CN101979599B - 利用BGIos244基因促进植物根的生长 - Google Patents

Abstract

本发明提供了促进植物根的生长的方法。特别地，本发明提供了利用BGIos244基因促进植物根的生长的方法。本发明还提供了BGIos244基因用于促进植物根的生长的用途。本发明还提供了具有导入的BGIos244基因的转基因植物，以及产生此类转基因植物的方法。

Description

利用BGIos244基因促进植物根的生长

发明领域

本发明涉及用于促进植物根的生长的方法。特别地，本发明利用BGIos244基因促进植物根的生长。

发明背景

水稻是我国重要的经济作物，其栽种面积为4.5亿亩左右。世界上约有60％的人口以稻米作为日常主食。通过水稻的分子育种来提高产量，给全球的粮食生产带来了巨大收益。矮秆基因的利用和多分蘖水稻的育成，使我国的水稻产量取得了巨大飞跃。但在相当长的一段时间里，我国的水稻单产出现了徘徊不前的局面。由此，许多育种工作者从育种理论和方法上提出了新的思路和设想，希望使水稻单产取得新的突破。在水稻的高产育种理论上，国际水稻研究所于20世纪90年代初就提出了基于新株型的超级稻理论，然而，到目前为止，在水稻的育种科研与实践中对水稻地下部分的形态和生理性状的改良却未能在水稻的分子育种中得以具体体现。

目前我国水稻的水肥利用率低，这不仅造成大量人力、物力和财力的浪费，而且大量的化学肥料和农药通过地表径流以及土壤渗透排入江河湖泊和地下水中，对地表和地下水造成严重污染。这已经成为环境污染的一个重要方面。另一方面，全世界近一半的水稻种植面积处在缺水的状态下，严重影响了水稻产量的提高。我国很多地区由于相对缺乏灌溉用水，致使水稻生产难以发展，这在一定程度上影响了耕地资源的充分利用。因此，提高水稻本身的水肥利用率，发展节水型水稻，是新时期可持续农业发展的又一基本要求。而对于提高水稻品种本身的肥料利用率来说，根系的相关形态和生理性状的改良至关重要。随着环保和农业的进一步发展，在经济发达的地区，解决水稻易发生根倒伏，提高水肥利用率已成为提高水稻产量和发展的一个关键问题。从根系角度研究水稻抗根倒伏的生物学、力学机制及其遗传基础，对于从栽培和育种角度减轻水稻根倒伏的危害，具有巨大的现实和长远意义。

水稻根系既是吸收养分和水分的重要器官，也是一些物质合成和运输的器官，它的形态发育对水稻产量和品质的影响很早就引起人们的注意。育种学家主要关注于环境对根系生长发育的影响(孙传清等，中国农业科学.1995，28(1)：42-48)以及根系与产量等因素之间的相互关系(凌启鸿等，中国农业科学.1984，(4)：3-11)，然而，关于根系的分子育种研究却很少报道。与根系性状表达相关的分子标记的开发表明，控制水稻根系发育的是数量性状(Yadav等人，Theor ApplGenet.1997，94：619-632；徐吉臣等，遗传学报.2002，29(3)：245-249)，但这并未引起足够的重视。石庆华等(中国农业科学.1997，30(4)：61-67)研究了根系发育与地上部分的相关关系，并指出，在栽培上培育有利于塑造理想株型的根型是水稻高产栽培的新要求，深根系更有利于高产。但是，育种工作者至今未能就什么是理想的水稻根型提出具体明确的指标。

目前，如何从思路和技术上提出一种崭新的方法来定位水稻根系发育的基因已成为水稻育种的关键。相关研究表明，检测自然选择信号可能是一条崭新的、高通量的鉴定有用基因的道路。由于人工选择的时间短，遗传重组事件少，受选择的基因与其邻近区域会紧密连锁，因此，如果观察到一个基因组区域的多态性分布很特别，具有统计学显著性，那么该区域含有的基因和突变位点即有可能与选择的性状相关。研究表明，水稻全基因组大约6％的区域为SNP高变区，这些区域可能富集了与亚种分化和重要复杂农艺性状相关的基因(Tang等人，PLoS Genet.2006，2：e199)。Gao LZ等(BMC Evolutionary Biology.2008，8：11)通过对栽培稻和普通野生稻进行对比分析，建立了理论群体遗传学数学模型，检测了60个微卫星位点所受的人工选择，发现了一些留有显著选择痕迹的位点以及其近邻的可能的功能基因。但这些研究离从全基因组水平全面分析人工选择的基因依然遥远，这主要是因为数据量远远不够，模型和方法也有待提高。迄今为止识别出的水稻性状基因如qSH1、Rc、sh4、hd1(Kovach等人，Trends in Genetics.2007，23(11)：578-587)，以及PROG1(Jin等人，Nature Genetics.2008，40(11)：1365-1369)和GIF1(Wang等人，Nature Genetics.2008，40(11)：1370-1374)仍然是通过传统的图位克隆手段获得的。

新一代测序技术(如Solexa、Solid测序仪)的出现，为廉价高效地获得水稻根系发育基因和基因家族提供了前所未有的机会。利用野生稻与栽培稻的基因组重测序数据和技术，能够比较各栽培种及野生种的基因组结构的异同，这使运用进化基因组学的理论和方法来获得根系发育相关的基因或基因组功能元件成为可能。

长期以来，对水稻根系发育形态、生理性状的遗传改良一直未能在水稻的分子育种中得以体现。虽然杂交水稻的根系比常规品种在形态和生理上占有优势，使育种家看到了根系改良的重要性和实际效果，但是迄今为止未能提出一套具体的改良指标。因此，需要进一步研究和开发水稻根系发育相关基因，以进一步提高根系对营养的吸收和对水肥的利用率，减少农药的施用，增加地上部分的分蘖和收获等。

随着水稻分子育种理论与技术的不断成熟和完善，以及遗传转化体系的建立和优化，利用新型测序技术结合基因组学方法来鉴定受人工选择的基因资源，使得利用基因组重测序技术发掘根系发育相关基因和遗传转化成为可能。水稻地下部分发育的改良将进一步提高水稻的产量、品质和抗性等。水稻根系发育相关基因的开发和遗传转化对于提高水稻地上部分的产量、降低农业投入、缓解环境污染、实现农业可持续发展具有重要的意义，其有利于增强我国农业在国际上的竞等力。

发明内容

本发明通过实验证实，基因BGIos244(其序列可以是SEQ ID NO：7)具有促进植物根系生长的功能。

因此，在一个方面，本发明提供了含有基因BGIos244的载体。在一个实施方案中，所述载体优选是表达载体，更优选是在植物中高效表达基因BGIos244的载体，例如包含基因BGIos244的重组载体p6，如本发明的重组载体p6+BGIos244。

在另一个方面，本发明提供了含有基因BGIos244或根据本发明的载体的宿主细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞优选是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，例如根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos244。

在另一个方面，本发明提供了基因BGIos244和/或根据本发明的载体和/或宿主细胞用于促进植物根系生长或用于制备转基因植物或用于植物育种的用途。在一个实施方案中，所述转基因植物与未进行转基因的植物相比，展示更优良的植物根系生长。

在另一个方面，本发明提供了促进植物根系生长的方法，其包括将基因BGIos244和/或根据本发明的载体转化入植物，或用根据本发明的宿主细胞感染植物。

在一个实施方案中，通过本领域公知的方法，例如根癌农杆菌转化法来将基因BGIos244或根据本发明的载体转化入植物。

在一个实施方案中，基因BGIos244可操作地连接至在植物中有效的表达调控元件，例如启动子和/或终止子，优选玉米泛素启动子和/或NOS终止子。

在另一个方面，本发明提供了产生转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：

1)将基因BGIos244和/或根据本发明的载体转化入植物愈伤组织，或用根据本发明的宿主细胞感染植物愈伤组织；

2)从所述愈伤组织再生转基因植物。

在一个实施方案中，通过上述方法产生的转基因植物与未进行转基因的植物相比，展示更优良的植物根系生长。特别地，本发明的转基因植物的根系与对照植物的根系相比，在浅层分布生长，并且根系短且密。

在一个实施方案中，通过本领域公知的方法，例如根癌农杆菌转化法来将基因BGIos244和/或根据本发明的载体转化入植物愈伤组织。

在一个实施方案中，基因BGIos244可操作地连接至在植物中有效的表达调控元件，例如启动子和/或终止子，优选玉米泛素启动子和/或NOS终止子。

在另一个方面，本发明提供了通过上述方法产生的转基因植物。

在另一个方面，本发明提供了被导入了基因BGIos244或本发明的载体或被本发明的宿主细胞感染的植物愈伤组织。

在另一个方面，本发明提供了上文所述的植物愈伤组织用于制备转基因植物或用于植物育种的用途。

在另一个方面，本发明提供了一种转基因植物，其被导入了基因BGIos244和/或根据本发明的载体和/或根据本发明的宿主细胞。

在一个实施方案中，所述转基因植物，与未导入基因BGIos244或根据本发明的载体或根据本发明的宿主细胞的对照植物相比，展示更优良的植物根系生长，例如转基因植物的根系在浅层分布生长，并且根系短且密。

在一个实施方案中，基因BGIos244可操作地连接至在植物中有效的表达调控元件，所述表达调控元件例如启动子和/或终止子，优选玉米泛素启动子和/或NOS终止子。

在本发明中，重组载体p6是指，包含玉米泛素启动子和NOS终止子的pCAMBIA-1301载体。

在本发明中，植物优选是单子叶植物，更优选为水稻、谷子(Setaria italica)、小麦、高粱、玉米，特别优选为水稻，例如日本晴(Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare)。

发明的有益效果

本发明通过实验证实，基因BGIos244具有促进植物根系生长的功能。从而，与现有技术相比，本发明的技术方案将进一步提高根系对营养的吸收和对水肥的利用率，减少农药的施用，增加地上部分的分蘖和收获，进一步提高水稻的产量、品质和抗性。这对于降低农业投入、缓解环境污染、实现农业可持续发展和增强我国农业在国际上的竞争力具有重要的意义。

关于生物材料保藏的说明

本发明涉及以下生物材料：

1.普通野生稻元江种子，其于2010年9月6日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：P201011；

2.根癌农杆菌EHA105，其于2009年12月24日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 209315；

3.水稻日本晴种子，其于2009年12月18日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：P200910。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图概述

图1是显示愈伤组织GUS染色的检测结果的照片。左边的愈伤组织为未转化BGIos244基因的对照愈伤组织，右边的愈伤组织为转化了BGIos244基因的转基因愈伤组织。

图2是显示水稻幼苗GUS染色的检测结果的照片。其中，上图显示根的GUS染色的检测结果，下图显示叶的GUS染色的检测结果。在图2中，左边的根和叶均来自未转化BGIos244基因的对照水稻幼苗，右边的根和叶均来自转化了BGIos244基因的转基因水稻幼苗。

图3是显示水稻苗的根系性状观察结果的照片。其中，图的左侧为转化了BGIos244基因的转基因水稻苗，图的右侧为未转化BGIos244基因的对照水稻苗。

具体实施方式

实施例1：BGIos244基因的PCR扩增和pMD18-T+BGIos244重组载体的构建

1.PCR扩增

使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒，目录号：DP320-02)提取普通野生稻元江(Oryza.rifupongon Yuanjiang)(其由中国科学院昆明动物研究所董杨提供)的基因组DNA(gDNA)。根据BGIos244基因的碱基序列，设计一对PCR特异性扩增引物：上游引物F1(SEQ ID NO：1)包含限制性酶切位点BamHI，下游引物R1(SEQ ID NO：2)包含限制性酶切位点Xba I。以上述提取的元江gDNA为模板，利用上游引物F1、下游引物R1和高保真Ex Taq^TM(TaKaRa，DRR100B)聚合酶进行PCR扩增。PCR扩增体系如表1所示。

表1：BGIos244基因的PCR扩增体系

PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性45秒，55℃退火50秒，72℃延伸90秒，进行35个反应循环；72℃延伸7分钟。

上游引物F1(SEQ ID NO：1)：CGCGGATCCATGATCAGCACCAAGAGAATT，其中下划线代表BamHI酶切位点。下游引物R1(SEQ ID NO：2)：TGCTCTAGAGGAGCTGCAAATAGCAACTT，其中下划线代表XbaI酶切位点。

PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，得到大小为450bp的条带。使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209-03)进行纯化回收。

2.pMD18-T+BGIos244重组载体的构建

将上述纯化回收的PCR扩增产物进行T/A克隆(pMD18-T质粒，TaKaRa，D103A)，然后转化大肠杆菌，挑取阳性克隆并测序，以验证目的基因的序列。

其中，T/A克隆的连接体系如下：

pMD18-T               1μl

2*Solution I          5μl

纯化回收的产物        10-20ng

ddH₂O                 补充至总体积10μl

于16℃在节能型智能恒温槽(宁波新芝，SDC-6)中连接至少8小时，得到pMD18-T+BGIos244重组载体。按照本领域技术人员熟知的方法，将经过上述连接后的产物转化入大肠杆菌DH5α，从而获得含有pMD18-T+BGIos244克隆载体的重组大肠杆菌，将其命名为DH5α-BGIos244。由深圳华大基因科技有限公司对pMD18-T+BGIos244克隆载体中的BGIos244进行测序。测序结果与SEQ ID NO：7一致。

SEQ ID NO：7的序列如下所示：

ATGATCAGCACCAAGAGAATTGCTCAACTAGCAAAGAAGTGGAGAAGGATGGCAGCCAAGGGAAGGAAGCGGCTTACAATGATGGCACCACAAGAAGCTGAAGGATGCTCAACAATGGTGGCAGGCAAGGGCTACTGCATCGTATACACCGCAGATGGCATGCGGTTTGAGGTGCCACTGCGGTACCTCGGCACGATGGTCTTCGGTGAGCTCCTGAGGATGTCACAGGAGGAGTTTGGCTTCACGAGTGATGGAAAGATCACATTACCATGTGATGCCATGGTGATGGAGTACGTGATGTGCTTACTTAGAAGAAATGCTTCAGTAGATGTTGAGAAGGCATTCTTGAGCTCCATGGCGATTTCGTGCCACTATGCAAACAGTACGACACCGTCTCTGGGAGTAAACATGCAAGTTGCTATTTGCAGCTCC。

实施例2：p6重组载体的构建

1.玉米泛素(ubi)启动子片段的PCR扩增和pMD18-T+Ubi重组载体的构建

Ubi启动子的PCR扩增

使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒，目录号：DP320-02)提取玉米品种B73(Zea mays mayscv.B73)的基因组DNA(gDNA)。根据实施例1中描述的方法，使用下列引物，以上述提取的玉米B73的gDNA为模板，用高保真Ex Taq^TM(TaKaRa，DRR100B)聚合酶进行Ubi启动子的PCR扩增：

上游引物F2(SEQ ID NO：3)：GGCTGCAGTGCAGCGTGACCCGGTCGT，含有限制性酶切位点PstI；

下游引物R2(SEQ ID NO：4)：GGCTGCAGAAGTAACACCAAAC，含有限制性酶切位点PstI。

PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后，使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209-03)纯化回收。

pMD18-T+Ubi重组载体的构建

根据实施例1中描述的方法，将上述纯化回收的PCR扩增产物连接入pMD18-T质粒(TaKaRa，D103A)，然后转化入大肠杆菌DH5α，从而获得含有pMD18-T+Ubi克隆载体的重组大肠杆菌，将其命名为DH5α-Ubi。由深圳华大基因科技有限公司进行测序验证，从而确定目的片段的正确插入。

2.pCAMBIA-1301+Ubi重组载体的构建

根据厂商的说明书，使用TIANGEN普通质粒小提试剂盒(目录号：DP103-03)从DH5α-Ubi重组大肠杆菌提取含有玉米Ubi启动子序列的重组载体pMD18-T+Ubi。用限制性内切酶PstI(购自NEB)对重组载体pMD18-T+Ubi进行酶切，然后用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209-03)回收玉米Ubi启动子片段。同样地，用限制性内切酶PstI酶切pCAMBIA-1301质粒(由中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如上海国瑞基因科技有限公司购得)，并进行纯化回收。50μl酶切体系如下：

ddH₂O                        34.9μl

10*Buffer 3                  5μl

Pst I                        0.1μl(10U)

pMD18-T+Ubi或pCAMBIA-1301    10μl(＜1000ng)

根据厂商的说明书，使用T4连接酶(TaKaRa，D2011A)，连接回收的Ubi启动子片段与回收的pCAMBIA-1301质粒片段。10μl连接体系如下：

10*T4 Buffer              1μl

回收的pCAMBIA-1301质粒    1μl(20ng)

回收的Ubi启动子片段       10-20ng

ddH₂O                     补齐至9.5μl

T4连接酶                  0.5μl

将连接体系于16℃在节能型智能恒温槽(宁波新芝，SDC-6)中连接至少8小时。

将经过上述连接后的产物转化入大肠杆菌DH5α，从而获得含有重组载体pCAMBIA-1301+Ubi的重组大肠杆菌。根据厂商的说明书，使用TIANGEN普通质粒小提试剂盒(目录号：DP103-03)提取重组载体pCAMBIA-1301+Ubi。

用引物F2和R2对所得的重组载体pCAMBIA-1301+Ubi进行PCR检测，从而确证所得的重组载体pCAMBIA-1301+Ubi中含有所需的Ubi启动子。

3.NOS终止子的PCR扩增和pMD18-T+NOS重组载体的构建

根据上文描述的方法，使用下列引物，pCAMBIA-1301质粒为模板，用高保真Ex Taq^TM(TaKaRa，DRR100B)聚合酶进行NOS终止子的PCR扩增：

上游引物F3(SEQ ID NO：5)：GGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAA，含有限制性酶切位点Sac I；

下游引物R3(SEQ ID NO：6)：GGGAATTCCCGATCTAGTAACATAGAT，含有限制性酶切位点EcoR I。

PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后，使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209-03)纯化回收。

根据上文描述的方法，将上述纯化回收的PCR扩增产物连接入pMD18-T质粒(TaKaRa，D103A)，然后转化入大肠杆菌DH5α，从而获得含有pMD18-T+NOS克隆载体的重组大肠杆菌，将其命名为DH5α-NOS。由深圳华大基因科技有限公司进行测序验证，从而确定目的片段的正确插入。

4.pCAMBIA-1301+Ubi+NOS即p6重组载体的构建

根据厂商的说明书，使用TIANGEN普通质粒小提试剂盒(目录号：DP103-03)从DH5α-NOS重组大肠杆菌提取pMD18-T+NOS克隆载体。使用上文描述的方法，用限制性内切酶Sac I和EcoR I(购自NEB)对pMD18-T+NOS克隆载体进行酶切，然后用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209-03)回收NOS终止子片段。同样地，用限制性内切酶Sac I和EcoR I酶切上文制备的pCAMBIA-1301+Ubi重组载体，并进行纯化回收。

使用上文描述的方法，用T4连接酶(TaKaRa，D2011A)连接回收的NOS终止子片段与回收的pCAMBIA-1301+Ubi重组载体片段，并将连接产物转化入DH5α，并最终获得重组载体pCAMBIA-1301+Ubi+NOS，即p6。

实施例3：p6+BGIos244重组载体的构建

使用上文描述的方法，提取pMD18-T+BGIos244重组载体，用限制性内切酶BamHI/XbaI进行酶切并回收BGIos244基因片段。类似地，提取p6重组载体，用相应的限制性内切酶BamHI/XbaI进行酶切并回收大片段。使用上文描述的方法，连接回收的BGIos244基因片段和p6重组载体片段，并将连接产物转化入DH5α，从而最终获得重组载体p6+BGIos244。进行测序验证，从而确定目的片段的正确插入。

实施例4：重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos244细胞的制备

按照本领域技术人员熟知的方法，制备根癌农杆菌EHA105的感受态细胞(参见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)。

将实施例3制备的p6+BGIos244重组载体转化入根癌农杆菌EHA105的感受态细胞，具体方法如下。

将根癌农杆菌感受态细胞EHA105于超低温冰箱中取出，置于冰上解冻。解冻后，加入5μl的p6+BGIos244重组载体，轻轻混匀，冰浴10分钟，放入液氮中冷冻5分钟，37℃温育5分钟，然后加入800μl常温的LB液体培养基(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，并于28℃，160rpm下复苏3小时。复苏后，以8000rpm离心30秒，吸去上清而留下200μl并吹匀、涂布于含有卡那霉素-利福平(kan-rif)的YM培养基平板上(50mg/l Kan，10mg/l Rif，具体配方参见表4)。28℃倒置培养2-3天，获得重组根癌农杆菌单菌落。

通过用引物F1(SEQ ID NO：1)和R1(SEQ ID NO：2)进行PCR检测和通过BamHI/Xba I酶切筛选重组根癌农杆菌转化子。

PCR扩增出约450bp的条带和酶切出约436bp的条带的转化子为包含重组载体p6+BGIos244的重组根癌农杆菌，将其命名为重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos244。

实施例5：水稻愈伤组织的诱导和转化

按照如下步骤诱导水稻愈伤组织，并用重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos244转化所述愈伤组织。

1)将水稻日本晴种子去壳，用70％乙醇表面消毒30秒，然后用有效氯1.5％的次氯酸钠消毒30分钟，并伴随剧烈摇动；消毒后用灭菌水清洗5次；将清洗后的种子置于N6D培养基(具体配方参见表2)上，用封口膜封口；29.5℃光照培养3-4周；

2)选取活跃生长的愈伤组织(黄白色，干燥，直径1-3mm)，在新N6D培养基上29.5℃光照培养3天；

3)挑取实施例4获得的重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos244单菌落，于添加抗生素(50mg/l Kan，10mg/l Rif)的YM培养基(具体配方参见表3、表4)上划线培养3天，培养温度为28℃；刮取上述重组根癌农杆菌，将其置于添加了30μl 100mM的乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)的30ml AAM培养基(具体配方参见表5)中，温和重悬所述重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos244细胞；

4)将继代培养的愈伤组织置于灭菌培养皿中；然后将步骤3)制备的重组根癌农杆菌悬液倒入所述培养皿中，将所述愈伤组织浸泡15分钟；

5)弃去培养皿中的重组根癌农杆菌悬液，用灭菌吸水纸将愈伤组织上多余的液体吸干；在N6-AS培养基(具体配方参见表6)上放置一张灭菌滤纸，并添加1ml含AS的AAM培养基，然后将愈伤组织转移至滤纸上；密封培养皿，28℃暗培养48-60小时；

6)将步骤5)获得的愈伤组织置于50ml灭菌管中，用灭菌水摇动清洗，直至上清液变澄清；将愈伤组织浸泡于含500mg/l羧苄青霉素(Carb)的无菌水中以杀死重组根癌农杆菌；用灭菌吸水纸除去愈伤组织上多余的水分，然后将其转移至含1mg/l潮霉素B(HmB)和50mg/l Carb的N6-AS培养基上；用封口膜密封培养皿，29.5℃光照培养3-4周。

实施例6：水稻愈伤组织中的GUS表达的检测

为检测实施例5制备的经转化的水稻愈伤组织中GUS的表达情况，按照Chen SY等描述的方法(Journal of Integrative Plant Biology，2008，50(6)：742-751)，对用重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos244转化的水稻愈伤组织进行染色。

1ml GUS染色液中包含：610μl 0.2M Na₂HPO₄溶液(pH＝7.0)；390μl 0.2M NaH₂PO₄溶液和10μl 0.1M X-gluc。

将用重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos244转化的水稻愈伤组织浸泡在GUS染色液中，在37℃下温育直至出现蓝色。拍照记录染色结果，并示于图1中。结果显示，实施例5制备的经转化的水稻愈伤组织经染色后呈现蓝色(图1右侧)，而未经转化的对照愈伤组织经GUS染色后颜色未发生变化(图1左侧)。这表明，本发明的p6+BGIos244重组载体已转化入水稻愈伤组织。

实施例7：转基因水稻幼苗中的GUS表达的检测

将实施例5制备的经转化的愈伤组织转移至含50mg/l潮霉素B(HmB)的MS-R分化培养基(具体配方见表7)，以分化生长幼苗；用封口膜密封培养皿，29.5℃光照培养3-4周；待幼苗长至3-4cm时，将幼苗转移到含50mg/l潮霉素B(HmB)的1/2MS生根培养基(具体配方参见表8)，以进行生根筛选。

转基因水稻幼苗的GUS染色方法与实施例6中愈伤组织的GUS染色方法相同。拍照记录染色结果，并示于图2中。结果显示，经含有p6+BGIos244重组载体的根癌农杆菌转化的水稻幼苗的根和叶(图2右侧)经GUS染色后呈现蓝色，未经转化的对照幼苗的根和叶(图2左侧)经GUS染色后颜色未发生变化。这表明，本发明的p6+BGIos244重组载体已转化入水稻幼苗中。

实施例8：转基因水稻苗的根系的性状观察

转基因水稻幼苗在1/2MS生根培养基中生长20天后，进行拍照记录，结果示于图3中。结果显示，经含有p6+BGIos244重组载体的根癌农杆菌转化的水稻苗的根系(图3，左侧)与未经转化的对照水稻苗的根系(图3，右侧)相比，展示更优良的根系生长。在本实施例中，一共栽培了41株转基因水稻苗，其中的35株显示，根系在浅层分布生长，并且根系短且密(与对照水稻苗相比)。这些数据表明，本发明的BGIos244基因有效地促进植物的根系生长，并且用BGIos244基因转化的植物显示更优良的植物根系生长(与对照相比，根系在浅层分布生长，并且根系短且密)。

本发明实施例中所使用的各种培养基的配方示于下文中。特别地，在本发明中，培养基的“常规灭菌”是指如下条件的灭菌：在121℃下蒸汽灭菌20分钟。

表2：N6D培养基

用1N氢氧化钾将pH值调节到5.8，封口后常规灭菌。

N₆ macro母液(20X)：硝酸钾56.60g，磷酸二氢钾8.00g，硫酸铵9.26g，硫酸镁3.70g，氯化钙3.32g，用蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

N₆ micro母液(1000X)：碘化钾0.80g，硼酸1.60g，硫酸锰3.33g，硫酸锌1.50g，用蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)：将3.73g乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78g FeSO₄·7H₂O分别溶解，并混合。用蒸馏水定容至1000ml，70℃温浴2小时，冷却后4℃保存不超过1个月。

N₆维生素贮存液(1000X)：维生素B1 0.10g，维生素B6 0.05g，烟酸0.05g，甘氨酸0.20g，用蒸馏水定容至100ml，过滤除菌，4℃保存不超过1周。

表3：YM液体培养基(含有50mg/L Kan，10mg/L Rif)

表4：YM固体培养基(含有50mg/L Kan，10mg/L Rif)

表5：AAM培养基

用1N氢氧化钾将pH值调节至5.2，常规灭菌。

AAM macro(10X)：2.5g七水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)，1.5g二水氯化钙(CaCl₂·2H₂O)，1.33g二水磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)，用蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

AAM micro(100X)：0.7g单水硫酸锰(MnSO₄·H₂O)，0.2g七水硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)，0.075g碘化钾(KI)，0.3g硼酸(H₃BO₃)，25mg二水钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)，2.5mg五水硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)，2.5mg六水氯化钴(CoCl₂·6H₂O)，用蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

AAM有机(1000X)：0.75g甘氨酸(Glycine)，0.1g烟酸(Nicotinic acid)，0.1g VB₆(Pyridoxine)，1g VB₁(Thiamine)，用蒸馏水定容至100ml，4℃保存备用。

铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)：见表2。

表6：N6-AS共培养基

调节pH至5.2。

N₆ macro母液(20X)，N₆ micro母液(1000X)，铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)，N₆维生素贮存液(1000X)：均见表2。

表7：MS-R分化培养基

调节PH值至5.8，常规灭菌。

MS macro(20X)：硝酸铵33.0g，硝酸钾38.0g，磷酸二氢钾3.4g，硫酸镁7.4g，氯化钙8.8g，逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1L，4℃保存。

MS micro(1000X)：硫酸锰16.90g，硫酸锌8.60g，硼酸6.20g，碘化钾0.83g，钼酸钠0.25g，硫酸铜0.025g，氯化钴0.025g，上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1L，4℃保存。

MS维生素贮存液(1000X)：维生素B₁ 0.010g，维生素B₆ 0.050g，烟酸0.050g，甘氨酸0.200g，用蒸馏水定容至100ml，过滤除菌，4℃保存不超过1周。

铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)：见表2。

表8：1/2MS生根培养基

调节PH值至5.8。

MS macro(20X)：见表7。

MS micro(1000X)，MS维生素贮存液(1000X)：见表7。

铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)：见表2。

参考文献

本文中用于举例说明本发明或提供关于本发明的实施的另外的详细内容的专利、出版物和其他材料通过引用合并入本文，并且为方便起见按下列文献目录提供。

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Claims (22)

1.基因BGIos244或含有基因BGIos244的载体或含有基因BGIos244的宿主细胞用于促进植物根系短且密地生长的用途，其中所述基因BGIos244的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，并且所述植物是水稻。

2.基因BGIos244或含有基因BGIos244的载体或含有基因BGIos244的宿主细胞用于制备转基因植物的用途，其中所述基因BGIos244的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述转基因植物是水稻，并且所述转基因植物与未进行转基因的植物相比，根系短且密。

3.基因BGIos244或含有基因BGIos244的载体或含有基因BGIos244的宿主细胞用于植物育种的用途，其中所述基因BGIos244的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述植物是水稻，并且所述基因BGIos244促进所获得的植物的根系短且密地生长。

4.权利要求1-3任一项的用途，其中所述载体是表达载体。

5.权利要求1-3任一项的用途，其中所述宿主细胞是根癌农杆菌。

6.一种促进植物根系短且密地生长的方法，所述方法包括将基因BGIos244或含有基因BGIos244的载体转化入植物，或用含有基因BGIos244的宿主细胞感染植物，其中，所述基因BGIos244的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，并且所述植物是水稻。

7.权利要求6的方法，其中通过根癌农杆菌转化法来将所述基因或所述载体转化入植物。

8.权利要求6的方法，其中所述基因可操作地连接至在植物中有效的表达调控元件。

9.权利要求8的方法，其中所述表达调控元件包括启动子和/或终止子。

10.权利要求9的方法，其中所述启动子是玉米泛素启动子，和/或所述终止子是NOS终止子。

11.权利要求6的方法，其中所述载体是表达载体。

12.权利要求6的方法，其中所述宿主细胞是根癌农杆菌。

13.一种产生转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：

1)将基因BGIos244或含有基因BGIos244的载体转化入植物愈伤组织，或用含有基因BGIos244的宿主细胞感染植物愈伤组织，其中所述基因BGIos244的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；

2)从所述愈伤组织再生转基因植物，其中所述转基因植物与未进行转基因的植物相比，根系短且密；

其中，所述植物为水稻。

14.权利要求13的方法，其中通过根癌农杆菌转化法来将所述基因或所述载体转化入植物愈伤组织。

15.权利要求13的方法，其中所述基因可操作地连接至在植物中有效的表达调控元件。

16.权利要求15的方法，其中所述表达调控元件包括启动子和/或终止子。

17.权利要求16的方法，其中所述启动子是玉米泛素启动子，和/或所述终止子是NOS终止子。

18.权利要求13的方法，其中所述载体是表达载体。

19.权利要求13的方法，其中所述宿主细胞是根癌农杆菌。

20.植物愈伤组织用于制备转基因植物或用于植物育种的用途，其中所述植物愈伤组织已导入了基因BGIos244或含有基因BGIos244的载体，或已被含有基因BGIos244的宿主细胞感染，并且其中所述植物是水稻，所述基因BGIos244的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，并且其中所述愈伤组织促进所获得的植物的根系短且密地生长。

21.权利要求20的用途，其中所述载体是表达载体。

22.权利要求20的用途，其中所述宿主细胞是根癌农杆菌。

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