发明内容
本发明通过实验证实,基因BGIos135(其序列可以是SEQ ID NO:7)具有促进植物根系生长的功能。
因此,在一个方面,本发明提供了含有基因BGIos135的载体。在一个实施方案中,所述载体优选是表达载体,更优选是在植物中高效表达基因BGIos135的载体,例如包含基因BGIos135的重组载体p6,如本发明的重组载体p6+BGIos135。
在另一个方面,本发明提供了含有基因BGIos135或根据本发明的载体的宿主细胞。在一个实施方案中,所述宿主细胞优选是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens),例如根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos135。
在另一个方面,本发明提供了基因BGIos135和/或根据本发明的载体和/或宿主细胞用于促进植物根系生长或用于制备转基因植物或用于植物育种的用途。在一个实施方案中,所述转基因植物与未进行转基因的植物相比,展示更优良的植物根系生长。
在另一个方面,本发明提供了促进植物根系生长的方法,其包括将基因BGIos135和/或根据本发明的载体转化入植物,或用根据本发明的宿主细胞感染植物。
在一个实施方案中,通过本领域公知的方法,例如根癌农杆菌转化法来将基因BGIos135或根据本发明的载体转化入植物。
在一个实施方案中,基因BGIos135可操作地连接至在植物中有效的表达调控元件,例如启动子和/或终止子,优选玉米泛素启动子和/或NOS终止子。
在另一个方面,本发明提供了产生转基因植物的方法,所述方法包括以下步骤:
1)将基因BGIos135和/或根据本发明的载体转化入植物愈伤组织,或用根据本发明的宿主细胞感染植物愈伤组织;
2)从所述愈伤组织再生转基因植物。
在一个实施方案中,通过上述方法产生的转基因植物与未进行转基因的植物相比,展示更优良的植物根系生长,例如转基因植物的根系更深且更发达。
在一个实施方案中,通过本领域公知的方法,例如根癌农杆菌转化法来将基因BGIos135和/或根据本发明的载体转化入植物愈伤组织。
在一个实施方案中,基因BGIos135可操作地连接至在植物中有效的表达调控元件,例如启动子和/或终止子,优选玉米泛素启动子和/或NOS终止子。
在另一个方面,本发明提供了通过上述方法产生的转基因植物。
在另一个方面,本发明提供了被导入了基因BGIos135或本发明的载体或被本发明的宿主细胞感染的植物愈伤组织。
在另一个方面,本发明提供了上文所述的植物愈伤组织用于制备转基因植物或用于植物育种的用途。
在另一个方面,本发明提供了一种转基因植物,其被导入了基因BGIos135和/或根据本发明的载体和/或根据本发明的宿主细胞。
在一个实施方案中,所述转基因植物,与未导入基因BGIos135或根据本发明的载体或根据本发明的宿主细胞的对照植物相比,展示更优良的植物根系生长,例如转基因植物的根系更深且更发达。
在一个实施方案中,基因BGIos135可操作地连接至在植物中有效的表达调控元件,所述表达调控元件例如启动子和/或终止子,优选玉米泛素启动子和/或NOS终止子。
在本发明中,重组载体p6是指,包含玉米泛素启动子和NOS终止子的pCAMBIA-1301载体。
在本发明中,植物优选是单子叶植物,更优选为水稻、谷子(Setariaitalica)、小麦、高粱、玉米,特别优选为水稻,例如日本晴(Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare)。
发明的有益效果
本发明通过实验证实,基因BGIos135具有促进植物根系生长的功能。从而,与现有技术相比,本发明的技术方案将进一步提高根系对营养的吸收和对水肥的利用率,减少农药的施用,增加地上部分的分蘖和收获,进一步提高水稻的产量、品质和抗性。这对于降低农业投入、缓解环境污染、实现农业可持续发展和增强我国农业在国际上的竞争力具有重要的意义。
关于生物材料保藏的说明
本发明涉及以下生物材料:
1.普通野生稻元江种子,其于2010年9月6日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心,即中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:P201011;
2.根癌农杆菌EHA105,其于2009年12月24日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心,即中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M 209315;
3.水稻日本晴种子,其于2009年12月18日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心,即中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:P200910。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将理解,下列附图和实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
具体实施方式
实施例1:BGIos135基因的PCR扩增和pMD18-T+BGIos135重组载体的构建
1.PCR扩增
使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒,目录号:DP320-02)提取普通野生稻元江(Oryza.rifupongon Yuanjiang)(其由中国科学院昆明动物研究所董杨提供)的基因组DNA(gDNA)。根据BGIos135基因的碱基序列,设计一对PCR特异性扩增引物:上游引物F1(SEQ ID NO:1)包含限制性酶切位点KpnI,下游引物R1(SEQ ID NO:2)包含限制性酶切位点Xba I。以上述提取的元江gDNA为模板,利用上游引物F1、下游引物R1和高保真Ex TaqTM(TaKaRa,DRR100B)聚合酶进行PCR扩增。PCR扩增体系如表1所示。
表1:BGIos 135基因的PCR扩增体系
PCR反应条件为:94℃预变性5分钟;94℃变性45秒,55℃退火50秒,72℃延伸90秒,进行35个反应循环;72℃延伸7分钟。
上游引物F1(SEQ ID NO:1):CGGGGTACCGAGTGAAGAGGAGGAAGATG,其中下划线代表KpnI酶切位点。下游引物R1(SEQ ID NO:2):TGCTCTAGAGGTTGAACATGACCTTGA,其中下划线代表XbaI酶切位点。
PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离,得到大小为1140bp的条带。使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号:DP209-03)进行纯化回收。
2.pMD18-T+BGIos135重组载体的构建
将上述纯化回收的PCR扩增产物进行T/A克隆(pMD18-T质粒,TaKaRa,D103A),然后转化大肠杆菌,挑取阳性克隆并测序,以验证目的基因的序列。
其中,T/A克隆的连接体系如下:
pMD18-T 1μl
2*Solution I 5μl
纯化回收的产物 10-20ng
ddH2O 补充至总体积10μl
于16℃在节能型智能恒温槽(宁波新芝,SDC-6)中连接至少8小时,得到pMD18-T+BGIos135重组载体。按照本领域技术人员熟知的方法,将经过上述连接后的产物转化入大肠杆菌DH5α,从而获得含有pMD18-T+BGIos135克隆载体的重组大肠杆菌,将其命名为DH5α-BGIos135。由深圳华大基因科技有限公司对pMD18-T+BGIos135克隆载体中的BGIos135进行测序。测序结果与SEQ ID NO:7一致。
SEQ ID NO:7的序列如下所示:
ATGGGGAAGGGAGGGAAAGGAGCCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGCCGGAGCC
GGTGAGGAGGAGAACATGGCGGCGTGGCTGGTGGCGAAGAACACCCTCAAGATCA
TGCCCTTCAAGCTCCCGCCAGTTGGGCCTTATGATGTCCGTGTCCGGATGAAGGCAG
TGGGCATCTGCGGCAGCGACGTGCACTACCTCAGGGAGATGCGCATTGCGCATTTC
GTGGTGAAGGAGCCGATGGTGATCGGGCACGAGTGCGCCGGCGTGATAGAGGAGG
TCGGCAGCGGCGTGACGCACCTCGCCGTCGGCGACCGCGTGGCGCTCGAGCCCGGC
ATCAGCTGCTGGCGCTGCAGGCACTGCAAGGGCGGCCGCTACAACCTCTGCGAGGA
CATGAAGTTCTTCGCCACCCCTCCCGTCCACGGATCCCTCGCCAACCAGATCGTGCA
CCCTGGTGATCTGTGCTTCAAGCTGCCGGAGAACGTGAGCCTGGAGGAAGGCGCCA
TGTGCGAGCCGCTGAGCGTGGGCGTGCACGCGTGCCGCCGCGCCGACGTCGGGCCG
GAGACGGGGGTGCTGATCATGGGCGCGGGGCCGATCGGCCTGGTCACCCTGCTGGC
GGCGCGCGCGTTCGGCGCGACGCGCGTCGTGATCGTGGACGTGGACGAACACCGCC
TCTCCGTGGCCCGATCCCTCGGCGCCGACGCCGCCGTGAGGGTGTCGGCGCGCGCG
GAGGACGTCGGCGAGGAGGTGGAACGGATCAGGGCGGCGATGGGCGGGGACATCG
ACGTGAGCCTGGACTGCGCCGGGTTCAGCAAGACGGTGGCGACGGCGCTGGAGGC
GACGCGCGGCGGCGGGAAGGTGTGCCTCGTCGGGATGGGGCACAACGAGATGACG
GTGCCGCTGACGTCGGCGGCGATCAGGGAGGTGGACGTGGTGGGGATATTCCGGTA
CAAGGACACGTGGCCGCTCTGCATCGAGTTCCTCCGCAGCGGCAAGATCGACGTGA
AGCCGCTCATCACCCACCGATTCGGGTTCTCGCAGGAGGACGTGGAGGAGGCGTTC
GAGGTCAGCGCCCGTGGCCGCGACGCCATCAAGGTCATGTTCAACCTC。
实施例2:p6重组载体的构建
1.玉米泛素(ubi)启动子片段的PCR扩增和pMD18-T+Ubi重组载体的构建
Ubi启动子的PCR扩增
使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒,目录号:DP320-02)提取玉米品种B73(Zea mays mayscv.B73)的基因组DNA(gDNA)。根据实施例1中描述的方法,使用下列引物,以上述提取的玉米B73的gDNA为模板,用高保真Ex TaqTM(TaKaRa,DRR100B)聚合酶进行Ubi启动子的PCR扩增:
上游引物F2(SEQ ID NO:3):GGCTGCAGTGCAGCGTGACCCGGTCGT,含有限制性酶切位点PstI;
下游引物R2(SEQ ID NO:4):GGCTGCAGAAGTAACACCAAAC,含有限制性酶切位点PstI。
PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离后,使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号:DP209-03)纯化回收。
pMD18-T+Ubi重组载体的构建
根据实施例1中描述的方法,将上述纯化回收的PCR扩增产物连接入pMD18-T质粒(TaKaRa,D103A),然后转化入大肠杆菌DH5α,从而获得含有pMD18-T+Ubi克隆载体的重组大肠杆菌,将其命名为DH5α-Ubi。由深圳华大基因科技有限公司进行测序验证,从而确定目的片段的正确插入。
2.pCAMBIA-1301+Ubi重组载体的构建
根据厂商的说明书,使用TIANGEN普通质粒小提试剂盒(目录号:DP103-03)从DH5-Ubi重组大肠杆菌提取含有玉米Ubi启动子序列的重组载体pMD18-T+Ubi。用限制性内切酶PstI(购自NEB)对重组载体pMD18-T+Ubi进行酶切,然后用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号:DP209-03)回收玉米Ubi启动子片段。同样地,用限制性内切酶PstI酶切pCAMBIA-1301质粒(由中国科学院昆明动物研究所董杨提供;或者可从例如上海国瑞基因科技有限公司购得),并进行纯化回收。50μl酶切体系如下:
ddH2O 34.9μl
10*Buffer 3 5μl
Pst I 0.1μl(10U)
pMD18-T+Ubi或pCAMBIA-1301 10μl(<1000ng)
根据厂商的说明书,使用T4连接酶(TaKaRa,D2011A),连接回收的Ubi启动子片段与回收的pCAMBIA-1301质粒片段。10μl连接体系如下:
10*T4Buffer 1μl
回收的pCAMBIA-1301质粒 1μl(20ng)
回收的Ubi启动子片段 10-20ng
ddH2O 补齐至9.5μl
T4连接酶 0.5μl
将连接体系于16℃在节能型智能恒温槽(宁波新芝,SDC-6)中连接至少8小时。
将经过上述连接后的产物转化入大肠杆菌DH5α,从而获得含有重组载体pCAMBIA-1301+Ubi的重组大肠杆菌。根据厂商的说明书,使用TIANGEN普通质粒小提试剂盒(目录号:DP103-03)提取重组载体pCAMBIA-1301+Ubi。
用引物F2和R2对所得的重组载体pCAMBIA-1301+Ubi进行PCR检测,从而确证所得的重组载体pCAMBIA-1301+Ubi中含有所需的Ubi启动子。
3.NOS终止子的PCR扩增和pMD18-T+NOS重组载体的构建
根据上文描述的方法,使用下列引物,pCAMBIA-1301质粒为模板,用高保真Ex TaqTM(TaKaRa,DRR100B)聚合酶进行NOS终止子的PCR扩增:
上游引物F3(SEQ ID NO:5):GGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAA,含有限制性酶切位点Sac I;
下游引物R3(SEQ ID NO:6):GGGAATTCCCGATCTAGTAACATAGAT,含有限制性酶切位点EcoR I。
PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离后,使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号:DP209-03)纯化回收。
根据上文描述的方法,将上述纯化回收的PCR扩增产物连接入pMD18-T质粒(TaKaRa,D103A),然后转化入大肠杆菌DH5α,从而获得含有pMD18-T+NOS克隆载体的重组大肠杆菌,将其命名为DH5α-NOS。由深圳华大基因科技有限公司进行测序验证,从而确定目的片段的正确插入。
4.pCAMBIA-1301+Ubi+NOS即p6重组载体的构建
根据厂商的说明书,使用TIANGEN普通质粒小提试剂盒(目录号:DP103-03)从DH5α-NOS重组大肠杆菌提取pMD18-T+NOS克隆载体。使用上文描述的方法,用限制性内切酶Sac I和EcoR I(购自NEB)对pMD18-T+NOS克隆载体进行酶切,然后用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号:DP209-03)回收NOS终止子片段。同样地,用限制性内切酶Sac I和EcoR I酶切上文制备的pCAMBIA-1301+Ubi重组载体,并进行纯化回收。
使用上文描述的方法,用T4连接酶(TaKaRa,D2011A)连接回收的NOS终止子片段与回收的pCAMBIA-1301+Ubi重组载体片段,并将连接产物转化入DH5α,并最终获得重组载体pCAMBIA-1301+Ubi+NOS,即p6。
实施例3:p6+BGIos135重组载体的构建
使用上文描述的方法,提取pMD18-T+BGIos135重组载体,用限制性内切酶KpnI/XbaI进行酶切并回收BGIos135基因片段。类似地,提取p6重组载体,用相应的限制性内切酶KpnI/XbaI进行酶切并回收大片段。使用上文描述的方法,连接回收的BGIos135基因片段和p6重组载体片段,并将连接产物转化入DH5α,从而最终获得重组载体p6+BGIos135。进行测序验证,从而确定目的片段的正确插入。
实施例4:重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos135细胞的制备
按照本领域技术人员熟知的方法,制备根癌农杆菌EHA105的感受态细胞(参见《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社)。
将实施例3制备的p6+BGIos135重组载体转化入根癌农杆菌EHA105的感受态细胞,具体方法如下。
将根癌农杆菌感受态细胞EHA105于超低温冰箱中取出,置于冰上解冻。解冻后,加入5μl的p6+BGIos135重组载体,轻轻混匀,冰浴10分钟,放入液氮中冷冻5分钟,37℃温育5分钟,然后加入800μl常温的LB液体培养基(具体配方详见《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社),并于28℃,160rpm下复苏3小时。复苏后,以8000rpm离心30秒,吸去上清而留下200μl并吹匀、涂布于含有卡那霉素-利福平(kan-rif)的YM培养基平板上(50mg/l Kan,10mg/l Rif,具体配方参见表4)。28℃倒置培养2-3天,获得重组根癌农杆菌单菌落。
通过用引物F1(SEQ ID NO:1)和R1(SEQ ID NO:2)进行PCR检测和通过Kpn I/Xba I酶切筛选重组根癌农杆菌转化子。
PCR扩增出约1140bp的条带和酶切出约1124bp的条带的转化子为包含重组载体p6+BGIos135的重组根癌农杆菌,将其命名为重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos135。
实施例5:水稻愈伤组织的诱导和转化
按照如下步骤诱导水稻愈伤组织,并用重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos135转化所述愈伤组织。
1)将水稻日本晴种子去壳,用70%乙醇表面消毒30秒,然后用有效氯1.5%的次氯酸钠消毒30分钟,并伴随剧烈摇动;消毒后用灭菌水清洗5次;将清洗后的种子置于N6D培养基(具体配方参见表2)上,用封口膜封口;29.5℃光照培养3-4周;
2)选取活跃生长的愈伤组织(黄白色,干燥,直径1-3mm),在新N6D培养基上29.5℃光照培养3天;
3)挑取实施例4获得的重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos135单菌落,于添加抗生素(50mg/l Kan,10mg/l Rif)的YM培养基(具体配方参见表3、表4)上划线培养3天,培养温度为28℃;刮取上述重组根癌农杆菌,将其置于添加了30μl 100mM的乙酰丁香酮(Acetosyringone,AS)的30ml AAM培养基(具体配方参见表5)中,温和重悬所述重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos135细胞;
4)将继代培养的愈伤组织置于灭菌培养皿中;然后将步骤3)制备的重组根癌农杆菌悬液倒入所述培养皿中,将所述愈伤组织浸泡15分钟;
5)弃去培养皿中的重组根癌农杆菌悬液,用灭菌吸水纸将愈伤组织上多余的液体吸干;在N6-AS培养基(具体配方参见表6)上放置一张灭菌滤纸,并添加1ml含AS的AAM培养基,然后将愈伤组织转移至滤纸上;密封培养皿,28℃暗培养48-60小时;
6)将步骤5)获得的愈伤组织置于50ml灭菌管中,用灭菌水摇动清洗,直至上清液变澄清;将愈伤组织浸泡于含500mg/l羧苄青霉素(Carb)的无菌水中以杀死重组根癌农杆菌;用灭菌吸水纸除去愈伤组织上多余的水分,然后将其转移至含1mg/l潮霉素B(HmB)和50mg/l Carb的N6-AS培养基上;用封口膜密封培养皿,29.5℃光照培养3-4周。
实施例6:水稻愈伤组织中的GUS表达的检测
为检测实施例5制备的经转化的水稻愈伤组织中GUS的表达情况,按照Chen S Y等描述的方法(Journal of Integrative Plant Biology,2008,50(6):742-751),对用重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos135转化的水稻愈伤组织进行染色。
1ml GUS染色液中包含:610μl 0.2M Na2HPO4溶液(pH=7.0);390μl 0.2M NaH2PO4溶液和10μl 0.1M X-gluc。
将用重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos135转化的水稻愈伤组织浸泡在GUS染色液中,在37℃下温育直至出现蓝色。拍照记录染色结果,并示于图1中。结果显示,实施例5制备的经转化的水稻愈伤组织经染色后呈现蓝色(图1右侧),而未经转化的对照愈伤组织经GUS染色后颜色未发生变化(图1左侧)。这表明,本发明的p6+BGIos135重组载体已转化入水稻愈伤组织。
实施例7:转基因水稻幼苗中的GUS表达的检测
将实施例5制备的经转化的愈伤组织转移至含50mg/l潮霉素B(HmB)的MS-R分化培养基(具体配方见表7),以分化生长幼苗;用封口膜密封培养皿,29.5℃光照培养3-4周;待幼苗长至3-4cm时,将幼苗转移到含50mg/l潮霉素B(HmB)的1/2MS生根培养基(具体配方参见表8),以进行生根筛选。
转基因水稻幼苗的GUS染色方法与实施例6中愈伤组织的GUS染色方法相同。拍照记录染色结果,并示于图2中。结果显示,经含有p6+BGIos135重组载体的根癌农杆菌转化的水稻幼苗的根和叶(图2右侧)经GUS染色后呈现蓝色,未经转化的对照幼苗的根和叶(图2左侧)经GUS染色后颜色未发生变化。这表明,本发明的p6+BGIos135重组载体已转化入水稻幼苗中。
实施例8:转基因水稻苗的根系的性状观察
转基因水稻幼苗在1/2MS生根培养基中生长20天后,进行拍照记录,结果示于图3中。结果显示,经含有p6+BGIos135重组载体的根癌农杆菌转化的水稻苗的根系(图3,试管1-2)与未经转化的对照水稻苗的根系(图3,试管3-4)相比,根系更深且更发达。在本实施例中,一共栽培了19株转基因水稻苗,其中的16株显示加粗加密生长的根系(与对照水稻苗相比)。这些数据表明,本发明的BGIos135基因有效地促进植物的根系生长,并且用BGIos135基因转化的植物显示更优良的植物根系生长(与对照相比,其根系更深且更发达)。
本发明实施例中所使用的各种培养基的配方示于下文中。特别地,在本发明中,培养基的“常规灭菌”是指如下条件的灭菌:在121℃下蒸汽灭菌20分钟。
表2:N6D培养基
用1N氢氧化钾将pH值调节到5.8,封口后常规灭菌。
N6macro母液(20X):硝酸钾56.60g,磷酸二氢钾8.00g,硫酸铵9.26g,硫酸镁3.70g,氯化钙3.32g,用蒸馏水定容至1L,4℃保存备用。
N6micro母液(1000X):碘化钾0.80g,硼酸1.60g,硫酸锰3.33g,硫酸锌1.50g,用蒸馏水定容至1L,4℃保存备用。
铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X):将3.73g乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)和2.78g FeSO4·7H2O分别溶解,并混合。用蒸馏水定容至1000ml,70℃温浴2小时,冷却后4℃保存不超过1个月。
N6维生素贮存液(1000X):维生素B10.10g,维生素B60.05g,烟酸0.05g,甘氨酸0.20g,用蒸馏水定容至100ml,过滤除菌,4℃保存不超过1周。
表3:YM液体培养基(含有50mg/L Kan,10mg/L Rif)
表4:YM固体培养基(含有50mg/L Kan,10mg/L Rif)
表5:AAM培养基
用1N氢氧化钾将pH值调节至5.2,常规灭菌。
AAM macro(10X):2.5g七水硫酸镁(MgSO4·7H2O),1.5g二水氯化钙(CaCl2·2H2O),1.33g二水磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O),用蒸馏水定容至1L,4℃保存备用。
AAM micro(100X):0.7g单水硫酸锰(MnSO4·H2O),0.2g七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O),0.075g碘化钾(KI),0.3g硼酸(H3BO3),25mg二水钼酸钠(Na2MoO4·2H2O),2.5mg五水硫酸铜(CuSO4·5H2O),2.5mg六水氯化钴(CoCl2·6H2O),用蒸馏水定容至1L,4℃保存备用。
AAM有机(1000X):0.75g甘氨酸(Glycine),0.1g烟酸(Nicotinicacid),0.1g VB6(Pyridoxine),1g VB1(Thiamine),用蒸馏水定容至100ml,4℃保存备用。
铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X):见表2。
表6:N6-AS共培养基
调节pH至5.2。
N6macro母液(20X),N6micro母液(1000X),铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X),N6维生素贮存液(1000X):均见表2。
表7:MS-R分化培养基
调节PH值至5.8,常规灭菌。
MS macro(20X):硝酸铵33.0g,硝酸钾38.0g,磷酸二氢钾3.4g,硫酸镁7.4g,氯化钙8.8g,逐一溶解,然后室温下用蒸馏水定容至1L,4℃保存。
MS micro(1000X):硫酸锰16.90g,硫酸锌8.60g,硼酸6.20g,碘化钾0.83g,钼酸钠0.25g,硫酸铜0.025g,氯化钴0.025g,上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1L,4℃保存。
MS维生素贮存液(1000X):维生素B10.010g,维生素B60.050g,烟酸0.050g,甘氨酸0.200g,用蒸馏水定容至100ml,过滤除菌,4℃保存不超过1周。
铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X):见表2。
表8:1/2MS生根培养基
调节PH值至5.8。
MS macro(20X):见表7。
MS micro(1000X),MS维生素贮存液(1000X):见表7。
铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X):见表2。
参考文献
本文中用于举例说明本发明或提供关于本发明的实施的另外的详细内容的专利、出版物和其他材料通过引用合并入本文,并且为方便起见按下列文献目录提供。
1.Feltus FA,Wan J,Schulze SR,Estill JC,Jiang N,PatersonAH.An SNP resource for rice genetics and breeding based onsubspecies indica and japonica genome alignments.GenomeResearch.2004,14:1812-1819;
2.Iafrate AJ,Feuk L,Rivera MN,Listewnik ML,Donahoe PK,Qi Y,Scherer SW,Lee C.Detection of large-scale variation inthe human genome.Nat Genetics.2004,36:949-951;
3.Jin J,Huang W,Gao J,Yang J,Shi M,Zhu M,Luo D,LinH.Genetic control of rice plant architecture under domestication.Nature Genetics.2008,40(11):1365-1369;
4.Kovach MJ,Megan T,MT,McCouch SR.New insights into thehistory of rice domestication.Trends in Genetics.2007,23(11):578-587;
5.Lu J,Tang T,Tang H,Huang J,Shi S,Wu CI.The accumulationof deleterious mutations in rice genomes:a hypothesis on the costof domestication.Trends in Genetics.2006,22:126-131;
6.Redon R,Ishikawa S,Fitch KR,Feuk L,Perry GH,AndrewsTD,Fiegler H,Shapero MH,Carson AR,Chen W,et al.Globalvariation in copy number in the human genome.Nature.2006,444:444-454;
7.Shen YJ,Jiang H,Jin JP,Zhang ZB,Xi B,He YY,Wang G,Wang C,Qian L,Li X,et al.Development of genome-wide DNApolymorphism database for map-based cloning of rice genes.PlantPhysiology.2004,135:1198-1205;
8.Tang T,Lu J,Huang J,He J,McCouch SR,Shen Y,Kai Z,Purugganan MD,Shi S,Wu CI.Genomic variation in rice:genesisof highly polymorphic linkage blocks during domestication.PLoSGenet.2006,2:e199;
9.Wang E,Wang J,Zhu X,Hao W,Wang L,Li Q,Zhang L,HeW,Lu B,Lin H,Ma H,Zhang G,He Z.Control of rice grain-fillingand yield by a gene with a potential signature of domestication.Nature Genetics.2008,40(11):1370-1374;
10.Wang W,Zheng H,Fan C,Li J,Shi J,Cai Z,Zhang G,LiuD,Zhang J,Vang S,et al.High rate of chimeric gene originationby retroposition in plant genomes.Plant Cell.2006,18:1791-1802;
11.Yadav R,Courtois B,Huang N,et al.Mapping genescontrolling root morphology and root distribution in adoubled-haploid population of rice.Theor Appl Genet.1997,94:619-632;
12.Gao L Z,Xu H Y.Patterns of mutation rate variation atmicrosatellites:evolutionary insights from comparisons of Asiancultivated rice(Oryza sativa L.)and related species.BMCEvolutionary Biology.2008,8:11;
13.凌启鸿,等.水稻不同层次根系的功能及对产量形成作用的研究.中国农业科学.1984,(4):3-11;
14.石庆华,黄英金,李木英,等.水稻根系性状与地上部的相关及根系性状的遗传研究.中国农业科学.1997,30(4):61-67;
15.孙传清,等.水稻根系性状和叶片水势的遗传及其相关性研究.中国农业科学.1995,28(1):42-48;
16.吴伟明,程式华.水稻根系育种的意义与前景.中国水稻科学.2005,19(2):174-180;
17.徐吉臣,邹亮星.利用相关性分析鉴定与水稻根系性状表达相关的分子标记.遗传学报.2002,29(3):245-249。