CN101980729A

CN101980729A - 交联水凝胶

Info

Publication number: CN101980729A
Application number: CN2008801211873A
Authority: CN
Inventors: K·基塔; N·G·史密斯; A·M·劳曼; G·W·富塞尔; M·F·基恩
Original assignee: Synthes GmbH
Current assignee: Synthes GmbH; Drexel University; Synthes USA LLC
Priority date: 2007-12-17
Filing date: 2008-12-16
Publication date: 2011-02-23
Also published as: US20100272672A1; KR20110025889A; JP2011506753A; BRPI0822088A2; WO2009079507A2; WO2009079507A3; US9078953B2; EP2219694A2; AU2008338428A1; AU2008338428A8; EP2219694B1; CA2708755A1

Abstract

本发明优选提供一种成形方法和得到的固体聚合物凝胶组合物，所述组合物包括聚乙烯亚胺和至少一种氢键接聚合物。该组合物的粘度高于聚乙烯亚胺或氢键接聚合物的单独的粘度，并能够在聚乙烯亚胺和至少一种氢键接聚合物混合后紧接着注射。组织修复方法包括混合大约9.25％(w/w)到大约13.65％(w/w)的聚乙烯亚胺和大约18.02％(w/w)到大约26.62％(w/w)的聚乙烯醇，以形成一种可注射组合物；注射所述可注射组合物进入人体内的空腔；并允许组合物原位固化。一种试剂盒包括一个多管式注射器，至少一个管装载有聚乙烯亚胺，而至少另一个管装载有至少一种氢键接聚合物。

Description

交联水凝胶

相关申请的交叉引用

本申请要求美国临时申请号为61/014,347，2007年12月17日提交的，标题为“交联水凝胶”的权益，这篇申请的内容在此以引用的方式全文并入。

背景技术

人椎间盘包括外部或外围腱结构，所述结构包围内部凝胶状髓核材料。椎间盘结构整体性的缺失导致这些组织的脱水和退化，从而导致椎间盘的功能缺失。

慢性背痛是上述退化结果在患者中的常见症状。目前的治疗范围从卧床休息到大创伤外科手术，包括脊椎融合术和全盘替换。另外，通过髓核组织的替换或补充，可以缓解疼痛，并且恢复脊椎健康的生理学功能。文中所述的交联水凝胶已经应用在这种髓核组织的替换或补充以及其它生物应用中。

虽然包括单一聚合物的聚合物组合物能够配制形成固体，但是使得组合物会具有远高于本发明实施方式的总的聚合物浓度，并且也不能注射。

发明简述

本发明涉及成形方法，以及得到的固态化聚合物凝胶和其中间物(intermediaries)，用作软组织替代、补充或修复物，植入刚性结构，支架和/或生物粘合剂或用在椎体成形术(vertebroplasty)。

本发明一个实施方式可以包括聚合物凝胶组合物，该组合物包括聚乙烯亚胺和至少一种氢键聚合物，该组合物的粘度高于聚乙烯亚胺或氢键接聚合物的单独的粘度。聚乙烯亚胺和至少一种氢键接聚合物都可以具有适宜的粘度和性质，在混合前，能够在室温或手术室条件下进行注射。所述组合物也能够在聚乙烯亚胺和至少一种氢键接聚合物混合后紧接着(immediately，立即)注射，但是此后固化成可模制形式。所述组合物在混合后可以是可注射的，但随后可能在患者体内原位固化。所述氢键接聚合物可以包括聚乙烯醇、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟基乙酯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸或其组合。

本发明另一个实施方式可包括聚合物凝胶，该凝胶包括大约9.25％(w/w)到大约13.65％(w/w)的聚乙烯亚胺和至少一种氢键接聚合物，该组合物的粘度高于聚乙烯亚胺或氢键接聚合物的单独的粘度。聚乙烯亚胺和至少一种氢键接聚合物都可以在混合前具有适宜的粘度和其他性质，以便能够在混合后紧接着进行注射，但是此后固化成可模制形式。所述组合物可以在混合后注射但是此后可在患者体内原位固化。

本发明另一个实施方式可包括聚合物凝胶，该凝胶包括聚乙烯亚胺和大约18.02％(w/w)到大约26.62％(w/w)的氢键接聚合物，该组合物的粘度高于聚乙烯亚胺和至少一种氢键接聚合物的单独的粘度。聚乙烯亚胺和至少一种氢键接聚合物都可以在混合前具有适宜的粘度和其他性质，以便能够在室温或手术室条件下进行注射，但是此后固化成可模制形式，和/或在患者体内原位固化。

本发明另一个实施方式可包括固体聚合物凝胶，该凝胶包括聚乙烯亚胺和大约18.02％(w/w)到大约26.62％(w/w)的聚乙烯醇，该组合物的粘度高于聚乙烯亚胺和聚乙烯醇的单独的粘度。聚乙烯亚胺和至少一种氢键接聚合物都可以在混合前具有适宜的粘度和其他性质，以便能够在混合后紧接着进行注射，但是此后固化成可模制形式，和/或在患者体内原位固化。

本发明另一个实施方式可包括固体聚合物凝胶，该凝胶包括大约9.25％(w/w)到大约13.65％(w/w)的聚乙烯亚胺和大约18.02％(w/w)到大约26.62％(w/w)的聚乙烯醇，该组合物的粘度高于聚乙烯亚胺或聚乙烯醇的单独的粘度。所述组合物可以在聚乙烯亚胺和聚乙烯醇混合后紧接着是能够注射的。所述组合物可以在混合后能够注射但是此后固化成可模制形式和/或在患者体内原位固化。所述组合物优选在医疗步骤中保持足够时间的可注射性已被植入，但是之后在植入后相对快的原位固化。

本发明另一个实施方式提供了形成固体聚合物凝胶组合物的方法，该方法包括：提供聚乙烯亚胺，其具有适宜的粘度和性质，以便能够在室温或手术室条件下进行注射；提供至少一种氢键接聚合物，其具有适宜的粘度和性质，以便能够在室温或手术室条件下进行注射；混合所述聚乙烯亚胺和至少一种氢键接聚合物，其中经混合的组分的粘度高于混合前聚乙烯亚胺或至少一种氢键接聚合物的粘度，且其中聚合物凝胶组合物与没有使用聚乙烯亚胺的至少一种氢键接组合物固化相比，能够在较低的聚合物含量下固化。

本发明另一个实施方式可包括组织修复方法，该方法包括：混合大约9.25％(w/w)到大约13.65％(w/w)的聚乙烯亚胺和大约18.02％(w/w)到大约26.62％(w/w)的聚乙烯醇，以形成可注射组合物；将该可注射组合物注射入哺乳动物体内的空腔内；并且允许组合物原位固化。

本发明另一个实施方式提供了试剂盒，包括：多管式(multi-barrel)注射器，其中一个管内可装有足够浓度的聚乙烯亚胺以便在室温或手术室条件下能够注射，其中至少一个管内装有足够浓度的氢键接聚合物以便在室温或手术室条件下能够注射。

上述实施方式只是对本质的说明和示范，并不用于限制和定义本发明的保护范围。

附图简述

前述的发明简述，以及下面对申请优选实施方式的详述，在与附图一起阅读时会更有助于理解。说明书中的附图、实施例和实施方式是对本发明结构、特征和方面的说明和示范，并不用于限制本发明的保护范围。可以理解为，本申请不限于所示的精确安排和手段。附图中：

图1是模制为圆柱体的样品组合物的压缩实验数据的图示。

图2是对于4小时模制时间，样品组合物的压缩模量与增加的PEI含量的图示。

图3是对于18小时模制时间，样品组合物的压缩模量与增加的PEI含量的图示。

图4是对于模制30分钟的样品组合物，密度大小和浸入时间关系的图示。

图5是对于模制30分钟的样品组合物，归一化质量和浸入时间关系的图示。

图6是测试样品和对照样品的典型DSC扫描的图示。

发明详述

说明书中的方法、实施例和实施方式是应理解为对本发明的结构、特征和方面的说明和示范，并不用于限制本发明的保护范围。

本发明一个示范实施方式涉及成形方法，以及得到的固体聚合物凝胶组合物，该组合物具有超过组合物中任何单独组分的粘度。所述聚合物凝胶组合物可以在组分混合后紧接着注射，但是此后可以固化成可模制形式和/或在患者体内原位固化。

由于其高含水量和模仿本体生理组织的能力，水凝胶在用于髓核替代，以及体内其它不同位置的组织替代和增补的合成材料的研究中非常有价值。物理交联结构的开发是有价值的，以便避免含有用于形成多种化学网络结构的有毒交联剂。本发明的组合物可以包含通过增强的氢键接得到的密集的物理交联网络结构。

产生增强的氢键接效果的多组分的组合，例如具有本发明的组成，并没有在之前公开，并且，两种可注射组分通过自然增强的物理交联形成具有期望的机械和弹性性能的固态水凝胶结构也没有在之前公开。

本发明一个实施方式可包括可注射多组分系统，其中一种组分包括PEI或类似的阳离子聚合物。第二组分可包括亲水性、离子型或氢键接聚合物的水溶液，例如，但不限于，PVA，聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)(包括超接枝种类)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯酰胺(PAAm)、聚甲基丙烯酸羟基乙酯(PHEMA)、聚丙烯酸(PAA)和聚甲基丙烯酸(PMA)。还预期了亲水性组分的组合(混合物或共聚物)例如，99∶1的聚乙烯醇∶聚乙烯基吡咯烷酮。

本发明另一个实施方式是可注射多组分组合物，该组合物包括大约9.25％(w/w)到大约13.65％(w/w)的PEI，优选大约10.2％(w/w)到大约12.4％(w/w)的PEI，更优选大约11.4％(w/w)到大约11.8％(w/w)的PEI，还包括大约18.02％(w/w)到大约26.62％(w/w)的PVA，优选大约19.7％(w/w)到大约23.3％(w/w)的PVA，更优选大约22.1％(w/w)到大约22.6％(w/w)的PVA。

聚乙烯亚胺(PEI)上的伯胺和仲胺基团已知可以形成强力氢键并在液态中高度缔合。聚乙烯醇(PVA)类似地形成氢键。这两者聚合物都可以在水中混溶，并且当PEI与PVA水溶液混合时形成单相溶液。

本发明一个实施方式是聚合物凝胶，其可由两种低粘度组分组成，其组合形成粘度高于两种组分中任一的单独粘度的组合物。这种协同作用通过固化凝胶的压缩模量的明显增加以及物理交联的网络结构稳定由两种组分形成的凝胶加以证明。本发明一个方面是两种组分的可注射性，以及单独组分紧随混合后最终组合物的可注射性。这样就允许在组合物固化成所得的凝胶配制剂之前将其注射入哺乳动物体内。本发明的聚合物组合物可以在大约5分钟到大约32小时内固化成所得凝胶配制剂，优选20分钟到16小时，更优选45分钟到8小时。本领域普通技术人员很容易理解聚合物组合物优选在外科手术期间保持可注射性。

低粘度的聚合物，例如，PEI，和能够氢键接的聚合物，例如，PVA，的组合通过增强的氢键接作用交联和稳定凝胶，从而得到固化特性。这是意想不到的结果，因为之前没有提示两种粘性组分的组合能够导致弹性网络的形成。添加PEI允许在不牺牲组合物的可注射性能的情况下增加总的聚合物含量。多组分系统可以在注射前混合在一起，或在注射过程期间混合，例如，使用常规静态混合器。

包括聚合物组分的材料可以以在分隔容器中的试剂盒形式提供，这样聚合物能够容易地仅在医用过程之前或期间混合。在一个实施方式中，聚乙烯亚胺可以提供在至少一个第一容器中，该第一容器装载有足够浓度的聚乙烯亚胺以在室温或手术室条件下可注射，以及至少一种氢键接聚合物可以提供在至少一个第二容器中，该第一容器装载有足够浓度的氢键接聚合物以在室温或手术室条件下可注射。所述多管式注射器可以包含混合室或以使它们混合形成会在之后固化的组合物的形式注射所述组合物。聚合物提供在多管式注射器的分隔的管中，并且具有形成固化凝胶组合物的足够浓度。

作为与PVA/PEI凝胶相当的总聚合物浓度下的氢键接的相互作用的一般形式的结果，只含有PVA的聚合物凝胶表现出较低的压缩模量并且不能模制为自立式(self-supporting)结构。作为比较，PVA/PEI凝胶表现出由于形成密集的网络结构得以增强的机械性能，这通过在混合时与所预期的两种组分的混合物的更高的快速粘度增加，以及不同于只含有PVA的聚合物凝胶的固化(即固态化)特性和可模制为固体凝胶的能力得到证明。

本发明所述组合物可以用作软组织替代、补充、修复或用于脊椎成形术中。软组织应用包括椎间盘修复(例如，髓核替代，对纤维环的矫正)，膝盖半月板修复，或关节重建系统的任意部分。也已考虑用于美容和重建手术(例如组织增补)以及单独使用该组合物或部分地作为辅助修整手术的粘着物使用该组合物。其他用途包括细胞(例如，间充质干细胞)支架，结合生长因子(例如，骨形态发生蛋白)以及在药物递送中的应用。

实施例和实验

下面的实施例和实验描述了文中所述固化凝胶组合物的某些性能，并且只是用于帮助解释和说明固化凝胶组合物的某些结构、特征和方面，并不用于将本发明的保护范围限定到前述的明确安排、组合物、性能或特征。

实施例1：组合物的制备

实施例1阐述了本发明所述组合物的一个实例的配制。将PEI与PVA的水溶液和水组合，如表1所示。

表1：PEI/PVA组合物

组分	百分比(w/v)
		PEI	11.45±2.2
PVA	22.32±4.3
		H₂O	66.23±12.9

通过混合PEI(以供应的原样使用；Sigma Aldrich Cat.#408727；Batch#09529KD；M_n：10kDa)与PVA水溶液以及水制备得到组合物。使用的PVA等级是Mowiol 28-99(Kuraray Specialties Europe，99.0-99.8％的水解度；M_w：145kDa)。在PEI和PVA混合之前，两种聚合物是粘性的但是可以流动或注射。文中所述的可注射混合物，在室温和/或通常低于室温的手术室条件下可以流动通过直径大约1mm到大约5mm的孔口。

将各组分的混合物在水浴中保持在75℃。混合各组分并得到硬化(stiff)凝胶或糊剂，其具有相比两组分中任一单独组分增加或更高的粘度。分开的组分是可注射的，并使用两个注射器将PVA和PEI溶液进行混合。还使用配备有一个或多个混合室的多管式注射器。混合后，混合物的粘度紧接着有明显增加，从组合物散热，且混合物变成半透明状。然后将该糊剂以其原样(green form)转移到密封的圆柱形模具中直到机械测试的时间。混合物的粘度稳步上升直至样品固化。根据以上描述制备数个样品组合物，放于模具中并培养不同长度的时间，无论是小到15分钟还是大到32小时。当整体凝胶形成圆柱体时，将样品组合物从模具中移出。

对于只含有PVA的总聚合物浓度低于32％的组合物来说，不容易观察到其从液态到固态的转变。超过32％的只有PVA的凝胶组合物在溶液形成后紧接着“立起”或固化，并且不能在常压下流动(即，不可注射)。尽管只有PVA(Mowiol28-99)的34％溶液不能被搅拌或注射，但是PVA/PEI组合(22.32％的PVA/11.45％的PEI；33.77％的聚合物总含量)的34％溶液具有可注射原样状态(green state)，从而在熟化为稳定的固化聚合物网络结构前有一段时间。这段时间能够使得到的组合物注射到人体内。然后组合物能在体内固化。

实施例2：轴向压缩测试

根据实施例1所述配制22.32％的PVA/11.45％的PEI组合物，然后在应变率为100％应变每分钟的条件下轴向压缩到35％中进行测试。表2中试样1，2和3代表样品组合物的不同样品。还测试了只有PVA的28％浓度的组合物作为对比。

当与模制后的低压缩模量，无定形的PVA凝胶比较时，不同PVA/PEI样品组合物很容易固化并显示出增长的压缩模量。

表2

表2示出了从原样状态固化或熟化32小时后的样品组合物的机械测试数据。图1是表2中试样之一的典型曲线的图示。样品组合物在轴向压缩/恢复试验中进行了装载阶段(图1所示曲线的上部)和卸载阶段(图1所示曲线的下部)。装载阶段代表样品组合物压缩时的相对于应变的应力。卸载阶段代表当从样品组合物上移出装载(或压力)时的相对于应变的应力。装载和卸载曲线联合表示“滞后”。通常，具有更大弹性响应的凝胶导致小的两个曲线间的面积(即，“接近的”滞后”)。通常，曲线下的大面积代表组合物能够弹性变形并且不能在压缩后恢复。

能够观察到，在产生35％的应变和移除装载后，表2的样品组合物紧接着恢复到非常接近它们原始高度(例如，没有观察到明显的高度差)。图1中的接近的滞后示出了样品的恢复。装载和卸载循环十分近似，表示最小的塑性形变。在压缩测试后，这些测试圆柱体没有明显的缺陷，裂缝或断裂，测试结果显示，样品没有总体上的改变。

实施例3：配制比较

使用实施例2的压缩测试，对于4小时和18小时，分别测试下面增加的PEI浓度的样品组合物。各样品组合物配制三次，然后经历测试阶段。

表3：总的组合物(％w/w)

图2是各样品组合物4小时的压缩模量的图示。图3是各样品组合物18小时的压缩模量的图示。图2和3中每个数据栏端部的直线代表样品组合物间的偏差。具有PEI组分的样品组合物在4小时的压缩模量明显高于只含有PVA的对照组合物。PVA/PEI样品18小时分析的压缩模量也较高。含有PEI的凝胶是半透明的，显示出结晶性并且能够被模制，而只含有PVA的对照组合物是透明的且不能保持模制的形状。PVA水凝胶的结晶性通常导致物理交联，因为聚合物片段内的羟基连接到邻近聚合物链上的其他羟基。通过使PVA溶液和PEI共混而显示出的结晶性促进凝胶形成和最终压缩模量的增加。

实施例4：浸入研究

在短期研究中(例如，14天；n＝3)，将22.32％PVA/11.45％PEI的组合物模制30分钟，并浸入到磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中，其相当于典型的局部软组织环境，或葡聚糖水溶液(20％w/w)中，其相当于脊柱内椎间盘的渗透压(0.1MPa)。随着水吸入，显示出样品凝胶组合物的质量(mass)增加，以及密度降低。图4示出了样品组合物随时间的密度。在最初的密度降低后，浸入了葡聚糖的组合物能够恢复到初始密度的0.01g/ml内。但是，浸入了PBS的组合物在其最初的密度降低后不能恢复其密度。

图5示出了组合物随时间的归一化质量。浸入了葡聚糖的组合物显示随时间保持稳定的归一化质量，但是浸入了PBS的组合物随时间损失质量。图4和5的数据都显示浸入葡聚糖中的组合物比浸入PBS中的组合物更加稳定。

实施例5：替换的配制

使用与PEI混合的PEO(Fluka#：81280；M_n＝10kDa)制备PEI和聚环氧乙烷(PEO)的组合物。将PEI与33％PEO溶液按照1∶1的质量比混合。所述混合物导致粘度比PEI或PEO任一单独组分都高的半透明溶液的形成。得到的组合物在PEI与PEO混合时固化。

实施例6：量热学

使用差示扫描量热计(DSC)来比较PVA/PEI凝胶组合物(“测试样品”)与只有PVA(即，无PEI)形成的凝胶组合物(“对照样品”)的样品结晶温度。正如该研究所示，随着PEI的加入，结晶温度显示出升高。

表4：组合物^*

测试样品	对照样品
		20％PVA	25％PVA
20％PEI	0％PEI
		60％H₂O	75％H₂O

*组合物百分比是基于w/w，并加以选择以保持PVA与水的比是常量。

测试样品的DSC显示在刚过90℃的吸热，而对照样品显示出在75℃-85℃范围的吸热。见图6。更高的结晶温度并具有更大的吸热是更稳定凝胶的标志。因此PVA中添加PEI是合意的，因其形成结晶网络结构从而较不会倾向于“融化掉”。当凝胶组合物“融化”时，结晶网络结构中的键遭到破坏。PVA/PEI测试样品是具有高压缩模量和较高吸热的稳定的凝胶组合物。

之前的说明书中清楚描述的前述实施方式能够充分完成，而且，只要不背离本发明的精神和范围，可以对上述形成方法和得到的组合物做出某些改变，可以认为上述说明书中包含的所有主题是解释作为说明，并不用于限制范围。

也可以理解为，文中的实施方式可以认为覆盖本发明文中所述的一般和特殊特征以及本发明范围的所有陈述，语言上说，可以落入其中。特别可以理解为，所述实施方式中单一列举的成分或化合物可以认为包括此类成分的可兼容混合物。

本领域技术人员可以从上述实施方式中得以领会，从而做出不背离公开的发明构思的改变。因此，可以理解为，本发明不限于公开的特定实施方式，且可以认为覆盖在附加权利要求限定的本申请的精神和范围内做出的改进。

Claims

1.固体聚合物凝胶组合物，其包括聚乙烯亚胺和至少一种氢键接聚合物，其中所述聚乙烯亚胺在混合前是可注射的，所述至少一种氢键接聚合物在混合前是可注射的，其中该组合物的粘度高于所述聚乙烯亚胺或所述氢键接聚合物中任一单独的粘度，并且紧接在所述聚乙烯亚胺和所述至少一种氢键接聚合物的混合后是可注射的。

2.权利要求1的组合物，其中所述氢键接聚合物选自聚乙烯醇、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟基乙酯、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸。

3.权利要求1的组合物，其中所述氢键接聚合物是聚乙烯醇。

4.权利要求1的组合物，其中所述聚乙烯亚胺为大约9.25％(w/w)到大约13.65％(w/w)。

5.权利要求1的组合物，其中所述聚乙烯亚胺为大约10.2％(w/w)到大约12.4％(w/w)。

6.权利要求1的组合物，其中所述聚乙烯亚胺为大约11.4％(w/w)到大约11.8％(w/w)。

7.权利要求3的组合物，其中所述聚乙烯醇为大约18.02％(w/w)到大约26.62％(w/w)。

8.权利要求3的组合物，其中所述聚乙烯醇为大约19.7％(w/w)到大约23.3％(w/w)。

9.权利要求3的组合物，其中所述聚乙烯醇为大约22.1％(w/w)到大约22.6％(w/w)。

10.固体聚合物凝胶组合物，该组合物包括大约9.25％(w/w)到大约13.65％(w/w)的聚乙烯亚胺和大约18.02％(w/w)到大约26.62％(w/w)的聚乙烯醇，该组合物的粘度高于所述聚乙烯亚胺或所述聚乙烯醇组分中任一的单独的粘度，并紧接在所述聚乙烯亚胺和所述聚乙烯醇混合后是可注射的。

11.用于形成固化聚合物凝胶组合物的试剂盒，包括：

至少一个第一容器，其装载有足够浓度的聚乙烯亚胺以便在室温或手术室条件下是可注射的，和

至少一个第二容器，其装载有足够浓度的至少一种氢键接聚合物，以便在室温或手术室条件下是可注射的，

其中，将所述聚乙烯亚胺和所述氢键接聚合物以足够的浓度和量供应在所述第一和第二容器中，从而在使所述聚乙烯亚胺和所述至少一种氢键接聚合物混合时，得到的组合物对于预定量的时间是可注射的，并且此后固化成可模制形式。

12.权利要求11的试剂盒，其中该试剂盒还包括多管式注射器，其中所述第一容器是该多管式注射器的一个管，而所述第二容器是该多管式注射器的另一个管。

13.权利要求11的试剂盒，其中所述氢键接聚合物选自聚乙烯醇、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟基乙酯、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸。

14.权利要求11的试剂盒，其中所述氢键接聚合物是聚乙烯醇。

15.权利要求11的试剂盒，其中所述聚乙烯亚胺为大约9.25％(w/w)到大约13.65％(w/w)。

16.权利要求11的试剂盒，其中所述聚乙烯亚胺为大约10.2％(w/w)到大约12.4％(w/w)。

17.权利要求11的试剂盒，其中所述聚乙烯亚胺为大约11.4％(w/w)到大约11.8％(w/w)。

18.权利要求14的试剂盒，其中所述聚乙烯醇为大约18.02％(w/w)到大约26.62％(w/w)。

19.权利要求14的试剂盒，其中所述聚乙烯醇为大约19.7％(w/w)到大约23.3％(w/w)。

20.权利要求14的试剂盒，其中所述聚乙烯醇为大约22.1％(w/w)到大约22.6％(w/w)。

21.权利要求11的试剂盒，其中所述预定量的时间多达大约四个小时。

22.权利要求11的试剂盒，其中所述预定量的时间少于三十分钟。