CN101978067A

CN101978067A - 在醛脱氢酶存在下产生发酵产物

Info

Publication number: CN101978067A
Application number: CN2009801103727A
Authority: CN
Inventors: 宋子良; 刘继银
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2008-01-25
Filing date: 2009-01-26
Publication date: 2011-02-16
Also published as: ES2660694T3; EP2245172A1; EP2245172B1; WO2009094614A1; US20110053237A1; US8349592B2

Abstract

本发明涉及在发酵培养基中使用发酵生物将植物材料发酵为发酵产物的方法，其中一种或多种醛脱氢酶存在于所述发酵培养基中。

Description

在醛脱氢酶存在下产生发酵产物

技术领域

本发明涉及将植物来源的材料发酵为所期望发酵产物的方法。该发明亦涉及使用一种或多种发酵生物自植物材料产生发酵产物的方法；可用于本发明方法和/或工艺中的组合物；转基因植物；和修饰的发酵生物。

背景技术

大量难以人工产生的商业产品现在通过发酵生物产生。上述产品包括醇类(例如，乙醇、甲醇、丁醇、1，3-丙二醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐、乳酸、琥珀酸、2，5-二酮-D-葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H₂和CO₂)，以及更加复杂的化合物，包括，例如，抗生素(例如，青霉属和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B₁₂、β-胡萝卜素)；以及激素。发酵亦常用于消费醇类(例如，啤酒和葡萄酒)、乳类制品(例如，用于生产酸奶和奶酪)、皮革和烟草工业。

大量通过发酵由含淀粉和/或木素纤维素材料降解提供的糖产生发酵产物(如乙醇)的方法是本领域已知的。

然而，自植物材料产生发酵产物(如乙醇)仍然成本太高昂。因此，需要提供可增加所述发酵产物的产量从而减少产生成本的方法。

发明内容

在第一个方面，本发明涉及在发酵培养基中使用发酵生物将植物材料来源的糖发酵成为发酵产物的方法，其中一种或多种醛脱氢酶存在于所述发酵培养基中。

在第二个方面，本发明涉及自含淀粉材料产生发酵产物的方法，包括下述步骤：

i)将含淀粉材料液化；

ii)糖化所述经液化的材料；和

iii)使用发酵生物进行发酵；

其中发酵根据本发明的发酵方法进行。在第三个方面，本发明涉及自含淀粉材料产生发酵产物的方法，包括下述步骤：

(a)在所述含淀粉材料的起始糊化温度以下的温度糖化含淀粉材料；和

(b)使用发酵生物进行发酵；

其中发酵根据本发明的发酵方法进行。

在第四个方面，本发明涉及自含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，包括下述步骤：

(a)预处理含木素纤维素材料；

(b)将所述材料水解；

(c)使用发酵生物进行发酵；

其中发酵根据本发明的发酵方法进行。

在第五个方面，本发明涉及包含一种或多种醛脱氢酶的组合物。

在第六个方面，本发明涉及在本发明的发酵方法或工艺中使用醛脱氢酶或本发明的组合物。

在第七个方面，本发明涉及转基因植物材料，其中该植物材料用编码醛脱氢酶的多核苷酸序列转化。

在第八个方面，本发明涉及经修饰的发酵生物，其中所述发酵生物用编码醛脱氢酶的多核苷酸转化，其中所述发酵生物能够在发酵条件下表达醛脱氢酶。

附图简述

图1是关于醛脱氢酶如何能够在过量乙酸和NADH+存在下在发酵过程中逆转乙醛-至-乙酸平衡的示意图

图2说明了在同时糖化和发酵过程中醛脱氢酶对乙醇得率(yield)的作用。

发明详述

乙醇发酵是氧化还原中性的(redox neutral)。然而，在其他细胞过程中产生的过量NAD(P)H必须由下述机理来平衡，在所述机理中，NAD(P)H重新氧化为NAD(P)+以避免NAD(P)+/NAD(P)H比例的不平衡。过量乙酸和NAD(P)H的存在可促进产生乙醛的逆反应，而乙醛可随即转化为乙醇(参见图1)。因此，在发酵过程中醛脱氢酶的存在/添加可导致数种积极作用，包括1)重新产生NAD(P)+，并增加发酵产物得率(例如，乙醇)，和2)增强发酵生物(例如，酵母)的生长。

因此，本发明的第一个方面涉及在发酵培养基中使用发酵生物将来源于植物材料的糖发酵为发酵产物的方法，其中在发酵产物中存在一种或多种醛脱氢酶。

所述醛脱氢酶可在发酵之前和/或过程中添加/导入。所述醛脱氢酶可来自外源，和/或可以，例如，在原位通过由所述发酵生物过表达醛脱氢酶来产生。后者可通过制备经修饰能够表达ALDH的发酵生物(例如酵母)来实现，例如通过用一种或多种ALDH编码基因转化该酵母或导入增加内源ALDH基因表达的启动子来进行。将ALDH基因导入发酵生物(如酵母)和/或在发酵生物中过表达ALDH基因的技术，是本领域已知的。醛脱氢酶亦可以含有和/或表达醛脱氢酶的转基因植物材料的形式存在于/导入所述发酵培养基。

醛脱氢酶(ALDH)

根据本发明，所谓醛脱氢酶(ALDH)可为任何来源，如哺乳类或微生物来源，如细菌或真菌来源的任何单独的醛脱氢酶，或两种或更多ALDH的组合。在一个优选实施方案中，所述ALDH是真菌来源的，优选酵母来源。在一个优选实施方案中，所述ALDH来源于酵母属(Saccharomyces)，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株。

ALDH为EC 1.2.1.3(醛脱氢酶NAD(+))、EC 1.2.1.4(醛脱氢酶(NADP(+))和EC 1.2.1.5醛脱氢酶(NAD(P)(+))分类下的酶。EC分类基于国际生物化学和分子生物学联合会(IUBMB)命名委员会的推荐。对EC分类的描述可见于互联网，例如，在“expasv.org/enzyme/”。ALDH是催化下列反应的酶：

EC1.2.1.3：

EC1.2.1.4：

EC1.2.1.5：

多种形式存在于哺乳类的胞质溶胶、线粒体和内质网中。其归类为1类(胞质溶胶)、2类(线粒体)和3类(肿瘤和其他同工酶)。

在一个实施方案中，所述ALDH归类为EC1.2.1.3。

在一个实施方案中，所述ALDH归类为EC1.2.1.4。在一个实施方案中，所述ALDH归类为EC1.2.1.5。在一个实施方案中，所述ALDH为1类ALDH。在一个实施方案中，所述ALDH为2类ALDH。在一个实施方案中，所述ALDH为3类ALDH。ALDH的实例可见于下列参考文献：

Saigal等，1991，J.Bacteriology 173(10)：3199-3208，concerns cloning ofmitochondrial ALDH gene of Saccharomyces cerevisiae。

Farres等(1989)discloses the primary structure of rat and bovine livermitochondrial ALDH。

Guan等(1990)discloses the sequence of precursor bovine livermitochondrial ALDH。

Hsu等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3771-3775discloses cloning ofcDNAs for human ALDH 1and 2。

Jones等，1988，Proc.Nall.Acad.Sci.USA 85：1782-1786concerns cloningand complete nucleotide sequence of a full-length cDNA encoding a catalyticallyfunctional rumor-associated ALDH。

Hempel等，1984，Eur.J.Biochem.141：21-25，discloses the primarystructure of ALDH from human liver。

Johansson等，1988，Eur.J.Biochem.172：527-533，concerns mitochondrialALDH from horse liver。

可市购的ALDH包括来自酿酒酵母的，可从SIGMA，USA得到(产品#A6338)。

发酵培养基

短语“发酵培养基”指进行发酵的环境，包括发酵底物，即，由发酵生物代谢的碳源，且可包括发酵生物。

所述发酵培养基可包括供发酵生物的营养物和生长刺激剂。营养物和发酵刺激剂广泛用于发酵领域，且包括氮源，如氨、维生素和矿物质，或其组合。

在发酵后，所述发酵培养基可进一步包含发酵产物。

发酵生物

术语“发酵生物”指任何适于产生所期望的发酵产物的生物，包括细菌和真菌生物，包括酵母和丝状真菌。所述发酵生物可为C6或C5发酵生物，或其组合。C6和C5发酵生物在本领域均众所周知。

根据本发明合适的发酵生物能够将可发酵的糖(如葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、甘露糖或阿拉伯糖)直接或间接发酵(即转化)为所期望的发酵产物。

发酵生物的实例包括真菌生物，如酵母。优选的酵母包括酵母属(Saccharomyces)的菌株，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)的菌株，毕赤酵母属(Pichia)，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株如树干毕赤酵母CBS 5773或巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)的菌株；假丝酵母属(Candida)的菌株，特别是产朊假丝酵母(Candidautilis)，阿糖发酵假丝酵母(Candida arabinofermentans)，迪丹氏假丝酵母(Candida diddensii)，Candida sonorensis，休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)，热带假丝酵母(Candida tropicalis)或博伊丁氏假丝酵母(Candida boidinii)的菌株。其他发酵生物包括汉逊酵母属(Hansenula)，特别是多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)或异常汉逊酵母(Hansenula anomala)；克鲁维酵母(Kluyveromyces)，特别是脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)或马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，特别是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的菌株。

优选的细菌发酵生物包括埃希氏菌属(Escherichia)，特别是大肠杆菌(Escherichia coli)的菌株，发酵单胞菌属(Zymomonas)，特别是运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的菌株，发酵细菌属(Zymobacter)，特别是棕榈发酵细菌(Zymobactor palmae)的菌株，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，特别是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)的菌株，明串珠菌属(Leuconostoc)，特别是肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的菌株，梭菌属(Clostridium)，特别是酪酸梭菌(Clostridium butyricum)的菌株，肠杆菌属(Enterobacter)，特别是产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)的菌株，以及热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)的菌株，特别是热厌氧杆菌BG1L1(Appl.Microbiol.Biotech.77：61-86)和乙醇热厌氧杆菌(Thermoanarobacter ethanolicus)，热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterthermosaccharolyticum)或Thermoanaerobacter mathrani的菌株。还想到的是乳杆菌属(Lactobacillus)以及谷氨酸棒状杆菌R(Corynebacterium glutamicum R)，热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillus thermoglucosidaisus)和热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)的菌株。

在一个实施方案中，所述发酵生物为C6糖类发酵生物，例如，酿酒酵母的菌株。

对于发酵木素纤维素来源材料，涵盖了C5糖发酵生物。大多数C5糖发酵生物也发酵C6糖。C5糖发酵生物的实例包括毕赤酵母，例如树干毕赤酵母菌种的菌株。C5糖发酵细菌也是已知的。而且，一些酿酒酵母菌株发酵C5(和C6)糖。实例为能够发酵C5糖的酵母属菌种的经遗传修饰的菌株，包括，例如，Ho等，1998，Applied and Environmental Microbiology，p.1852-1859和Karhumaa等，2006，Microbial Cell Factories 5：18和Kuyper等，2005，FEMS YeastResearch 5925-934中涉及的菌株。

在一个实施方案中，将所述发酵生物添加至发酵培养基中从而使得每ml发酵培养基的中活的发酵生物(如酵母)计数为10⁵至10¹²，优选10⁷至10¹⁰的范围内，特别是约5x10⁷。

对于乙醇发酵，酵母是优选的发酵生物。优选的是酵母属的菌株，特别是酿酒酵母种的菌株，优选对高水平的乙醇(即，高至例如约10、12、15或20vol％或更高的乙醇)具有抗性的菌株。

可市购的酵母包括，例如，RED STAR^TM和ETHANOL RED^TM酵母(可由Fermentis/Lesaffre，USA得到)，FALI(可由Fleischmann’s Yeast，USA得到)，SUPERSTART和THERMOSACC^TM新鲜酵母(可由Ethanol Technology，WI，USA得到)，BIOFERM AFT和XR(可由NABC-North American BioproductsCorporation，GA，USA得到)，GERT STRAND(可由Gert Strand AB，Sweden得到)，以及FERMIOL(可由DSM Specialties得到)。

根据本发明能够自可发酵的糖类，包括葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、甘露糖或阿拉伯糖产生期望的发酵产物的发酵生物，优选在准确的条件下以特定的生长速率生长。当将所述发酵生物导入/添加入所述发酵培养基时，接种的发酵生物经过许多阶段。起初，生长并未发生。该期间称为“迟滞期”，且可看作适应期。在下一个称为“指数期”的阶段，生长速率逐渐增加。经过一个最大生长的期间，生长速率停止，且所述发酵生物进入“稳定期”。又一段时间后所述发酵生物进入“死亡期”，其间活细胞数减少。

在一个实施方案中，当所述发酵生物处于迟滞期时，将所述醛脱氢酶添加至所述发酵培养基。

在另一个实施方案中，当所述发酵生物处于指数期时，将所述醛脱氢酶添加至所述发酵培养基。

在另一个实施方案中，当所述发酵生物处于稳定期时，将所述醛脱氢酶添加至所述发酵培养基。

发酵产物

术语“发酵产物”意指使用发酵生物通过包括发酵的方法或工艺生成的产物。根据本发明所包括的发酵产物包括醇类(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H₂和CO₂)；抗生素(例如，青霉属和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B₁₂、β-胡萝卜素)；以及激素。在优选实施方案中，所述发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇(即，可饮用的中性酒)；或工业乙醇或用于消费醇类工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳制品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革和烟草工业的产物。优选的啤酒类型包括爱儿啤酒(ale)、烈性啤酒(stout)、钵尔透黑啤酒(porters)、陈贮啤酒(lagers)、苦味酒(bitters)、麦芽酒(malt liquors)、happoushu(发泡酒)、高醇啤酒(high-alcohol beer)、低醇啤酒(low-alcohol beer)、低热量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)。使用的优选发酵工艺包括醇发酵工艺。根据本发明方法获得的发酵产物(如乙醇)可优选用作燃料。然而，对于乙醇，其亦可用作饮用乙醇。

发酵

用于本发明方法或工艺的植物起始材料可为含淀粉材料和/或含木素纤维素材料。发酵条件基于例如，植物材料的种类、可用的可发酵糖类、发酵生物和/或期望的发酵产物来确定。本领域技术人员可方便地确定合适的发酵条件。根据本发明的发酵可在通常使用的条件下进行。优选的发酵方法为厌氧方法。

本发明的方法或工艺可作为分批或连续过程进行。本发明的发酵可在超滤系统中进行，其中在存在固体、水和发酵生物的循环下保持渗余物，而渗透物为所期望的含有液体的发酵产物。同样涵盖的是在具有超滤膜的连续膜反应器中进行的方法/工艺，其中在存在固体、水和发酵生物的循环下保持渗余物，而渗透物为所期望的含有液体的发酵产物。

在发酵后，发酵生物可自发酵浆料分离并再循环。

发酵源自淀粉的糖

不同类型的发酵生物可用于发酵来源于含淀粉材料的糖。发酵通常使用酵母，如酿酒酵母作为发酵生物进行。然而，细菌和丝状真菌亦可用作发酵生物。一些细菌与，例如酿酒酵母相比较，具有较高的最适发酵温度。因此，在这样的情况下，发酵可在高达75℃，例如，40-70℃，如50-60℃的温度进行。然而，亦已知最适温度显著较低，低至大约室温(约20℃)的细菌。合适的发酵生物的实例可见于上面的“发酵生物”部分。

对于使用酵母产生乙醇，发酵可在一个实施方案中持续24至96小时，特别是35至60小时。在一个实施方案中，发酵在20至40℃，优选26至34℃，特别是约32℃的温度进行。在一个实施方案中，pH为pH3至6，优选约pH4至5。

其他发酵产物可在本领域技术人员已知适于该发酵生物的温度下进行。

发酵通常在3至7，优选pH 3.5至6的范围的pH，如约pH 5进行。发酵通常持续24-96小时。

发酵木素纤维素来源的糖

不同类型的发酵生物可用于发酵来源于含木素纤维素材料的糖。发酵通常由酵母、细菌或丝状真菌进行，包括在上面“发酵生物”中提及的那些。如果目标是C6可发酵的糖，条件通常类似于上述的淀粉发酵。然而，如果目标是发酵C5糖(例如，木糖)或C6和C5可发酵的糖的组合，发酵生物和/或发酵条件可能会不同。

细菌发酵可在比通常的酵母发酵更高温度，如高至75℃，例如，40-70℃，如50-60℃进行，而后者通常在20-40℃的温度进行。然而，亦已知在低至20℃温度的细菌发酵。发酵通常在3到7范围的pH，优选pH 3.5到6，如约pH 5进行。发酵通常持续24-96小时。

回收

在发酵之后，可自发酵培养基中分离发酵产物。可蒸馏发酵培养基以提取期望的发酵产物，或可自发酵培养基中通过微滤或膜过滤技术提取期望的发酵产物。或者，可通过气提(stripping)回收发酵产物。回收技术在本领域为众所周知的。

自含淀粉材料产生发酵产物

自经糊化的含淀粉材料中产生发酵产物的方法

在此方面，本发明涉及自含淀粉材料产生发酵产物(特别是乙醇)的方法，所述方法包括液化步骤，以及顺序或同时进行的糖化和发酵步骤。

本发明涉及自含淀粉材料产生发酵产物的方法，包括下述步骤：

i)液化含淀粉材料；

ii)糖化所述经液化的材料；

iii)使用一种或多种发酵生物进行发酵，其中发酵在一种或多种醛脱氢酶的存在下进行。

糖化步骤ii)以及发酵步骤iii)可顺序或同时进行。醛脱氢酶可在同时糖化和发酵步骤或发酵步骤iii)之前(例如，在液化步骤i)或单独的糖化步骤ii)过程中)和/或过程中添加。

所期望的发酵产物，如特别是乙醇，可任选地在发酵后回收，例如，通过蒸馏进行。合适的含淀粉的起始材料列于下面“含淀粉材料”部分。涵盖的酶列于下面“酶”部分。液化步骤优选在α-淀粉酶，优选细菌α-淀粉酶和/或酸性真菌α-淀粉酶存在的条件下进行。所述发酵生物优选是酵母，优选酿酒酵母菌株。合适的发酵生物列于上面“发酵生物”部分。

在一个特定的实施例中，本发明的方法在步骤(i)之前还包括下述步骤：

x)减小含淀粉材料的粒度；

y)形成包含含淀粉材料和水的浆料。

减少所述含淀粉材料的粒度的方法对本领域技术人员是已知的。特别涵盖的是将所述含淀粉材料磨制(milling)以减少粒度。

含水浆料可含有10-55wt％含淀粉材料的干固体(DS)，优选25-45wt％的干固体(DS)，更优选30-40％干固体(DS)。将浆料加热到糊化温度以上，并可添加α-淀粉酶，优选细菌和/或酸性真菌α-淀粉酶以起始液化(或稀化(thinning))。在一个实施方案中，在进行本发明步骤i)中的α-淀粉酶处理前，浆料可经喷射蒸煮(jet-cooked)以进一步使其糊化。

液化过程可作为三步热浆方法来进行。将浆料加热至60-95℃，优选80-85℃，并添加α-淀粉酶以起始液化(稀化)。然后可将浆料在95-140℃，优选105-125℃的温度喷射蒸煮约1-15分钟，优选约3-10分钟，特别是约5分钟。使浆料冷却至60-95℃并添加更多的α-淀粉酶以完成水解(二次液化)。液化方法通常在pH 4.5-6.5，特别是在pH 5至6进行。

糖化步骤(ii)中的可使用本领域众所周知的条件进行。举例而言，完全的糖化步骤可持续约24至约72小时，然而，亦通常仅在30-65℃，通常约60℃的温度进行通常40-90分钟的预糖化，然后是在同时发酵和糖化(SSF)方法中在发酵过程中的完全糖化。糖化通常在20-75℃，优选40-70℃，通常约60℃的温度，在约pH 4-5的pH，通常在约pH 4.5进行。

发酵产物，特别是乙醇生产中最广泛使用的方法为同时糖化和发酵(SSF)方法。其中对糖化没有保持阶段，意思是发酵生物(如酵母)和酶，包括醛脱氢酶可一起添加。当发酵生物是酵母，如酿酒酵母菌株，而所期望的发酵产物是乙醇时，SSF通常在20℃到40℃，如28℃到35℃，优选约32℃的温度进行。

其他发酵产物可在本领域技术人员众所周知适于所用发酵生物的条件和温度下进行发酵。根据本发明，在发酵过程中温度可上下调节。

自未糊化的含淀粉材料产生发酵产物的方法

在此方面，本发明涉及自含淀粉材料产生发酵产物，而无含淀粉材料的糊化(通常称作“无烹制”)的方法。根据本发明，可产生期望的发酵产物，如乙醇，而不液化含有含淀粉材料的含水浆料。在一个实施方案中，本发明的方法包括在起始糊化温度以下，优选在α-淀粉酶和/或糖源生成酶的存在下对(例如，经磨制的)含淀粉材料，例如粒状淀粉进行糖化以产生糖类，所述糖类可由合适的发酵生物发酵成期望的发酵产物。

在本发明的实施方案中，期望的发酵产物(优选乙醇)自未糊化的(即，未烹制的)，优选经磨制的谷类谷粒，如玉米(corn)产生。

因此，在此方面，本发明涉及自含淀粉材料产生发酵产物的方法，包括下述步骤：

(a)在所述含淀粉材料的起始糊化温度以下的温度糖化含淀粉材料；

(b)使用一种或多种发酵生物进行发酵，其中发酵在一种或多种醛脱氢酶的存在下进行。

在一个优选实施方案中，步骤(a)或(b)同时(即，一步发酵)或顺序进行。

所述发酵产物，如特别是乙醇，可任选地在发酵后回收，例如，通过蒸馏进行。合适的含淀粉的起始材料列于下面“含淀粉材料”部分。涵盖的酶列于下面“酶”部分。通常淀粉酶，如葡糖淀粉酶和/或其他糖原生成酶和/或α-淀粉酶存在于发酵过程中。

术语“起始糊化温度”意指淀粉发生糊化的最低温度。通常，在水中加热的淀粉在约50℃-75℃开始糊化；糊化的准确温度取决于特定的淀粉，并可方便的由本领域技术人员确定。从而，起始糊化温度可根据植物物种，植物物种的特定变种以及生长条件而改变。在本发明的上下文中，给定含淀粉材料的起始糊化温度可确定为使用由Gorinstein.S.和Lii.C.，1992Starch/

44(12)：461-466描述的方法5％的淀粉颗粒丧失双折射的温度。

在步骤(a)之前，可制备含淀粉材料，如粒状淀粉的浆料，其具有10-55wt％含淀粉材料的干固体(DS)，优选25-45wt％干固体，更优选30-40％干固体。浆料可包含水分和/或工艺水(process water)，例如釜馏物(逆流(backset))、洗涤水(scrubber water)、蒸发器冷凝液或馏出物、来自蒸馏的侧线汽提器水(side-stripper water)或来自其他发酵产物设备(plant)的工艺水。由于本发明的方法在起始糊化温度以下进行，因此不发生显著的粘度增加，如果需要，可使用高水平的釜馏物。在一个实施方案中，含水浆料包含约1至约70vol％，优选15-60vol％，特别为约30至50vol％的水和/或工艺水，如釜馏物(逆流)、洗涤水、蒸发器冷凝物或蒸馏物，来自蒸馏的侧线汽提器水，或来自其他发酵产物设备的工艺水，或其组合等。

可通过优选以干磨或湿磨将其粒度减小到0.05至3.0mm，优选0.1-0.5mm来制备含淀粉材料。在进行本发明的方法或工艺后，含淀粉材料中至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或者优选至少99％的干固体转化为可溶的淀粉水解物。

本发明该方面的方法在低于起始糊化温度的温度进行。当步骤(a)与发酵步骤(b)分开进行时，温度通常位于30-75℃的范围内，优选45-60℃的范围内。然后下述单独的发酵步骤(b)在适于发酵生物的温度进行，当所述发酵生物是酵母时，其通常为25-40℃的范围。

在一个优选实施方案中，步骤(a)和步骤(b)作为同时糖化和发酵方法进行。在这样的实施方案中，当所述发酵生物是酵母时，所述方法通常在25-40℃，如29-35℃，如30℃-34℃，如约32℃的温度进行。本领域技术人员可容易地确定何种方法条件是适合的。

在一个实施方案中，进行发酵从而使得糖水平，如葡萄糖水平保持在低水平，如6wt％以下，如约3wt％以下，如约2wt％以下，如约1wt％以下，如约0.5％以下或0.25wt％以下，如约0.1wt％以下。所述低水平的糖可通过简单的使用经调整量的酶和发酵生物来实现。本领域技术人员可方便地确定使用的酶和发酵生物的剂量/量。酶和发酵生物的使用量也可经选择以保持麦芽糖在发酵液中的低浓度。举例而言，麦芽糖水平可保持为约0.5wt％以下，如约0.2wt％以下。

本发明的方法可在pH约3-7，优选pH 3.5至6，或更优选pH 4至5进行。

含淀粉材料

根据本发明，可使用任何合适的含淀粉的起始材料，包括粒状淀粉(未烹制的生淀粉)。所述起始材料通常基于期望的发酵产物而选择。适用于本发明方法或工艺的含淀粉的起始材料的实例包括块茎、根、茎、全谷粒、玉米、玉米穗轴、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯、树薯、高粱、稻、豌豆(pea)、豆(bean)或甘薯，或它们的组合，或谷类。也涵盖蜡质和非蜡质类型的玉米和大麦。

术语“粒状淀粉”意指未烹制的生淀粉，即，以其天然形式存在于谷类、块茎或谷粒中的淀粉。淀粉在植物细胞中作为微小的不溶于水的颗粒形成。当置于冷水中时，淀粉颗粒可吸收少量液体并膨胀(swell)。在高至50℃至75℃的温度，膨胀可为可逆的。然而，在更高温度开始称为“糊化”的不可逆膨胀。待加工的粒状淀粉可为高度精制的淀粉质量，优选至少90％，至少95％，至少97％或至少99.5％纯，或者其可为更加粗制的含淀粉材料，其含有包括非淀粉部分(例如胚残余物和纤维)的(例如，经磨制的)全谷粒。原材料(如全谷粒)可通过例如磨制减小粒度以打开其结构并允许进一步的加工。根据本发明优选两个方法，湿磨和干磨。在干磨中，将整粒磨碎并使用。湿磨给出胚和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，并通常用于使用淀粉水解物产生，例如，糖浆的场合(location)。干磨和湿磨在淀粉加工领域都是众所周知的，并等同地涵盖于本发明的方法中。在一个实施方案中，粒度减少至约0.05到3.0mm，优选0.1-0.5mm，或使得至少30％，优选至少50％，更优选至少70％，甚至更加优选至少90％的含淀粉材料可穿过具有0.05到3.0mm筛网，优选0.1到0.5mm筛网的筛。

自含木素纤维素材料产生发酵产物

在此方面，本发明涉及自含木素纤维素材料产生发酵产物的方法。将含木素纤维素材料转化为发酵产物，如乙醇，具有大量原料(包括木材、农业残余物，草本作物，城市固体废物等)现成可用的优势。含木素纤维素材料通常主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，并常常称作“生物质”。

木素纤维素的结构使其无法直接的接受酶水解。因此，含木素纤维素材料必需经预处理，例如，通过在足够的压力和温度条件下的酸水解，这是为了打破木质素的密封(seal)并破坏纤维素的晶体结构。这导致半纤维素和纤维素组分的溶解(solubilization)。所述纤维素和半纤维素可随即用酶水解，例如通过纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶，以将碳水化合物聚合物转化为可发酵的糖类，其可经发酵成为所期望的发酵产物，例如乙醇。任选地，所述发酵产物可通过，例如，也如上所述的蒸馏加以回收。

在此方面，本发明涉及自含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，包括下述步骤：

(a)预处理含木素纤维素材料；

(b)将该材料水解；

(c)使用一种或多种发酵生物进行发酵，其中发酵在一种或多种醛脱氢酶存在的情况下进行。

所述醛脱氢酶可在发酵之前和/或过程中添加。水解步骤(b)和发酵步骤(c)可顺序或同时进行。在优选实施方案中，所述步骤以SSF、SHF或HHF方法步骤进行，所述步骤进一步在下面描述。

预处理

所述含木素纤维素材料可根据本发明在被水解和/或发酵之前经预处理。在一个优选实施方案中，将经预处理的材料在发酵之前和/或过程中水解，优选酶催化水解。预处理的目标为分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素，且该方法改善了酶水解的速率。

根据本发明，预处理步骤(a)可为本领域技术人员已知的常规预处理步骤。预处理可在含水浆料中进行。含木素纤维素材料可在预处理期间以10-80wt％，优选20-50wt％的量存在。

化学、机械和/或生物预处理

所述含木素纤维素材料可根据本发明在水解和/或发酵前经化学、机械和/或生物预处理。机械处理(常常称作物理预处理)可单独使用或和后续或同时的水解(特别是酶水解)组合使用，从而促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。

优选的，所述化学、机械和/或生物预处理在水解和/或发酵之前进行。或者，所述化学、机械和/或生物预处理可与水解，如与添加一种或多种纤维素分解酶或下面提及的其他酶同时进行，以释放可发酵的糖类，例如葡萄糖和/或麦芽糖。

在本发明的一个实施方案中，所述预处理的含木素纤维素材料在水解步骤(b)之前或之后经洗涤和/或解毒。这可能改善，例如，稀酸水解的含木素纤维素材料(例如，玉米秸杆(corn stover))的可发酵性。解毒可以任何合适的方式进行，例如，通过蒸汽气提、蒸发、离子交换、树脂或木炭处理液体级分或洗涤所述经预处理的材料来进行。

化学预处理

根据本发明“化学预处理”指促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放的任何化学处理。合适的化学预处理步骤的实例包括用，例如稀酸、石灰、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳进行处理。进一步，湿法氧化和控制pH的水热解(hydrothermolysis)也是期望的化学预处理。

优选的，所述化学预处理为酸处理，更优选，为连续的稀酸和/或弱酸(mildacid)处理，例如，用硫酸，或其他有机酸，如乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸或其混合物处理。也可使用其他酸。弱酸处理在本发明的上下文中意为处理的pH在1-5，优选pH在1-3的范围内。在一个特定实施方案中，所述酸浓度在0.1到2.0wt％酸(优选硫酸)的范围内。该酸可与根据本发明方法待发酵的材料混合或相接触，且混合物可保持在160-220℃，如165-195℃范围内的温度，处理时间为数分钟到数秒，例如，1-60分钟，如2-30分钟或3-12分钟。可添加强酸(如硫酸)来移除半纤维素。这增强了纤维素的可消化性。

根据本发明也涵盖纤维素溶剂处理，显示其可将约90％的纤维素转化为葡萄糖。也显示当木素纤维素结构被破坏时，极大增强了酶水解。碱、H₂O₂、臭氧、有机溶剂(使用水性醇中的路易斯酸，FeCl₃，(Al)₂SO₄)、甘油、二

烷，苯酚或乙二醇属于已知破坏纤维素结构并促进水解的溶剂(Mosier等，2005，Bioresource Technology 96：673-686)。

使用碱，例如NaOH，Na₂CO₃和/或氨等的碱性化学预处理也在本发明的范围内。使用氨的预处理方法描述于WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO2006/110900、WO 2006/110901，其通过提述并入本文。

湿氧化技术涉及使用氧化剂，如，基于亚硫酸盐的氧化剂等。溶剂预处理的实例包括用DMSO(二甲亚砜)等的处理。化学预处理通常进行1到60分钟，如5到30分钟，但可依赖于待进行预处理的材料进行较短或较长的时间。

其他合适的预处理方法的实例描述于Schell等，2003，Appl.Biochem andBiotechn.105-108：69-85和Mosier等，2005，Bioresource Technology 96：673-686，以及美国专利申请公开号2002/0164730，这些文件通过提述并入本文。在一个优选实施方案中，所述纤维素材料，优选木素纤维素材料，用化学和/或机械预处理来处理。

机械预处理

如本发明的上下文中所用的术语“机械预处理”指任何机械的或物理的预处理，其促进自含木素纤维素材料分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素。举例而言，机械预处理包括多种类型的磨制、辐射、汽蒸/蒸汽爆炸(steamexplosion)，以及水热解。

机械预处理包括粉碎(机械减小粒度)。粉碎包括干磨、湿磨和振动球磨(vibratory ball milling)。机械预处理可涉及高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在本发明的一个实施方案中，高压意指压力在300到600psi，优选400到500psi，例如约450psi的范围内。在本发明的一个实施方案中，高温意指温度在约100到300℃，优选约140到235℃的范围内。在一个优选实施方案中，机械预处理为分批工艺蒸汽枪水解器系统，其使用如上定义的高压和高温。也可为此使用Sunds Hydrolyzer(可由Sunds Defibrator AB(Sweden)得到)。

组合的化学和机械预处理

在本发明的一个实施方案中，进行了化学和机械预处理，其涉及，例如，稀酸或弱酸预处理以及高温和高压处理。所述化学和机械预处理可根据需要顺序或同时进行。

因此，在一个优选实施方案中，对所述含木素纤维素材料进行化学和机械的预处理以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。

在一个优选实施方案中，所述预处理作为稀酸和/或弱酸蒸汽爆炸步骤进行。在另一个优选实施方案中，预处理作为氨纤维爆炸(fiber explosion)步骤(或AFEX预处理步骤)进行。

生物预处理

如本发明所用的术语“生物预处理”指促进自含木素纤维素材料的分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素的任何生物预处理。生物预处理技术可涉及应用溶化木质素的微生物(参见，例如，Hsu，T.-A.，1996，Pretreatment ofbiomass，于Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.编，Taylor&Francis，Washington，DC，179-212；Ghosh，P.和Singh，A.，1993，Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion oflignocellulosic biomass，Adv.Appl.Microbiol.39：295-333；McMillan，J.D.，1994，Pretreating lignocellulosic biomass：a review，于Enzymatic Conversion of Biomassfor Fuels Production，Himmel，M.E.，Baker，J.O.和Overend，R.P.编，ACSSymposium Series 566，American Chemical Society，Washington，DC，第15章；Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.和Tsao，G.T.，1999，Ethanol production fromrenewable resources，于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，Scheper，T.编，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65：207-241；Olsson，L.和Hahn-Hagerdal，B.，1996，Fermentation of lignocellulosic hydrolysates forethanol production，Enz.Microb.Tech.18：312-331；以及Vallander，L.和Eriksson，K.-E.L.，1990，Production ofethanol from lignocellulosic materials：State ofthe art，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42：63-95))。

水解

在发酵之前和/或过程中经预处理的含木素纤维素材料可经水解以打破木质素的密封并破坏纤维素的晶体结构。在一个优选实施方案中，水解以酶法进行。根据本发明待发酵的经预处理的含木素纤维素材料可经一种或多种水解酶(根据酶命名法为EC3类)，优选一种或多种糖酶，包括纤维素分解酶和半纤维素分解酶，或其组合来进行水解。此外，蛋白酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶等也可在水解和/或发酵过程中存在，因为所述含木素纤维素材料可能包含一些，例如，含淀粉(starchy)或蛋白质类(proteinaceous)材料。

用于水解的酶可能能够直接或间接将碳水化合物聚合物转化为可发酵的糖类，如葡萄糖和/或麦芽糖，其可发酵为期望的发酵产物，如乙醇。

在一个优选实施方案中，所述糖酶具有纤维素分解和/或半纤维素分解酶活性。

在一个优选实施方案中，使用纤维素分解酶制备物进行水解，所述制备物进一步包括一种或多种具有纤维素分解增强活性的多肽。在一个优选实施方案中，所述具有纤维素分解增强活性的多肽是家族GH61A来源的。合适和优选纤维素分解酶制备物和具有纤维素分解增强活性的多肽的实例描述于下述“纤维素分解酶”部分和“纤维素分解增强多肽”部分。

合适的酶描述于下面“酶”部分。

半纤维素聚合物可通过半纤维素分解酶和/或酸水解发生分解以释放其五碳糖或六碳糖组分。六碳糖(己糖)，如，葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖，可通过合适的发酵生物(包括酵母)容易地发酵为发酵产物，如乙醇、丙酮、丁醇、甘油、柠檬酸、富马酸等。

酶水解优选在合适的水性环境，在可由本领域技术人员容易确定的条件下进行。在一个优选实施方案中，水解在对所述酶合适的，优选最佳的条件下进行。

合适的工艺时间，温度和pH条件可由本领域技术人员容易地确定。优选的，水解在25-70℃，优选40-60℃，特别为约50℃的温度进行。该步骤优选在pH 3-8，优选pH 4-6范围内进行。水解通常进行12-96小时，优选16到72小时，更优选24-48小时。

来源于木素纤维素的材料的发酵根据如上所述本发明的发酵方法来进行。

含木素纤维素材料(生物质)

本发明的上下文中涵盖任何合适的含木素纤维素材料。含木素纤维素材料可为任何含有木素纤维素的材料。在一个优选实施方案中，所述含木素纤维素材料含有至少50wt％，优选至少70wt％，更优选至少90wt％木素纤维素。可理解的是含木素纤维素材料也可包含其他组分，例如纤维质材料，如纤维素、半纤维素，且也可包含组分如糖类，如可发酵糖和不可发酵糖。

含木素纤维素材料通常见于，例如，植物的茎、叶、荚、壳和穗轴或树的叶、枝、木材。含木素纤维素材料也可为，但不仅限于，草本材料，农业残余物、林业残余物、城市固体废物，废纸，以及纸浆和造纸厂残余物。在本文中可理解的是含木素纤维素材料可以植物细胞壁材料的形式出现，其在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素。

在一个实施方案中，所述含木素纤维素材料为玉米纤维、稻草、松木、刨花、杨木、麦秆、柳枝稷(switch grass)、甘蔗渣以及纸和纸浆加工废物。

其他更加特定的实例包括玉米秸杆、玉米穗轴、玉米纤维、硬木如杨木和桦木、软木、谷物草秆如麦秆、柳枝稷、芒属(Miscanthus)、稻壳、城市固体废物(MSW)，工业有机废物，办公室用纸，或其混合物。

在一个优选实施方案中，所述含木素纤维素材料为玉米秸杆或玉米穗轴。在另一个优选实施方案中，所述含木素纤维素材料为玉米纤维。在另一个优选实施方案中，所述含木素纤维素材料为柳枝稷。在另一个优选实施方案中，所述含木素纤维素材料为甘蔗渣。

SSF，HHF和SHF

在本发明一个实施方案中，水解和发酵作为同时水解和发酵步骤(SSF)进行。通常这意味组合的/同时水解和发酵在对所述发酵生物为合适，优选最佳的条件(例如，温度和/或pH)下进行。

在另一个实施方案中，水解步骤和发酵步骤作为杂合水解和发酵(HHF)进行。HHF通常以单独的部分水解步骤开始，并以同时水解和发酵步骤结束。单独的部分水解步骤为酶法纤维素糖化步骤，通常在对所述的水解酶为合适，优选最佳的条件(例如，在较高温度)下进行。后续的同时水解和发酵步骤通常在对发酵生物合适的条件(常常在比所述单独水解步骤更低的温度)下进行。

在另一个实施方案中，水解和发酵步骤也可作为单独的水解和发酵步骤进行，其中所述水解在起始发酵之前已经完成。这常常称作“SHF”。

酶

在本发明的方法和工艺的上下文中，即使未特别提及，可理解的是酶为以“有效量”使用。

α-淀粉酶

根据本发明可使用任何α-淀粉酶，如来源于真菌、细菌和植物的。在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶为酸性α-淀粉酶，例如，酸性真菌α-淀粉酶或酸性细菌α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意指α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，当其以有效量添加时，在3到7，优选3.5到6，或更优选4-5的范围内的pH具有最佳活性。

细菌α-淀粉酶

根据本发明，所述细菌α-淀粉酶优选源自芽孢杆菌属。

在一个优选实施方案中，所述芽孢杆菌属α-淀粉酶源自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，枯草杆菌(Bacillus subtilis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的菌株，但也可源自其他芽孢杆菌属菌种的菌株。涵盖的α-淀粉酶的特定实例包括示于WO 99/19467的SEQ ID NO：4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，示于WO99/19467的SEQ ID NO：5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，示于WO 99/19467的SEQ ID NO：3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列通过提述并入本文)。在一个实施方案中，所述α-淀粉酶可为分别与示于WO 99/19467的SEQID NOS：1，2或3中的任何序列具有至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，例如至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同一性程度的酶。

所述芽孢杆菌属α-淀粉酶也可为变体和/或杂合体，特别是描述于WO96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059和WO 02/10355(所有文件通过提述并入本文)中任一的变体和/或杂合体。特别涵盖的α-淀粉酶变体公开于美国专利号6,093,562、6,297,038或美国专利号6,187,576(通过提述并入本文)，并包括在位置R179到G182具有一个或两个氨基酸缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，优选WO1996/023873公开的双缺失-参见，例如，第20页第1-10行(通过提述并入本文)，优选与WO 99/19467公开的SEQ ID NO：3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比对应于Δ(181-182)，或使用WO 99/19467中的SEQ ID NO：3的编号方式缺失氨基酸R179和G180(所述文献通过提述并入本文)。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其较之WO 99/19467公开的SEQ ID NO：3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列具有对应于delta(181-182)的双缺失，且进一步包括N193F取代(也表示为I181^*+G182^*+N193F)。

细菌杂合体α-淀粉酶

特别涵盖的杂合体α-淀粉酶包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(示于WO99/19467的SEQ ID NO：4)的445个C-末端氨基酸残基，以及源自解淀粉芽孢杆菌的α淀粉酶(示于WO 99/19467的SEQ ID NO：5)的37个N-末端氨基酸残基，并具有下列取代中的一个或多个，特别是全部：

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO：4的地衣芽孢杆菌编号)。也优选具有一个或更多下述突变的变体(或在其他芽孢杆菌属α-淀粉酶骨架中的对应突变)：H154Y，A181T，N190F，A209V和Q264S和/或位置176和179之间两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(使用WO 99/19467的SEQ ID NO：5编号)。

在一个实施方案中，所述细菌α-淀粉酶以0.0005-5KNU每g DS(干物质)，优选0.001-1KNU每g DS，如约0.050KNU每g DS的量添加。

真菌α-淀粉酶

真菌α-淀粉酶包括源自曲霉属菌株的α-淀粉酶，如米曲霉(Aspergillusoryzae)，黑曲霉(Aspergillus niger)和川地曲霉(Aspergillis kawachii)α-淀粉酶。

优选的酸性真菌α-淀粉酶为Fungamyl样α-淀粉酶，其源自米曲霉的菌株。根据本发明，术语“Fungamyl样α-淀粉酶”指下述的α-淀粉酶，即与WO96/23874的SEQ ID NO：10的氨基酸序列成熟部分显示高同一性，即，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或甚至100％的同一性。

另一个优选的酸性α-淀粉酶源自黑曲霉的菌株。在一个优选实施方案中，所述酸性真菌α-淀粉酶来自黑曲霉，作为“AMYA_ASPNG”以原始登录号P56271公开于Swiss-prot/TeEMBL数据库中，并描述于WO 89/01969(实施例3，通过提述并入本文)。源自黑曲霉的商业上可得到的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可由NovozymesA/S，Denmark得到)。

其他涵盖的野生型α-淀粉酶包括源自根毛霉属(Rhizomucor)和亚灰树花菌属(Meripilus)的菌株，优选微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)(WO2004/055178通过提述并入本文)或大型亚灰树花菌(Meripilus giganteus)菌株的那些α-淀粉酶。

在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶源自川地曲霉，并由Kaneko等1996，J.Ferment.Bioeng.81：292-298“Molecular-cloning and determination ofthe nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable α-amylase fromAspergillus kawachii.”公开，并进一步作为EMBL：#AB008370公开。

所述真菌α-淀粉酶也可为包括淀粉结合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即，非杂合体)，或其变体。在一个实施方案中，所述野生型α-淀粉酶源自川地曲霉的菌株。

真菌杂合体α-淀粉酶

在一个优选实施方案中，所述真菌酸性α-淀粉酶为杂合体α-淀粉酶。真菌杂合体α-淀粉酶的优选实例包括公开于WO 2005/003311或美国专利公开号2005/0054071(Novozymes)或WO 2006/069290(Novozymes)中的那些，通过提述并入本文。杂合体α-淀粉酶可包括α-淀粉酶催化域(CD)和碳水化合物结合域/模块(CBM)，如淀粉结合域，以及任选的接头。

所涵盖的杂合体α-淀粉酶的特定实例包括WO 2006/069290实施例中的表1到5中公开的那些，包括具有催化域JA118和罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)SBD(US 60/638,614中的SEQ ID NO：100)的Fungamyl变体，具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD(US 60/638,614中的SEQ ID NO：101)的微小根毛霉α-淀粉酶，具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(其作为美国申请号11/316,535中氨基酸序列SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：72和SEQID NO：96的组合公开于表5)，或作为WO2006/069290中表5中的V039，和具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的大型亚灰树花菌α-淀粉酶(WO2006/069290中的SEQ ID NO：102)。其他特别涵盖的杂合体α-淀粉酶为任何列于美国申请号11/316,535和WO 2006/069290(通过提述并入本文)实施例4中表3、4、5、6中所列的任何杂合体α-淀粉酶。

涵盖的杂合体α-淀粉酶的其他特定实例包括美国专利公开号2005/0054071中公开的那些，包括第15页表3公开的那些，如具有川地曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。

也涵盖下述α-淀粉酶，其与任何上面提及的α-淀粉酶显示高同一性，即，与成熟酶序列显示至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或甚至100％同一性。

酸性α-淀粉酶可根据本发明以0.001到10AFAU/g DS，优选从0.01到5AFAU/g DS，特别为0.3到2AFAU/g DS或0.001到1FAU-F/g DS，优选0.01到1FAU-F/g DS的量添加。

商业性α-淀粉酶产品

优选的包含α-淀粉酶的商业组合物包括来自DSM(Gist Brocades)的MYCOLASE^TM、BAN^TM、TERMAMYL^TM SC、FUNGAMYL^TM、LIQUOZYME^TM X、LIQUOZYME^TM SC和SAN^TM SUPER、SAN^TM EXTRA L(Novozymes A/S)和CLARASE^TM L-40,000、DEX-LO^TM、SPEZYME^TM FRED、SPEZYME^TMAA和SPEZYME^TM DELTA AA(Genencor Int.)，以及以商品名SP288出售的酸性真菌α-淀粉酶(可由Novozymes A/S，Denmark得到)。

糖源生成酶

术语“糖源生成酶”包括葡糖淀粉酶(其为葡萄糖生成者)，β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(其为麦芽糖生成者)以及支链淀粉酶和α-葡糖苷酶。糖源生成酶能够产生碳水化合物，其可由所述发酵生物用作能量源，例如，当用于本方面的方法以供产生发酵产物，例如乙醇时。所产生的碳水化合物可直接或间接的转化为期望的发酵产物，优选乙醇。根据本发明，可使用糖源生成酶的混合物。特别涵盖的混合物为包括至少葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，特别是酸性淀粉酶，甚至更优选酸性真菌α-淀粉酶的混合物。

葡糖淀粉酶活性(AGU)和酸性真菌α-淀粉酶活性(FAU-F)间的比例(即，AGU每FAU-F)可在本发明的优选实施方案中为1-100AGU/FAU-F，特别是2-50AGU/FAU-F，如在10-40AGU/FAU-F范围内，特别是当进行一步发酵(生淀粉水解，Raw Starch Hydrolysis-RSH)中，即，当步骤(a)中的糖化和步骤(b)中的发酵同时进行时(即，无液化步骤)。

在常规的淀粉到乙醇的方法(即，包括液化步骤(a))中，所述比例可优选如在EP140，410-B1中所定义，特别是当步骤ii)中的糖化和步骤iii)中的发酵同时进行时。

葡糖淀粉酶

根据本发明使用的葡糖淀粉酶可源自任何合适的来源，例如源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自下组：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等，1984，EMBO J.3(5)：1097-1102)，或其变体，如公开于WO 92/00381，WO 00/04136和WO 01/04273(来自Novozymes，Denmark)的那些；公开于WO 84/02921的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(1991，Agric.Biol.Chem.，55(4)：941-949)，或它们的变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等，1996，Prot.Eng.9，499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等，1995，Prot.Eng.8，575-582)；N182(Chen等，1994，Biochem.J.301，275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等，1996，Biochemistry，35，8698-8704)；以及在A435和S436位置导入Pro残基(Li等，1997，Protein Eng.10，1199-1204)。

其他的葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)(之前表示为罗耳伏革菌(Corticium rolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利号4727026和(Nagasaka，Y.等，1998，“Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylasesfrom Corticium rolfsii，Appl Microbiol Biotechnol 50：323-330))，踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是源自埃莫森踝节菌(Talaromyces emersonii)(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利号Re.32，153)，杜邦踝节菌(Talaromyces duponti)，嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)(美国专利号4,587,215)。

涵盖的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831)以及瓣环栓菌(Trametes cingulata)，纸质大纹饰孢菌(Pachykytospora papyracea)，以及大白桩菇(Leucopaxillus giganteus)的葡糖淀粉酶，其均披露于WO 2006/069289；或PCT/US2007/066618中的红边隔孢伏革菌(Peniophora rufomarginata)，或其混合物。根据本发明涵盖的还有杂合体葡糖淀粉酶。所述杂合体葡糖淀粉酶的实例公开于WO 2005/045018。特定的实例包括公开于实施例1表1和4的杂合体葡糖淀粉酶(该杂合体通过提述并入本文)。

涵盖的还有葡糖淀粉酶，即与任何上面提及的葡糖淀粉酶显示高同一性，即，与上面提及的成熟酶序列显示至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或甚至100％的同一性。

商业上可得到的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG 200L、AMG 300L、SAN^TM SUPER、SAN^TM EXTRA L、SPIRIZYME^TM PLUS、SPIRIZYME^TMFUEL、SPIRIZYME^TM B4U、SPIRIZYME ULTRA^TM和AMG^TM E(来自Novozymes A/S，丹麦)；OPTIDEX^TM 300、GC480^TM和GC 147^TM(来自GenencorInt.，美国)；AMIGASE^TM和AMIGASE^TM PLUS(来自DSM)；G-ZYME^TM G900、G-ZYME^TM和G990ZR(来自Genencor Int.)。

在一个实施方案中，葡糖淀粉酶以0.02-20AGU/g DS，优选0.1-10AGU/g DS，特别是在1-5AGU/g DS之间，如0.1-2AGU/g DS，如0.5AGU/gDS的量或以0.0001-20AGU/g DS，优选0.001-10AGU/g DS，特别是在0.01-5AGU/g DS，如0.1-2AGU/g DS的量添加。

β-淀粉酶

β-淀粉酶(E.C 3.2.1.2)为传统上给予外作用的(exo-acting)产麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉以及相关的葡萄糖聚合物中1，4-α-糖苷键的水解。自非还原的链末端以逐步的方式连续移除麦芽糖单元直至分子降解，或者，在支链淀粉的情况下，直至到达分枝点。释放的麦芽糖具有β异头物构象，由此得到β-淀粉酶的名称。

已经从多种植物和微生物中分离了β-淀粉酶(W.M.Fogarty和C.T.Kelly，1979，Progress in Industrial Microbiology，15，112-115)。这些β-淀粉酶的特征在于具有40℃到65℃的最适温度以及4.5到7的最适pH。来自大麦的商业上可得到的β-淀粉酶为来自NovozymesA/S，Denmark的NOVOZYM^TM WBA和来自Genencor Int.，USA的SPEZYME^TM BBA 1500。

产麦芽糖淀粉酶

淀粉酶也可为产麦芽糖α-淀粉酶。“产麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成α构象的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的产麦芽糖淀粉酶商业上可由Novozymes A/S得到。产麦芽糖的α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048，4,604,355和6,162,628，其通过提述并入本文。

在一个优选实施方案中，所述产麦芽糖淀粉酶可以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/g DS的量添加。

纤维素分解活性

本文所使用的术语“纤维素分解活性”应理解为包括具有纤维二糖水解酶活性(EC 3.2.1.91)的酶，例如，纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II，以及具有内切葡聚糖酶活性(EC 3.2.1.4)和β-葡糖苷酶活性(EC3.2.1.21)的酶。

纤维素的消化可能需要几种类型的酶协同作用方才有效。通常需要至少三类酶将纤维素转化为葡萄糖：内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)，其随机剪切纤维素链；纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)，其自纤维素链末端切割纤维二糖单元，以及β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)，其将纤维二糖和可溶性纤维糊精转化为葡萄糖。在这三类涉及纤维素生物降解的酶中，纤维二糖水解酶是降解天然晶体纤维素的关键酶。在本文中术语“纤维二糖水解酶I”定义为纤维素1，4-β-纤维二糖水解酶(亦称为外切葡聚糖酶，外切纤维二糖水解酶或1，4-β纤维二糖水解酶)活性，如酶分类EC 3.2.1.91所定义，其在纤维素和纤维四糖中催化1，4-β-D-糖苷键的水解，将纤维二糖自所述链的非还原端释放出来。术语“纤维二糖水解酶II活性”的定义是相同的，只不过纤维二糖水解酶II自所述链的还原端进攻。

纤维素酶可以包含糖结合模块(CBM)，其增强酶与含纤维素纤维的结合并增加酶的催化活性部分的效力。CBM定义为糖活性酶内具有糖结合活性的谨慎折叠的连续氨基酸序列。更多关于CBM信息参见CAZy互联网服务器(见上文)或Tomme等，(1995)于Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides(Saddler，J.N.&Penner，M.编)中，Cellulose-binding domains：classification andproperties.142-163页，American Chemical Society，Washington。

在一个优选的实施方案中，纤维素酶活性可为源自真菌来源的酶制备物形式，如来自木霉属(Trichoderma)菌株，优选里氏木霉(Trichoderma reesei)菌株；腐质霉属(Humicola)菌株，如特异腐质霉(Humicola insolens)菌株；或金孢子属(Chrysosporium)菌株，优选Chrysosporium lucknowense菌株(参见，例如，来自Dyadic Inc，USA的美国公开#2007/0238155)。

在一个优选的实施方案中，所述纤维素酶酶制备物包含一种或多种下述活性：纤维素酶、半纤维素酶、纤维素分解酶增强活性、β-葡糖苷酶活性、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或木糖异构酶。

在一个优选实施方案中，所述纤维素酶或纤维素分解酶可为如PCT/2008/065417所定义的纤维素分解制备物，其通过提述并入本文。在一个优选实施方案中，所述纤维素分解制备物包含具有增强纤维素分解的活性的多肽(GH61A)，优选在WO2005/074656中公开的制备物。所述纤维素分解酶制备物可进一步包含β-葡糖苷酶，如来源于木霉属、曲霉属或青霉属菌株的β-葡糖苷酶，包括WO2008/057637(Novozymes)中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白。在一个实施方案中，所述纤维素分解制备物亦可包含CBH II，优选土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL 6A)。在另一个优选实施方案中，所述纤维素分解制备物亦可包含纤维素分解酶，优选源自里氏木霉、特异腐质霉和/或Chrysosporium lucknowense的。

在一个实施方案中，所述纤维素分解酶制备物包含具有下述活性的多肽：公开于WO2005/074656中的纤维素分解增强活性(GH61A)；纤维二糖水解酶，如土生梭孢霉(Thielavia terrestris)纤维二糖水解酶II(CEL6A)；β-葡糖苷酶(例如，公开于WO/2008057634中的融合蛋白)以及纤维素分解酶，例如源自里氏木霉的。

在一个实施方案中，所述纤维素分解酶制备物包含具有下述活性的多肽：公开于WO2005/074656中的纤维素分解增强活性(GH61A)；β-葡糖苷酶(例如，公开于美国申请号60/832,511中的融合蛋白)以及纤维素分解酶，例如源自里氏木霉的。

在一个实施方案中，纤维素酶是商业上可以获得的产品CELLUCLAST^TM1.5L、CELLUZYME^TM(得自NovozymesA/S，Denmark)或ACCELERASE^TM1000(得自Genencor Inc.USA)

可以加入纤维素酶以供水解经预处理的含木素纤维素材料。纤维素酶可以以0.1-100FPU每克总固体(TS)，优选0.5-50FPU每克DS，特别是1-20FPU每克TS范围内的剂量加入。在另一个实施方案中，将至少0.1mg纤维素分解酶每克总固体(TS)，优选至少3mg纤维素分解酶每克TS，如5-10mg纤维素分解酶每克TS用于水解。

内切葡聚糖酶(EG)

术语“内切葡聚糖酶”意为内-1，4-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(E.C.No.3.2.1.4)，其催化下述化合物中1，4-β-D-葡糖苷键的内水解：纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉、混合β-1，3-葡聚糖，如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖中的β-1，4键，以及其他含有纤维素组分的植物材料。内切葡聚糖酶活性可使用羧甲基纤维素(CMC)水解根据Ghose，1987，Pure and Appl.Chem.59：257-268的方法确定。

在一个优选实施方案中，内切葡聚糖酶可源自木霉属的菌株，优选里氏木霉的菌株；腐质霉属的菌株，优选特异腐质霉的菌株；或金孢子菌属的菌株，优选Chrysosporium lucknowense的菌株。

纤维二糖水解酶(CBH)

术语“纤维二糖水解酶”意指1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其在纤维素，纤维寡糖或任何含有β-1，4-连接的葡萄糖的聚合物中催化1，4-β-D-葡糖苷键的水解，将纤维二糖自链的还原或非还原末端释放。

纤维二糖水解酶的实例为上面提及的，包括来自里氏木霉、特异腐质霉的CBH I和CBH II；来自土生梭孢霉的CBH II纤维二糖水解酶(CELL6A)。

纤维二糖水解酶活性可根据由Lever等，1972，Anal.Biochem.47：273-279和由van Tilbeurgh等，1982，FEBS Letters 149：152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens，1985，FEBS Letters 187：283-288描述的方法来确定。所述Lever等的方法适用于评估玉米秸杆中纤维素的水解，而van Tilbeurgh等的方法适用于对于荧光二糖衍生物确定纤维二糖水解酶的活性。

β-葡糖苷酶

一种或多种β-葡糖苷酶可在水解过程中存在。

术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡萄糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，及β-D-葡萄糖的释放。就本发明而言，β-葡糖苷酶的活性根据由Venturi等，2002，J.Basic Microbiol.42：55-66描述的基本方法确定，只是如本文所述使用不同的条件。一单位的β-葡糖苷酶活性定义为自4mM p-硝基苯酚-β-D-吡喃葡糖苷作为底物在100mM柠檬酸钠，0.01％

20中在50℃，pH 5每分钟产生1.0微摩尔的p-硝基苯酚。

在一个优选实施方案中，所述β-葡糖苷酶为真菌来源，例如木霉属、曲霉属或青霉属的菌株。在一个优选实施方案中，所述β-葡糖苷酶源自里氏木霉，如由bgl1基因编码的β-葡糖苷酶(参见EP 562003的图1)。在另一个优选实施方案中，所述β-葡糖苷酶源自米曲霉(根据WO 02/095014在米曲霉中重组产生)，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(根据WO 02/095014的实施例22在米曲霉中重组产生)，或黑曲霉(1981，J.Appl.3，157-163)。

半纤维素分解酶

根据本发明经预处理的含木素纤维素材料可进一步用一种或多种半纤维素分解酶，例如，一种或多种半纤维素酶处理。

半纤维素可由半纤维素酶和/或酸水解分解以释放其五和六碳糖组分。

在本发明的一个实施方案中，木素纤维素来源材料可用一种或多种半纤维素酶进行处理。

可使用任何适用于将半纤维素优选水解为木糖的半纤维素酶。优选的半纤维素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶，葡萄糖醛酸糖苷酶、内切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶，内切或外切阿拉伯糖酶、外切半乳聚糖酶以及上述两种以上的混合物。优选的，用于本发明的半纤维素为外作用的半纤维素酶，且更优选地，所述半纤维素酶为下述的外作用的半纤维素酶，其具有在pH小于7，优选3-7的酸性条件下水解半纤维素的能力。适用于本发明的半纤维素酶实例包括VISCOZYME^TM(可自NovozymesA/S，Denmark得到)。

在一个实施方案中，所述半纤维素酶为木聚糖酶。在一个实施方案中，所述木聚糖酶可优选为微生物来源的，如真菌来源的(例如，木霉属、亚灰树花菌属、腐质霉属、曲霉属、镰孢属(Fusarium))或来自细菌(例如，芽孢杆菌属)。在一个优选实施方案中，所述木聚糖酶源自丝状真菌，优选源自曲霉属，如棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的菌株，或腐质霉属，优选疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)的菌株。所述木聚糖酶可优选为内切-1，4-β-木聚糖酶，更优选GH10或GH11的内切-1，4-β-木聚糖酶。商业木聚糖酶的实例包括来自Novozymes A/S，Denmark的SHEARZYME^TM和BIOFEED WHEAT^TM。

所述半纤维素酶也可以有效于水解半纤维素的量添加，如，以约0.001到0.5wt％的总固体(TS)，更优选约0.05到0.5wt％的TS的量添加。

木聚糖酶也可以0.001-1.0g/kg DM(干物质)底物，优选以0.005-0.5g/kgDM底物的量，且最优选0.05-0.10g/kg DM底物的量添加。

阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)催化在α-L-阿拉伯糖苷中末端非还原性的α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。

半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)，阿拉伯半乳聚糖内切-1，4-β-半乳糖苷酶催化阿拉伯半乳聚糖中1，4-D-半乳糖苷键的内水解。

果胶酶(EC 3.2.1.15)催化果胶和其他聚半乳糖醛酸中1，4-α-D-半乳醛酸糖苷键(1，4-α-D-galactosiduronic linkage)的水解。

木葡聚糖酶催化木葡聚糖的水解。

半纤维素酶可以有效水解半纤维素的量添加，如，以约0.001到0.5wt.％的总固体(TS)，更优选约0.05到0.5wt.％的TS的量添加。

纤维素分解增强活性

术语“纤维素分解增强活性”在本文中定义为增强具有纤维素分解活性的蛋白质对木素纤维素来源材料的水解的生物活性。就本发明而言，通过测量与具有相等总蛋白加载量但没有纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中的纤维素)的对照水解相比，在如下条件下由于纤维素分解蛋白对木素纤维素来源材料(例如经预处理的含木素纤维素材料)的水解而发生的还原糖的增加或纤维二糖和葡萄糖总量的增加来测定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白质/gPCS(经预处理的玉米秸)中纤维素，其中总蛋白质包含或组成为80-99.5％w/w纤维素分解蛋白/gPCS中的纤维素和0.5-20％w/w纤维素分解增强活性蛋白，在50℃进行1-7天。

具有纤维素分解增强活性的多肽通过降低达到相同程度水解所要求的纤维素分解酶量来增强具有纤维素分解活性的蛋白质所催化的对木素纤维素来源材料的水解，所述纤维素分解酶量的降低优选至少0.1倍、更优选至少0.2倍、更优选至少0.3倍、更优选至少0.4倍、更优选至少0.5倍、更优选至少1倍、更优选至少3倍、更优选至少4倍、更优选至少5倍、更优选至少10倍、更优选至少20倍、更优选至少30倍、最优选至少50倍、甚至最优选至少100倍。

在一个优选的实施方案中，水解和/或发酵是在存在与具有增强活性的多肽组合的纤维素分解酶的情况中实施的。在一个优选的实施方案中，具有增强活性的多肽是家族GH61A多肽。WO 2005/074647披露了来自土生梭孢霉的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。WO 2005/074656披露了来自桔橙嗜热霉(Thermoascus aurantiacus)的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。美国公开申请系列号2007/0077630披露了来自里氏木霉的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。

木糖异构酶

木糖异构酶(D-木糖酮异构酶)(E.C 5.3.1.5)为催化D-木糖变为D-木酮糖的可逆异构化反应的酶。一些木糖异构酶也转化D-葡萄糖到D-果糖的可逆异构化。因此，木糖异构酶有时称为“葡萄糖异构酶”。

用于本发明方法或工艺的木糖异构酶可为任何具有木糖异构酶活性的酶，且可得自任何来源，优选细菌或真菌来源，如丝状真菌或酵母。细菌木糖异构酶的实例包括属于链霉菌属(Streptomyces)、游动放线菌属(Actinoplanes)、芽孢杆菌属和黄杆菌属(Flavobacterium)的那些，以及栖热袍菌属(Thermotoga)的，例如新阿波罗栖热袍菌(T.neapolitana)(Vieille等，1995，Appl.Environ.Microbiol.61(5)，1867-1875)和海栖热袍菌(T.maritime)。

真菌木糖异构酶的实例为担子菌纲(Basidiomycetes)种来源的菌种。

优选的木糖异构酶源自酵母假丝酵母属的菌株，优选博伊丁氏假丝酵母，特别是由例如Vongsuvanlert等，1988，Agric.Biol.Chem.，52(7)：1817-1824公开的博伊丁氏假丝酵母木糖异构酶。所述木糖异构酶可优选源自博伊丁氏假丝酵母的菌株(Kloeckera 2201)，其以DSM 70034和ATCC 48180保藏，公开于Ogata等，Agric.Biol.Chem，33，1519-1520或Vongsuvanlert等，1988，Agric.Biol.Chem，52(2)，1519-1520。

在一个实施方案中，所述木糖异构酶源自链霉菌属的菌株，例如，源自鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)(美国专利号4,687,742)、黄微绿链霉菌(S.flavovirens)、白色链霉菌(S.albus)、不产色链霉菌(S.achromogenus)、多刺链霉菌(S.echinatus)、威德莫尔链霉菌(S.wedmorensis)，其均公开于美国专利号3,616,221。其他的木糖异构酶公开于美国专利号3,622,463，美国专利号4,351,903，美国专利号4,137,126，美国专利号3,625,828，HU专利号12,415，DE专利2,417,642，JP专利号69,28,473，以及WO 2004/044129，其均通过提述并入本文。

所述木糖异构酶可为固定化或液体形式。优选液体形式。

商业上可得到的木糖异构酶的实例包括来自Novozymes A/S，Denmark的SWEETZYME^TM T。

添加木糖异构酶以提供0.01-100IGIU每克总固体范围内的活性水平。

蛋白酶

蛋白酶可在步骤ii)中的水解、步骤iii)中的发酵或同时水解和发酵过程中添加。所述蛋白酶可为任何蛋白酶。在一个优选实施方案中，所述蛋白酶为微生物来源的酸性蛋白酶，优选真菌或细菌来源的。酸性真菌蛋白酶是优选的，但也可使用其他蛋白酶。

合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，例如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶为酸性蛋白酶，即，特征为能够在pH7以下的酸性条件下水解蛋白质的蛋白酶。

涵盖的酸性真菌蛋白酶包括源自曲霉属，毛霉属(Mucor)，根霉属(Rhizopus)，假丝酵母属，革盖菌属(Coriolus)、疫病霉属/内座壳属(Endothia)、虫霉属(Enthomophtra)、耙齿菌属(Irpex)、青霉属、丝核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)的真菌蛋白酶。特别涵盖的是源自黑曲霉(参见，例如，Koaze等，1964，Agr.Biol.Chem.Japan，28，216)，斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)(参见，例如，Yoshida，1954，J.Agr.Chem.Soc.Japan，28，66)，泡盛曲霉(Hayashida等，1977Agric.Biol.Chem.，42(5)，927-933)，棘孢曲霉(WO 95/02044)或米曲霉的蛋白酶，如pepA蛋白酶，以及来自微小毛霉(Mucor pusillus)和米黑毛霉(Mucor miehei)的酸性蛋白酶。

也涵盖中性或碱性蛋白酶，如源自芽孢杆菌属菌株的蛋白酶。本发明涵盖的特定蛋白酶源自解淀粉芽孢杆菌，且具有在Swissprot作为登录号P06832可得到的序列，也涵盖与在Swissprot作为登录号P06832可得到的氨基酸序列具有至少90％同一性，如至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或特别为至少99％同一性的蛋白酶。

进一步涵盖的是与WO 2003/048353中作为SEQ.ID.NO：1公开的氨基酸序列具有至少90％的同一性，如至92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或特别为至少99％的同一性的蛋白酶。

还涵盖木瓜蛋白酶样蛋白酶，如E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)内的蛋白酶，如EC 3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC 3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC 3.4.22.7(萝蘼蛋白酶(asclepain))、EC 3.4.22.14(猕猴桃蛋白酶(actinidain))、EC3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC 3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)和EC 3.4.22.30(番木瓜蛋白酶(caricain))。

在一个实施方案中，所述蛋白酶为源自曲霉属，如米曲霉的菌株的蛋白酶制备物。在另一个实施例中，所述蛋白酶源自根毛霉属，优选曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的菌株。在另一个涵盖的实施方案中，所述蛋白酶为蛋白酶制备物，优选源自曲霉属(如米曲霉)的菌株的蛋白水解制备物以及源自根毛霉属(优选曼赫根毛霉)的菌株的蛋白酶的混合物。

天冬氨酸蛋白酶描述于，例如，Hand-book of Proteolytic Enzymes，A.J.Barrett，N.D.Rawlings和J.F.Woessner编，Aca-demic Press，San Diego，1998，Chapter 270)。天冬氨酸蛋白酶的合适的实例包括，例如，R.M.Berka等，1990，Gene，96，313)；(R.M.Berka等，1993，Gene，125，195-198)；以及Gomi等，1993Biosci.Biotech.Biochem.57，1095-1100公开的那些，其通过提述并入本文。

商业上可得到的产品包括

ESPERASE^TM、FLAVOURZYME^TM、PROMIX^TM、

NOVOZYM^TMFM 2.0L、以及NOVOZYM^TM 50006(可由NovozymesA/S、Denmark得到)以及来自Genencor Int.，Inc.USA.的GC 106^TM和SPEZYME^TM FAN。

所述蛋白酶可以0.0001-1mg酶蛋白质每克DS，优选0.001到0.1mg酶蛋白质每克DS的量存在。或者，所述蛋白酶可以0.0001到1LAPU/g DS，优选0.001到0.1LAPU/g DS和/或0.0001到1mAU-RH/g DS，优选0.001到0.1mAU-RH/g DS的量存在。

组合物

在此方面本发明涉及包括一种或多种醛脱氢酶的组合物。合适的ALDH的实例可见于上面的“醛脱氢酶”部分。

在一个实施方案中，所述组合物进一步包括一种或多种其他糖酶，如α-淀粉酶。在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶为酸性淀粉酶或真菌α-淀粉酶，优选酸性真菌α-淀粉酶。

所述组合物可包括一种或多种糖源生成酶，如特别是葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶、支链淀粉酶、α-葡糖苷酶或其混合物。

在一个实施方案中，所述组合物包括选自下组的酶：纤维素分解酶，如纤维素酶，和半纤维素分解酶，如半纤维素酶。

所涵盖的酶的实例可见于上面“酶”部分。

在另一个优选实施方案中，所述组合物包括一种或多种醛脱氢酶并进一步包括一种或多种发酵生物，如酵母和/或细菌。发酵生物的实例可见于上面的“发酵生物”部分

用途

在此方面本发明涉及醛脱氢酶在发酵过程中的用途。在一个实施方案中，ALDH用于改善发酵产物得率。在一个实施方案中，ALDH用于增加发酵生物的生长。

转基因植物材料

在此方面，本发明涉及用一个或多个醛脱氢酶基因转化的转基因植物材料。

在一个实施方案中，本发明涉及转基因植物、植物部分或植物细胞，其用编码醛脱氢酶的多核苷酸序列转化，从而表达并产生该酶。所述酶可从所述植物或植物部分中回收，但是在本发明的上下文中，包含所述重组醛脱氢酶的植物或植物部分可用在上面提及和描述的本发明一种或多种方法或工艺中。

所述转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(corn)。

双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vasculartissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如为了促进本发明的应用而分离的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。

同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的子代。

表达醛脱氢酶的转基因植物或植物细胞可以依照本领域众所周知的方法构建。简言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码醛脱氢酶的一个或多个表达构建体并入植物宿主基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。

表达载体便利地是包含编码醛脱氢酶的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸序列所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定宿主细胞有用的选择性标记，在所述宿主细胞中整合了表达构建体和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。

调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达该酶而确定。例如，编码醛脱氢酶的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列为例如Tague等，1988，Plant Physiology 86：506所述。

对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动子(Franck等，1980，Cell 21：285-294，Christensen等，1992，Plant Mo.Biol.18：675-689；Zhang等，1991，Plant Cell3：1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards&Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24：863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等，1998，Plant andCell Physiology 39：885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998，Journal of Plant Physiology152：708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等，1998，Plantand Cell Physiology 39：935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其它种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，Plant Physiology 102：991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins，1994，Plant Molecular Biology 26：85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，Molecular and General Genetics 248：668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，Plant Molecular Biology 22：573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理来诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellic acid)，和重金属。

启动子增强子元件亦可用于实现醛脱氢酶在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码醛脱氢酶的核苷酸序列之间。例如Xu等，1993，见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。

选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。

将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等，1990，Science 244：1293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto等，1989，Nature 338：274)。

目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(genetransfer)，是产生转基因双子叶植物的优选方法(关于综述，见Hooykas和Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 19：15-38)，且其亦可用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物其他的转化方法是常用的。目前，产生转基因单子叶植物的优选的方法，是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou，1992，Plant Journal 2：275-281；Shimamoto，1994，Current OpinionBiotechnology 5：158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology 10：667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等，1993，Plant Molecular Biology 21：415-428所描述的。

转化之后，根据本领域熟知的方法选择并入了表达构建体的转化体并且再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两种独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

在植物中生成醛脱氢酶的方法可包括：(a)在有利于产生该酶的条件下培养包含编码醛脱氢酶的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。

如上所述，该转基因植物材料可用于本发明上述的方法或工艺。

与相应的未经修饰的植物材料相比，转基因植物能够增加一种或多种醛脱氢酶的表达量。

修饰的发酵生物

在这个方面本发明涉及用编码醛脱氢酶的多核苷酸转化的修饰的发酵生物，其中所述发酵生物能够在发酵条件下表达醛脱氢酶。

在一个优选实施方案中，所述发酵条件是根据本发明定义的条件。在一个优选实施方案中，所述发酵生物是微生物，如酵母或丝状真菌，或细菌。其他发酵生物的实例可见于“发酵生物”部分。

发酵生物可用醛脱氢酶编码基因使用本领域众所周知的技术转化。

本文中所描述和要求保护的发明不限于本文中所公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案旨在说明本发明的数个方面。任何等同的实施方案意欲在本发明的范围内。事实上，根据前述说明，除本文所显示和描述的之外，本发明的各种修改形式对于本领域技术人员是显而易见的。此类修改也意欲落入所附权利要求的范围内。若有冲突，以包括定义本公开为准。

本文中引用了多篇参考文献，通过提述将它们的公开内容完整并入本文。

材料和方法

方法：

同一性

两个氨基酸序列或多核苷酸序列间的相关性由参数“同一性”描述。

就本发明而言，两个氨基酸序列间的同一性程度通过Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5：151-153)使用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)及同一性表和下述多重比对(multiplealignment)参数确定：缺口罚分为10，而缺口长度罚分为10。配对比对参数(pairwise alignment parameter)为K元组(Ktuple)＝1，缺口罚分＝3，窗口＝5和对角线＝5。

就本发明而言，两个多核苷酸序列间的同一性通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman，1983，Proceedings of the National Academy of Science USA80：726-730)使用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)及同一性表和下述多重比对参数确定：缺口罚分为10，而缺口长度罚分为10。配对比对参数为K元组＝3，缺口罚分＝3和窗口＝20。

醛脱氢酶的SIGMA酶分析法

原理

使用的缩写：

β-NAD＝β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，氧化形式

β-NADH＝β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原形式

条件：T＝25℃，pH＝8.0，A_340nm，光径(Light path)＝1cm

方法：连续分光光度率测定(Continuous Spectrophotetric RateDetermination)

该分析法更加详细的描述(SPACE05，08/30-96修改)可见于Sigma^TM网站上的ALDH产品(产品号A6338)产品信息。或者，该分析经要求可由Novozymes A/S，丹麦获得。该分析法的描述通过提述并入本文。

葡糖淀粉酶活性

葡糖淀粉酶活性可以葡糖淀粉酶单位(AGU)测定。

葡糖淀粉酶活性(AGU)

Novo Glucoamylase Unit(AGU)定义为在37℃，pH4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟的标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量。

可使用自动分析系统。将变旋酶添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，使得任何存在的α-D-葡萄糖转化为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶特异性地与β-D-葡萄糖在上述反应中反应，形成NADH，其使用光度计在340nm处测定作为起始葡萄糖浓度的量度。

AMG温育：

底物：麦芽糖23.2mM

缓冲液：乙酸盐0.1M

pH： 4.30±0.05

温育温度： 37℃±1

反应时间： 5分钟

酶工作范围： 0.5-4.0AGU/mL

颜色反应

GlucDH： 430U/L

变旋酶： 9U/L

NAD： 0.21mM

缓冲液：磷酸盐0.12M；0.15M NaCl

pH： 7.60±0.05

温育温度 37℃±1

反应时间： 5分钟

波长： 340nm

更详细描述此分析方法的文件夹(EB-SM-0131.02/01)可根据要求由NovozymesA/S，Denmark得到，其通过提述并入本文。

α-淀粉酶活性(KNU)

α-淀粉酶活性可使用马铃薯淀粉作为底物来确定。该方法基于酶对于改性马铃薯淀粉的分解，并通过将淀粉/酶溶液的样本与碘溶液混合来跟踪反应。起初，形成了蓝黑色(blackish blue)，但在淀粉分解过程中，蓝色越来越淡，并逐渐变为红棕色(reddish-brown)，将其和有色玻璃标准(colored glassstandard)进行比较。

一个千Novo α-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即，在37℃+/-0.05；0.0003M Ca²⁺；以及pH 5.6)糊精化5260mg的淀粉干底物MerckAmylum Solubile所需的酶量。

更详细描述该分析方法的文件夹EB-SM-0009.02/01可根据要求由NovozymesA/S，Denmark得到，其通过提述并入本文。

酸性α-淀粉酶活性

当根据本发明使用时，酸性α-淀粉酶的活性可以以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)或FAU-F测定。

酸性α-淀粉酶活性(AFAU)

酸性α-淀粉酶活性可以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)进行测量，其相对于酶标准物来确定。1AFAU定义为在下面提及的标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。

酸性α-淀粉酶，其为内切α-淀粉酶(1，4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)水解淀粉分子内部区域中的α-1，4-葡糖苷键以形成具有不同链长的寡糖和糊精。与碘形成的颜色的强度与淀粉浓度成正比。使用反向比色法(reversecolorimetry)在规定的分析条件下测定淀粉浓度的降低作为淀粉酶活性。

λ＝590nm

蓝色/紫色 t＝23秒脱色

标准条件/反应条件

底物：可溶性淀粉，大约0.17g/L

缓冲液：柠檬酸盐，大约0.03M

碘(I₂) 0.03

CaCl₂： 1.85mM

pH： 2.50±0.05

温育温度： 40℃

反应时间 23秒

波长 590nm

酶浓度 0.025AFAU/mL

酶工作范围 0.01-0.04AFAU/mL

更详细描述该分析方法的文件夹EB-SM-0259.02/01可根据要求由NovozymesA/S，Denmark得到，其通过提述并入本文。

确定FAU-F

FAU-F真菌α-淀粉酶单位(Fungamyl)相对于已知强度的酶标准进行测量。

更详细描述该分析方法的文件夹(EB-SM-0216.02)可根据要求由NovozymesA/S，Denmark得到，其通过提述并入本文。

使用滤纸分析法(FPU分析法)测定纤维素酶活性

1.方法来源

1.1本方法公开于Adney，B.和Baker，J.1996.Laboratory AnalyticalProcedure，LAP-006，National Renewable Energy Laboratory(NREL)的题为“Measurement of Cellulase Activities”的文件。其基于供测定纤维素酶活性的IUPAC方法(Ghose，T.K.，1987，Measurement of Cellulse Activities，Pure&Appl.Chem.59，257-268)。

2.方法

2.1该方法如Adney和Baker，1996，见上文所述进行，只是使用96孔板来读取显色后的吸光度值，如下文所述。

2.2酶测定管：

2.2.1将成卷的(rolled)滤纸条(#1Whatman；1cm X 6cm；50mg)添加至试管(13mm X 100mm)的底部。

2.2.2向管中添加1.0mL 0.05M柠檬酸钠缓冲液(pH 4.80)。

2.2.3将含有滤纸和缓冲液的管在循环水浴中在50℃(±0.1℃)温育5分钟。

2.2.4温育后，向管中添加0.5mL柠檬酸盐缓冲液中的酶稀释液。酶稀释液设计成产生略高于和略低于目标值2.0mg葡萄糖的值。

2.2.5通过温和涡旋震荡将管内容物混合3秒钟。

2.2.6涡旋震荡后，将管在循环水浴中在50℃(±0.1℃)温育60分钟。

2.2.7在60分钟温育后立即将管从水浴中取出，并向每个管中添加3.0mL DNS试剂以终止反应。将管涡旋震荡3秒钟以混合。

2.3空白和对照

2.3.1通过向试管中添加1.5mL柠檬酸盐缓冲液来制备试剂空白。

2.3.2通过将成卷的滤纸条置于试管的底部并添加1.5mL柠檬酸盐缓冲液来制备底物对照。

2.3.3通过将1.0mL柠檬酸盐缓冲液与0.5mL适宜的酶稀释液混合来制备每种酶稀释液的酶对照。

2.3.4以与酶测定管相同的方式测定试剂空白、底物对照和酶对照，而且与酶测定管一起进行。

2.4葡萄糖标准物

2.4.1制备100mL葡萄糖储液(10.0mg/mL)，并冷冻5mL等分试样。在使用前，将等分试样融化并涡旋震荡以混合。

2.4.2如下在柠檬酸盐缓冲液中制备储液的稀释液：

G1＝1.0mL储液+0.5mL缓冲液＝6.7mg/mL＝3.3mg/0.5mL

G2＝0.75mL储液+0.75mL缓冲液＝5.0mg/mL＝2.5mg/0.5mL

G3＝0.5mL储液+1.0mL缓冲液＝3.3mg/mL＝1.7mg/0.5mL

G4＝0.2mL储液+0.8mL缓冲液＝2.0mg/mL＝1.0mg/0.5mL

2.4.3通过向1.0mL柠檬酸盐缓冲液中添加0.5mL每种稀释液来制备葡萄糖标准物管。

2.4.4以与酶测定管相同的方式测定葡萄糖标准物管，而且与酶测定管一起进行。

2.5显色

2.5.1在60分钟温育和添加DNS后，将所有管一起在水浴中煮沸5分钟。

2.5.2煮沸后，立即将它们在冰/水浴中冷却。

2.5.3冷却时，将管短暂地涡旋震荡，并让纸浆沉降。然后通过将来自管的50微升添加至96孔板中的200微升ddH₂O来稀释每个管。将每个孔混合，并在540nm读取吸光度。

2.6计算(例子在NREL文件中给出)

2.6.1通过将四种标准品(G1-G4)的葡萄糖浓度(mg/0.5mL)对A₅₄₀绘图来绘制葡萄糖标准曲线。这是使用线性回归(Prism Software)来拟合的，并使用该线的方程来确定每个酶测定管所生成的葡萄糖。

2.6.2绘制所生成的葡萄糖(mg/0.5mL)对总酶稀释度的曲线，其中Y轴(酶稀释度)为对数刻度。

2.6.3在生成刚刚高于2.0mg葡萄糖的酶稀释度与生成刚刚低于该值的稀释度之间画一条线。根据此线确定精确生成2.0mg葡萄糖的酶稀释度。

2.6.4如下计算滤纸单位/mL(FPU/mL)：

FPU/mL＝0.37/生成2.0mg葡萄糖的酶稀释度

蛋白酶分析方法-AU(RH)

蛋白质分解活性可用变性的血红蛋白作为底物来确定。用于确定蛋白质分解活性的Anson-Hemoglobin方法中，消化变性的血红蛋白，并将未消化的血红蛋白用三氯乙酸(TCA)沉淀。TCA可溶性产物的量用酚试剂来确定，其与酪氨酸和色氨酸产生蓝色。

一个Anson单位(AU-RH)定义为在标准条件(即25℃，pH 5.5和10分钟反应时间)下以一定初始速率消化血红蛋白的酶量，该初始速率使得每分钟所释放的TCA可溶性产物的量与酚试剂产生与1毫当量酪氨酸相同的颜色。

所述AU(RH)方法描述于EAL-SM-0350，并可根据要求由NovozymesA/S Denmark得到。

蛋白酶分析方法(LAPU)

1个亮氨酸氨肽酶单位(LAPU)指在如下条件每分钟分解1μM底物的酶量：26mM L-亮氨酸-对-硝基苯胺(L-leucine-p-nitroanilide)作为底物，0.1M Tris缓冲液(pH 8.0)，37℃，10分钟反应时间。

LAPU描述于EB-SM-0298.02/01，其可根据要求由Novozymes A/SDenmark得到。

确定产麦芽糖淀粉酶活性(MANU)

一个MANU(产麦芽糖淀粉酶Novo单位)可定义为在10mg麦芽三糖(Sigma M 8378)底物每ml柠檬酸盐缓冲液，pH5.0的浓度在37℃30分钟，每分钟释放一微摩尔的麦芽糖所需的酶量。

材料：

醛脱氢酶(ALDH)：来自面包酵母(酿酒酵母)冻干粉的钾激活的醛脱氢酶，2-10单位/mg蛋白质，购自Sigma(A6338)。

葡糖淀粉酶(GA)：WO 2006/069289的SEQ ID NO：2中公开的源自瓣环栓菌，并可自Novozymes A/S得到的葡糖淀粉酶。

α-淀粉酶A(AA)：WO 2006/069290的表5中作为V039公开的由微小根毛霉α-淀粉酶及黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD组成的杂合体α-淀粉酶(Novozymes A/S)。

酵母：可得自Red Star/Lesaffre，USA的RED STAR^TM。

实施例

实施例1

醛脱氢酶(ALDH)对来自一步同时糖化和发酵(SSF)方法中的α-淀粉酶(AA 1)和葡糖淀粉酶(GA)组合的乙醇得率的作用

所有的处理通过小规模发酵的方法来评价。将410g的磨碎的普通黄玉米(yellow dent corn)(其平均粒度约0.5mm)添加到590g自来水中。对该混合物补充以3.0ml的1g/L青霉素和1g的尿素。将该浆料的pH用40％H₂SO₄调整至4.5。干固体(DS)水平确定为35wt％。将大约5g的该浆料添加入15ml聚丙烯管中。所述管通过钻出1/32英寸(1.5mm)的孔来制备，然后在添加玉米浆料之前将空管称重。在添加醪液之后再次对所述管称重以确定每个管中醪液的准确重量。向每个管添加以表1所示的适量的酶剂量，然后添加200微升酵母繁殖物/5g浆料。实际酶剂量基于每个管中玉米浆料的准确重量。将管在32℃温育。对于每个处理运行九次重复发酵。选择三个重复用于24小时、48小时和70小时时间点分析。在24、48和70小时涡旋震荡所述管并通过HPLC进行分析。HPLC的准备由以下组成：通过添加50微升40％H₂SO₄终止反应，离心，并过滤通过0.45微米滤器。在4℃保存样品直到进行分析。使用偶联有RI检测器的Agilent^TM 1100HPLC系统以确定乙醇和寡糖浓度。分离柱为来自BioRad^TM的Aminex HPX-87H离子排阻柱(300mm x7.8mm)。所得结果总结于图2。

Claims

1.一种在发酵培养基中使用发酵生物将来源于植物材料的糖发酵为发酵产物的方法，其中一种或多种醛脱氢酶存在于所述发酵培养基中。

2.权利要求1的方法，其中将所述醛脱氢酶添加至所述发酵培养基。

3.一种自含淀粉材料产生发酵产物的方法，包括下述步骤：

i)将含淀粉材料液化；

ii)糖化所述经液化的材料；

iii)使用发酵生物发酵，

其中发酵根据权利要求1或2所述的方法进行。

4.权利要求3的方法，其中步骤ii)和iii)同时进行。

5.权利要求3或4的方法，在i)步骤之前还包括下述步骤：

x)减小含淀粉材料的粒度；和

y)形成包含所述含淀粉材料和水的浆料。

6.权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述含淀粉材料选自下组：玉米、木薯、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱和马铃薯，或其任意组合。

7.一种自含淀粉材料产生发酵产物的方法，包括下述步骤：

(a)在所述含淀粉材料的起始糊化温度以下的温度对含淀粉材料进行糖化；

(b)使用发酵生物进行发酵，

其中所述发酵如权利要求1或2所述进行。

8.权利要求7的方法，其中步骤(a)和(b)同时进行。

9.权利要求7或8所述的方法，其中所述含淀粉材料选自下组：玉米、木薯、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱和马铃薯，或其任意组合。

10.一种自含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，包括下述步骤：

(a)预处理含木素纤维素材料；

(b)将所述材料水解；

(c)使用发酵生物发酵，

其中发酵如权利要求1或2所述进行。

11.权利要求10的方法，其中所述含木素纤维素材料源自选自下组的材料：玉米秸杆、玉米穗轴、玉米纤维、硬木、软木、谷类草秆、麦秆、柳枝稷(switchgrass)、稻壳、芒属(Miscanthus)、城市固体废物、工业有机废物、甘蔗渣和办公室用纸，或其混合物。

12.权利要求11的方法，其中所述含木素纤维素材料在步骤(a)中经化学、机械或生物预处理。

13.权利要求10-12任一项所述的方法，其中所述发酵生物是C6或C5发酵生物。

14.权利要求1-13任一项所述的方法，其中所述发酵产物是乙醇。

15.权利要求1-14任一项所述的方法，其中所述发酵产物通过蒸馏回收。

16.醛脱氢酶在发酵方法中的用途。

17.权利要求16的用途，其中所述发酵方法是产生乙醇的方法。

18.一种经编码醛脱氢酶的多核苷酸转化的修饰发酵生物，其中所述发酵生物能够在发酵条件下表达醛脱氢酶。