PCR引物、反应体系、反应条件及克隆测序同实施例4，电泳图见附图2，M13+引物测序见附图5。

从图5中可看出45个CpG岛中只有103位、227位、238位3个CpG岛两种方法检测有差异，其它42个CpG岛的检测结果是一致的。所有非CpG岛的C都转变为T，转化率为100％。

但这种差异不是试剂盒不同引起的，而样品中细胞株之间甲基化程度略有差异引起的。检测说明EZ试剂盒检测该胃癌细胞株IGFBP7基因启动子区也是存在高甲基化现象与本试剂盒检测结果是一致的。

通过以上实例可以得出结论：

1、本发明确实是一种快速DNA甲基化检测的试剂盒，从细胞样品到DNA修饰纯化不到3个小时，远少于传统方法的2天时间。与Zymo公司生产的EZ DNAMethylation-Gold Kit处理时间相当。

2、回收效率高，每次处理的DNA样品可以完成10次以上的PCR，高于EZ DNAMethylation-Gold Kit的3～5次。

3、转化效率高，以上3个实例中所有C都转化为T，转化效率达到100％。

Claims (10)

1.一种检测DNA甲基化的试剂盒，包括修饰液、清理液和洗涤液。

2.如权利要求1所述检测DNA甲基化的试剂盒，其特征在于，所述修饰液包括如下组分：亚硫酸氢钠4-6M，亚硫酸氢铵3-7M，氢醌3-7mM，硫化促进剂1-5mM，异硫氰酸胍2.5-5.5M和缓冲液。

3.如权利要求2所述检测DNA甲基化的试剂盒，其特征在于，所述硫化促进剂为MBT，所述缓冲液为pH 5-6的40-60mM Tris-HCl。

4.如权利要求1所述检测DNA甲基化的试剂盒，其特征在于，所述清理液包括如下组分：乙醇30-50％、氢氧化钠300-500mM和氯化钠200-400mM。

5.如权利要求1所述检测DNA甲基化的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液包括如下组分：pH 6.8的5-15mM Tris，乙醇65-85％。

6.如权利要求1-5任一权利要求所述检测DNA甲基化的试剂盒用于从样本细胞中提取DNA，作为亚硫酸氢盐修饰后测序法或甲基化特异性的PCR法的PCR模板的用途。

7.一种采用权利要求1-6任一权利要求所述试剂盒检测DNA甲基化的方法，包括下列步骤：

1)将适当数量的样本细胞与修饰液混合完成细胞裂解后高温处理；

2)将修饰液处理的产物转到核酸纯化柱中；

3)先用清理液去磺化处理，再用洗涤液洗涤核酸纯化柱后洗脱，收集洗脱液；

4)以洗脱液中的DNA为模板，采用亚硫酸氢盐修饰后测序法或甲基化特异性的PCR法检测DNA甲基化。

8.如权利要求7所述试剂盒检测DNA甲基化的方法，其特征在于，所述核酸纯化柱为UNIQ-10核酸纯化柱。

9.如权利要求7所述试剂盒检测DNA甲基化的方法，其特征在于，所述洗脱液选自双蒸水或TE。

10.如权利要求7所述试剂盒检测DNA甲基化的方法，其特征在于，所述步骤1)中的高温处理方法为：98℃20秒→90℃20分钟→70℃5分钟→4℃保温。

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