CN101977937A - Ron抗体及其用途 - Google Patents

Ron抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN101977937A
CN101977937A CN2009801102175A CN200980110217A CN101977937A CN 101977937 A CN101977937 A CN 101977937A CN 2009801102175 A CN2009801102175 A CN 2009801102175A CN 200980110217 A CN200980110217 A CN 200980110217A CN 101977937 A CN101977937 A CN 101977937A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
antibody
fragment
polynucleotide
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2009801102175A
Other languages
English (en)
Inventor
H·休特
V·贝利
E·加伯
C·加弗
S·米克拉斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biogen Inc
Biogen MA Inc
Original Assignee
Biogen Idec MA Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Idec MA Inc filed Critical Biogen Idec MA Inc
Publication of CN101977937A publication Critical patent/CN101977937A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及结合RON(receptor d’origine nantais，MST1R)的抗体及其用途，特别是在癌症的诊断和治疗中的用途。提供了抑制RON介导的促存活和肿瘤增殖途径的特异性抗体、及其变体、片段和衍生物。还提供了阻断配体MSP与RON结合能力的特异性抗体、以及这些抗体的片段、变体和衍生物。本发明还包括编码上述抗体或其片段、变体或衍生物的多核苷酸、以及含有这些多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明还包括使用本发明的抗体来诊断和治疗癌症的方法。

Description

RON抗体及其用途
发明背景
RON(recepteur d’origine nantais，也称为MST1R)是一种对于胚胎发育必不可少的受体型蛋白酪氨酸激酶，并且还在炎症反应中起重要作用(Camp等人Ann.Surg.Oncol.12：273-281(2005))。RON主要在来源于上皮的细胞类型中表达，并且有人提出RON同大量的其它受体型酪氨酸激酶一样可能在恶性上皮癌的演变中起作用(Wang等人Carcinogensis 23：1291-1297(2003))。
受体型蛋白酪氨酸激酶通常由结合胞外配体诸如生长因子和激素的胞外结构域以及具备激酶功能结构域的胞内结构域组成。受体型蛋白酪氨酸激酶已被细分为许多类别，并且RON是受体酪氨酸激酶的MET家族的成员，该家族还包括Stk、c-Met和c-Sea(Camp等人Ann.Surg.Oncol.12：273-281(2005))。RON和c-Met是在人类中发现的仅有的该家族的成员，并且它们总体上共有约65％的同源性。C-Met是肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF)的受体并且已被相当充分地表征为原癌基因。
已经确定RON的配体巨噬细胞刺激蛋白(MSP)，其与c-Met配体HGF/SF共有约40％的同源性。MSP和HGF属于通过Kringle结构域表征的纤溶酶原-凝血酶原家族。有趣的是，MSP也已证实与癌症有关。例如，Welm等人最近观察到MSP与乳腺癌的转移和不良预后之间的关联(PNAS104：7501-7575(2007))。
已经证实MSP与称为脑信号蛋白(sema)结构域的RON的胞外部分中的特定结构域结合。RON和c-Met是仅有的具有胞外sema结构域的受体酪氨酸激酶，并且已经证实RON的sema结构域包括其配体结合位点。MSP与RON的结合导致RON的激酶结构域中磷酸化，这使得RON激酶活性增加。或者，β1整联蛋白可经由Src依赖性途径将RON磷酸化并活化(Camp等人Ann.Surg.Oncol.12：273-281(2005))。RON的活化引发了许多途径的信号传导，包括PI3-K、Ras、src、β-连环蛋白和Fak信号传导。由RON活化的许多信号传导途径牵涉在与癌症相关的过程诸如增殖和凋亡的抑制中。
最近，由于多种原因，RON本身已牵涉在癌症演变中。例如，RON在包括乳腺癌、膀胱癌、结肠癌、卵巢癌和胰腺癌的多种人类肿瘤中表达。此外，RON已经在体外显示出增加细胞增殖和活动性。而且，RON在RON转基因小鼠中诱导肿瘤生长和转移(metastisis)(Waltz等人Cancer Research66：11967-11974(2006))。因此，对可以抑制RON信号传导途径的包括抗RON抗体在内的分子存在需求。
发明内容
在一些实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合至与选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的参考单克隆Fab抗体片段或选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的参考单克隆抗体相同的RON表位。
在一些实施方案中，本发明提供一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段竞争性地抑制选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的参考单克隆Fab抗体片段或选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的参考单克隆抗体与RON结合。
在一些实施方案中，本发明提供一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段包含与选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的参考单克隆Fab抗体片段或选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的参考单克隆抗体的抗原结合结构域相同的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，本发明提供一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的重链可变区(VH)包含与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列：SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：145。
在一些实施方案中，本发明提供一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的轻链可变区(VL)包含与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列：SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：89、SEQ IDNO：99、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：140和SEQ ID NO：150。
在一些实施方案中，本发明提供一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH包含除了20个或更少的保守性氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：74、SEQ IDNO：84、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：145。
在一些实施方案中，本发明提供一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VL包含除了20个或更少的保守性氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：79、SEQ IDNO：89、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：140和SEQ ID NO：150。
在一些实施方案中，本发明提供一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：74、SEQ IDNO：84、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：145。
在一些实施方案中，本发明提供一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VL包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：79、SEQ IDNO：89、SEQ ID NO：99、SEQ TD NO：120、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：140和SEQ ID NO：150。
在一些实施方案中，本发明提供一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH和VL分别包含与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：24和SEQID NO：29；SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：44和SEQ IDNO：49；SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：59；SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：69；SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：79；SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：89；SEQ IDNO：94和SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：140、以及SEQ IDNO：145和SEQ ID NO：150。
在一些实施方案中，本发明提供一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH和VL各自除了20个或更少的保守性氨基酸取代以外，分别包含与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：34和SEQID NO：39；SEQ ID NO：44和SEQ TD NO：49；SEQ ID NO：54和SEQ IDNO：59；SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：69；SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：79；SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：89；SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：99、SEQ IDNO：115和SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：130、SEQ IDNO：135和SEQ ID NO：140、以及SEQ ID NO：145和SEQ ID NO：150。
在一些实施方案中，本发明提供一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH和VL分别包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：34和SEQID NO：39；SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：49；SEQ ID NO：54和SEQ IDNO：59；SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：69；SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：79；SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：89；SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：99、SEQ IDNO：115和SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：130、SEQ IDNO：135和SEQ ID NO：140、以及SEQ ID NO：145和SEQ ID NO：150。
在一些实施方案中，本发明提供一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH包含除了两个或更少的氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考重链互补决定区-1(VH-CDR1)氨基酸序列相同的Kabat VH-CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：95、SEQ IDNO：116、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：136和SEQ ID NO：146。在另外的实施方案中，所述VH-CDR1氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：85、SEQ IDNO：95、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：136和SEQ ID NO：146。
在一些实施方案中，本发明提供一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH包含除了四个或更少的氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考重链互补决定区-2(VH-CDR2)氨基酸序列相同的Kabat VH-CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：96、SEQ IDNO：117、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：147。在另外的的实施方案中，所述VH-CDR2氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：86、SEQ IDNO：96、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：137和SEQ IDNO：147。
在一些实施方案中，本发明提供一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH包含除了四个或更少的氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考重链互补决定区-3(VH-CDR3)氨基酸序列相同的Kabat VH-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：97、SEQ IDNO：118、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：138和SEQ ID NO：148。在另外的实施方案中，所述VH-CDR3氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：87、SEQ IDNO：97、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：138和SEQ IDNO：148。
在一些实施方案中，本发明提供一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VL包含除了四个或更少的氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考轻链互补决定区-1(VL-CDR1)氨基酸序列相同的Kabat VL-CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：100、SEQID NO：121、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：151。在另外的实施方案中，所述VL-CDR1氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：90、SEQ IDNO：100、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：141和SEQ IDNO：151。
在一些实施方案中，本发明提供一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VL包含除了两个或更少的氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考轻链互补决定区-2(VL-CDR2)氨基酸序列相同的Kabat VL-CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：101、SEQID NO：122、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：142和SEQ ID NO：152。在另外的实施方案中，所述VL-CDR2氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：91、SEQ IDNO：101、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：142和SEQ ID NO：152。
在一些实施方案中，本发明提供一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VL包含除了四个或更少的氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考轻链互补决定区-3(VL-CDR3)氨基酸序列相同的Kabat VL-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：102、SEQID NO：123、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：153。在另外的实施方案中，所述VL-CDR3氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：92、SEQ IDNO：102、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：153。
在一些实施方案中，本发明提供一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中除了在所述VH-CDR中的至少一个上的一个、二个、三个或四个氨基酸取代以外，所述抗体或其片段的VH包含选自由以下组成的组的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：5、6和7；SEQ ID NO：15、16和17；SEQ ID NO：25、26和27；SEQ ID NO：35、36和37；SEQ ID NO：45、46和47；SEQ ID NO：55、56和57；SEQID NO：65、66和67；SEQ ID NO：75、76和77；SEQ ID NO：85、86和87；SEQ ID NO：95、96和97；SEQ ID NO：116、117和118；SEQ ID NO：126、127和128；SEQ ID NO：136、137和138；以及SEQ ID NO：146、147和148。
在一些实施方案中，本发明提供一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH包含选自由以下组成的组的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：5、6和7；SEQ ID NO：15、16和17；SEQ ID NO：25、26和27；SEQ ID NO：35、36和37；SEQ ID NO：45、46和47；SEQ ID NO：55、56和57；SEQ ID NO：65、66和67；SEQ ID NO：75、76和77；SEQ ID NO：85、86和87；SEQID NO：95、96和97；SEQ ID NO：116、117和118；SEQ ID NO：126、127和128；SEQ ID NO：136、137和138；以及SEQ ID NO：146、147和148。
在一些实施方案中，本发明提供一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中除了在VL-CDR中至少一个上的一个、二个、三个或四个氨基酸取代以外，所述抗体或其片段的VL包含选自由以下组成的组的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：10、11和12；SEQ ID NO：20、21和22；SEQ ID NO：30、31和32；SEQ ID NO：40、41和42；SEQ ID NO：50、51和52；SEQ ID NO：60、61和62；SEQ ID NO：70、71和72；SEQ ID NO：80、81和82；SEQ ID NO：90、91和92；SEQID NO：100、101和102；SEQ ID NO：121、122和123；SEQ ID NO：131、132和133；SEQ ID NO：141、142和143；以及SEQ ID NO：151、152和153。
在一些实施方案中，本发明提供一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VL包含选自由以下组成的组的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：10、11和12；SEQ ID NO：20、21和22；SEQ ID NO：30、31和32；SEQ ID NO：40、41和42；SEQ ID NO：50、51和52；SEQ ID NO：60、61和62；SEQ ID NO：70、71和72；SEQ ID NO：80、81和82；SEQ ID NO：90、91和92；SEQID NO：100、101和102；SEQ ID NO：121、122和123；SEQ ID NO：131、132和133；SEQ ID NO：141、142和143；以及SEQ ID NO：151、152和153。
在上述的抗体或其片段的各种实施方案中，除了五个或更少的氨基酸取代以外，所述VH构架区和/或VL构架区是人类的。
在一些实施方案中，上述的抗体或其片段结合至线性表位或非线性构象表位。
在一些实施方案中，上述的抗体或其片段是多价的，并包含至少两条重链和至少两条轻链。
在一些实施方案中，上述的抗体或其片段是多特异性的。在另外的实施方案中，上述的抗体或其片段是双特异性的。
在上述的抗体或其片段的各种实施方案中，重链和轻链可变结构域是鼠的。在另外的实施方案中，重链和轻链可变结构域来自选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的单克隆抗体。
在上述的抗体或其片段的各种实施方案中，重链和轻链可变结构域是完全人类的。在另外的实施方案中，重链和轻链可变结构域来自选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的单克隆Fab抗体片段。
在各种实施方案中，上述的抗体或其片段是人源化的。
在各种实施方案中，上述的抗体或其片段是嵌合的。
在各种实施方案中，上述的抗体或其片段是灵长源化的。
在各种实施方案中，上述的抗体或其片段是完全人类的。
在某些实施方案中，上述的抗体或其片段是Fab片段、Fab’片段、F(ab)2片段或Fv片段。
在某些实施方案中，上述的抗体是单链抗体。
在某些实施方案中，上述的抗体或其片段包含选自由人类κ恒定区和人类λ恒定区组成的组的轻链恒定区。
在某些实施方案中，上述的抗体或其片段包含重链恒定区或其片段。在另外的实施方案中，重链恒定区或其片段选自由人类IgG4、IgG4agly、IgG1和IgG1agly组成的组。
在一些实施方案中，上述的抗体或其片段以小于所述参考单克隆抗体的解离常数(KD)的KD所表征的亲和力特异性地结合至RON多肽或其片段、或RON变体多肽。在另外的实施方案中，解离常数(KD)不大于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M。
在一些实施方案中，上述的抗体或其片段相对于鼠RON多肽或其片段优先地结合至人类RON多肽或其片段。
在一些实施方案中，上述的抗体或其片段结合至细胞表面上表达的RON。在另外的实施方案中，所述细胞是恶性细胞、赘生性细胞、肿瘤细胞、转移性细胞或肿瘤相关巨噬细胞。
在一些实施方案中，上述的抗体或其片段阻断MSP与RON结合。
在一些实施方案中，上述的抗体或其片段抑制MSP依赖性RON活化。
在一些实施方案中，上述的抗体或其片段抑制非MSP依赖性RON活化。
在一些实施方案中，上述的抗体或其片段抑制RON介导的RAS/MAPK信号传导途径的活化。
在一些实施方案中，上述的抗体或其片段抑制RON介导的ERK或AKT的磷酸化。
在一些实施方案中，上述的抗体或其片段抑制RON介导的细胞增殖、肿瘤细胞生长、肿瘤细胞迁移、肿瘤细胞侵入或肿瘤细胞转移。
在一些实施方案中，上述的抗体或其片段诱导凋亡。
在另外的实施方案中，上述的抗体或其片段还包含与其融合的异源性多肽。
在一些实施方案中，上述的抗体或其片段轭合于选自由以下组成的组的剂：细胞毒性剂、治疗剂、细胞抑制剂、生物毒素、前体药物、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药物剂、淋巴因子、异源性抗体或其片段、可检测标记、聚乙二醇(PEG)、和两种或两种以上任何所述剂的组合。在另外的实施方案中，所述细胞毒性剂选自由以下组成的组：放射性核素、生物毒素、酶促活性的毒素、细胞抑制性或细胞毒性治疗剂、前体药物、免疫活性的配体、生物反应调节剂、或者两种或两种以上任何所述细胞毒性剂的组合。在另外的实施方案中，所述可检测标记选自由以下组成的组：酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记、或者两种或两种以上任何所述可检测标记的组合。
在另外的实施方案中，本发明包括包含上述抗体或其片段和载体的组合物。
本发明的某些实施方案包括一种包含编码抗体VH多肽的核酸的分离的多核苷酸，其中所述VH多肽的氨基酸序列与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列至少90％相同：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：115、SEQ IDNO：125、SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：145；并且其中包含所述VH多肽的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。在另外的实施方案中，所述VH多肽的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：94、SEQ IDNO：115、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：145。
在某些实施方案中，编码所述VH多肽的核苷酸序列被优化以增加所述VH多肽的表达而不改变其氨基酸序列。在另外的实施方案中，所述优化包括识别和移除剪接供体位点和剪接受体位点和/或表达所述多核苷酸细胞的密码子使用的优化。在另外的实施方案中，所述核酸包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO：3、SEQ FD NO：13、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：63、SEQ IDNO：73、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：134和SEQ ID NO：144。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含编码抗体VL多肽的核酸的分离的多核苷酸，其中所述VL多肽的氨基酸序列与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列至少90％相同：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：120、SEQ IDNO：130、SEQ ID NO：140和SEQ ID NO：150；并且其中包含所述VL多肽的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。在另外的实施方案中，所述VL多肽的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：99、SEQ IDNO：120、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：140和SEQ ID NO：150。
在某些实施方案中，编码所述VL多肽的核苷酸序列被优化以增加所述VL多肽的表达而不改变其氨基酸序列。在另外的实施方案中，所述优化包括识别和移除剪接供体位点和剪接受体位点和/或表达所述多核苷酸细胞的密码子使用的优化。在另外的实施方案中，所述核酸包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：78、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：149。
在某些其它实施方案中，本发明提供一种包含编码抗体VH多肽的核酸的分离的多核苷酸，其中除了20个或更少的保守性氨基酸取代以外，所述VH多肽的氨基酸序列与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列相同：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：34、SEQID NO：44、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：135和SEQID NO：145；并且其中包含所述VH多肽的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含编码抗体VL多肽的核酸的分离的多核苷酸，其中除了20个或更少的保守性氨基酸取代以外，所述VL多肽的氨基酸序列与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列相同：SEQID NO：9、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：89、SEQ IDNO：99、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：140和SEQ IDNO：150；并且其中包含所述VL多肽的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含编码VH-CDR1氨基酸序列的核酸的分离的多核苷酸，其中除了两个或更少的氨基酸取代以外，所述VH-CDR1氨基酸序列与选自由以下组成的组的参考VH-CDR1氨基酸序列相同：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：75、SEQ IDNO：85、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：136和SEQ ID NO：146；并且其中包含所述VH-CDR1的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。在另外的实施方案中，所述VH-CDR1氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：116、SEQID NO：126、SEQ ID NO：136和SEQ ID NO：146。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含编码VH-CDR2氨基酸序列的核酸的分离的多核苷酸，所述VH-CDR2氨基酸序列除了四个或更少的氨基酸取代以外，与选自由以下组成的组的参考VH-CDR2氨基酸序列相同：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：36、SEQID NO：46、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：147；并且其中包含所述VH-CDR2的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。在另外的实施方案中，所述VH-CDR2氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：66、SEQ IDNO：76、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：147。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含编码VH-CDR3氨基酸序列的核酸的分离的多核苷酸，所述VH-CDR3氨基酸序列除了四个或更少的氨基酸取代以外，与选自由以下组成的组的参考VH-CDR3氨基酸序列相同：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：37、SEQID NO：47、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：138和SEQ ID NO：148；并且其中包含所述VH-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。在另外的实施方案中，所述VH-CDR3氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：67、SEQ IDNO：77、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：138和SEQ ID NO：148。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含编码VL-CDR1氨基酸序列的核酸的分离的多核苷酸，所述VL-CDR1氨基酸序列除了四个或更少的氨基酸取代以外，与选自由以下组成的组的参考VL-CDR1氨基酸序列相同：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：80、SEQ IDNO：90、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：131、SEQ FD NO：141和SEQ ID NO：151；并且其中包含所述VL-CDR1的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。在另外的实施方案中，所述VL-CDR1氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：121、SEQID NO：131、SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：151。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含编码VL-CDR2氨基酸序列的核酸的分离的多核苷酸，所述VL-CDR2氨基酸序列除了两个或更少的氨基酸取代以外，与选自由以下组成的组的参考VL-CDR2氨基酸序列相同：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：81、SEQ IDNO：91、SEQ ID NO：101；SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：142和SEQ ID NO：152；并且其中包含所述VL-CDR2的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。在另外的实施方案中，所述VL-CDR2氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：122、SEQID NO：132、SEQ ID NO：142和SEQ ID NO：152。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含编码VL-CDR3氨基酸序列的核酸的分离的多核苷酸，所述VL-CDR3氨基酸序列除了四个或更少的氨基酸取代以外，与选自由以下组成的组的参考VL-CDR3氨基酸序列相同：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：82、SEQ IDNO：92、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：153；并且其中包含所述VL-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。在另外的实施方案中，所述VL-CDR3氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：123、SEQID NO：133、SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：153。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含编码抗体VH多肽的核酸的分离的多核苷酸，其中所述VH多肽包含选自由以下组成的组的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：5、6和7；SEQ ID NO：15、16和17；SEQ ID NO：25、26和27；SEQ ID NO：35、36和37；SEQ ID NO：45、46和47；SEQ ID NO：55、56和57；SEQ ID NO：65、66和67；SEQ ID NO：75、76和77；SEQ ID NO：85、86和87；SEQID NO：95、96和97；SEQ ID NO：116、117和118；SEQ ID NO：126、127和128；SEQ ID NO：136、137和138；以及SEQ ID NO：146、147和148；并且其中包含所述VH-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含编码抗体VL多肽的核酸的分离的多核苷酸，其中所述VL多肽包含选自由以下组成的组的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：10、11和12；SEQ ID NO：20、21和22；SEQ ID NO：30、31和32；SEQ ID NO：40、41和42；SEQ ID NO：50、51和52；SEQ ID NO：60、61和62；SEQ ID NO：70、71和72；SEQ ID NO：80、81和82；SEQ ID NO：90、91和92；SEQID NO：100、101和102；SEQ ID NO：121、122和123；SEQ ID NO：131、132和133；SEQ ID NO：141、142和143；以及SEQ ID NO：151、152和153；并且其中包含所述VL-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。
在一些实施方案中，上述的多核苷酸还包含编码融合于所述抗体VH多肽或所述抗体VL多肽的信号肽的核酸。
在某些其它实施方案中，上述的多核苷酸还包含编码融合于所述VH多肽的重链恒定区CH1结构域、编码融合于所述VH多肽的重链恒定区CH2结构域、编码融合于所述VH多肽的重链恒定区CH3结构域、或编码融合于所述VH多肽的重链铰链区的核酸。在另外的实施方案中，所述重链恒定区选自由人类IgG4、IgG4agly、IgG1或IgG1agly组成的组。
在一些实施方案中，上述的多核苷酸包含编码融合于所述VL多肽的轻链恒定区结构域的核酸。在另外的实施方案中，所述轻链恒定区是人类κ。
在上述多核苷酸的各种实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段特异性地结合与选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10和M80-B03组成的组的参考单克隆Fab抗体片段或选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的参考单克隆抗体相同的RON表位。
在上述多核苷酸的各种其它实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段竞争性地抑制选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的参考单克隆Fab抗体片段或选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的参考单克隆抗体。
在上述多核苷酸的各种实施方案中，除了五个或更少的氨基酸取代以外，所述VH多肽或所述VL多肽的构架区是人类的。
在上述多核苷酸的各种实施方案中，本发明提供一种包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段，其结合于线性表位或非线性构象表位。
在上述多核苷酸的各种实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是多价的，并包含至少两条重链和至少两条轻链。
在上述多核苷酸的某些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是多特异性的。在另外的实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是双特异性的。
在上述多核苷酸的各种实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段包含为完全人类的重链和轻链可变结构域。在另外的实施方案中，重链和轻链可变结构域与选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E 12组成的组的单克隆Fab抗体片段的重链和轻链可变结构域相同。
在上述多核苷酸的各种实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段包含为鼠的重链和轻链可变结构域。在另外的实施方案中，重链和轻链可变结构域与选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的单克隆抗体的重链和轻链可变结构域相同。
在上述多核苷酸的各种实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是人源化的。
在上述多核苷酸的各种实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是灵长源化的。
在上述多核苷酸的各种实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
在上述多核苷酸的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是完全人类的。
在上述多核苷酸的各种实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是Fab片段、Fab’片段、F(ab)2片段或FV片段。在上述多核苷酸的某些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是单链抗体。
在上述多核苷酸的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段以解离常数(KD)所表征的亲和力特异性地结合至RON多肽或其片段、或RON变体多肽，所述解离常数(KD)不大于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M。
在上述多核苷酸的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段相对于鼠RON多肽或其片段优先地结合至人类RON多肽或其片段。
在上述多核苷酸的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段结合于细胞表面上表达的RON。在另外的实施方案中，所述细胞是恶性细胞、赘生性细胞、肿瘤细胞或转移性细胞。
在上述多核苷酸的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段阻断MSP与RON结合。
在上述多核苷酸的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制MSP依赖性RON活化。
在上述多核苷酸的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制非MSP依赖性RON活化。
在上述多核苷酸的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制Ras/MAPK信号传导途径的活化。
在上述多核苷酸的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制RON介导的ERK的磷酸化。
在上述多核苷酸的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制RON介导的细胞增殖或肿瘤细胞生长。
在上述多核苷酸的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段诱导凋亡。
在一些实施方案中，上述的多核苷酸还包含编码异源性多肽的核酸。
在上述多核苷酸的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段轭合于选自由以下组成的组的剂：细胞毒性剂、治疗剂、细胞抑制剂、生物毒素、前体药物、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药物制剂、淋巴因子、异源性抗体或其片段、可检测标记、聚乙二醇(PEG)、以及两种或两种以上任何所述剂的组合。在另外的实施方案中，所述细胞毒性剂选自由以下组成的组：放射性核素、生物毒素、酶促活性的毒素、细胞抑制性或细胞毒性治疗剂、前体药物、免疫活性的配体、生物反应调节剂、或者两种或两种以上任何所述细胞毒性剂的组合。在某些其它实施方案中，所述可检测标记选自由以下组成的组：酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记、或者两种或两种以上任何所述可检测标记的组合。
在一些实施方案中，本发明提供包含上述的多核苷酸的组合物。
在某些其它实施方案中，本发明提供包含上述的多核苷酸的载体。在另外的实施方案中，所述多核苷酸可操作地与启动子缔合。在另外的实施方案中，本发明提供包含这样的载体的宿主细胞。在另外的实施方案中，本发明提供其中多核苷酸可操作地与启动子缔合的载体。
在另外的实施方案中，本发明提供产生特异性地结合RON的抗体或其片段的方法，包括培养含有包含上述的多核苷酸的载体的宿主细胞，并回收所述抗体或其片段。在另外的实施方案中，本发明提供由上述方法产生的分离的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供由上述的多核苷酸编码的分离的多肽。
在上述多肽的另外的实施方案中，包含所述多肽的抗体或其片段特异性地结合至RON。其它实施方案包括包含上述多肽的分离的抗体或其片段。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含分离的VH编码多核苷酸和分离的VL编码多核苷酸的组合物，其中所述VH编码多核苷酸和所述VL编码多核苷酸分别包括编码与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的核酸：SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：9；SEQ IDNO：14和SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：49；SEQ ID NO：54和SEQID NO：59；SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：69；SEQ ID NO：74和SEQ IDNO：79；SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：89；SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：99；SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：130；SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：140；以及SEQ ID NO：145和SEQ IDNO：150；并且其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段特异性地结合RON。在另外的实施方案中，所述VH编码多核苷酸和所述VL编码多核苷酸分别包括编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：19；SEQ IDNO：24和SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：49；SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：59；SEQ ID NO：64和SEQID NO：69；SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：79；SEQ ID NO：84和SEQ IDNO：89；SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：99；SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：130；SEQ ID NO：135和SEQ IDNO：140；以及SEQ ID NO：145和SEQ ID NO：150。
在某些其它实施方案中，本发明提供一种包含分离的VH编码多核苷酸和分离的VL编码多核苷酸的组合物，其中所述VH编码多核苷酸和所述VL编码多核苷酸分别包括编码除了少于20个保守性氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列相同的氨基酸序列的核酸：SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：44和SEQID NO：49；SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：59；SEQ ID NO：64和SEQ IDNO：69；SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：79；SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：89；SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：99；SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；SEQID NO：125和SEQ ID NO：130；SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：140；以及SEQ ID NO：145和SEQ ID NO：150；并且其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段特异性地结合RON。
在另外的实施方案中，所述VH编码多核苷酸编码包含选自由以下组成的组的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列的VH多肽：SEQID NO：5、6和7；SEQ ID NO：15、16和17；SEQ ID NO：25、26和27；SEQ ID NO：35、36和37；SEQ ID NO：45、46和47；SEQ ID NO：55、56和57；SEQ ID NO：65、66和67；SEQ ID NO：75、76和77；SEQ ID NO：85、86和87；SEQ ID NO：95、96和97；SEQ ID NO：116、117和118；SEQ ID NO：126、127和128；SEQ ID NO：136、137和138；以及SEQ IDNO：146、147和148；其中所述VL编码多核苷酸编码包含选自由以下组成的组的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列的VL多肽：SEQID NO：10、11和12；SEQ ID NO：20、21和22；SEQ ID NO：30、31和32；SEQ ID NO：40、41和42；SEQ ID NO：50、51和52；SEQ ID NO：60、61和62；SEQ ID NO：70、71和72；SEQ ID NO：80、81和82；SEQ ID NO：90、91和92；SEQ ID NO：100、101和102；SEQ ID NO：121、122和123；SEQ ID NO：131、132和133；SEQ ID NO：141、142和143；以及SEQ IDNO：151、152和153；并且其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段特异性地结合RON。
在上述组合物的各种实施方案中，所述VH编码多核苷酸还包含编码融合于所述抗体VH多肽的信号肽的核酸。
在上述组合物的各种实施方案中，所述VL编码多核苷酸还包含编码融合于所述抗体VL多肽的信号肽的核酸。
在上述组合物的一些实施方案中，所述VH编码多核苷酸还包含编码融合于所述VH多肽的重链恒定区CH1结构域的核酸，还包含编码融合于所述VH多肽的重链恒定区CH2结构域的核酸，还包含编码融合于所述VH多肽的重链恒定区CH3结构域的核酸，或者还包含编码融合于所述VH多肽的重链铰链区的核酸。在另外的实施方案中，所述重链恒定区选自由人类IgG4、IgG4agly、IgG1和IgG1agly组成的组。
在上述组合物的一些实施方案中，所述VL编码多核苷酸还包含编码融合于所述VL多肽的轻链恒定区结构域的核酸。在另外的实施方案中，所述轻链恒定区是人类κ。
在上述组合物的一些实施方案中，由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段特异性地结合与选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的参考单克隆Fab抗体片段或选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的参考单克隆抗体相同的RON表位。
在上述组合物的一些实施方案中，由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段竞争性地抑制选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的参考单克隆Fab抗体片段或选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的参考单克隆抗体与RON结合。
在上述组合物的一些实施方案中，除了五个或更少的氨基酸取代以外，所述VH和VL多肽的构架区是人类的。
在上述组合物的一些实施方案中，由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段结合于线性表位或非线性构象表位。
在上述组合物的一些实施方案中，由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段是多价的，并且包含至少两条重链和至少两条轻链。
在上述组合物的一些实施方案中，由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段是多特异性的。在另外的实施方案中，由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段是双特异性的。
在上述组合物的一些实施方案中，由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段包含为完全人类的重链和轻链可变结构域。在另外的实施方案中，所述重链和轻链可变结构域与选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的单克隆Fab抗体片段的重链和轻链可变结构域相同。
在上述组合物的一些实施方案中，由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段包含为鼠的重链和轻链可变结构域。在另外的实施方案中，所述重链和轻链可变结构域与选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的单克隆抗体的重链和轻链可变结构域相同。
在上述组合物的各种实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是人源化的。
在上述组合物的各种实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是灵长源化的。
在上述组合物的各种实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
在上述组合物的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是完全人类的。
在上述组合物的各种实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是Fab片段、Fab’片段、F(ab)2片段或Fv片段。在上述组合物的某些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是单链抗体。
在上述组合物的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段以解离常数(KD)表征的亲和力特异性地结合至RON多肽或其片段、或RON变体多肽，其中所述解离常数(KD)不大于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M。
在上述组合物的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段相对于鼠RON多肽或其片段优先地结合至人类RON多肽或其片段。
在上述组合物的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段结合至细胞表面上表达的RON。在另外的实施方案中，所述细胞是恶性细胞、赘生性细胞、肿瘤细胞、转移性细胞或肿瘤相关巨噬细胞。
在上述组合物的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段阻断MSP与RON结合。
在上述组合物的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制MSP依赖性RON活化。
在上述组合物的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制非MSP依赖性RON活化。
在上述组合物的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制Ras/MAPK信号传导途径的活化。
在上述组合物的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制RON介导的ERK或AKT的磷酸化。
在上述组合物的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制RON介导的细胞增殖、肿瘤细胞生长、肿瘤细胞迁移、肿瘤细胞侵入或肿瘤细胞转移。
在上述组合物的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段诱导凋亡。
在上述组合物的一些实施方案中，所述VH编码多核苷酸、所述VL编码多核苷酸、或所述VH和VL编码多核苷酸二者还包含编码异源性多肽的核酸。
在上述组合物的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段轭合于选自由以下组成的组的剂：细胞毒性剂、治疗剂、细胞抑制剂、生物毒素、前体药物、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药物制剂、淋巴因子、异源性抗体或其片段、可检测标记、聚乙二醇(PEG)、以及两种或两种以上任何所述剂的组合。在另外的实施方案中，所述细胞毒性剂选自由以下组成的组：放射性核素、生物毒素、酶促活性的毒素、细胞抑制性或细胞毒性治疗剂、前体药物、免疫活性的配体、生物反应调节剂、或者两种或两种以上任何所述细胞毒性剂的组合。在某些其它实施方案中，所述可检测标记选自由以下组成的组：酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记、或者两种或两种以上任何所述可检测标记的组合。
在上述组合物的一些实施方案中，所述VH编码多核苷酸包含在第一载体上且所述VL编码多核苷酸包含在第二载体上。在另外的实施方案中，所述VH编码多核苷酸可操作地与第一启动子缔合且所述VL编码多核苷酸可操作地与第二启动子缔合。在某些其它实施方案中，所述第一启动子和所述第二启动子是相同启动子的拷贝。在另外的实施方案中，所述第一启动子和所述第二启动子是不相同的。
在上述组合物的各种实施方案中，所述第一载体和所述第二载体包含在单个宿主细胞中。
在上述组合物的某些其它实施方案中，所述第一载体和所述第二载体包含在分别的宿主细胞中。
在一些实施方案中，本发明提供一种产生特异性地结合RON的抗体或其片段的方法，包括培养上述的宿主细胞，并回收所述抗体或其片段。
在其它实施方案中，本发明提供一种产生特异性地结合RON的抗体或其片段的方法，包括共培养分别的宿主细胞，并回收所述抗体或其片段。在上述方法的另外的实施方案中，本发明提供组合所述VH编码多肽和VL编码多肽，并回收所述抗体或其片段。
在一些实施方案中，本发明提供由上述的方法产生的一种特异性地结合RON的抗体或其片段。
在一些实施方案中，本发明提供组合物，其中所述VH和VL编码多核苷酸在同一载体上，以及所述组合物所在的载体。
在上述载体的各种实施方案中，所述VH和VL编码多核苷酸各自可操作地与启动子缔合。
在上述载体的各种实施方案中，所述VH和VL编码多核苷酸在框内融合，从与其可操作地缔合的单个启动子共转录，并共翻译为单链抗体或其抗原结合片段。
在上述载体的各种实施方案中，所述VH和VL编码多核苷酸从与其可操作地缔合的单个启动子共转录，但分别翻译。在另外的实施方案中，所述载体还包括安放在所述VH编码多核苷酸与所述VL编码多核苷酸之间的IRES序列。在某些其它实施方案中，各自与分别的启动子可操作地缔合的所述编码VH的多核苷酸和所述编码VL的多核苷酸分别转录。在另外的实施方案中，所述分别的启动子是同一启动子的拷贝，或所述分别的启动子是不相同的。
在一些实施方案中，本发明提供包含上述载体的宿主细胞。
在其它实施方案中，本发明提供一种产生特异性地结合RON的抗体或其片段的方法，包括培养上述的宿主细胞，并回收所述抗体或其片段。
在一些实施方案中，本发明提供一种由上述的方法产生的特异性地结合RON的抗体或其片段。
在一些实施方案中，本发明提供一种治疗动物的过度增生性病症的方法，包括向需要治疗的动物施用包含以下组分的组合物：a)如上述的分离的抗体或片段；和b)药学上可接受的载体。在另外的实施方案中，所述过度增生性疾病或病症选自由癌症、赘生物、肿瘤、恶性肿瘤、或其转移组成的组。
在上述方法的各种实施方案中，所述抗体或其片段特异性地结合至恶性细胞表面上表达的RON。在另外的实施方案中，所述抗体或其片段对恶性细胞的结合导致所述恶性细胞的生长抑制。
在上述方法的各种实施方案中，所述抗体或其片段抑制RON磷酸化或抑制肿瘤细胞增殖。在另外的实施方案中，通过阻止或阻滞转移性生长而抑制肿瘤细胞增殖。
在上述方法的各种实施方案中，所述抗体或其片段抑制肿瘤细胞迁移。在另外的实施方案中，通过阻止或阻滞肿瘤向相邻组织扩散而抑制肿瘤细胞增殖。
在上述方法的各种实施方案中，所述过度增生性疾病或病症是位于以下位置的赘生物：前列腺、结肠、腹部、骨、乳房、消化系统、肝脏、胰、腹膜、肾上腺、甲状旁腺、垂体腺、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺、眼、头、颈、中枢神经系统、周围神经系统、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部、或泌尿生殖道。
在上述方法的各种实施方案中，所述过度增生性疾病是癌症，所述癌症选自由以下组成的组：上皮鳞状细胞癌、黑素瘤、白血病、骨髓瘤、胃癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌和头颈癌。在另外的实施方案中，所述癌症选自由胃癌、肾癌、脑癌、膀胱癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌组成的组。
在上述方法的各种实施方案中，所述动物是哺乳动物。在另外的实施方案中，所述哺乳动物是人类。
附图说明
图1显示与SW480细胞结合的抗体的代表性FACS结合曲线。
图2A和2B显示单克隆鼠抗RON抗体和人类单克隆抗RON Fab对MSP与RON结合的作用。
图3A-3C显示抗RON抗体对MB-453乳腺癌细胞和BxPC-3胰腺癌细胞中MSP引起的RON磷酸化的作用。
图4A-C显示抗RON抗体对过表达野生型RON的293细胞、表达RON的组成型活化的激酶结构域突变体的细胞和BxPC-3胰腺细胞中非MSP依赖性RON信号传导的作用。
图5显示抗RON抗体对BxPC3和MDA-MB-453肿瘤细胞中pAKT磷酸化的作用。
图6显示与表达人类RON剪接变体RONδ160的细胞结合的抗体的FACS结合曲线。
图7显示测量RON抗体对可溶性RON的结合的ELISA测定结果。
图8显示与表达RON的293细胞结合的抗体的FACS结合曲线。
图9是描绘测量与表达RON的CHO细胞结合的抗体的FACS测定结果的条形图。
图10显示用RON抗体处理的肿瘤细胞中ERK和磷酸-ERK的蛋白质印迹。该条形图显示利用抗体1P3B2.2获得的蛋白质印迹中的结果定量。
图11A显示用RON抗体处理的肿瘤细胞中AKT和磷酸-AKT的蛋白质印迹。图11B描绘条形图，显示利用抗体1P3B2.2获得的蛋白质印迹中的结果定量。
图12显示未处理的、用对照抗体处理的、用MSP处理的、或用MSP和抗RON抗体处理的各种肿瘤细胞中磷酸-AKT和磷酸-ERK的蛋白质印迹。
图13A显示测量RON抗体与可溶性人类RON和cyno RON的结合的ELISA测定结果。图13B和13C显示测量人类MSP与可溶性人类RON(图13C)和cyno(图13B)RON的结合的ELISA结果。
图14A-C显示利用HT1080和HT1080-RON(图14A)、AGS(图14B)和MDA-MB-231(图14C)细胞系的肿瘤细胞侵入测定结果。较高的条表示增加的细胞侵入。
图15显示测量RON抗体对可溶性人类RON(Sema和PSI结构域)和RON的PSI结构域的结合的ELISA测定结果。
图16显示抗鼠RON抗体结合至表达鼠RON的293细胞的FACS结合曲线。
图17A显示表达鼠RON的且用抗鼠RON抗体处理的CHO细胞中AKT和磷酸-AKT的蛋白质印迹。图17B显示其定量。
图18A-B显示抗鼠RON抗体和抗人类RON抗体与表达鼠RON蛋白(图18A)或人类(图18B)RON蛋白的293细胞结合的FACS结合曲线。
图19是显示在各种癌症细胞类型中RON表达水平和磷酸-ERK与磷酸-AKT的增加的表格。
图20显示展示施用了肿瘤细胞并用抗RON抗体治疗的SCID小鼠中肿瘤大小的图。箭头表示施用抗体的时间点。
发明详述
I.定义
注意：术语“一个”实体是指一个或多个该实体；例如“RON抗体”理解为表示一个或多个RON抗体。像这样，术语“一个)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换地使用。
如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且指的是由被酰胺键(也被称作肽键)以线状连接的单体(氨基酸)所组成的分子。术语“多肽”是指含两个或更多个氨基酸的任何链，并且不是指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、低聚肽、“蛋白”、“氨基酸链”或用来指两个或更多个氨基酸的链的任何其它术语被包括在“多肽”的定义之中，而且术语“多肽”可替代这些术语中的任何一个使用或者可与这些术语中的任何一个互换地使用。术语“多肽”也意指多肽的表达后修饰的产物，所述修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、由已知的保护/封端基团进行的衍生作用、蛋白酶剪切或由非天然存在的氨基酸进行的修饰。多肽可由天然生物来源得到或由重组技术产生，但不一定是从指定的核酸序列翻译而来。它能够以任何方式产生，包括通过化学合成。
本发明的多肽可以具有大约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个或者2,000个或更多个氨基酸的大小。多肽可具有确定的三维结构，虽然它们不一定具有这种结构。具有确定的三维结构的多肽被称为是折叠的，而不具有确定的三维结构的多肽反而能够采用大量不同构象并且被称为是未折叠的。如本文所用，术语糖蛋白是指与至少一个碳水化合物部分偶联的蛋白，其中所述碳水化合物部分是通过氨基酸残基例如丝氨酸残基或天冬酰胺残基的含氧或含氮侧链连接至蛋白的。
“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物意为不处于其天然环境的多肽。不需要特定水平的纯化。例如，分离的多肽可从其天生的或天然的环境中取出。表达在宿主细胞中的重组产生的多肽和蛋白被认为是为了本发明的目的而分离的，就像已通过任何适合的技术而分离、分馏或者部分地或基本上纯化的天生或重组多肽一样。
本发明的多肽还包括前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体及其任意组合。当指本发明的RON抗体或抗体多肽时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括保留相应的天然抗体或多肽的至少一些抗原结合特性的任何多肽。本发明多肽的片段包括蛋白酶解片段以及缺失片段，另外还包括本文在别处所讨论的具体抗体片段。本发明的RON抗体和抗体多肽的变体包括上述的片段，并且还包括含有由于氨基酸取代、缺失或插入所致的氨基酸序列改变的多肽。变体可天然地存在或非天然地存在。可以使用领域已知的诱变技术产生非天然地存在的变体。变体多肽可包括保守的或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。本发明的RON抗体和抗体多肽的衍生物是已被改变以表现未见于天然多肽的其它特征的多肽。实例包括融合蛋白。变体多肽在本文还称为“多肽类似物”。如本文所用，RON抗体或抗体多肽的“衍生物”是指具有通过功能侧基的反应而化学衍生出的一个或多个残基的主题多肽。还包括为“衍生物”的是包含二十种标准氨基酸的一种或多种自然产生的氨基酸衍生物的肽。例如，4-羟基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；以及鸟氨酸可以取代赖氨酸。
术语“多核苷酸”旨在涵盖单数的核酸以及复数的核酸，并且是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包括常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如酰胺键，像在肽核酸(PNA)中发现的)。术语“核酸”是指任何一个或多个核酸区段，例如存在于多核苷酸中的DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸是指从其天生环境被取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，为了本发明的目的，包含在载体中的编码RON抗体的重组多核苷酸被视为分离的。分离的多核苷酸的另外的实例包括被保持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的(部分地或基本上)纯化的多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括通过合成而产生的那些分子。另外，多核苷酸或核酸可以是调节元件或者可以包括调节元件，例如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
如本文所用，“编码区”是由翻译为氨基酸的密码子所组成的核酸分子的一部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译为氨基酸，但它可被视为编码区的一部分，然而任何旁侧序列例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子以及诸如此类不是编码区的一部分。本发明的两个或多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中例如在单个载体上，或者在分别的多核苷酸构建体中例如在分别的(不同的)载体上。此外，任何载体可含有单个编码区，或者可包括两个或更多编码区，例如单个载体可分别编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。另外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源性编码区，所述异源性编码区被融合或未被融合至编码RON抗体或其片段、变体或衍生物的核酸。异源性编码区包括但不限于专门的元件或模体，例如分泌信号肽或异源性功能域。
在某些实施方案中，所述多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，包括编码多肽的核酸在内的多核苷酸通常可包含与一个或多个编码区可操作地缔合的启动子和/或其它转录或翻译控制元件。可操作的缔合是指基因产物例如多肽的编码区以这样一种方式与一个或多个调节序列相缔合以将该基因产物的表达置于所述一个或多个调节序列的影响或控制之下。两个DNA片段(例如多肽编码区和与之相缔合的启动子)是“可操作地缔合的”，如果启动子功能的诱导导致编码期望的基因产物的mRNA的转录并且如果这两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导该基因产物的表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力的话。因此，可将启动子区与编码多肽的核酸可操作地缔合，如果所述启动子能够实现该核酸的转录。所述启动子可以是只在预先确定的细胞中指导DNA的大量转录的细胞特异性启动子。除了启动子之外的其它转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻抑物和转录终止信号，能够与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。适合的启动子和其它转录控制区公开在本文中。
本领域技术人员知道各种转录控制区。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，例如但不限于来自如下病毒的启动子和增强子区段：细胞巨化病毒(与内含子A一起的立即早期启动子)、猿猴病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(例如劳氏肉瘤病毒)。其它的转录控制区包括源自脊椎动物基因的那些，例如肌动蛋白、热激蛋白、牛生长激素和兔β-球蛋白，以及能够控制真核细胞中的基因表达的其它序列。另外的适合的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子诱导的启动子(例如可被干扰素或白细胞介素诱导的启动子)。
相似地，各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始密码子和终止密码子以及源自微小RNA病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES，其也被称作CITE序列)。
在其它的实施方案中，本发明的多核苷酸是RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可与编码分泌肽或信号肽的另外的编码区相缔合，其中所述分泌肽或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白具有信号肽或分泌前导序列，其在生长中的蛋白链跨粗面内质网输出被启动时从成熟蛋白上被切下。本领域普通技术人员知道，由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有融合至所述多肽N端的信号肽，其从完整的或“全长”的多肽被切下以产生分泌的或“成熟的”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然的信号肽例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或者该序列的功能衍生物，所述功能性衍生物保持了指导与之可操作地缔合的多肽分泌的能力。或者，可以使用异源性哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，可以用人类组织纤溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸酶的前导序列取代野生型前导序列。
本发明还涉及某些RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物。除非具体地指原尺寸的抗体诸如自然产生的抗体，否则术语“RON抗体”涵盖原尺寸的抗体以及这样的抗体的抗原结合片段、变体、类似物或衍生物，例如，以类似于抗体分子的方式结合抗原的天然产生的抗体或免疫球蛋白分子或改造的抗体分子或片段。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中被互换地使用。抗体或免疫球蛋白至少包含重链的可变结构域，并且通常至少包含重链和轻链的可变结构域。脊椎动物系统中基本的免疫球蛋白结构被理解得相对较好。参见，例如Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验手册)，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)。
下面将更详细地讨论到，术语“免疫球蛋白”包括可通过生物化学手段区别的各种广泛类别的多肽。本领域技术人员将理解，重链被分类为gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)以及它们中的一些亚类(例如，γ1-γ4)。此链的性质决定抗体的“类别”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等被很好地表征并已知给予功能专门化。这些类别和同种型的各自的修饰形式是可由技术人员鉴于本公开而容易辨别的，并且因此在本发明的范围内。所有的免疫球蛋白类别都清楚地在本发明的范围内，下面的讨论通常将针对免疫球蛋白分子的IgG类别。关于IgG，标准的免疫球蛋白分子包含两个分子量大约为23,000道尔顿的相同的轻链多肽和两个分子量为53,000-70,000的相同的重链多肽。这四条链通常被二硫键以“Y”构型连结，其中所述轻链支撑所述重链，其中所述重链从“Y”的口开始并延伸通过可变区。
轻链被分类为kappa或lambda(κ，λ)。每个重链类别可与κ或λ轻链结合。通常，轻链和重链互相以共价键相连，并且当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或基因工程改造的宿主细胞产生时，两条重链的“尾”部由共价的二硫键连接或非共价的连接相连。在重链中，氨基酸序列从处于Y构型叉端的N端向处于每条链底部的C端延伸。
轻链和重链均被划分成结构和功能同源的一些区域。术语“恒定”和“可变”是就功能而言使用的。就此而言，将理解轻链(VL)和重链(VH)部分的可变结构域均决定抗原的识别和特异性。相反地，轻链的恒定结构域(CL)和重链的恒定结构域(CH1、CH2或CH3)赋予重要的生物特性，诸如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区结构域的编号随着它们离抗原结合位点或抗体的氨基端更远而增加。N端部分是可变区，而在C端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。
如上指出，可变区允许抗体选择性地识别并特异性地结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VL结构域和VH结构域，或者多个互补决定区(CDR)的亚组联合形成定义三维抗原结合位点的可变区。这种四级抗体结构形成存在于Y每条臂末端的抗原结合位点。更具体地，抗原结合位点是由在每条VH和VL链上的三个CDR所定义的。在一些情况下，例如来源于骆驼科动物物种或根据骆驼科动物免疫球蛋白工程化的某些免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可以只由重链组成而不含轻链。参见，例如Hamers-Casterman等人，Nature 363：446-448(1993)。
在天然存在的抗体中，各抗原结合结构域中存在的六个“互补决定区”或“CDR”是当抗体采取它在水环境中的三维构型时被特定地设置以形成抗原结合结构域的短的、不连续的氨基酸序列。抗原结合结构域中余下的氨基酸显示较少的分子间差异性，称作“构架”区。构架区很大程度地采用β折叠构象而且CDR形成环，所述环连接β折叠结构并且在一些情况下形成β折叠结构的一部分。因此，构架区起到形成支架的作用，所述支架有助于通过链间非共价相互作用而将六个CDR置于正确的方向。由放置的CDR形成的抗原结合结构域确定与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。该互补的表面促进抗体与其同类表位的非共价结合。对任何给定的重链或轻链可变区，分别包含CDR和构架区的氨基酸可由本领域普通技术人员容易地识别，因为它们已被准确地界定(参见，“Sequence of Proteinsof Immunological Interest(免疫学上重要蛋白的序列)”Kabat，E.等人，美国卫生和服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，(1983)；以及Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196：901-917(1987)，其全文以引用的方式并入本文)。
在本领域中使用和/或公认术语的存在两种或两种以上定义的情况下，除非明确说明相反，否则如本文所用的术语的定义意为包括所有这样的含义。具体的实例是使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述见于重链和轻链多肽二者的可变区中的不连续抗原组合位点。这一特定区域已经描述在Kabat等人，美国卫生和服务部，“Sequence of Proteins of ImmunologicalInterest(免疫学上重要蛋白的序列)”(1983)和Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)，其以引用的方式并入本文，其中定义包括彼此比较时氨基酸残基的重叠或亚组。然而，应用任一种定义来指抗体或其变体的CDR意为在本文定义和使用的术语的范围之内。包含以上引用的参考文献定义的CDR的适当的氨基酸残基列在下表1中作为比较。包含特定CDR的准确残基数将依赖于CDR的序列和大小而变化。给出抗体的可变区氨基酸序列时，本领域技术人员可常规地确定哪些残基包含特定CDR。
表1.CDR定义1
  Kabat   Chothia
  VH CDR1   31-35   26-32
  VH CDR2   50-65   53-55
  VH CDR3   95-102   96-101
  VL CDR1   24-34   26-32
  VL CDR2   50-56   50-52
  VL CDR3   89-97   91-96
1表1中所有的CDR定义的编号是根据由Kabat等人阐明的编号协议(参见以下)。
Kabat等人还定义了可变结构域序列的编号系统，其适用于任何抗体。本领域普通技术人员可明确地将该“Kabat编号”系统指定给任何可变结构域序列而不依赖于除序列自身之外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指由Kabat等人，美国卫生和服务部，“Sequence of Proteins ofImmunological Interest(免疫学上重要蛋白的序列)”(1983)所阐述的编号系统。除非另外指出，否则提及本发明的RON抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中具体氨基酸残基位置的编号是根据Kabat编号系统。
在骆驼科动物物种中，称为VHH的重链可变区形成完整的抗原结合结构域。骆驼科动物VHH可变区与来源于常规抗体的可变区(VH)之间的主要差异包括：(a)与VHH中的对应区域相比，VH的轻链接触表面中疏水氨基酸更多，(b)VHH中CDR3更长，并且(c)VHH中CDR1与CDR3之间频繁出现二硫键。
本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括但不限于：多克隆的、单克隆的、多特异性的、人类的、人源化的、灵长源化的或嵌合的抗体，单链抗体，表位结合片段例如Fab、Fab’和F(ab’)2，Fd，Fv，单链Fv(scFv)，单链抗体，二硫键连接的Fv(sdFv)，包含VL或VH结构域的片段，由Fab表达文库产生的片段，以及抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对本文所公开的RON抗体的抗Id抗体)。ScFv分子是本领域中已知的并被描述在例如美国专利5,892,019中。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
包括单链抗体的抗体片段可包括单独的或与下面的整体或一部分组合的一个或多个可变区：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。本发明还包括抗原结合片段，其也包括一个或多个可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。本发明的抗体或其免疫特异性片段可以来自包括鸟和哺乳动物的任何动物来源。优选地，所述抗体是人类、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡的抗体。在另一个实施方案中，所述可变区可以是软骨鱼类(condricthoid)来源的(例如来自鲨鱼)。如本文所用，“人类”抗体包括具有人类免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，并且包括从人类免疫球蛋白文库或从转基因动物分离的抗体，其中所述转基因动物表达一种或多种人类免疫球蛋白且不表达内源性免疫球蛋白，如下文所述并且例如在Kucherlapati等人的美国专利第5,939,598号中。即使在抗体中进行氨基酸取代，人类抗体仍然是“人类”的。
如本文所用，术语“重链部分”包括来源于免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽包括以下中的至少一个：CH1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、或其变体或片段。例如，本发明所用的结合多肽可包括含有CH1结构域的多肽链；含有CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH2结构域的多肽链；含有CH1结构域和CH3结构域的多肽链；含有CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH3结构域的多肽链；或者含有CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。在另一个实施方案中，本发明的多肽包括含有CH3结构域的多肽链。此外，本发明所用的结合多肽可缺少CH2结构域的至少一部分(例如CH2结构域的全部或部分)。如上所述，本领域普通技术人员将理解，这些结构域(例如重链部分)可被修饰以使它们在氨基酸序列上不同于天然存在的免疫球蛋白分子。
在本文公开的某些RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物中，多聚体的一条多肽链的重链部分与所述多聚体的第二条多肽链上的那些相同。或者，本发明含有重链部分的单体是不相同的。例如，每个单体可包括不同的靶结合位点，形成例如双特异性抗体。
用于本文所公开的诊断方法和治疗方法的结合多肽的重链部分可来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可包括来源于IgG1分子的CH1结构域和来源于IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可包括部分来源于IgG1分子和部分来源于IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可包括部分来源于IgG1分子和部分来源于IgG4分子的嵌合铰链。
如本文所用，术语“轻链部分”包括来源于免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。优选地，所述轻链部分包括VL或CL结构域中的至少一个。
本文所公开的RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物可从它们识别或特异性结合的抗原的一个或多个表位或一个或多个部分方面来描述或说明，例如靶多肽(RON)。靶多肽与抗体的抗原结合结构域特异性相互作用的部分是“表位”或“抗原决定簇”。靶多肽可包括单个表位，但通常包括至少两个表位，并且可包括任何数目的表位，这取决于抗原的大小、构象和类型。此外，应该注意的是，靶多肽上的“表位”可以是非多肽元件或者包括非多肽元件，例如“表位”可包括碳水化合物侧链。
抗体的肽表位或多肽表位的最小尺寸被认为是大约4至5个氨基酸。肽或多肽表位优选地含有至少7个，更优选地至少9个并且最优选地在至少约15个和约30个氨基酸之间。因为CDR能识别处于三级形式的抗原性肽或多肽，所以含有一个表位的氨基酸不需要是连续的，并且在一些情况下甚至可以不在相同的肽链上。在本发明中，由本发明RON抗体所识别的肽或多肽表位含有具有至少4个、至少5个、至少6个、至少7个，更优选地至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个，或者在约15个和约30个之间的连续或不连续的RON氨基酸的序列。
所谓“特异性地结合”，它通常是指抗体通过其抗原结合结构域结合至表位，并且所述结合需要抗原结合结构域与表位之间的一定的互补性。根据此定义，当抗体通过其抗原结合结构域结合至表位比它与随机、无关表位结合更容易时，表述为抗体“特异性地结合”至该表位。本文使用术语“特异性”来限定某一抗体藉以结合至某一表位的相对亲和力。例如，可能认为抗体“A”对于给定表位比抗体“B”具有更高特异性，或抗体“A”可以被表述为以比其对相关的表位“D”更高的特异性结合至表位“C”。
所谓“优先地结合”，它是指抗体特异性地结合至表位比其结合至相关的、相似的、同源的或类似的表位更容易。因此，“优先地结合”至给定表位的抗体相比于其与相关表位的结合将更可能与该表位结合，即使这样的抗体可能与相关表位交叉反应。
通过非限制性示例的方式，如果抗体以小于其对第二表位的解离常数(KD)的KD结合第一表位，可认为该抗体优先地结合所述第一表位。在另一非限制性实例中，如果抗体以比它对第二表位的KD小至少一个数量级的亲和力结合第一表位，可认为该抗体优先地结合第一抗原。在另一非限制性实例中，如果抗体以比抗体对第二表位的KD小至少两个数量级的亲和力结合第一表位，可认为该抗体优先地结合第一表位。
在另一非限制性实例中，如果抗体以小于抗体对第二表位的解离速率(k(off))的k(off)结合第一表位，可认为该抗体优先地结合第一表位。在另一非限制性实例中，如果抗体以比它对第二表位的k(off)小至少一个数量级的亲和力结合第一表位，可认为该抗体优先地结合第一表位。在另一非限制性实例中，如果抗体以比它对第二表位的k(off)小至少两个数量级的亲和力结合第一表位，可认为该抗体优先地结合第一表位。
本文公开的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可描述为以小于或等于5×10-2sec-1、10-2sec-1、5×10-3sec-1或10-3sec-1的解离速率(k(off))结合本文公开的靶多肽或其片段或变体。更优选地，本发明的抗体可描述为以小于或等于5×10-4sec-1、10-4sec-1、5×10-5sec-1或10-5sec-15×10-6sec-1、10-6sec-1、5×10-7sec-1或10-7sec-1的解离速率(k(off))结合本文公开的靶多肽或其片段或变体。
本文公开的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可描述为以大于或等于103M-1sec-1、5×103M-1sec-1、104M-1sec-1或5×104M-1sec-1的结合速率(k(on))结合本文公开的靶多肽或其片段或变体。更优选地，本发明的抗体可描述为以大于或等于105M-1sec-1、5×105M-1sec-1、106M-1sec-1或5×106M-1sec-1或107M-1sec-1的结合速率(k(on))结合本文公开的靶多肽或其片段或变体。
如果抗体优先地结合给定表位的程度导致其在某种程度上阻碍了参考抗体与给定表位的结合，那么抗体被描述为竞争性地抑制参考抗体与给定表位的结合。可通过本领域熟知的任何方法来确定竞争性抑制，例如竞争ELISA测定。抗体可被描述为竞争性地抑制参考抗体与给定表位的结合至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。
如本文所用，术语“亲和力”是指单独表位与免疫球蛋白分子的CDR的结合强度的量度。参见，例如Harlow等人，Antibodies：A LaboratoryManual(抗体：实验手册)，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)中第27-28页。如本文所用，术语“亲合力”是指免疫球蛋白的群体与抗原之间形成的复合物的总的稳定性，也就是免疫球蛋白混合物与抗原的功能性结合强度。参见，例如Harlow第29-34页。亲合力与群体中单个免疫球蛋白与特定表位的亲和力还有免疫球蛋白和抗原的价二者有关。例如，二价的单克隆抗体与具有高度重复的表位结构的抗原如多聚体之间的相互作用将是高度亲合力的一种。
本发明的RON抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还可以从其交叉反应性方面描述或指明。如本文所用，术语“交叉反应性”是指对一种抗原有特异性的抗体与第二抗原反应的能力；是两种不同抗原性物质之间相关性的量度。因此，如果一种抗体结合至除了诱导其形成的表位之外的表位，则它是交叉反应性的。交叉反应性表位通常含有许多与诱导表位相同的互补结构特征，并且在一些情况下实际上可以比原先的表位适合得更好。
例如，某些抗体具有某些程度的交叉反应性，原因是它们结合相关的但不相同的表位，例如与参考表位具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、和至少50％同一性(如使用本领域已知的和本文所描述的方法计算)的表位。如果抗体不结合与参考表位有小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％以及小于50％同一性(如使用本领域已知的和本文所描述的方法计算)的表位，则可以表述为它具有很少的交叉反应性或没有交叉反应性。如果抗体不结合某一表位的任何其它类似物、直向同源物或同系物，它可被视为对该表位“高度特异性的”。
本发明的RON抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还可以从其对本发明的多肽的结合亲和力方面描述或指明。优选的结合亲和力包括具有小于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M的解离常数或Kd的结合亲和力。
本发明的RON抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以是“多特异性的”，如双特异性的、三特异性的或更大的多特异性，表示其同时识别并结合至一个或多个不同抗原(如，蛋白)上存在的两个或多个不同表位。因此，RON抗体是“单特异性的”或“多特异性的”，如“双特异性的”，是指结合多肽与之反应的不同表位的数目。多特异性的抗体对本文所述的靶多肽不同表位可以是特异性的，或对靶多肽以及对异源性表位诸如异源性多肽或固态支持材料可以是特异性的。
如本文所用，术语“价”是指在RON抗体、结合多肽或抗体中存在的可能的结合结构域如抗原结合结构域的数目。每种结合结构域特异性地结合一种表位。当RON抗体、结合多肽或抗体包括多于一个结合结构域时，每个结合结构域可特异性地结合相同表位，对于具有两个结合结构域的抗体称为“二价单特异性”，或每个结合结构域可特异性地结合不同表位，对于具有两个结合结构域的抗体称为“二价双特异性的”。抗体对于每种特异性还可以是双特异性和二价的(称为“双特异性的四价抗体”)。在另一实施方案中，可制备四价微型抗体(minibody)或结构域缺失的抗体。
双特异性的二价抗体以及制备它们的方法描述在例如美国专利第5,731,168、5,807,706、5,821,333号以及美国申请公布第2003/020734和2002/0155537号中，其所有公开内容以引用的方式并入本文。双特异性的四价抗体以及制备它们的方法描述在例如WO 02/096948和WO 00/44788中，其所有公开内容以引用的方式并入本文。通常参见PCT公布WO93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等人，J.Immunol.147：60-69(1991)；美国专利第4,474,893、4,714,681、4,925,648、5,573,920、5,601,819号；Kostelny等人，J.Immunol.148：1547-1553(1992)。
如之前指出的，各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚基结构和三维构型是公知的。如本文所用，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基端可变结构域，并且术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(最氨基端)恒定区结构域。所述CH1结构域与VH结构域邻近，并且是在免疫球蛋白重链分子铰链区的氨基端。
如本文所用，术语“CH2结构域”包括利用常规编号方案(残基244至360，Kabat编号系统；和残基231-340，EU编号系统；参见Kabat EA等人，同上)从抗体的约残基244至残基360延伸的重链分子的部分。CH2结构域在其不与另外的结构域紧密配对方面是独特的。相反地，两条N连接的支链碳水化合物链被放入完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。也被许多资料证明的是，CH3结构域从IgG分子的CH2结构域延伸到C端，并包括大约108个残基。
如本文所用，术语“铰链区”包括连接CH1结构域和CH2结构域的重链分子的部分。此铰链区包括大约25个残基并且是可弯曲的，因此其允许所述两个N端抗原结合区独立地移动。铰链区可被细分为三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域(Roux等人，J.Immunol.161：4083(1998))。
如本文所用，术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价健。氨基酸半胱氨酸包含一个巯基，可以与第二巯基形成二硫键或桥。在多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接，并且两个重链通过在对应于使用Kabat编号系统的239和242位(EU编号系统的226或229位)的两个二硫键连接。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指在其中免疫反应性区域或位点是从第一物种获得或衍生的，而恒定区(其可以是完整的、部分的或根据本发明而修饰的)是从第二物种获得的任何抗体。在优选的实施方案中，靶结合区域或位点将来自非人类来源(例如小鼠或灵长类)而恒定区是人类的。
如本文所用，术语“工程化的抗体”是指这样的抗体，在其中重链和轻链任意一个或二者的可变结构域被改变，所述改变是通过具有已知特异性的抗体的一个或多个CDR的至少部分的替换，并且如果必要，是通过部分的构架区替换和序列改变。虽然CDR可来源于与构架区所来源的抗体相同的类别或甚至亚类别的抗体，据设想，所述CDR将来源于不同类别的抗体并且优选地来源于不同物种的抗体。在本文中被称作“人源化的抗体”是工程化的抗体，在其中来自具有已知特异性的非人类抗体的一个或多个“供体”CDR被移植进人类重链或轻链构架区。用来自供体可变区的完整的CDR来替换所有CDR以将一个可变结构域的抗原结合能力转移至另一个可能不是必需的。相反地，可能只需转移对于维持靶结合位点的活性必要的那些残基。根据例如美国专利第5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370号中所述的解释，通过进行常规的实验或者试错测试(trial anderror testing)来获得功能性工程化的或人源化的抗体完全是在本领域技术人员的能力之内。
如本文所用，术语“适当地折叠的多肽”包括这样的多肽(例如RON抗体)，在其中包括所述多肽的所有功能性结构域都是明显地有活性的。如本文所用，术语“不适当地折叠的多肽”包括这样的多肽，在其中所述多肽的功能性结构域中的至少一个没有活性。在一个实施方案中，适当地折叠的多肽包括被至少一个二硫键连接的多肽链，并且相反地，不适当地折叠的多肽包括不被至少一个二硫键连接的多肽链。
如本文所用，术语“工程化的”包括通过合成手段(例如，通过重组技术、体外肽合成、通过肽的酶促或化学偶联，或者这些技术的组合)对核酸或多肽分子进行的操作。
如本文所用，术语“连接的”、“融合的”或者“融合”可以互换使用。这些术语是指通过包括化学轭合或重组手段在内的任何手段将两个以上的要素或成分联合到一起。“框内融合”是指将两个或两个以上的多核苷酸开放阅读框(ORF)连在一起形成一个连续的更长的ORF，连接方式保持原始ORF的正确翻译阅读框。因此，重组融合蛋白是含有两个或两个以上区段的单个蛋白，所述区段对应于由原始ORF编码的多肽(这些区段在自然界中正常不会那样连在一起)。虽然全部融合区段的阅读框被如此制成了连续的，这些区段可以被例如框架内连接序列在物理上或空间上分隔开。例如，编码免疫球蛋白可变区CDR的多核苷酸可被融合在框内但被编码至少一个免疫球蛋白构架区或另外的CDR区的多核苷酸分开，只要“融合的”CDR作为连续多肽的一部分而被共同翻译。
在多肽的背景下，“线性序列”或“序列”是处于氨基端到羧基端方向的多肽中氨基酸的顺序，其中序列中彼此相邻的残基在该多肽的一级结构中是连续的。
本文所用术语“表达”是指基因藉以产生生物化学产物例如RNA或多肽的一种过程。该过程包括对细胞中基因的功能性存在的任何表现，其包括但不限于基因敲减以及瞬时表达和稳定表达二者。它包括但不限于将基因转录成信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其它RNA产物，以及将这种mRNA翻译成一种或多种多肽。如果最终期望的产物是生物化学产物，那么表达包括该生物化学产物和任何前体的产生。基因的表达产生“基因产物”。如本文所用，基因产物可以是核酸(例如由基因转录产生的信使RNA)或者从转录物翻译而来的多肽。本文所述的基因产物还包括具有转录后修饰(例如多腺苷酸化)的核酸或者具有翻译后修饰的多肽，所述翻译后修饰为例如甲基化、糖基化、脂质的加入、与其它蛋白亚基缔合、蛋白酶剪切以及诸如此类。
如本文所用，术语“治疗”是指治疗学上的治疗和预防或防止的措施，其中目标是防止或延缓(减轻)不期望的生理改变或病症，例如癌症的发生或扩散。有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的缓解、疾病范围的减小、疾病的稳定(即不继续恶化的)状态、疾病演变的延迟或减缓、疾病状态的改善或减轻、以及缓和(部分的或完全的)，不论是可检测的或是不可检测的。“治疗”还可以指与不接受治疗时所预期的存活相比存活的延长。需要治疗的那些人包括已经具有病况或病症的那些人以及倾向于具有病况或病症的那些人或者其中病况或病症有待预防的那些人。
“受治疗者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指如下的任何受治疗者，特别是哺乳动物受治疗者：对其而言诊断、预后或治疗是期望的。哺乳动物受治疗者包括人类、家畜、农畜和动物园、体育或宠物动物，如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等等。
如本文所用，短语例如“将得益于结合分子的施用的受治疗者”和“需要治疗的动物”包括将得益于结合分子的施用和/或得益于使用特异性结合给定靶蛋白的结合分子的治疗(即减轻或防止疾病例如癌症)的受治疗者例如哺乳动物受治疗者，其中所述结合分子被用来例如检测被结合分子所识别的抗原(例如诊断程序)。如本文更详细描述的，结合分子能够以未轭合的形式使用或可被轭合至例如药物、前体药物或同位素。
所谓“过度增生性疾病或病症”是指所有赘生性细胞的生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，包括所有转化的细胞和组织以及所有的癌细胞和组织。过度增生性疾病或病症包括但不限于癌前病变、异常的细胞生长、良性肿瘤、恶性肿瘤和“癌症”。在本发明的某些实施方案中，过度增生性疾病或病症例如癌前病变、异常的细胞生长、良性肿瘤、恶性肿瘤或“癌症”包括表达、过度表达或异常表达RON的细胞。
过度增生性疾病、病症和/或病况的另外的例子包括但不限于赘生物，不论是良性的还是恶性的，其位于：前列腺、结肠、腹部、骨、乳房、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺体(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头颈、神经(中枢和周围)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸和泌尿生殖道。在某些实施方案中，这种赘生物表达、过度表达或异常表达RON。
其它的过度增生性病症包括但不限于：高γ球蛋白血症、淋巴增生性病症、病变蛋白血症、紫癜、肉样瘤病、塞扎里综合症、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、高歇氏病、组织细胞增生病以及除了位于上面所列器官系统中的赘生物之外的任何其它的过度增生性疾病。在本发明的某些实施方案中，疾病包括表达、过度表达或异常表达RON的细胞。
如本文所用，术语“肿瘤”或“肿瘤组织”是指由过度的细胞分裂所致的异常的组织块，在某些情况下组织包括表达、过度表达或异常表达RON的细胞。肿瘤或肿瘤组织包括“肿瘤细胞”，其为具有异常生长特性并且不具有有用的身体功能的赘生性细胞。肿瘤、肿瘤组织和肿瘤细胞可以是良性的或恶性的。肿瘤或肿瘤组织还可包括“肿瘤相关的非肿瘤细胞”，例如形成血管以供给肿瘤或肿瘤组织的血管细胞。可以通过肿瘤细胞来诱导非肿瘤细胞的复制和发育，例如诱导肿瘤或肿瘤组织中的血管生成。
如本文所用，术语“恶性肿瘤”是指非良性肿瘤或癌症。如本文所用，术语“癌症”意思就是一类过度增生性疾病，其包括特征为不受调节的或不受控制的细胞生长的恶性肿瘤。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更特别的例子被记录如下且包括：鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌的肺癌，腹膜癌，肝细胞癌，包括胃肠癌的胃癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，子宫颈癌，卵巢癌，肝癌(liver cancer)，膀胱癌，肝癌(hepatoma)，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾脏癌或肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌以及头颈癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如其细胞未迁移至除原始恶性肿瘤或肿瘤的位点之外的受治疗者身体中的位点的那些恶性细胞或肿瘤)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如由转移所引起的那些恶性细胞或肿瘤，所述转移是恶性细胞或肿瘤细胞向不同于原始肿瘤位点的二级位点的迁移)。有助于本发明的治疗方法的癌症包括表达、过度表达或异常表达RON的细胞。
癌症或恶性肿瘤的其它例子包括但不限于：儿童急性淋巴母细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞样白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞白血病、成人急性髓细胞样白血病、成人霍奇金氏病、成人霍奇金氏淋巴瘤、成人淋巴细胞白血病、成人非霍奇金氏淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、艾滋病相关的淋巴瘤、艾滋病相关的恶性肿瘤、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、子宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性淋巴母细胞白血病、儿童急性髓细胞样白血病、儿童脑干胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童颅外生殖细胞肿瘤、儿童霍奇金氏病、儿童霍奇金氏淋巴瘤、儿童下丘脑和视觉通路胶质瘤、儿童淋巴母细胞白血病、儿童髓母细胞瘤、儿童非霍奇金氏淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食道癌、尤因氏肉瘤和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳腺癌、高歇氏病、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠肿瘤、生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金氏病、霍奇金氏淋巴瘤、高γ球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波西氏肉瘤、肾脏癌、喉癌、唇及口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增生性病症、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移隐匿原发性鳞状颈癌(Metastatic Occult Primary SquamousNeck Cancer)、转移原发性鳞状颈癌、转移性鳞状颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物、骨髓增生异常综合征、骨髓性白血病、髓细胞性白血病、骨髓增殖性病症、鼻腔及鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、怀孕期间的非霍奇金氏淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、隐匿原发转移性鳞状颈癌、口咽癌、骨/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨骼的骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性度肿瘤、胰腺癌、病变蛋白血症、紫癜、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、浆细胞赘生物/多发性骨髓瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉样瘤病肉瘤、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、移行性肾盂和输尿管癌、滋养细胞肿瘤、输尿管和肾盂细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视觉通路和下丘脑胶质瘤、外阴癌、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、维尔姆斯氏肿瘤以及除了位于上面所列器官系统中的赘生物之外任何其它的过度增生性疾病。
本发明的方法可被用来治疗恶化前的状况并预防演变至赘生性或恶性状态，包括但不限于上述的那些病症。这种用途在已知的或被怀疑为前述的向瘤形成或癌症演变的状况中被指出，其中所述状况特别是在发生由增生、组织转化或最特别地发育异常所组成的非赘生性细胞生长的时候(关于这种异常生长状况的综述，参见Robbins和Angell，Basic Pathology(基础病理学)，第2版，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，第68-79页(1976))。其中细胞开始表达、过度表达或异常表达RON的这种状况可以特别地通过本发明的方法治疗。
增生是一种受控的细胞增殖形式，其包括组织或器官中细胞数量的增多，而不显著改变结构或功能。可以通过本发明的方法治疗的增生病症包括但不限于血管滤泡纵膈淋巴结的增生、血管淋巴样增生伴嗜酸性粒细胞增多、非典型的黑素细胞增生、基底细胞增生、良性巨大淋巴结增生、牙骨质增生、先天性肾上腺增生、先天性皮脂腺增生、囊性增生、乳腺囊性增生、义齿增生、导管增生、子宫内膜增生、纤维肌性增生、局灶性上皮增生、牙龈增生、炎性纤维增生、炎症性乳头状增生、血管内乳头状内皮增生、前列腺结节性增生、结节再生性增生、假性上皮瘤性增生、老年皮脂腺增生和疣状增生。
组织转化是一种受控的细胞生长形式，在其中一种类型的成年或完全分化的细胞代替另一种类型的成年细胞。可以通过本发明的方法治疗的组织转化病症包括但不限于特发性骨髓样组织转化、顶泌腺组织转化、非典型组织转化、自发实质性组织转化、结缔组织的组织转化、上皮组织转化、肠组织转化、组织转化性贫血、组织转化性骨化、组织转化性息肉、骨髓样组织转化、原发性骨髓样组织转化、继发性骨髓样组织转化、鳞状组织转化、羊膜的鳞状组织转化和症状性骨髓样组织转化。
发育异常经常是癌症的先兆，并且主要在上皮中被发现；它是非赘生性细胞生长的最无序的形式，包括个别细胞的均一性和细胞构造方向的丧失。发育异常的细胞常常具有异常巨大的、深度染色的核，并且显示多形现象。发育异常特征性地发生在存在慢性刺激或炎症之处。可以通过本发明的方法治疗的发育异常病症包括但不限于无汗性外胚层发育异常、前脸(anterofacial)发育异常、窒息性胸廓发育异常、心房手指发育异常、支气管肺发育异常、脑发育异常、宫颈发育异常、软骨外胚层发育异常、锁骨颅骨发育异常、先天性外胚层发育异常、颅骨骨干发育异常、颅腕跗发育异常、颅骨干骺端发育异常(craniometaphysial dysplasia)、牙本质发育异常、骨干发育异常、外胚层发育异常、釉质发育异常、脑-眼发育异常、半肢骨骺发育异常(dysplasia epiphysialis hemimelia)、多发性骨骺发育异常、点状骨骺发育异常、上皮发育异常、面指生殖器发育异常、家族性颌骨纤维性发育异常、家族性白色褶皱发育异常、纤维肌性发育异常、骨纤维发育异常、繁盛性骨发育异常、遗传性肾脏-视网膜发育异常、出汗性外胚层发育异常、少汗性外胚层发育异常、淋巴细胞减少性胸腺发育异常、乳腺发育异常、下颌面发育异常(mandibulofacial dysplasia)、干骺端发育异常、Mondini发育异常、单骨纤维发育异常、粘液上皮发育异常(mucoepithelial dysplasia)、多发性骨骺发育异常、眼耳脊椎发育异常、眼牙指发育异常、眼与脊椎发育异常、牙源性发育异常、眼下颌肢发育异常、根尖周牙骨质发育异常、多骨纤维性发育异常、假性软骨性脊柱骨骺发育异常、视网膜发育异常、视网中隔发育异常、脊柱骨骺发育异常和心室径向发育异常。
可以通过本发明的方法治疗的另外的瘤前病症包括但不限于良性增殖异常病症(例如良性肿瘤、纤维性囊肿病况、组织肥大、肠息肉、结肠息肉和食管发育异常)、粘膜白斑病、角化病、博温氏病(Bowen′s disease)、农民皮肤、日光性唇炎和日光性角化病。
在优选的实施方案中，本发明的方法用来抑制癌症的生长、演变和/或转移，特别是上面所列的那些。
另外的过度增生性疾病、病症和/或病况包括但不限于恶性肿瘤和相关病症的演变和/或转移，所述相关病症例如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病(其包括成髓细胞的、前髓细胞白血病、髓单核细胞白血病、单核细胞白血病和红白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链病和实体瘤，所述实体瘤包括但不限于肉瘤和癌瘤如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、肉皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯氏肿瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤(emangioblastoma)、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜母细胞瘤。
II.RON
天然产生的成熟RON(receptor d’origine nantais)是由较小的λ链和较大β链构成的异二聚体，它包括跨膜结构域和激酶结构域。这种成熟形式的RON通过裂解单链前体pro-RON而产生。裂解后，λ和β链经由二硫键保持缔合。
报道以下多肽序列为人类RON序列，在Genbank中具有登录号NP_002438。
人类RON(SEQ ID NO：1)：
MELLPPLPQSFLLLLLLPAKPAAGEDWQCPRTPYAASRDFDVKYVVPSF
SAGGLVQAMVTYEGDRNESAVFVAIRNRLHVLGPDLKSVQSLATGPAG
DPGCQTCAACGPGPHGPPGDTDTKVLVLDPALPALVSCGSSLQGRCFLH
DLEPQGTAVHLAAPACLFSAHHNRPDDCPDCVASPLGTRVTVVEQGQA
SYFYVASSLDAAVAASFSPRSVSIRRLKADASGFAPGFVALSVLPKHLVS
YSIEYVHSFHTGAFVYFLTVQPASVTDDPSALHTRLARLSATEPELGDYR
ELVLDCRFAPKRRRRGAPEGGQPYPVLRVAHSAPVGAQLATELSIAEGQ
EVLFGVFVTGKDGGPGVGPNSVVCAFPIDLLDTLIDEGVERCCESPVHPG
LRRGLDFFQSPSFCPNPPGLEALSPNTSCRHFPLLVSSSFSRVDLFNGLLG
PVQVTALYVTRLDNVTVAHMGTMDGRILQVELVRSLNYLLYVSNFSLG
DSGQPVQRDVSRLGDHLLFASGDQVFQVPIQGPGCRHFLTCGRCLRAW
HFMGCGWCGNMCGQQKECPGSWQQDHCPPKLTEFHPHSGPLRGSTRL
TLCGSNFYLHPSGLVPEGTHQVTVGQSPCRPLPKDSSKLRPVPRKDFVEE
FECELEPLGTQAVGPTNVSLTVTNMPPGKHFRVDGTSVLRGFSFMEPVLI
AVQPLFGPRAGGTCLTLEGQSLSVGTSRAVLVNGTECLLARVSEGQLLC
ATPPGATVASVPLSLQVGGAQVPGSWTFQYREDPVVLSISPNCGYINSHI
TICGQHLTSAWHLVLSFHDGLRAVESRCERQLPEQQLCRLPEYVVRDPQ
GWVAGNLSARGDGAAGFTLPGFRFLPPPHPPSANLVPLKPEEHAIKFEYI
GLGAVADCVGINVTVGGESCQHEFRGDMVVCPLPPSLQLGQDGAPLQV
CVDGECHILGRVVRPGPDGVPQSTLLGILLPLLLLVAALATALVFSYWW
RRKQLVLPPNLNDLASLDQTAGATPLPILYSGSDYRSGLALPAIDGLDST
TCVHGASFSDSEDESCVPLLRKESIQLRDLDSALLAEVKDVLIPHERVVT
HSDRVIGKGHFGVVYHGEYIDQAQNRIQCAIKSLSRITEMQQVEAFLRE
GLLMRGLNHPNVLALIGIMLPPEGLPHVLLPYMCHGDLLQFIRSPQRNPT
VKDLISFGLQVARGMEYLAEQKFVHRDLAARNCMLDESFTVKVADFGL
ARDILDREYYSVQQHRHARLPVKWMALESLQTYRFTTKSDVWSFGVLL
WELLTRGAPPYRHIDPFDLTHFLAQGRRLPQPEYCPDSLYQVMQQCWE
ADPAVRPTFRVLVGEVEQIVSALLGDHYVQLPATYMNLGPSTSHEMNV
RPEQPQFSPMPGNVRRPRPLSEPPRPT
已报道小鼠RON多肽具有以下序列，并且在Genbank中具有登录号NP_033100(SEQ ID NO：2)：
MGLPLPLLQSSLLLMLLLRLSAASTNLNWQCPRIPYAASRDFSVKYV
VPSFSAGGRVQATAAYEDSTNSAVFVATRNHLHVLGPDLQFIENLTT
GPIGNPGCQTCASCGPGPHGPPKDTDTLVLVMEPGLPALVSCGSTLQ
GRCFLHELEPRGKALHLAAPACLFSANNNKPEACTDCVASPLGTRVT
VVEQGHASYFYVASSLDPELAASFSPRSVSIRRLKSDTSGFQPGFPSLS
VLPKYLASYLIKYVYSFHSGDFVYFLTVQPISVTSPPSALHTRLVRLN
AVEPEIGDYRELVLDCHFAPKRRRRGAPEGTQPYPVLQAAHSAPVD
AKLAVELSISEGQEVLFGVFVTVKDGGSGMGPNSVVCAFPIYHLNILI
EEGVEYCCHSSNSSSLLSRGLDFFQTPSFCPNPPGGEASGPSSRCHYFP
LMVHASFTRVDLFNGLLGSVKVTALHVTRLGNVTVAHMGTVDGRV
LQVEIARSLNYLLYVSNFSLGSSGQPVHRDVSRLGNDLLFASGDQVF
KVPIQGPGCRHFLTCWRCLRAQRFMGCGWCGDRCDRQKECPGSWQ
QDHCPPEISEFYPHSGPLRGTTRLTLCGSNFYLRPDDVVPEGTHQITV
GQSPCRLLPKDSSSPRPGSLKEFIQELECELEPLVTQAVGTTNISLVIT
NMPAGKHFRVEGISVQEGFSFVEPVLTSIKPDFGPRAGGTYLTLEGQS
LSIATSRAALVNGTQCRLEQVNEEQILCVTPPGAGTARVPLHLQIGG
AEVPGSWTFHYKEDPIVLDISPKCGYSGSHIMIHGQHLTSAWHFTLSF
HDGQSTVESRCAGQFVEQQQRRCRLPEYVVRNPQGWATGNLSVWG
DGAAGFTLPGFRFLPPPSPLRAGLVELKPEEHSVKVEYVGLGAVADC
VTVNMTVGGEVCQHELRGDVVICPLPPSLQLGKDGVPLQVCVDGGC
HILSQVVRSSPGRASQRILLIALLVLILLVAVLAVALIFNSRRRKKQLG
AHSLSPTTLSDINDTASGAPNHEESSESRDGTSVPLLRTESIRLQDLDR
MLLAEVKDVLIPHEQVVIHTDQVIGKGHFGVVYHGEYTDGAQNQTH
CAIKSLSRITEVQEVEAFLREGLLMRGLHHPNILALIGIMLPPEGLPRV
LLPYMRHGDLLRFIRSPQRNPTVKDLVSFGLQVACGMEYLAEQKFV
HRDLAARNCMLDESFTVKVADFGLARGVLDKEYYSVRQHRHARLP
VKWMALESLQTYRFTTKSDVWSFGVLLWELLTRGAPPYPHIDPFDL
SHFLAQGRRLPQPEYCPDSLYHVMLRCWEADPAARPTFRALVLEVK
QVVASLLGDHYVQLTAAYVNVGPRAVDDGSVPPEQVQPSPQHCRST
SKPRPLSEPPLPT
本文所用的RON多肽结构域名称被定义如下：
表2.RON多肽结构域的实例
如本领域技术人员将理解的，所列的结构域的开始残基和结束残基可随着用于确定结构域的计算机建模程序或方法而不同。
已经识别了人类RON序列的一种变体RONδ160。RONδ160(p160)具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO：113)：
MELLPPLPQSFLLLLLLPAKPAAGEDWQCPRTPYAASRDFDVKYVVP
SFSAGGLVQAMVTYEGDRNESAVFVAIRNRLHVLGPDLKSVQSLAT
GPAGDPGCQTCAACGPGPHGPPGDTDTKVLVLDPALPALVSCGSSL
QGRCFLHDLEPQGTAVHLAAPACLFSAHHNRPDDCPDCVASPLGTR
VTVVEQGQASYFYVASSLDAAVAASFSPRSVSIRRLKADASGFAPGF
VALSVLPKHLVSYSIEYVHSFHTGAFVYFLTVQPASVTDDPSALHTR
LARLSATEPELGDYRELVLDCRFAPKRRRRGAPEGGQPYPVLQVAH
SAPVGAQLATELSIAEGQEVLFGVFVTGKDGGPGVGPNSVVCAFPID
LLDTLIDEGVERCCESPVHPGLRRGLDFFQSPSFCPNPPGLEALSPNTS
CRHFPLLVSSSFSRVDLFNGLLGPVQVTALYVTRLDNVTVAHMGTM
DGRILQVELVRSLNYLLYVSNFSLGDSGQPVQRDVSRLGDHLLFASG
DQVFQVPIQGPGCRHFLTCGRCLRAWHFMGCGWCGNMCGQQKECP
GSWQQDHCPPKLTEEPVLIAVQPLFGPRAGGTCLTLEGQSLSVGTSR
AVLVNGTECLLARVSEGQLLCATPPGATVASVPLSLQVGGAQVPGS
WTFQYREDPWLSISPNCGYINSHITICGQHLTSAWHLVLSFHDGLRA
VESRCERQLPEQQLCRLPEYVVRDPQGWVAGNLSARGDGAAGFTLP
GFRFLPPPHPPSANLVPLKPEEHAIKFEYIGLGAVADCVGINVTVGGE
SCQHEFRGDMVVCPLPPSLQLGQDGAPLQVCVDGECHILGRVVRPG
PDGVPQSTLLGILLPLLLLVAALATALVFSYWWRRKQLVLPPNLNDL
ASLDQTAGATPLPILYSGSDYRSGLALPAIDGLDSTTCVHGASFSDSE
DESCVPLLRKESIQLRDLDSALLAEVKDVLIPHERVVTHSDRVIGKGH
FGVVYHGEYIDQAQNRIQCAIKSLSRITEMQQVEAFLREGLLMRGLN
HPNVLALIGIMLPPEGLPHVLLPYMCHGDLLQFIRSPQRNPTVKDLIS
FGLQVARGMEYLAEQKFVHRDLAARNCMLDESFTVKVADFGLARD
ILDREYYSVQQHRHARLPVKWMALESLQTYRFTTKSDVWSFGVLL
WELLTRGAPPYRHIDPFDLTHFLAQGRRLPQPEYCPDSLYQVMQQC
WEADPAVRPTFRVLVGEVEQIVSALLGDHYVQLPATYMNLGPSTSH
EMNVRPEQPQFSPMPGNVRRPRPLSEPPRPT
本发明还涉及特异性地、优先地或竞争性地结合至非人类RON蛋白(例如来自于啮齿动物或非人类灵长类的RON)的RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物。
RON在大量肿瘤细胞中表达，包括但不限于以下的某些肿瘤细胞：乳腺癌(Camp等人.Ann.Surg.Oncol.12：273-281(2005))、结肠直肠癌、肺癌、卵巢癌、肝细胞癌、头颈鳞状细胞癌、甲状腺癌(Wang等人.Journalof Pathology 213：402-411(2007))、皮肤癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌(O’Toole等人.Cancer Research 66：9162-9710(2006))、肝癌和肾癌。
III.RON抗体
在一个实施方案中，本发明涉及RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物。例如，本发明至少包括表3和表4中显示的某些单克隆抗体、及其片段、变体和衍生物的抗原结合结构域。表3列出从噬菌体展示文库确定的人类抗RON Fab区。表4列出来源于杂交瘤的小鼠抗RON抗体。
表3：RON特异性人类Fab。
  Fab
  1   M14-H06
  2   M15-E10
  3   M16-C07
  4.   M23-F10
  5   M80-B03
  6   M93-D02
  7   M96-C05
  8   M97-D03
  9   M98-E12
表4：RON特异性鼠单克隆抗体。
Figure BPA00001230452800541
在2007年12月4日，将以下杂交瘤保存在Manassas，VA的美国典型培养物保藏中心(ATCC)：1.P2E7.3、1P3B2.2、1.P4A3.3、1.P4A12.2和1.P5B10.3.10，并分别给出以下ATCC专利保存名称：PTA-8816、PTA-8813、PTA-8814、PTA-8815和PTA-8817。保存的杂交瘤1.P2E7.3产生本文所述的单克隆抗体1P2E7。保存的杂交瘤1P3B2.2产生本文所述的单克隆抗体1P4A3。保存的杂交瘤1.P4A3.3产生本文所述的单克隆抗体1P3B2。保存的杂交瘤1.P4A12.2产生本文所述的单克隆抗体1P4A12。保存的杂交瘤1.P5B10.3.10产生本文所述的单克隆抗体1P5B10。
如本文所用，术语“抗原结合结构域”包括特异性地结合抗原上的表位(例如，RON的表位)的位点。抗体的抗原结合结构域通常包括免疫球蛋白重链可变区的至少一部分和免疫球蛋白轻链可变区的至少一部分。由这些可变区形成的结合位点决定抗体的特异性。
本发明更具体地涉及RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中RON抗体特异性地结合至与选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的参考单克隆Fab抗体片段或选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的参考单克隆抗体相同的RON表位。
本发明还涉及如下RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中RON抗体竞争性地抑制选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的参考单克隆Fab抗体片段或选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的参考单克隆抗体与RON的结合。
本发明还涉及如下RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中RON抗体包含与选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的单克隆Fab抗体片段或选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的参考单克隆抗体相同的抗原结合结构域。
制备抗体的方法是本领域公知的并在本文描述。产生了针对不含信号序列的各种RON片段或针对全长RON的抗体之后，可通过本文所述的表位定位方案以及本领域已知的方法(例如“第11章-免疫学”，CurrentProtocols in Molecular Biology(分子生物学最新实验方案)，Ausubel等人编辑，第2版，John Wiley & Sons，Inc.(1996)中所述的双抗体夹心ELISA)来确定抗体或抗原结合片段结合RON的哪些氨基酸或表位。可在Morris，G.Epitope Mapping Protocols(表位定位方案)，New Jersey：Humana Press(1996)中找到另外的表位定位方案，二者的全文以引用的方式并入本文。还可通过市售的方式(即ProtoPROBE，Inc.(Milwaukee，Wisconsin))来进行表位定位。
另外，然后可筛选产生的与RON的任何部分结合的抗体作为RON的拮抗剂起作用的能力，例如，抑制MSP与RON的结合，抑制PI3-K/Akt途径的活化，抑制Ras/MAPK信号传导途径的活化，抑制src信号传导途径的活化，抑制β-连环蛋白信号传导途径的活化，抑制Fak途径的活化，抑制Erk 1/2的磷酸化，抑制Erk 1/2的活化，诱导凋亡，诱导失巢凋亡，抑制受体酪氨酸激酶(RTK)活性，阻断VEGF分泌，阻断包括但不限于EGFR、TGFβ受体和Met的其它受体激酶的活性，诱导细胞毒性一氧化氮(NO)分泌，诱导IL-12分泌，阻断MSP分泌或抑制肿瘤细胞生长、增殖、粘附、活动性、侵入或转移。可根据实施例中详细描述的方法筛选抗体的这些特性和其它特性。可使用本文实施例中所述的其它测定检验本发明的抗体的其它功能。
在其它实施方案中，本发明包括特异性地或优先地结合至RON的至少一个表位的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中该表位包括、基本上由或者由以下组成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：113的至少约四个至五个氨基酸、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：113的至少七个、至少九个或至少约15个至约30个氨基酸。如所述的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：113的给定表位的氨基酸可以是，但不必须是连续或线性的。在某些实施方案中，RON的至少一个表位包括、基本上由或者由以下组成：由在细胞表面上表达或作为例如融合于IgG Fc区的可溶片段的RON的胞外结构域形成的非线性表位。因此，在某些实施方案中，RON的至少一个表位包括、基本上由或者由以下组成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：113的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、约15个至约30个、或至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个连续或不连续的氨基酸，其中不连续的氨基酸通过蛋白折叠形成表位。
在其它实施方案中，本发明包括特异性地或优先地结合至RON的至少一个表位的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中该表位除了如上述的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：113的一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个连续或不连续的氨基酸以外，还包括、基本上由或者由修饰蛋白的另外部分组成，例如可包括糖类部分以使RON抗体以比它对未修饰形式的蛋白更高的亲和力结合修饰的靶蛋白。或者，RON抗体完全不结合未修饰形式的靶蛋白。
在某些方面，本发明涉及抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，它们以比对给定的参考单克隆抗体的解离常数(KD)小的KD表征的亲和力特异性地结合至RON多肽或其片段、或RON变体多肽。
在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物特异性地结合至上述RON或片段或变体的至少一个表位，即，与结合至不相关的或随机的表位相比更容易地结合至这样的表位；优先地结合至上述RON或片段或变体的至少一个表位，即与结合至相关的、相似的、同源的或类似的表位相比更容易地结合至这样的表位；竞争性地抑制参考抗体的结合，所述参考抗体自身与上述RON或片段或变体的某个表位特异性地或优先地结合；或者以由解离常数KD所表征的亲和力结合至上述RON或片段或变体的至少一个表位，所述KD小于约5×10-2M、约10-2M、约5×10-3M、约10-3M、约5×10-4M、约10-4M、约5×10-5M、约10-5M、约5×10-6M、约10-6M、约5×10-7M、约10-7M、约5×10-8M、约10-8M、约5×10-9M、约10-9M、约5×10-10M、约10-10M、约5×10-11M、约10-11M、约5×10-12M、约10-12M、约5×10-13M、约10-13M、约5×10-14M、约10-14M、约5×10-15M或约10-15M。在一个具体方面，抗体或其片段相对于鼠RON多肽或其片段优先地结合至人类RON多肽或其片段。在另一具体方面，抗体或其片段优先地结合至一种或多种RON多肽或其片段，例如一种或多种哺乳动物RON多肽。
如在抗体结合解离常数的范畴中使用的，术语“约”允许在用于测量抗体亲和力的方法中固有的变化程度。例如，取决于所用的仪器装备的精密水平、基于所测量的样品数目的标准差、和舍入误差，术语“约10-2M”可以包括例如，从0.05M到0.005M。
在特定的实施方案中，本发明的抗体、或其抗原结合片段、免疫特异性片段、变体或衍生物以小于或等于5×10-2sec-1、10-2sec-1、5×10-3sec-1或10-3sec-1的解离速率(k(off))结合RON多肽或其片段或变体。或者，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物以小于或等于5×10-4sec-1、10-4sec-1、5×10-5sec-1或10-5sec-15×10-6sec-1、10-6sec-1、5×10-7sec-1或10-7sec-1的解离速率(k(off))结合RON多肽或其片段或变体。
在其它的实施方案中，本发明的抗体、或其抗原结合片段、免疫特异性片段、变体或衍生物以大于或等于103M-1sec-1、5×103M-1sec-1、104M-1sec-1或5×104M-1sec-1的结合速率(k(on))结合RON多肽或其片段或变体。或者，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物以大于或等于105M-1sec-1、5×105M-1sec-1、106M-1sec-1或5×106M-1sec-1或107M-1sec-1的结合速率(k(on))结合RON多肽或其片段或变体。
在各种实施方案中，如本文所述的RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物是RON活性的拮抗剂。在某些实施方案中，例如，拮抗剂RON抗体与肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞上表达的RON的结合抑制MSP与RON的结合，抑制MSP诱导的RON信号传导，抑制PI3-K/Akt途径、Ras/MAPK途径、src途径、Fak途径或β-连环蛋白途径的活化，抑制ERK1/2的磷酸化或活化，阻断VEGF分泌，阻断包括但不限于EGFR、TGFβ受体和Met的其它受体激酶的活性，诱导细胞毒性一氧化氮(NO)分泌，诱导IL-12分泌，阻断MSP分泌或者抑制肿瘤细胞增殖、活动性或转移或者促进凋亡或失巢凋亡。
除非具体地指明，否则如本文所用的关于抗体的“其片段”是指抗原结合片段，即抗体的特异性地结合至抗原的部分。在一个实施方案中，RON抗体，例如本发明的抗体是双特异性的RON抗体，例如是对多于一个表位(如多于一个抗原或同一抗原上多于一个表位)具有结合特异性的双特异性的抗体、微型抗体、结构域缺失的抗体或融合蛋白。在一个实施方案中，双特异性的RON抗体具有对本文公开的靶多肽如RON上至少一个表位具有特异性的至少一个结合结构域。在另一实施方案中，双特异性的RON抗体具有对靶多肽上的表位具有特异性的至少一个结合结构域和对药物或毒素具有特异性的至少一个靶结合结构域。又在另一实施方案中，双特异性的RON抗体具有对本文公开的靶多肽上的表位具有特异性的至少一个结合结构域和对前体药物具有特异性的至少一个结合结构域。双特异性RON抗体可以是四价抗体，具有对本文公开的靶多肽的表位具有特异性的两个靶结合结构域和对第二靶具有特异性的两个靶结合结构域。因此，四价双特异性RON抗体对于每种特异性可以是二价的。
如本领域普通技术人员已知的，本发明的RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物可包括介导一种或多种效应子功能的恒定区。例如，补体的C1组分与抗体恒定区结合会活化补体系统。补体的活化在调理作用和细胞病原体的裂解中非常重要。补体的活化还刺激炎症反应，并可能参与自身免疫超敏反应。此外，随着抗体Fc区域的Fc受体结合位点结合到细胞上的Fc受体(FcR)，抗体借助Fc区域结合到不同细胞上的受体。存在许多对不同种类的抗体具有特异性的Fc受体，所述抗体包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(λ受体)和IgM(μ受体)。抗体结合细胞表面上的Fc受体引发大量重要和多样的生物反应，包括吞入和破坏被抗体包覆的颗粒、清除免疫复合体、杀伤细胞对包覆抗体的靶细胞的裂解(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、释放炎性介质、胎盘转移以及控制免疫球蛋白的产生。
因此，本发明的某些实施方案包括RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中一个或多个恒定区结构域中的至少一个部分已被缺失或以其它方式被改变以提供期望的生化特征，诸如与具有大致相同免疫原性的完整、未改变的抗体相比，减少的效应子功能，非共价地二聚化的能力，增加的在肿瘤部位集中的能力，减少的血清半衰期或增加的血清半衰期。例如，用于本文所述的诊断和治疗方法中的某些抗体是结构域缺失的抗体，所述抗体包括与免疫球蛋白重链相似的多肽链，但缺少一个或多个重链结构域的至少一部分。例如，在某些抗体中，修饰的抗体的恒定区的一个完整结构域将被缺失，例如，CH2结构域的全部或部分将被缺失。例如，Fc区改变的RON抗体可耗尽癌症或炎症中牵涉的巨噬细胞。在其它实施方案中，用于本文所述的诊断和治疗方法中的某些抗体具有已被改变以消除糖基化的恒定区，例如IgG4重链恒定区，在本文别处称为“agly”抗体。尽管不被理论限制，认为“agly”抗体可能具有改进的体内安全性和稳定性特性。产生具有期望的效应子功能的去糖基化的抗体的方法例如见于WO 2005018572，其全文以引用的方式并入。
在本文所述的某些RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物中，可以利用本领域已知技术将Fc部分突变来降低效应子功能。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其它手段)可能减少Fc受体结合循环系统中的经修饰的抗体，从而提高肿瘤定位。其它情况中，可能与本发明一致的恒定区修饰会减缓补体结合，并因此降低了轭合的细胞毒素的血清半衰期和非特异性缔合。然而，可以用恒定区的其它修饰来改变二硫键或寡糖部分，从而使其定位因为抗原特异性或抗体柔性增加的而增强。这些修饰所产生的生理特性、生物利用度及其它生化效果(诸如肿瘤定位、生物分布和血清半衰期)可以容易地利用已知免疫技术测量和定量而不需要过多实验。
可以用本领域已知技术由整个前体或亲本抗体制得修饰形式的本发明的RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物。示范性技术在本文更详细地讨论。
在某些实施方案中，RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的可变区和恒定区二者都是完全人类的。可以使用本领域已知的和本文所描述的技术来制备是完全人类的抗体。例如，可以通过将抗原施用于转基因动物来制备针对特异性抗原的完全人类的抗体，所述转基因动物被修饰以产生这种抗体作为对抗原性攻击的响应，但是其内源性基因座已失去功能。可被用来制备这种抗体的示例性的技术被描述于美国专利第6,150,584；6,458,592；6,420,140号。其它技术是本领域已知的。可以通过如本文其它地方更详细所述的各种展示技术例如噬菌体展示系统或其它病毒展示系统来同样地产生完全人类的抗体。
本发明的RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物可利用本领域已知的技术制备或制造。在某些实施方案中，抗体分子或其片段被“重组地产生”，即，利用重组DNA技术产生。用于制备抗体分子或其片段的示例性技术在本文别处更详细地讨论。
本发明的RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物还包括被修饰的衍生物，所述修饰例如，通过将任何类型的分子共价连接至抗体以致该共价连接不阻止抗体与其同类表位的特异性结合。例如但不进行限制，抗体衍生物包括已经通过例如如下方式修饰的抗体：糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封端基团的衍生化、蛋白酶剪切、与细胞配体或其它蛋白的连接等。可以通过已知技术进行许多化学修饰中的任一种，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等等。另外，衍生物可含有一种或多种非经典的氨基酸。
在某些实施方案中，本发明的RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物将不引起待治疗的动物例如人类中的有害的免疫反应。在一个实施方案中，使用本领域公认的技术修饰本发明的RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物以减少它们的免疫原性。例如，抗体可被人源化、灵长源化、去免疫化，或者可制备嵌合抗体。这些类型的抗体来源于非人类的抗体，通常是鼠或灵长类抗体，其保留或基本上保留亲本抗体的抗原结合特性，但是在人类中具有较少的免疫原性。这可通过各种方法来实现，包括(a)将完整的非人类可变结构域拼接到人类恒定区上以产生嵌合抗体；(b)将一种或多种非人类互补决定区(CDR)的至少一部分拼接到保留或不保留关键骨架残基的人类构架区和恒定区上；或者(c)移植完整的非人类可变结构域，但通过替换表面残基用类似于人类的部分将它们“覆盖”。这类方法公开在Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.81：6851-6855(1984)；Morrison等人，Adv.Immunol.44：65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.31：169-217(1994)和美国专利第5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,190,370号中，所有这些专利的全文据此以引用的方式并入本文。
还可使用去免疫作用来减少抗体的免疫原性。如本文所用，术语“去免疫作用”包括改变抗体以修饰T细胞表位(参见例如WO9852976A1、WO0034317A2)。例如，分析来自起始抗体的VH和VL序列，以及来自每个V区的人类T细胞表位“图谱”显示与互补决定区(CDR)和序列中的其它关键残基相关的表位位置。分析来自T细胞表位图谱的单个T细胞表位以确定具有低的改变最终抗体活性的风险的可选的氨基酸取代。设计一系列可选的VH和VL序列，其包括氨基酸取代的组合，并且这些序列随后被并入一系列结合多肽例如RON特异性抗体或其免疫特异性片段中以用于本文所公开的诊断和治疗方法，然后测试其功能。通常，产生并检验12至24个变体抗体。然后将包括修饰的V和人类C区域的完整的重链和轻链基因克隆进表达载体，并将所得的质粒引入细胞系以产生完整的抗体。然后在适当的生化和生物测定中比较所述抗体，并确定最佳的变体。
本发明的RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物可通过本领域已知的任何适合方法产生。可通过本领域熟知的各种步骤产生针对感兴趣的抗原的多克隆抗体。例如，可将RON抗体，例如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段施用于各种宿主动物(包括但不限于兔、小鼠、大鼠、鸡、仓鼠、山羊、驴等)以诱导含有对该抗原具有特异性的多克隆抗体的血清的产生。可以根据宿主物种来使用各种佐剂以增加免疫应答，并且佐剂包括但不限于弗氏(完全的和不完全的)、矿物凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇(pluronicpolyol)、聚阴离子、肽类、油乳剂、钥孔血蓝蛋白、二硝基苯酚和潜在有用的人类佐剂例如BCG(卡介苗)和短棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。这样的佐剂也是本领域中熟知的。
可以使用本领域已知的各种各样的技术来制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术、或其组合。例如，可以使用杂交瘤技术产生单克隆抗体，所述杂交瘤技术包括本领域已知的以及在例如Harlow等人，Antibodies ：A Laboratory Manual(抗体：实验手册)，Cold Spring HarborLaboratory Press，第2版(1988)；Hammerling等人，Monoclonal Antibodiesand T-Cell Hybridomas(单克隆抗体和T细胞杂交瘤)，Elsevier，N.Y.，563-681(1981)中所教导的那些技术(所述参考文献的全文以引用的方式并入)。如本文所用，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术所产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指来源于包括任何真核的、原核的或噬菌体克隆在内的单个克隆的抗体，而不是指产生它的方法。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术所产生的抗体。可以使用RON敲除小鼠制备单克隆抗体以增加表位识别的区域。可以使用本领域已知的各种各样的技术来制备单克隆抗体，包括如本文其它地方所述的杂交瘤和重组体和噬菌体展示技术的使用。
在一个实例中，使用本领域公认的方案，通过多次在皮下或腹膜内注射相关抗原(例如纯化的RON或者含RON的细胞或细胞提取物)和佐剂来在哺乳动物体内产生抗体。此免疫接种通常引发这样的免疫应答，其包括来自激活的脾细胞或淋巴细胞的抗原反应性抗体的产生。虽然所得的抗体可从动物血清收集以提供多克隆制品，但是常常期望从脾脏、淋巴结或外周血来分离单独的淋巴细胞以提供单克隆抗体(MAb)的同质制品。优选地，从脾脏获得淋巴细胞。
在这个熟知的过程(Kohler等人，Nature 256：495(1975))中，与抗原一起被注射的来自哺乳动物的相对短命的或必死的淋巴细胞与不死的肿瘤细胞系(例如骨髓瘤细胞系)融合，因此产生杂交细胞或“杂交瘤”，其既是不死的又能够产生B细胞的遗传编码的抗体。通过选择、稀释和再生长而将所得的杂交物分离成单个的遗传株，而每个单个的株包括用于形成单个抗体的特定基因。它们产生对期望的抗原有同质性的抗体，并且根据它们纯的遗传谱系被称为“单克隆的”。
将如此制备的杂交瘤细胞接种并生长在适合的培养基中，所述培养基优选地含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的一种或多种物质。本领域技术人员将会理解，杂交瘤的形成、选择和生长所需的试剂、细胞系和培养基是可从若干商业来源获得的，而且很好地建立了标准化方案。通常，对杂交瘤细胞所生长的培养基进行测定以确定针对期望抗原的单克隆抗体的产生。优选地，通过体外测定来确定由杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性，所述体外测定例如免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)。在确定杂交瘤细胞产生期望的特异性、亲和性和/或活性的抗体之后，可通过有限稀释步骤对所述克隆进行亚克隆，并通过标准方法使其生长(Goding，Monoclonal Antibodies ：Principles and Practice(编码、单克隆抗体：原理和实践)，Academic Press，第59-103页(1986))。还将理解的是，由亚克隆所分泌的单克隆抗体可通过常规的纯化步骤从培养基、腹水或血清中分离，所述纯化步骤例如蛋白A、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳法、透析或亲和色谱法。
识别具体表位的抗体片段可通过已知技术产生。例如，Fab和F(ab’)2片段可重组地产生或利用酶诸如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab’)2片段)通过蛋白酶剪切免疫球蛋白分子产生。F(ab’)2片段包含可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。
本领域技术人员还将理解，编码抗体或抗体片段(例如抗原结合位点)的DNA还可以来源于抗体文库，例如噬菌体展示文库。特别地，这种噬菌体可用来展示从所有组成成分或组合抗体文库(例如人类或鼠的)表达的抗原结合结构域。可以使用抗原来选择或确定表达结合至感兴趣抗原的抗原结合结构域的噬菌体，例如使用标记的抗原或者被结合或捕获至固体表面或珠子上的抗原。用在这些方法中的噬菌体通常是丝状噬菌体，其包括从噬菌体表达的fd和M13结合结构域，所述噬菌体具有以重组方式与噬菌体基因III或基因VIII蛋白融合的Fab、Fv OE DAB(来自轻链或重链的单个Fv区)或者二硫键稳定的Fv抗体结构域。示例性的方法列在例如EP 368 684 B1；美国专利5,969,108，Hoogenboom，H.R.和Chames，Immunol.Today 21：371(2000)；Nagy等人.Nat.Med.8：801(2002)；Huie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：2682(2001)；Lui等人，J.Mol.Biol.315：1063(2002)中，其中的每一个均以引用的方式并入本文。一些出版物(例如Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992))描述了通过链改组来产生高亲和性人类抗体，以及作为构建大噬菌体文库的策略的组合感染和体内重组。在另一个实施方案中，核糖体展示可被用来替代噬菌体作为展示平台(参见例如Hanes等人，Nat.Biotechnol.18：1287(2000)；Wilson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：3750(2001)；或Irving等人，J.Immunol.Methods 248：31(2001))。在又一个实施方案中，可以筛选细胞表面文库以寻找抗体(Boder等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：10701(2000)；Daugherty等人，J.Immunol.Methods 243：211(2000))。这样的方案提供了对传统杂交瘤技术的替代方案用于分离和随后克隆单克隆抗体。
在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域被展示在载有编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。例如，编码VH和VL区的DNA序列被扩增或以其它方式从动物cDNA文库(例如人类或鼠的淋巴样组织的cDNA文库)或合成的cDNA文库中分离。在某些实施方案中，编码VH和VL区的DNA通过PCR被scFv连接序列连接在一起，并被克隆进噬菌粒载体(例如p CANTAB 6或pComb 3HSS)。将所述载体经过电穿孔导入大肠杆菌，并用辅助噬菌体将大肠杆菌感染。用于这些方法的噬菌体通常是包括fd和M13的丝状噬菌体，而且VH或VL区常常被重组地融合至噬菌体基因III或基因VIII。可以使用抗原来选择或确定表达结合至感兴趣抗原的抗原结合结构域(即RON多肽或其片段)的噬菌体，例如使用标记的抗原或者被结合或捕获至固体表面或珠子上的抗原。
可被用来制备抗体的噬菌体展示方法的另外的实例包括在Brinkman等人，J.Immunol.Methods 182：41-50(1995)；Ames等人，J.Immunol.Methods 184：177-186(1995)；Kettleborough等人，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic等人，Gene 187：9-18(1997)；Burton等人，Advancesin Immunology 57：191-280(1994)；PCT申请第PCT/GB91/01134号；PCT公布WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401；以及美国专利第5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108号中所公开的那些，其中每个的全文均以引用的方式并入本文。
如上面的参考文献所述，在噬菌体选择之后，来自噬菌体的编码抗体的区域可被分离并用来产生包括人类抗体在内的完整抗体或任何其它期望的抗原结合片段，而且被表达在任何期望的宿主中，所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌。例如，还可利用使用本领域已知的方法来重组地产生Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技术，所述方法例如公开在PCT公布WO 92/22324；Mullinax等人，BioTechniques12(6)：864-869(1992)；和Sawai等人，AJRI 34：26-34(1995)；以及Better等人，Science 240：1041-1043(1988)中的那些(所述参考文献的全文以引用的方式并入)。
可用来产生单链Fv和抗体的技术的实例包括在美国专利第4,946,778和5,258,498号；Huston等人，Methods in Enzymology 203：46-88(1991)；Shu等人，PNAS 90：7995-7999(1993)；和Skerra等人，Science240：1038-1040(1988)中所述的那些。对于一些用途(包括抗体在人类的体内用途和体外检测测定)，优选使用嵌合的、人源化的或人类的抗体。嵌合抗体是这样的分子，在其中抗体的不同部分来源于不同动物物种，例如具有来源于鼠单克隆抗体可变区和人类免疫球蛋白恒定区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如Morrison，Science229：1202(1985)；Oi等人，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等人，J.Immunol.Methods 125：191-202(1989)；美国专利第5,807,715；4,816,567和4,816397号，其全文以引用的方式并入本文。另外，可以使用为产生“嵌合抗体”而开发的技术(Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.81：851-855(1984)；Neuberger等人，Nature 312：604-608(1984)；Takeda等人，Nature 314：452-454(1985))，通过将来自适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自适当生物活性的人类抗体分子的基因剪接在一起。如本文所用，嵌合抗体是这样的分子，其中不同的部分来源于不同的动物物种，例如具有来源于鼠单克隆抗体的可变区和人类免疫球蛋白恒定区的那些抗体，例如人源化的抗体。
人源化的抗体是结合期望的抗原的来自非人类物种抗体的抗体分子，其具有来自非人类物种的一个或多个互补决定区(CDR)以及来自人类免疫球蛋白分子的构架区。通常，人类构架区中的骨架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基所取代以改变、优选地促进抗原结合。通过本领域中熟知的方法确定这些骨架取代，例如通过对CDR和骨架残基的相互作用进行建模以确定对于抗原结合重要的骨架残基，并且通过序列对比来确定在特殊位置的不常见的骨架残基。(参见例如Queen等人，美国专利第5,585,089号；Riechmann等人，Nature 332：323(1988)，其全文以引用的方式并入本文。)可以使用本领域已知的各种技术将抗体人源化，所述技术包括例如CDR拼接(EP 239,400；PCT公布WO 91/09967；美国专利第5,225,539、5,530,101和5,585,089号)、镶饰(veneering)或表面重建(EP592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等人，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska等人，PNAS91：969-973(1994))和链改组(美国专利第5,565,332号)。
完全人类的抗体是在人类患者的治疗性处理中特别期望的。可通过本领域已知的各种方法制备人类抗体，包括上述的使用来源于人类免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。还参见美国专利第4,444,887和4,716,111号；和PCT公布WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741，其中每个的全文均以引用的方式并入本文。
还可使用转基因小鼠来产生人类抗体，所述转基因小鼠不能表达功能性内源免疫球蛋白，但是能表达人类免疫球蛋白基因。例如，可将人类重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机地或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞。或者，除人类重链和轻链基因之外，人类可变区、恒定区和多变区可被引入小鼠胚胎干细胞中。随着通过同源重组将人类免疫球蛋白基因座引入，小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可分别或同时变得无功能。具体地说，JH区的纯合缺失阻止内源性抗体的产生。将修饰的胚胎干细胞扩增并微注射进胚泡以产生嵌合小鼠。然后将嵌合小鼠繁殖以产生表达人类抗体的纯合后代。以通常方式用所选的抗原例如期望的靶多肽的全部或一部分来对转基因小鼠进行免疫。可使用常规的杂交瘤技术从被免疫的转基因小鼠获得针对所述抗原的单克隆抗体。转基因小鼠所含的人类免疫球蛋白转基因在B细胞分化时重排，并且随后进行类转换和体细胞突变。因此，使用这种技术可能产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于产生人类抗体的该技术的概况，参见Lonberg和HuszarInt.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。关于产生人类抗体和人类单克隆抗体的该技术以及产生这种抗体的方案的详细讨论，参见例如PCT公布WO 98/24893、WO96/34096、WO 96/33735；美国专利第5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598号，其全文以引用的方式并入本文。另外，可聘请例如Abgenix，Inc.(Freemont，Calif.)和GenPharm(San Jose，Calif.)等公司使用与上述相似的技术来提供针对所选抗原的人类抗体。
可使用称作“定向选择”的技术产生识别所选的表位的完全人类的抗体。在该方法中，所选的非人类单克隆抗体例如小鼠抗体被用来指导对识别相同表位的完全人类的抗体的选择。(Jespers等人，Bio/Technology12：899-903(1994)。还参见美国专利第5,565,332号。)
此外，可以反过来利用针对本发明靶多肽的抗体通过本领域技术人员熟知的技术来产生“模拟”靶多肽的抗独特型抗体。(参见例如Greenspan& Bona，FASEB J.7(5)：437-444(1989)和Nisinoff，J.Immunol.147(8)：2429-2438(1991))。例如，结合至并且竞争性地抑制多肽多聚化和/或本发明的多肽与配体结合的抗体可被用来产生“模拟”多肽多聚化和/或结合结构域的抗独特型，并且因此结合至并且中和多肽和/或其配体。这种中和的抗独特型或这种抗独特型的Fab片段可被用在治疗方案中以中和多肽配体。例如，这种抗独特型抗体可被用来结合期望的靶多肽和/或结合靶多肽的配体/受体，并且从而阻断靶多肽的生物活性。
在另一实施方案中，编码期望的单克隆抗体的DNA可利用常规步骤容易地分离和测序(例如，通过利用能够特异性地结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。分离和亚克隆的杂交瘤细胞用作这样的DNA的优选来源。分离后，可将DNA放入表达载体中，随后将表达载体转染到原核或真核宿主细胞，诸如但不限于本来不产生免疫球蛋白的大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞。更特别地，分离的DNA(可以是如本文所述合成的)可用于克隆恒定区和可变区序列以制造抗体，如Newman等人，1995年1月25日提交的美国专利第5,658,570号，其以引用的方式并入本文。基本上，这必须从选择的细胞提取RNA，转化为cDNA，并利用Ig特异性引物通过PCR扩增。为此目的合适的引物也描述在美国专利第5,658,570号中。如将在以下更详细地讨论的，可以相对大量地生长表达期望抗体的转化的细胞以提供免疫球蛋白的临床和商业供应。
在一个实施方案中，本发明的RON抗体包括抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一个实施方案中，本发明的RON抗体包括来自一个或多个抗体分子的至少两个CDR。在另一个实施方案中，本发明的RON抗体包括来自一个或多个抗体分子的至少三个CDR。在另一个实施方案中，本发明的RON抗体包括来自一个或多个抗体分子的至少四个CDR。在另一个实施方案中，本发明的RON抗体包括来自一个或多个抗体分子的至少五个CDR。在另一个实施方案中，本发明的RON抗体包括来自一个或多个抗体分子的至少六个CDR。本文描述了包括可被包含在主题RON抗体中的至少一个CDR的示例性的抗体分子。
在一个具体实施方案中，可以检查重链和/或轻链可变结构域的氨基酸序列以通过本领域熟知的方法(例如通过将其与其它重链和轻链可变区的已知氨基酸序列进行比较以确定具有序列超变化性的区域)来确定互补决定区(CDR)的序列。使用常规的重组DNA技术，可将一个或多个CDR插入构架区例如人类构架区中以使得非人类抗体人源化。所述构架区可以是天然存在的或共有的构架区，并优选地为人类构架区(关于人类构架区的列表，参见例如Chothia等人，J.Mol.Biol.278：457-479(1998))。优选地，由构架区和CDR的组合所产生的多核苷酸编码特异性地结合至期望的多肽例如RON的至少一个表位的抗体。优选地，可在构架区中制备一个或多个氨基酸取代，并且优选地，所述氨基酸取代改善抗体与其抗原的结合。另外，这种方法可被用来制备参与链内二硫键的一个或多个可变区半胱氨酸残基的氨基酸取代或缺失，以便产生缺少一个或多个链内二硫键的抗体分子。多核苷酸的其它改变被包括在本发明中并且在本领域的技术之内。
或者，所述用于生产单链抗体的技术(美国专利第4,694,778号；Bird，Science 242：423-442(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883(1988)；和Ward等人，Nature 334：544-554(1989))可被修改以产生单链抗体。通过氨基酸桥连将Fv区的重链和轻链片段连接以形成单链抗体，从而得到单链抗体。还可以使用在大肠杆菌中装配功能性Fv片段的技术(Skerra等人，Science 242：1038-1041(1988))。
然而本发明的其它实施方案包括在不能够产生内源性免疫球蛋白的转基因动物(例如小鼠)中生产人类的或基本上是人类的抗体(参见例如美国专利第6,075,181、5,939,598、5,591,669和5,589,369号，其中每个均以引用的方式并入本文)。例如已经描述，在嵌合的和种系突变的小鼠中抗体重链连接区的纯合缺失导致完全抑制内源性抗体的产生。将人类免疫球蛋白基因阵列转移至这种种系突变的小鼠将在抗原攻击时导致人类抗体的产生。使用SCID小鼠产生人类抗体的另一个优选的方法公开在美国专利第5,811,524号中，其以引用的方式并入本文。将会理解的是，还可按照本文所述来分离并操作与这些人类抗体相关的遗传物质。
另一高度有效的产生重组抗体的手段由Newman，Biotechnology 10：1455-1460(1992)公开。具体地，此技术导致产生含有猴可变结构域和人类恒定序列的灵长源化抗体。此文献的全文以引用的方式并入本文。此外，此技术还描述在共同指定的美国专利第5,658,570、5,693,780和5,756,096号之中，其中每个均以引用的方式并入本文。
在另一个实施方案中，可通过显微操作来选择淋巴细胞，并且分离可变基因。例如，可从免疫的哺乳动物分离外周血单核细胞并在体外培养大约7天。可筛选培养物中符合筛选标准的特异性IgG。可以分离来自阳性孔的细胞。单个的产生Ig的B细胞可通过FACS或通过在补体介导的溶血斑测定中确定它们来分离。可将产生Ig的B细胞显微操作进入管中，并使用例如RT-PCR扩增VH和VL基因。可将VH和VL基因克隆进抗体表达载体中并转染进细胞(例如真核或原核细胞)以表达。
或者，可以使用技术人员熟知的技术选择和培养产生抗体的细胞系。这些技术在各种实验室手册和主要出版物中都有描述。在这点上，如下所述适合用于本发明的技术描述在Current Protocols in Immunology(免疫学最新实验方案)，Coligan等人编辑，Green Publishing Associates andWiley-Interscience，John Wiley and Sons，New York(1991)中，其全文以引用的方式并入本文，包括附录。
本发明的抗体可由本领域已知用于合成抗体的任何方法产生，特别是通过化学合成，或优选地通过本文所述的重组表达技术。
在一个实施方案中，本发明的RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物包括合成的恒定区，其中部分地或全部地缺失了一个或多个结构域(“缺失结构域的抗体”)。在某些实施方案中，适合的修饰的抗体将包括缺失了结构域的构建体或变体，其中完整的CH2结构域已被除去(ΔCH2构建体)。对于其它实施方案，短连接肽可取代缺失的结构域以便为可变区提供柔性和移动的自由性。本领域技术人员将理解，由于CH2结构域对抗体分解代谢率的调节特性，这种构建体是特别优选的。可使用编码IgG1人类恒定结构域的载体来获得缺失结构域的构建体(参见例如WO02/060955A2和WO02/096948A2)。此载体被工程化以缺失CH2结构域并提供表达缺失结构域的IgG1恒定区的合成载体。
在某些实施方案中，本发明的RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物是微型抗体。可使用本领域所描述的方法来制备微型抗体(参见例如美国专利第5,837,821号或WO 94/09817A1)。
在一个实施方案中，本发明的RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物包括具有一些或甚至一个氨基酸的缺失或取代的免疫球蛋白重链，只要它允许单体亚基之间的缔合。例如，在CH2结构域所选区域中单个氨基酸的突变可足以基本上减少Fc结合并因此增加肿瘤定位。相似地，可以期望简单地缺失控制待调节的效应子功能(例如补体结合)的一个或多个恒定区结构域的部分。恒定区的这种部分缺失可改进抗体的所选特征(血清半衰期)，而让与所述主题恒定区结构域相关的其它期望的功能保持完整。此外，如上面所提到的，公开的抗体的恒定区可以是通过突变或取代一个或多个氨基酸而合成的，所述氨基酸增强所得构建体的特性。在这方面，可能破坏由保守结合位点所提供的活性(例如Fc结合)，而基本上保持被修饰的抗体的构型和免疫原性概况。然而其它的实施方案包括将一个或多个氨基酸加入恒定区以增强期望的特征例如效应子功能，或者提供更多细胞毒素或碳水化合物附着。在这样的实施方案中，可以期望插入或复制来源于所选恒定区结构域的特定序列。
本发明还提供这样的抗体，其包括、基本上由或者由本文所述的抗体分子(例如VH区和/或VL区)的变体(包括衍生物)所组成，所述抗体或其片段免疫特异性地结合至RON多肽或者其片段或变体。可以使用本领域技术人员已知的标准技术来将突变引入编码RON抗体的核苷酸序列中，其中所述技术包括但不限于导致氨基酸取代的位点定向诱变和PCR介导的诱变。优选地，所述变体(包括衍生物)编码相对于参考VH区、VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL区、VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3的少于50个氨基酸的取代，少于40个氨基酸的取代，少于30个氨基酸的取代，少于25个氨基酸的取代，少于20个氨基酸的取代，少于15个氨基酸的取代，少于10个氨基酸的取代，少于5个氨基酸的取代，少于4个氨基酸的取代，少于3个氨基酸的取代，或少于2个氨基酸的取代。“保守的氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基所替换的氨基酸取代。具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族已在本领域中被定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。或者，可沿着编码序列的全部或部分通过例如饱和诱变来随机地引入突变，而且可筛选所得的突变体的生物活性以确定保持活性(例如结合RON多肽的能力)的突变体。
例如，可能只在抗体分子的构架区或CDR区引入突变。引入的突变可以是沉默的或中性的错义突变，即对于抗体结合抗原的能力没有作用或作用很少，实际上一些此类突变对于氨基酸序列没有任何改变。这些类型的突变对于优化密码子使用、或者改进杂交瘤的抗体产生可能是有用的。在本文其它地方公开了编码本发明的RON抗体的密码子优化的编码区。或者，非中性错义突变可改变抗体结合抗原的能力。大多数沉默的和中性的错义突变的位置可能是在构架区中，而大多数非中性的错义突变的位置可能是在CDR中，虽然这不是绝对要求。本领域技术人员能够设计和检验具有期望特性的突变分子，所述期望特性为例如不改变抗原结合活性或改变结合活性(例如改进抗原结合活性或改变抗体特异性)。诱变之后，可常规地表达被编码的蛋白，并且可以使用本文所述的技术或通过本领域已知的常规修饰技术来确定被编码的蛋白的功能活性和/或生物活性(例如免疫特异性地结合RON多肽的至少一个表位的能力)。
IV.编码RON抗体的多核苷酸
本发明还提供了编码本发明的RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的核酸分子。
在一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其包括、基本上由或者由编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸所组成，其中所述重链可变区CDR中的至少一个或所述重链可变区VH-CDR中的至少两个与来自本文公开的单克隆RON抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同。或者，VH的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区与来自本文公开的单克隆RON抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同。因此，根据此实施方案，本发明的重链可变区具有与以下多肽序列相关的VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3多肽序列：SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：85、SEQ IDNO：95、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：136、和SEQ IDNO：146；SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：76、SEQ IDNO：86、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：127、SEQ IDNO：137、和SEQ ID NO：147；以及SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：118、SEQID NO：128、SEQ ID NO：138、和SEQ ID NO：148。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其包括、基本上由或者由编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸所组成，其中所述轻链可变区VL-CDR中的至少一个或所述轻链可变区VL-CDR中的至少两个与来自本文公开的单克隆RON抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同。或者，VL的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区与来自本文公开的单克隆RON抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同。因此，根据此实施方案，本发明的轻链可变区具有与以下多肽序列相关的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3多肽序列：SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：90、SEQ IDNO：100、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：141、和SEQ ID NO：151；SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：81、SEQ IDNO：91、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：142、和SEQ ID NO：152；和SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：123、SEQID NO：133、SEQ ID NO：143、和SEQ ID NO：153。
如本领域所知，通过比较一条多肽或多核苷酸的氨基酸或核酸序列与第二条多肽或多核苷酸的序列来确定两条多肽或两条多核苷酸之间的“序列同一性”。当在本文中讨论时，可使用本领域已知的方法和计算机程序/软件来确定任何特定的多肽是否与另一条多肽为至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相同，所述计算机程序/软件例如但不限于BESTFIT程序(威斯康辛序列分析包，用于Unix的第8版，Genetics Computer Group，University Research Park，575Science Drive，Madison，WI 53711)。BESTFIT使用Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics(应用数学进展)2：482-489(1981)中的局部同源性算法来找到两条序列之间最佳的同源区段。当使用BESTFIT或任何其它序列对比程序来确定特定序列是否根据与本发明的参考序列为例如95％相同时，毫无疑问地设置参数以针对参考多肽序列的全长来计算同一性百分比，并且允许参考序列中氨基酸总数的至多5％的同源性空位。
在某些实施方案中，含有由多核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至RON。在某些实施方案中，改变编码VH多肽的核苷酸序列而不改变由其编码的氨基酸序列。例如，可以改变序列以提高给定物种中的密码子使用，从而除去剪接位点，或除去限制酶切位点。像这些的序列优化描述在实施例中，并且是本领域普通技术人员所熟知的和常规地进行的。
在某些实施方案中，含有由所述多核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至RON。
在一些实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其包括编码抗体VH多肽的核酸，其中所述VH多肽包括选自由以下组成的组的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：5、6和7；SEQ ID NO：15、16和17；SEQ ID NO：25、26和27；SEQ ID NO：35、36和37；SEQID NO：45、46和47；SEQ ID NO：55、56和57；SEQ ID NO：65、66和67；SEQ ID NO：75、76和77；SEQ ID NO：85、86和87；SEQ ID NO：95、96和97；SEQ ID NO：116、117和118；SEQ ID NO：126、127和128；SEQID NO：136、137和138；以及SEQ ID NO：146、147和148；并且其中包含所述VH-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性地结合RON。
在某些实施方案中，包括、基本上由或者由被一种或多种上述多核苷酸编码的VH所组成的抗体或其抗原结合片段特异性地或优先地结合至与参考单克隆Fab抗体片段(选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组)或参考单克隆抗体(选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组)相同的RON表位，或者将竞争性地抑制这样的单克隆抗体或片段与RON的结合。
在某些实施方案中，包括、基本上由或者由被一种或多种上述多核苷酸编码的VH所组成的抗体或其抗原结合片段以解离常数(KD)所表征的亲和力特异性地或优先地结合至RON多肽或其片段或者RON变体多肽，所述解离常数(KD)不大于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M。
在某些实施方案中，含有由所述多核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至RON。
在一些实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其包括编码抗体VL多肽的核酸，其中所述VL多肽包括选自由以下组成的组的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：10、11和12；SEQ ID NO：20、21和22；SEQ ID NO：30、31和32；SEQ ID NO：40、41和42；SEQID NO：50、51和52；SEQ ID NO：60、61和62；SEQ ID NO：70、71和72；SEQ ID NO：80、81和82；SEQ ID NO：90、91和92；SEQ ID NO：100、101和102；SEQ ID NO：121、122和123；SEQ ID NO：131、132和133；SEQ ID NO：141、142和143；以及SEQ ID NO：151、152和153；并且其中包含所述VL-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性地结合RON。
在某些实施方案中，包括、基本上由或者由被一种或多种上述多核苷酸编码的VL所组成的抗体或其抗原结合片段特异性地或优先地结合至与参考单克隆Fab抗体片段(选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组)或参考单克隆抗体(选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组)相同的RON表位，或者将竞争性地抑制这样的单克隆抗体或片段与RON的结合。
在某些实施方案中，包括、基本上由或者由被一种或多种上述多核苷酸编码的VL所组成的抗体或其抗原结合片段以解离常数(KD)所表征的亲和力特异性地或优先地结合至RON多肽或其片段或者RON变体多肽，所述解离常数(KD)不大于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M。
在另外的实施方案中，本发明包括分离的多核苷酸，其包括、基本上由或者由编码与参考VH多肽序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的VH的核酸所组成，所述参考VH多肽序列选自由SEQ ID NO：4、14、24、34、44、54、64、74、84、94、115、125、135和145组成的组。在某些实施方案中，含有由所述多核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至RON。
另一方面，本发明包括分离的多核苷酸，其包括、基本上由或者由编码VH的核酸序列所组成，所述VH具有选自由SEQ ID NO：4、14、24、34、44、54、64、74、84、94、115、125、135和145组成的组的多肽序列。在某些实施方案中，含有由所述多核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至RON。
在另外的实施方案中，本发明包括分离的多核苷酸，其包括、基本上由或者由编码与参考核酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的编码VH的核酸所组成，所述参考核酸序列选自由SEQ ID NO：3、13、23、33、43、53、63、73、83、93、114、124、134和144组成的组。在某些实施方案中，含有由所述多核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至RON。
另一方面，本发明包括分离的多核苷酸，其包括、基本上由或者由编码本发明的VH的核酸序列所组成，其中所述VH的氨基酸序列选自由SEQID NO：4、14、24、34、44、54、64、74、84、94、115、125、135和145组成的组。本发明还包括分离的多核苷酸，其包括、基本上由或者由编码本发明的VH的核酸序列所组成，所述核酸序列选自由SEQ ID NO：3、13、23、33、43、53、63、73、83、93、114、124、134和144组成的组。在某些实施方案中，含有由此类多核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至RON。
在某些实施方案中，包括、基本上由或者由被一种或多种上述多核苷酸编码的VH所组成的抗体或其抗原结合片段特异性地或优先地结合至与参考单克隆Fab抗体片段(选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组)或参考单克隆抗体(选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组)相同的RON表位，或者将竞争性地抑制这样的单克隆抗体或片段与RON的结合，或者将竞争性地抑制这样的单克隆抗体与RON的结合。
在某些实施方案中，包括、基本上由或者由被一种或多种上述多核苷酸编码的VH所组成的抗体或其抗原结合片段以解离常数(KD)所表征的亲和力特异性地或优先地结合至RON多肽或其片段或者RON变体多肽，所述解离常数(KD)不大于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M。
在另外的实施方案中，本发明包括分离的多核苷酸，其包括、基本上由或者由编码VL的核酸所组成，所述编码VL的核酸与参考VL多肽序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同，所述参考VL多肽序列选自由SEQ ID NO：9、19、29、39、49、59、69、79、89、99、120、130、140和150组成的组。在另外的实施方案中，本发明包括分离的多核苷酸，其包括、基本上由或者由编码VL的核酸所组成，所述编码VL的核酸与参考核酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同，所述参考核酸序列选自由SEQ ID NO：8、18、28、38、48、58、68、78、88、98、119、129、139和149组成的组。在某些实施方案中，含有由此类多核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至RON。
另一方面，本发明包括分离的多核苷酸，其包括、基本上由或者由编码VL的核酸序列所组成，所述VL具有选自由SEQ ID NO：9、19、29、39、49、59、69、79、89、99、120、130、140和150组成的组的多肽序列。本发明还包括分离的多核苷酸，其包括、基本上由或者由编码本发明的VL的核酸序列所组成，其中所述核酸序列选自由SEQ ID NO：8、18、28、38、48、58、68、78、88、98、119、129、139和149组成的组。在某些实施方案中，含有由此类多核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至RON。
在某些实施方案中，包括、基本上由或者由被一种或多种上述多核苷酸编码的VL所组成的抗体或其抗原结合片段特异性地或优先地结合至与参考单克隆Fab抗体片段(选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M8O-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组)或参考单克隆抗体(选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组)相同的RON表位，或者将竞争性地抑制这样的单克隆抗体或片段与RON的结合。
在某些实施方案中，包括、基本上由或者由被一种或多种上述多核苷酸编码的VL所组成的抗体或其抗原结合片段以解离常数(KD)所表征的亲和力特异性地或优先地结合至RON多肽或其片段或者RON变体多肽，所述解离常数(KD)不大于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M。
上述多核苷酸中的任一个还可包括另外的核酸，所述另外的核酸编码例如指导被编码的多肽的分泌的信号肽、如本文所述的抗体恒定区或如本文所述的其它异源性多肽。
而且，如本文其它地方更详细描述的，本发明包括含有一种或多种上述的多核苷酸的多核苷酸的组合物。在一个实施方案中，本发明包括含有第一多核苷酸和第二多核苷酸的组合物，其中所述第一多核苷酸编码本文所述的VH多肽而且所述第二多核苷酸编码本文所述的VL多肽。特别地，组合物包括，基本上由或者由VH多核苷酸和VL多核苷酸所组成，其中所述VH多核苷酸和VL多核苷酸编码分别与参考VH和VL多肽氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的多肽，所述参考VH和VL多肽氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4和9、14和19、24和29、34和39、44和49、54和59、64和69、74和79、84和89、94和99、115和120、125和130、135和140、以及145和150组成的组。或者可选地，组合物包括，基本上由或者由VH多核苷酸和VL多核苷酸所组成，所述VH多核苷酸和VL多核苷酸分别与参考VL和VL核酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同，所述参考VL和VL核酸序列选自由SEQ IDNO：3和8、13和18、23和28、33和38、43和48、53和58、63和68、73和78、83和88、93和98、114和119、124和129、134和139、以及144和149组成的组。在某些实施方案中，含有由这种组合物中的多核苷酸所编码的VH和VL的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至RON。
本发明还包括本发明的多核苷酸的片段，如别处描述的。另外，编码如本文所述的融合多核苷酸、Fab片段和其它衍生物的多核苷酸也被本发明所包括。
可通过本领域任何已知方法来产生或制造多核苷酸。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，那么可以从化学合成的寡核苷酸(例如，如Kutmeier等人，BioTechniques 17：242(1994)中所述)组装编码该抗体的多核苷酸，这简单地包括合成重叠的含有编码该抗体的部分序列的寡核苷酸，将那些寡核苷酸退火并连接，并且然后将连接的寡核苷酸通过PCR进行扩增。
或者，可以由来自适合来源的核酸产生编码RON抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸。如果含有编码特定抗体的核酸的克隆是不可得的但该抗体分子的序列是已知的，那么编码所述抗体的核酸可以化学合成或者从适合的来源(例如抗体cDNA文库，或者从表达所述抗体或其它RON抗体的任何组织或细胞(例如被选择来表达抗体的杂交瘤细胞)所产生的cDNA文库或从中所分离的核酸，优选为poly A+RNA)通过如下手段获得以便确定例如来自编码所述抗体或其它RON抗体的cDNA文库的cDNA克隆，所述手段是通过使用可与序列的3’和5’端杂交的合成引物进行PCR扩增或者通过使用对特定基因序列有特异性的寡核苷酸探针进行克隆。然后使用本领域熟知的任何方法将通过PCR产生的扩增的核酸克隆到可复制的克隆载体中。
确定了RON抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的核苷酸序列和相应的氨基酸序列之后，可以使用本领域熟知的用于操作核苷酸序列的方法例如重组DNA技术、位点定向诱变、PCR等(参见例如在Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆实验手册)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)和Ausubel等人编辑，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新实验方案)，John Wiley & Sons，NY(1998)中所描述的技术，二者的全文以引用的方式并入本文)来操作它的核苷酸序列，以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸取代、缺失和/或插入。
编码RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸所组成，所述多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。例如，编码RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由单链和双链DNA、作为单链和双链区域的混合物的DNA、单链和双链RNA以及作为单链和双链区域的混合物的RNA、包括可能是单链的或更通常地是双链的或者单链和双链区域混合物的DNA和RNA在内的杂交分子所组成。另外，编码RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由三链区域所组成，其包括RNA或DNA或者RNA和DNA二者。编码RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸还可含有一个或多个修饰的碱基或者为了稳定性或其它原因而修饰的DNA或RNA骨架。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和不常见的碱基例如肌苷。可以对DNA和RNA进行各种修饰；因此，“多核苷酸”包括化学地、酶促地或代谢地修饰的形式。
可通过将一个或多个核苷酸取代、添加或缺失引入免疫球蛋白的核苷酸序列中从而将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入被编码的蛋白来产生编码来源于免疫球蛋白的多肽(例如免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的非天然变体的分离的多核苷酸。可以通过标准的技术例如位点定向诱变和PCR介导的诱变来引入突变。优选地，在一个或多个非必需氨基酸残基上进行保守的氨基酸取代。
V.RON抗体多肽
本发明还涉及构成RON抗体的分离的多肽，以及编码这种多肽的多核苷酸。本发明的RON抗体包括多肽例如编码来源于免疫球蛋白分子的RON特异性抗原结合区的氨基酸序列。“来源于”指定蛋白的多肽或氨基酸序列是指具有某种氨基酸序列的多肽的起源。在某些情况下，来源于特定起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列具有与该起始序列或其一部分基本上相同或者可以由本领域普通技术人员确定为在起始序列中具有其起源的氨基酸序列，其中所述部分是由至少10-20个氨基酸、至少20-30个氨基酸、至少30-50个氨基酸所组成的。
在一个实施方案中，本发明提供分离的多肽，其包括、基本上由或者由免疫球蛋白重链可变区(VH)所组成，其中所述重链可变区VH-CDR中的至少一个或所述重链可变区VH-CDR中的至少两个与来自本文公开的单克隆RON抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同。或者，VH的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区与来自本文公开的单克隆RON抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同。尽管VH-CDR可由Kabat系统限定，但其它CDR定义例如由Chothia系统限定的VH-CDR也包括在本发明中。在某些实施方案中，包含所述VH的抗体或抗原结合片段特异性或优先地结合RON。
在一些实施方案中，本发明提供分离的多肽，其包括、基本上由或者由免疫球蛋白重链可变区(VH)所组成，在其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区除了在所述VH-CDR中的至少一个上的1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸取代之外具有选自由以下组成的组的多肽序列：SEQ ID NO：5、6和7；SEQ ID NO：15、16和17；SEQ ID NO：25、26和27；SEQ ID NO：35、36和37；SEQ ID NO：45、46和47；SEQ ID NO：55、56和57；SEQ ID NO：65、66和67；SEQ ID NO：75、76和77；SEQ ID NO：85、86和87；SEQ ID NO：95、96和97；SEQ ID NO：116、117和118；SEQ ID NO：126、127和128；SEQ ID NO：136、137和138；以及SEQ IDNO：146、147和148。
在一些实施方案中，本发明提供分离的多肽，其包括、基本上由或者由免疫球蛋白重链可变区(VH)所组成，在其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有选自由以下组成的组的多肽序列：SEQ ID NO：5、6和7；SEQ ID NO：15、16和17；SEQ ID NO：25、26和27；SEQ ID NO：35、36和37；SEQ ID NO：45、46和47；SEQ ID NO：55、56和57；SEQ ID NO：65、66和67；SEQ ID NO：75、76和77；SEQ ID NO：85、86和87；SEQID NO：95、96和97；SEQ ID NO：116、117和118；SEQ ID NO：126、127和128；SEQ ID NO：136、137和138；以及SEQ ID NO：146、147和148。
在另外的实施方案中，本发明包括分离的多肽，其包括、基本上由或者由与参考VH多肽氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的VH多肽所组成，所述参考VH多肽序列选自由4、14、24、34、44、54、64、74、84、94、115、125、135和145组成的组。在某些实施方案中，含有所述VH多肽的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至RON。
在另一方面，本发明包括分离的多肽，其包括、基本上由或者由选自由SEQ ID NO：4、14、24、34、44、54、64、74、84、94、115、125、135和145组成的组的VH多肽所组成。在某些实施方案中，含有所述VH多肽的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至RON。
在某些实施方案中，包括、基本上由或者由一种或多种上述VH多肽所组成的抗体或其抗原结合片段特异性地或优先地结合至与参考单克隆Fab抗体片段(选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组)或参考单克隆抗体(选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组)相同的RON表位，或者将竞争性地抑制这样的单克隆抗体或片段与RON的结合。
在某些实施方案中，包括、基本上由或者由一种或多种上述VH多肽所组成的抗体或其抗原结合片段以解离常数(KD)所表征的亲和力特异性地或优先地结合至RON多肽或其片段或者RON变体多肽，所述解离常数(KD)不大于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的多肽，其包括、基本上由或者由免疫球蛋白轻链可变区(VL)所组成，其中所述轻链可变区VL-CDR中的至少一个或所述轻链可变区VL-CDR中的至少两个与来自本文公开的单克隆RON抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同。或者，VL的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区与来自本文公开的单克隆RON抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同。尽管VL-CDR可由Kabat系统限定，但其它CDR定义例如由Chothia系统限定的VL-CDR也包括在本发明中。在某些实施方案中，包含所述VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先地结合RON。
在一些实施方案中，本发明提供分离的多肽，其包括，基本上由或者由免疫球蛋白轻链可变区(VL)所组成，在其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区除了在所述VL-CDR中的至少一个上的1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸取代之外具有选自由以下组成的组的多肽序列：SEQID NO：10、11和12；SEQ ID NO：20、21和22；SEQ ID NO：30、31和32；SEQ ID NO：40、41和42；SEQ ID NO：50、51和52；SEQ ID NO：60、61和62；SEQ ID NO：70、71和72；SEQ ID NO：80、81和82；SEQ ID NO：90、91和92；SEQ ID NO：100、101和102；SEQ ID NO：121、122和123；SEQ ID NO：131、132和133；SEQ ID NO：141、142和143；以及SEQ IDNO：151、152和153。
在一些实施方案中，本发明提供分离的多肽，其包括、基本上由或者由免疫球蛋白重链可变区(VL)所组成，在其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有选自由以下组成的组的多肽序列：SEQ ID NO：10、11和12；SEQ ID NO：20、21和22；SEQ ID NO：30、31和32；SEQ ID NO：40、41和42；SEQ ID NO：50、51和52；SEQ ID NO：60、61和62；SEQ ID NO：70、71和72；SEQ ID NO：80、81和82；SEQ ID NO：90、91和92；SEQID NO：100、101和102；SEQ ID NO：121、122和123；SEQ ID NO：131、132和133；SEQ ID NO：141、142和143；以及SEQ ID NO：151、152和153。
在另外的实施方案中，本发明包括分离的多肽，其包括，基本上由或者由与参考VL多肽序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的VL多肽所组成，其中所述参考VL多肽序列选自由SEQ ID NO：9、19、29、39、49、59、69、79、89、99、120、130、140和150组成的组。在某些实施方案中，含有所述VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至RON。
在另一方面，本发明包括分离的多肽，其包括，基本上由或者由选自由SEQ ID NO：9、19、29、39、49、59、69、79、89、99、120、130、140和150组成的组的VL多肽所组成。在某些实施方案中，含有所述VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至RON。
在某些实施方案中，包括、基本上由或者由一种或多种上述VL多肽所组成的抗体或其抗原结合片段特异性地或优先地结合至与参考单克隆Fab抗体片段(选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组)或参考单克隆抗体(选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B 10组成的组)相同的RON表位，或者将竞争性地抑制这样的单克隆抗体或片段与RON的结合。
在某些实施方案中，包括、基本上由或者由一种或多种上述VL多肽所组成的抗体或其抗原结合片段以解离常数(KD)所表征的亲和力特异性地或优先地结合至RON多肽或其片段或者RON变体多肽，所述解离常数(KD)不大于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×106M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M。
在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段包括、基本上由或者由VH多肽和VL多肽组成，其中所述VH多肽和VL多肽分别与参考VH和VL多肽氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同，所述参考VH和VL多肽氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4和9、14和19、24和29、34和39、44和49、54和59、64和69、74和79、84和89、94和99、115和120、125和130、135和134、以及145和150组成的组。在某些实施方案中，含有这些VH和VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至RON。
上述任何多肽还可包括另外的多肽，例如指导被编码的多肽的分泌的信号肽、本文所述的抗体恒定区或本文所述的其它异源性多肽。另外，如其它地方所述，本发明的多肽包括多肽片段。另外，如本文所述，本发明的多肽包括融合多肽、Fab片段和其它衍生物。
而且，如本文其它地方更详细描述的，本发明包括含有上述多肽的组合物。
本领域普通技术人员还将理解，可以修饰本文所公开的RON抗体多肽以使它们在氨基酸序列上与天然存在的结合多肽不同，其中所述RON抗体多肽来源于这些天然存在的结合多肽。例如，来源于指定蛋白的多肽或氨基酸序列可以是相似的，例如与起始序列具有某种百分比同一性，例如，它可以与起始序列60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相同。
此外，可以进行导致在“非必需的”氨基酸区域的保守取代或改变的核苷酸或氨基酸取代、缺失或插入。例如，来源于指定蛋白的多肽或氨基酸序列可以除了一个或多个单个氨基酸取代、插入或缺失之外与起始序列相同，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个或更多单个氨基酸取代、插入或缺失。来源于指定蛋白的多肽或氨基酸序列可以除了一个或多个单个氨基酸取代、插入或缺失之外与起始序列相同，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个或更多单个氨基酸取代、插入或缺失。在其它实施方案中，来源于指定蛋白的多肽或氨基酸序列除了2个或更少、3个或更少、4个或更少、5个或更少、6个或更少、7个或更少、8个或更少、9个或更少、10个或更少、15个或更少或者20个或更少的单个氨基酸取代、插入或缺失之外可以与起始序列相同。在某些实施方案中，来源于指定蛋白的多肽或氨基酸序列相对于起始序列具有1至5个、1至10个、1至15个或1至20个单个氨基酸取代、插入或缺失。
本发明的某些RON抗体多肽包括、基本上由或者由来源于人类氨基酸序列的氨基酸序列所组成。然而，某些RON抗体多肽包括来源于另一哺乳动物物种的一个或多个连续的氨基酸。例如，本发明的RON抗体可包括灵长类重链部分、铰链部分或抗原结合区。在另一个例子中，一种或多种来源于鼠的氨基酸可存在于非鼠抗体多肽中，例如在RON抗体的抗原结合位点中。在另一个例子中，RON抗体的抗原结合位点完全是鼠的。在某些治疗应用中，设计RON特异性的抗体或其抗原结合片段、变体或类似物以使其在施用所述抗体的动物中不是免疫原性的。
在某些实施方案中，RON抗体多肽包括通常不与抗体缔合的氨基酸序列或者一个或多个部分。下面更详细地描述了示例性的修饰。例如，本发明的单链Fv抗体片段可包括柔性连接序列，或可被修饰以添加功能性部分(例如PEG、药物、毒素或标记物)。
本发明的RON抗体多肽可包括，基本上由或者由融合蛋白所组成。融合蛋白是嵌合分子，其包括例如具有至少一个靶结合位点的免疫球蛋白抗原结合结构域，以及至少一个异源性部分即在性质上是与免疫球蛋白抗原结合结构域非天然连接的部分。氨基酸序列通常可存在于被集合在融合多肽的不同蛋白中，或者它们通常可存在于相同蛋白中但在融合多肽中以新的排列安置。可以通过例如化学合成或通过产生和翻译多核苷酸来产生融合蛋白，其中所述多核苷酸中的肽区域以期望的关系被编码。
应用于多核苷酸或多肽的术语“异源性的”是指多核苷酸或多肽来源于与被比较的其它实体不同的实体。例如，如本文所用，待融合至RON抗体、或其抗原结合片段、变体或类似物的“异源性的多肽”来源于相同物种的非免疫球蛋白多肽，或者不同物种的免疫球蛋白或非免疫球蛋白多肽。
“保守的氨基酸取代”是这样的取代，在其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所替换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基优选地被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基所替换。在另一个实施方案中，一串氨基酸可被结构上相似但在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同的一串所替换。
或者，在另一个实施方案中，可沿着免疫球蛋白编码序列的全部或部分通过例如饱和诱变来随机地引入突变，并且可将所得的突变体并入RON抗体以用于本文公开的诊断和治疗方法，并筛选其结合至期望的抗原例如RON的能力。
VI.融合蛋白和抗体轭合物
如本文其它地方更详细地讨论的，本发明的RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物还可以在N端或C端被重组地融合至异源性多肽，或化学地轭合(包括共价和非共价轭合)至多肽或其它组合物。例如，RON特异性的RON抗体可被重组地融合或轭合至在检测测定中作为标记物有用的分子和效应分子，如异源性多肽、药物、放射性核素或毒素。参见例如PCT公布WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利第5,314,995号和EP 396,387。
本发明的RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物包括被修饰的衍生物，即，通过将任何类型的分子共价连接至抗体以致共价连接不阻止抗体与RON的结合。例如但不进行限制，抗体衍生物包括已经通过例如如下方式进行修饰的抗体：糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酰化(phosphylation)、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封端基团的衍生化、蛋白酶剪切、与细胞配体或其它蛋白的连接等。可以通过已知技术进行许多化学修饰中的任一种，其包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外地，衍生物可含有一种或多种非经典的氨基酸。
本发明的RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物可由通过肽键或修饰的肽键(即肽等排体)互相连接的氨基酸组成，并且可含有除了20个基因编码的氨基酸之外的氨基酸。可通过天然过程(例如翻译后加工)或本领域公知的化学修饰技术来修饰RON特异性抗体。在基础教科书中、在更详细的专题著作中、并在大量的研究文献中很好地描述了这些修饰。修饰可发生在RON特异性抗体中任何地方，其包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端，或在如碳水化合物等部分上。将理解的是，相同类型的修饰可以相同或不同程度地存在于给定的RON特异性抗体的若干位点。而且，给定的RON特异性抗体可含有许多类型的修饰。RON特异性抗体可以由于例如泛素化而是分支的，并且它们可以是含有或不含分支的环状。环状的、分支的和分支环状的RON特异性抗体可从翻译后的天然过程得到，或可以通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚的形成、羟基化、碘化、甲基化、十四酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、转运RNA介导的氨基酸向蛋白的添加例如精氨酰化(arginylation)和泛素化。(参见例如Proteins-Structure And Molecular Properties(蛋白-结构和分子特性)，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York第2版，(1993)；Posttranslational Covalent Modification Of Proteins(蛋白的翻译后共价修饰)，B.C.Johnson编辑，Academic Press，New York，第1-12页(1983)；Seifter等人，Meth.Enzymol.182：626-646(1990)；Rattan等人，Ann.NY Acad.Sci.663：48-62(1992))。
本发明还提供这样的融合蛋白，其包括RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物和异源性多肽。与抗体融合的异源性多肽对功能可能是有用的，或者对表达靶RON多肽的细胞是有用的。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包括、基本上由或者由具有本发明抗体的任何一个或多个VH区的氨基酸序列或本发明抗体的任何一个或多个VL区的氨基酸序列的多肽或其片段或变体、和异源性多肽序列组成。在另一个实施方案中，用于本文公开的诊断和治疗方法的融合蛋白包括、基本上由或者由具有RON特异性抗体、或其片段、变体或衍生物的任何一个、两个、三个VH-CDR的氨基酸序列，或者具有RON特异性抗体、或其片段、变体或衍生物的任何一个、两个、三个VL-CDR的氨基酸序列的多肽和异源性多肽序列组成。在一个实施方案中，融合蛋白包括具有本发明的RON特异性抗体、或其片段、衍生物或变体的VH-CDR3的氨基酸序列的多肽和异源性多肽序列，所述融合蛋白特异性地结合至RON的至少一个表位。在另一个实施方案中，融合蛋白包括具有本发明的RON特异性抗体的至少一个VH区的氨基酸序列和本发明的RON特异性抗体的至少一个VL区的氨基酸序列的多肽，或者其片段、衍生物或变体，以及异源性多肽序列。优选地，融合蛋白的VH和VL区对应于特异性地结合RON的至少一个表位的单个来源的抗体(或scFv或Fab片段)。在又一个实施方案中，用于本文公开的诊断和治疗方法的融合蛋白包括这样的多肽，其具有RON特异性抗体的任何一个、两个、三个或更多个VH CDR的氨基酸序列和RON特异性抗体的任何一个、两个、三个或更多个VL CDR的氨基酸序列的多肽，或者其片段或变体，以及异源性多肽序列。优选地，两个、三个、四个、五个、六个或更多个VH-CDR或VL-CDR对应于本发明的单个来源的抗体(或scFv或Fab片段)。编码这些融合蛋白的核酸分子也包括在本发明中。
文献中报道的示例性融合蛋白包括以下物质的融合蛋白：T细胞受体(Gascoigne等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：2936-2940(1987))；CD4(Capon等人，Nature 337：525-531(1989)；Traunecker等人，Nature339：68-70(1989)；Zettmeissl等人，DNA Cell Biol.USA 9：347-353(1990)；和Byrn等人，Nature 344：667-670(1990))；L-选择蛋白(归巢受体)(Watson等人，J.Cell.Biol.110：2221-2229(1990)；和Watson等人，Nature349：164-167(1991))；CD44(Aruffo等人，Cell 61：1303-1313(1990))；CD28和B7(Linsley等人，J.Exp.Med.173：721-730(1991))；CTLA-4(Lisley等人，J.Exp.Med.174：561-569(1991))；CD22(Stamenkovic等人，Cell66：1133-1144(1991))；TNF受体(Ashkenazi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10535-10539(1991)；Lesslauer等人，Eur.J.Immunol.27：2883-2886(1991)；和Peppel等人，J.Exp.Med.174：1483-1489(1991))；以及IgE受体a(Ridgway和Gorman，J.Cell.Biol.第115卷，摘要号1448(1991))。
如本文其它地方所讨论的，本发明的RON抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物可被融合至异源性多肽以增加多肽的体内半衰期或者供使用本领域已知方法的免疫测定中使用。例如，在一个实施方案中，可将PEG轭合至本发明的RON抗体以增加其体内半衰期。Leong，S.R.等人，Cytokine16：106(2001)；Adv.in Drug Deliv.Rev.54：531(2002)；或Weir等人，Biochem.Soc.Transactions 30：512(2002)。
此外，本发明的RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物可被融合至标志物序列(例如肽)以促进它们的纯化或检测。在优选的实施方案中，标志物氨基酸序列是六组氨酸肽，例如在pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259Eton Avenue，Chatsworth，Calif.，91311)中提供的标签，除此之外，许多其它的也可以市售的方式获得。如Gentz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：821-824(1989)中所述，例如，六组氨酸提供融合蛋白的方便的纯化。对纯化有用的其它肽标签包括但不限于“HA”标签和“flag”标签，所述“HA”标签对应于来源于流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人，Cell 37：767(1984))。
融合蛋白可以利用本领域熟知的方法来制备(参见，例如美国专利第5,116,964和5,225,538号)。可以根据经验选择进行融合的确切位点以便优化融合蛋白的分泌或结合特性。然后编码融合蛋白的DNA被转染到宿主细胞内进行表达。
能够以未轭合的形式使用本发明的RON抗体，或可将其轭合至各种分子中的至少一个以例如改进该分子的治疗特性，促进靶检测或用于患者的成像或治疗。当进行纯化时，本发明的RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物可在纯化之前或之后被标记或轭合。
特别地，本发明的RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物可被轭合至治疗剂、前体药物、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药剂或PEG。
本领域技术人员将理解，还可使用各种技术将轭合物组装，其取决于待轭合的所选剂。例如，通过将结合多肽与激活的生物素的酯(例如生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯)进行反应来制备含生物素的轭合物。相似地，可在偶联剂例如本文所列的那些偶联剂存在下，或通过与异硫氰酸酯(优选为荧光素-异硫氰酸酯)进行反应来制备含荧光标志物的轭合物。以类似的方式来制备本发明的RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的轭合物。
本发明还包括轭合至诊断剂或治疗剂的RON抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。可在诊断上使用RON抗体以例如监测神经疾病的形成或演变，其作为临床检验步骤的一部分以例如确定给定治疗和/或预防方案的效力。可通过将RON抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物偶联至可检测的物质以便于检测。可检测的物质的例子包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、使用各种正电子发射断层摄影术的发射正电子的金属和非放射性顺磁金属离子。参见例如美国专利第4,741,900号中可被与根据本发明的用于诊断的抗体轭合的金属离子。适合的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合物的例子包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适合的荧光物质的例子包括伞形花内酯、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括鲁米诺；生物发光物质的例子包括荧光素酶、虫荧光素和水母发光蛋白；并且适合的放射性物质的例子包括125I、131I、111In或99Tc。
RON抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还可以通过将它轭合至化学发光化合物而被可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中产生的发光的存在来确定化学发光标记的RON抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的例子是鲁米诺、异鲁米诺、热性吖啶酯(theromaticacridinium ester)、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
可将RON抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可检测地标记的方法中的一种是通过将其连接至酶并在酶免疫测定(EIA)中利用连接的产物(Voller，A.，“The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)(酶联免疫吸附测定(ELISA))”Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersville，Md.，Diagnostic Horizons 2：1-7(1978))；Voller等人，J.Clin.Pathol.31：507-520(1978)；Butler，J.E.，Meth.Enzymol.73：482-523(1981)；Maggio，E.(编辑)，Enzyme Immunoassay(酶的免疫测定)，CRC Press，BocaRaton，Fla.，(1980)；Ishikawa，E.等人，(编辑)，Enzyme Immunoassay(酶的免疫测定)，Kgaku Shoin，Tokyo(1981))。结合至RON抗体的酶将与合适的底物(优选地显色底物)以产生可通过例如分光光度计测量的、荧光的或目视手段检测的化学部分的方式发生反应。可被用来可检测地标记抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。另外，可通过使用酶的显色底物的比色法来完成检测。还可通过将底物的酶反应程度与相似地制备的标准物进行视觉对比来完成检测。
还可使用各种其它免疫测定中的任一种来完成检测。例如，通过RON抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的放射性标记，可能通过使用放射免疫测定(RIA)来检测该抗体(参见例如Weintraub，B.，Principles ofRadioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand AssayTechniques(放射免疫测定原理，放射配体测定技术的第七次培训课程)，The Endocrine Society，(1986年3月)，其以引用的方式并入本文)。可通过一些手段来检测放射性同位素，包括但不限于伽玛计数器、闪烁计数器或放射自显影法。
还可使用发射荧光的金属例如152Eu或镧系的其它元素来可检测地标记RON抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。可使用诸如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)这类金属螯合基团来将这些金属连接至所述抗体。
用于将各种部分轭合至RON抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的技术是熟知的，参见例如Arnon等人，“Monoclonal Antibodies ForImmunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy(癌症疗法中用于药物免疫靶向的单克隆抗体)”，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症疗法)中，Reisfeld等人(编辑)，第243-56页(Alan R.Liss，Inc.(1985)；Hellstrom等人，“Antibodies For Drug Delivery(用于药物递送的抗体)”，Controlled Drug Delivery(受控的药物递送)(第2版)中，Robinson等人(编辑)，Marcel Dekker，Inc.，第623-53页(1987)；Thorpe，“AntibodiesCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review(癌症疗法中细胞毒性剂的抗体载体：综述)”，Monoclonal Antibodies′84：Biological AndClinical Applications(单克隆抗体’84：生物和临床应用)中，Pinchera等人(编辑)，第475-506页(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective OfThe Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy(癌症疗法中放射性标记的抗体的治疗用途的分析、结果和未来展望)”，MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy(用于癌症检测和疗法的单克隆抗体)中，Baldwin等人(编辑)，Academic Press，第303-16页(1985)；以及Thorpe等人，“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-ToxinConiugates(抗体-毒素轭合物的制备和细胞毒特性)”，Immunol.Rev.62：119-58(1982)。
具体地，用于本文公开的诊断和治疗方法中的结合分子，例如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段可轭合于细胞毒素(诸如放射性同位素、细胞毒性药物或毒素)、治疗剂、细胞抑制剂、生物毒素、前体药物、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药剂、免疫活性配体(例如淋巴因子或其它抗体，其中所得分子既结合赘生性细胞，又结合效应细胞，诸如T细胞)、或PEG。在另一个实施方案中，用于本文公开的诊断和治疗方法中的结合分子，例如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段可以与减少肿瘤的血管化作用的分子轭合。在其它实施方案中，公开的组合物可包含偶联了药物或前体药物的结合分子，例如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段。本发明的再其它实施方案包括轭合了特异性生物毒素(诸如蓖麻毒蛋白、白树毒素、假单胞菌外毒素或白喉毒素)或其细胞毒性片段的结合分子，例如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段的用途。使用的轭合或未轭合的结合分子的选择取决于癌症的类型和阶段、辅助治疗(例如化疗或外部辐射)的使用以及患者的状况。应当意识到，本领域技术人员根据本文的教导可以容易地做出这类选择。
应当意识到，在以前的研究中，标记了同位素的抗肿瘤抗体已被成功地用于在动物模型中以及在一些情况下在人类中破坏实体瘤的细胞以及淋巴瘤/白血病细胞。示例性放射性同位素包括：90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re和188Re。放射性核素通过产生电离辐射而起作用，所述电离辐射引起核DNA多处链断裂，导致细胞死亡。用于产生治疗性轭合物的同位素典型地产生具有短路径长度的高能α或β粒子。这些放射性核素杀伤其邻近的细胞，例如该轭合物所附着的或已经进入的赘生性细胞。它们对非定位的细胞几乎无作用或完全无作用。放射性核素基本上是无免疫原性的。
在与本发明一起的放射标记轭合物的使用方面，结合分子，例如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段可以被直接标记(诸如通过碘化)或可以通过利用螯合剂来间接标记。本文所用的短语“间接标记”和“间接标记方法”均意味着将螯合剂共价地连接结合分子，而将至少一种放射性核素与该螯合剂相关联。这些螯合剂通常是指双功能螯合剂，因为它们既能结合多肽，又能结合放射性同位素。特别优选的螯合剂包括1-异硫氰酸苄基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(1-isothiocycmatobenzyl-3-methyldiothelene triaminepentaacetic acid)(″MX-DTPA″)和环己基二乙烯三胺五乙酸(″CHX-DTPA″)衍生物。其它螯合剂包括P-DOTA和EDTA衍生物。特别优选的用于间接标记的放射性核素包括111In和90Y。
本文所用的短语“直接标记”和“直接标记方法”均意味着将放射性核素直接共价地连到多肽上(通常借助氨基酸残基)。更具体的说，这些连接技术包括随机标记和定点标记。在后一种情况中，将标记定点到多肽上的特定位点，诸如仅存在于轭合物Fc部分上的N-连接的糖残基。此外，各种直接标记技术和实验方案是适用于本发明的。例如，锝-99标记的多肽可以通过配体交换过程来制备，即通过用二价锡离子溶液还原锝酸盐(pertechnate)(TcO4-)，将被还原的锝螯合到Sephadex柱上，并将结合多肽施加到该柱上；或者通过批量标记技术制备，例如通过将锝酸盐、还原剂(诸如SnCl2)、缓冲液(诸如邻苯二甲酸钠钾溶液)、以及抗体一起孵育。在任何情况中，用于直接标记抗体的优选放射性核素是本领域公知的，并且用于直接标记的特别优选的放射性核素是通过酪氨酸残基共价连接的131I。用于本文公开的诊断和治疗方法中的结合分子，例如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段可以用例如放射性碘化钠或碘化钾和化学氧化剂(诸如次氯酸钠、氯胺T或类似物质)，或者酶促氧化剂(诸如乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和葡萄糖)来获得。
关于螯合剂和螯合轭合物的专利是本领域已知的。例如，Gansow的美国专利第4,831,175号涉及多重取代的二乙烯三胺五乙酸螯合物，和含有该螯合物的蛋白轭合物，以及它们的制备方法。Gansow的美国专利第5,099,069、5,246,692、5,286,850、5,434,287和5,124,471号还涉及到多重取代的DTPA螯合物。这些专利的全文均以引用的方式并入本文。适用的金属螯合剂的其它例子是乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DPTA)、1，4，8，11-四氮杂十四烷(tetraazatetradecane)、1，4，8，11-四氮杂十四烷-1，4，8，11-四乙酸、1-氧代-4，7，12，15-四氮杂十七烷-4，7，12，15-四乙酸或类似物。环己基-DTPA或CHX-DTPA是特别优选的，并且在下文有大量的例子。还有其它一些适用的螯合剂，包括那些还有待发现的螯合剂，可能很容易地被技术人员识别，并且显然在本发明的范围内。
优选地选择美国专利第6,682,134、6,399,061和5,843,439号(其全文以引用的方式并入本文)中用于协助螯合的相容螯合剂，包括特异性双功能螯合剂来提供对三价金属的高亲合力，显示升高的肿瘤对非肿瘤比率，骨吸收下降以及更高的放射性核素在体内目标部位(即B细胞淋巴瘤肿瘤位点)的停留。然而，其它可能具备或可能不具备所有这些特点的双功能性螯合剂是本领域已知的，并且也有益于肿瘤治疗。
还应当意识到，与本文的教导一致，为了诊断和治疗目的，结合分子可以与不同的放射性标记轭合。为了这个目的，前面提到的美国专利第6,682,134、6,399,061和5,843,439号公开了放射性标记的治疗轭合物，其用于在施用治疗抗体前进行肿瘤的诊断“成像”。“In2B8”轭合物包含对人类CD20抗原具有特异性的小鼠单克隆抗体2B8，该抗体借助双功能螯合剂连接于111In，所述螯合剂即是包含1-异硫氰苄基-3-甲基-DTPA和1-甲基-3-异硫氰苄基-DTPA的1∶1混合物的MX-DTPA(二乙烯三胺五乙酸)。111In作为诊断放射性核素是特别优选的，因为在约1到约10mCi之间可以安全地施用而没有可检测到的毒性；并且成像数据通常可以预测后续的90Y标记的抗体分布。多数成像研究使用5mCi 111In标记的抗体，因为这个剂量既安全又比更低剂量的成像效果好，最佳成像发生在施用抗体后的3到6天。参见，例如Murray，J.Nuc.Med.26：3328(1985)和Carraguillo等人，J.Nuc.Med.26：67(1985)。
如上文所指出，有许多放射性核素可以用于本发明，并且本领域技术人员可以容易地确定各种情况下，哪种放射性核素是最合适的。例如，131I是公知用于靶向免疫治疗的放射性核素。然而，131I的临床应用可能受到几个因素的限制，包括：8天的物理半衰期；碘化抗体在血液和肿瘤部位的脱卤作用；以及发射特性(例如，γ成分高)，这对肿瘤局部剂量蓄积可能是次优状态。随着更佳螯合剂的出现，连接金属螯合基团与蛋白的机会提高了利用其它放射性核素诸如111In和90Y的机会。90Y提供了几个用于放射免疫治疗应用的益处：64小时的90Y的半衰期足以允许肿瘤的抗体积累；并且与例如131I不同，90Y是单纯的高能β发射体，在其衰变过程中不伴随γ辐射；辐射范围在100到1,000细胞直径的组织内。另外，最低贯穿辐射量使得可以门诊施用90Y-标记的抗体。此外，细胞杀伤不要求标记抗体的内化，并且电离辐射的局部发射对没有靶分子的临近肿瘤细胞应该是致死性的。
另一种用于轭合结合分子，例如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段的优选药剂是细胞毒性药物，特别是用于癌症治疗的那些细胞毒性药物。如本文所用，“细胞毒素或细胞毒性剂”意味着对细胞的生长和增殖有害的任何试剂，并且其可能表现为减少、抑制或破坏细胞和恶性肿瘤。示例性的细胞毒素包括但不限于，放射性核素、生物毒素、酶促活性毒素、细胞抑制剂或细胞毒性治疗剂、前体药物、免疫活性配体和生物反应调节剂(诸如细胞因子)。任何表现为阻滞或减慢免疫反应性细胞或恶性肿瘤细胞生长的细胞毒素均在本发明范围内。
示例性细胞毒素通常包括，细胞抑制剂、烷化剂、抗代谢物、抗增殖剂、微管蛋白结合剂、激素和激素拮抗剂、和类似的细胞毒素。适用于本发明的示例性细胞抑制剂包括烷化物质，诸如双氯乙基甲胺、三亚乙基磷酰胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、美法仑或三亚胺醌，还有亚硝基脲化合物，诸如卡莫司汀、洛莫司汀或司莫司汀。其它优选的细胞毒性剂类别包括例如类美登素(maytansinoid)族的药物。其它优选的细胞毒试剂种类包括，例如蒽环霉素(anthracycline)族药物、长春花属药物、丝裂霉素、博莱霉素、细胞毒性核苷、蝶啶族药物、二炔类(diynene)以及鬼臼毒素。这些种类中特别有用的成员包括，例如阿霉素、洋红霉素(carminomycin)、柔红霉素(道诺霉素)、多柔比星(doxorubicin)、氨基喋呤(aminopterin)、氨甲蝶呤、甲基叶酸(methopterin)、光辉霉素(mithramycin)、链黑菌素(streptonigrin)、二氯甲氨蝶呤、丝裂霉素C、放线菌素D、泊非霉素(porfiromycin)、5-氟尿嘧啶、氟尿苷(fioxuridine)、替加氟(ftorafur)、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞嘧啶(cytosinearabinoside)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)或鬼臼毒素衍生物(诸如依托泊苷(etoposide)或磷酸依托泊苷)、美法仑(melphalan)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、异长春碱(leurosidine)、长春地辛(vindesine)、环氧长春碱(leurosine)及类似物。还有其他适用于本文教导的细胞毒素包括紫杉酚、紫杉烷(taxane)，松胞菌素B(cytochalasinB)，短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭、吐根碱(emetine)，替尼泊苷(tenoposide)，秋水仙碱(colchicin)、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、心得安(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)以及它们的类似物或同系物。激素和激素拮抗剂，诸如皮质类固醇，例如泼尼松(Prednisone)；孕激素，例如羟基孕酮或甲羟孕酮(medroprogesterone)；雌激素，例如己烯雌酚(diethylstilbestrol)；抗雌激素，例如他莫昔芬；雄激素，例如睾酮，以及芳香酶抑制剂，例如氨鲁米特(aminogluthetimide)也适用于本文的教导。本领域技术人员可以对所需化合物进行化学修饰，从而为了制备本发明的轭合物的目的使得该化合物的反应更方便。
特别优选的细胞毒素的一个实例包含抗肿瘤抗生素中烯二炔(enediyne)家族的成员或衍生物，包括刺孢霉素(calicheamicin)、埃斯培拉霉素(esperamicin)或达内霉素(dynemicin)。这些毒素非常强力，并且通过切割核DNA起作用，导致细胞死亡。与能被体内切割产生许多无活性但是有免疫原性的多肽片段的蛋白毒素不同，象刺孢霉素、埃斯培拉霉素和其它烯二炔类毒素是基本没有免疫原性的小分子。这些非肽毒素是通过以前用于标记单克隆抗体和其它分子的技术以化学方式连接到二聚体或四聚体上。这些连接技术包括经由只存在于构建体Fc部分上的N-连接的糖残基发生的位点特异性连接。这种定点连接方法的优点是减少了连接对构建体的结合特性的可能的影响。
如前面提到的，用于制备轭合物的相容的细胞毒素可以包含前体药物。本文所用的术语“前体药物”是指药物活性物质的前体或衍生物形式，与亲本药物相比，它们对肿瘤细胞的细胞毒性低，并且能被酶促活化或转化成活性更高的亲本形式。适用于本发明的前体药物包括但不限于，含磷酸酯的前体药物、含硫代磷酸酯的前体药物、含硫酸酯的前体药物、含肽的前体药物、含β-内酰胺的前体药物，含有任选地取代的苯氧乙酰胺的前体药物或含有任选地取代的苯乙酰胺的前体药物、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物，它们能被转化为细胞毒性更高的游离型药物。可以衍生成前体药物形式用于本发明的细胞毒性药物的其他实例包括上面描述过的那些化疗剂。
在其它细胞毒素中，将理解的是，本文公开的结合分子，例如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段还可与生物毒素相缔合或轭合，所述生物毒素例如蓖麻毒蛋白A亚基、相思豆毒素、白喉毒素、肉毒杆菌毒素、蓝藻毒素(cyanginosin)、蛤蚌毒素(saxitoxin)、志贺毒素、破伤风、河豚毒素、单端孢霉烯毒素(trichothecene)、疣孢青霉原(verrucologen)或毒性酶。优选地，将使用允许抗体-毒素构建体的直接表达的基因工程技术来制备这种构建体。可与本文公开的结合分子，例如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段相缔合的其它的生物反应调节剂包括细胞因子，例如淋巴因子和干扰素。鉴于本公开，认为本领域技术人员可容易地使用常规技术形成这种构建体。
可用来与所公开的结合分子，例如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段缔合或轭合的另一类相容的细胞毒素是放射性敏化药物，其可有效地针对肿瘤细胞或免疫活性细胞。这种药物增强对电离辐射的敏感性，从而增加放射疗法的效力。被肿瘤细胞内化的抗体轭合物将把放射性敏化剂递送至较接近核处，在该处放射性敏化作用将是最大的。连接了未结合的放射性敏化剂的本发明的结合分子将被快速地从血液清除，将余下的放射性敏化剂定位在靶肿瘤中并在正常组织中提供最小吸收。在从血液快速清除之后，将以下面三种方法之一与相同靶向抗体一起施用附助放射疗法：1.)特别针对肿瘤的外部激光辐射，2.)直接植入肿瘤的放射性或3.)全身放射免疫疗法。该方法潜在的有吸引力的变化是将治疗性放射性同位素连接至放射性敏化的免疫轭合物，从而为了给患者施用单种药物提供方便。
在某些实施方案中，可以轭合增强结合分子，例如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段的稳定性或效力的部分。例如，在一个实施方案中，可将PEG轭合至本发明的结合分子以增加它们的体内半衰期。Leong，S.R.，等人，Cytokine 16：106(2001)；Adv.in Drug Deliv.Rev.54：531(2002)；或Weir等人，Biochem.Soc.Transactions 30：512(2002)。
本发明还包括轭合至诊断剂或治疗剂的结合分子，例如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段的用途。结合分子可以作为临床检验步骤的一部分在诊断上用来例如监测肿瘤的形成或演变以例如确定给定治疗和/或预防方案的效力。可通过将结合分子，例如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段与可检测的物质偶联以便于检测。可检测的物质的例子包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、使用各种正电子发射断层摄影术的发射正电子的金属和非放射性顺磁金属离子。参见例如美国专利第4,741,900号中可与根据本发明的用于诊断的抗体轭合的金属离子。适合的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合物的例子包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适合的荧光物质的例子包括伞形花内酯、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括鲁米诺；生物发光物质的例子包括荧光素酶、虫荧光素和水母发光蛋白；并且适合的放射性物质的例子包括125I、131I、111In或99Tc。
结合分子，例如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段还可通过将它偶联至化学发光化合物而被可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中产生的发光的存在来确定化学发光标记的结合分子的存在。特别有用的化学发光标记化合物的例子是鲁米诺、异鲁米诺、热性吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
可将结合分子，例如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段可检测地标记的方法中的一种是通过将其连接至酶并在酶免疫测定(EIA)中使用连接的产物(Voller，A.，“The Enzyme Linked ImmunosorbentAssay(ELISA)(酶联免疫吸附测定(ELISA))”Microbiological AssociatesQuarterly Publication，Walkersville，Md.，Diagnostic Horizons 2：1-7(1978))；Voller等人，J.Clin.Pathol.31：507-520(1978)；Butler，J.E.，Meth.Enzymol.73：482-523(1981)；Maggio，E.(编辑)，Enzyme Immunoassay(酶的免疫测定)，CRC Press，Boca Raton，Fla.，(1980)；Ishikawa，E.等人，(编辑)，EnzymeImmunoassay(酶的免疫测定)，Kgaku Shoin，Tokyo(1981))。结合至结合分子的酶将与合适的底物(优选地为显色底物)以产生可通过例如分光光度计测量的、荧光的或目视手段检测的化学部分的方式发生反应。可被用来可检测地标记抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。另外，可通过使用酶的显色底物的比色法来完成检测。还可通过将底物的酶反应程度与相似地制备的标准物进行视觉对比来完成检测。
还可使用各种其它免疫测定中的任一种来完成检测。例如，通过结合分子，例如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段的放射性标记，可能通过使用放射免疫测定(RIA)来检测癌症抗原(参见例如Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques(放射免疫测定原理，放射配体测定技术的第七次培训课程)，The Endocrine Society，(1986年3月)，其以引用的方式并入本文)。可通过一些手段来检测放射性同位素，其包括但不限于伽玛计数器、闪烁计数器或放射自显影法。
还可使用发射荧光的金属例如152Eu或镧系的其它元素来可检测地标记结合分子，例如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段。可使用金属螯合基团如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)来将这些金属连接至所述抗体。
用于将各种部分轭合至结合分子，例如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段的技术是熟知的，参见例如Arnon等人，“MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy(癌症疗法中用于药物免疫靶向的单克隆抗体)”，Monoclonal Antibodies And CancerTherapy(单克隆抗体和癌症疗法)中，Reisfeld等人(编辑)，第243-56页(Alan R.Liss，Inc.(1985)；Hellstrom等人，“Antibodies For Drug Delivery(用于药物递送的抗体)”，Controlled Drug Delivery(受控的药物递送)(第2版)中，Robinson等人(编辑)，Marcel Dekker，Inc.，第623-53页(1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review(癌症疗法中细胞毒性剂的抗体载体：综述)”，Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications(单克隆抗体’84：生物和临床应用)中，Pinchera等人(编辑)，第475-506页(1985)；“Analysis，Results，And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy(癌症疗法中放射性标记的抗体的治疗用途的分析、结果和未来展望)”，Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy(用于癌症检测和治疗的单克隆抗体)中，Baldwin等人(编辑)，Academic Press，第303-16页(1985)；以及Thorpe等人，“The Preparation And CytotoxicProperties Of Antibody-Toxin Conjugates(抗体-毒素轭合物的制备和细胞毒特性)”，Immunol.Rev.62：119-58(1982)。
VII.抗体多肽的表达
如所熟知，可从原始的杂交瘤细胞或从通过标准技术转化的其它细胞来分离RNA，其中所述标准技术例如异硫氰酸胍提取和沉淀接着是离心或色谱。当期望时，可通过标准技术例如寡dT纤维素上的色谱从总RNA分离mRNA。适合的技术是本领域所熟悉的。
在一个实施方案中，可以根据公知方法使用逆转录酶和DNA聚合酶来同时或分别制备编码抗体的轻链和重链的cDNA。可通过共有恒定区引物或通过基于公布的重链和轻链DNA和氨基酸序列的更特异的引物来起始PCR。如上所讨论，还可将PCR用于分离编码抗体的轻链和重链的DNA克隆。在该情况下，可通过共有引物或更大的同源探针如小鼠恒定区探针来筛选文库。
可使用本领域已知的技术从细胞中分离DNA，通常是质粒DNA，根据例如前面关于重组DNA技术的文献详细阐述的标准的公知技术来绘制其限制性图谱并测序。当然，根据本发明，在分离过程中或之后的分析过程中的任一点，所述DNA可以是合成的。
在操作分离的遗传物质以提供本发明的RON抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物之后，编码RON抗体的多核苷酸通常被插在表达载体中以引入到宿主细胞中，所述宿主细胞可被用来产生期望数量的RON抗体。
抗体或其片段、衍生物或类似物例如结合至本文所述靶分子(如RON)的抗体的重链或轻链的重组表达，要求构建含有编码所述抗体的多核苷酸的表达载体。获得编码本发明的抗体分子或抗体的重链或轻链或其部分(优选地包含重链或轻链可变结构域)的多核苷酸之后，可通过使用本领域公知技术的重组DNA技术来产生用于产生抗体分子的载体。因此，本文描述了通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白的方法。本领域技术人员公知的方法可被用来构建含有编码抗体的序列和适合的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供可复制的载体，其包含编码本发明的抗体分子、或者其重链或轻链、或者重链或轻链可变结构域的可操作地连接至启动子的核苷酸序列。这种载体可包含编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(参见例如PCT公布WO 86/05807、PCT公布WO89/01036和美国专利第5,122,464号)，而且抗体的可变结构域可被克隆进这种载体以表达完整的重链或轻链。
可用本发明的两种表达载体共同转染宿主细胞，第一载体编码重链衍生的多肽并且第二载体编码轻链衍生的多肽。两种载体可含有相同的选择性标记，其使得重链多肽和轻链多肽同等表达。或者，可以使用编码重链多肽和轻链多肽二者的单个载体。在这种情况，轻链被有利地置于重链之前以避免过量的毒性游离重链(Proudfoot，Nature 322：52(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：2197(1980))。重链和轻链的编码序列可包括cDNA或基因组DNA。
本文使用术语“载体”或“表达载体”来表示根据本发明被用作引入到宿主细胞中并且在宿主细胞中表达期望基因的媒介物的载体。如本领域技术人员所知，这种载体可容易地选自由质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒组成的组。通常，与本发明相容的载体将包括选择性标记、促进期望基因的克隆的适合的限制位点以及进入和/或在真核或原核细胞中复制的能力。
为了本发明的目的，可以使用许多表达载体系统。例如，一种类别的载体使用来源于动物病毒例如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA元件。其它的载体包括使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。另外，可通过引入一个或多个允许选择转染的宿主细胞的标记来选择已经将DNA整合进它们的染色体的细胞。所述标记可提供针对营养缺陷型宿主的原营养、杀生物剂(例如抗生素)抗性或对重金属例如铜的抗性。可将选择性标记基因直接连接至待表达的DNA序列，或者通过共同转化引入相同细胞中。对于mRNA的最优合成还可能需要另外的元件。这些元件可包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。
在特别优选的实施方案中，将克隆的可变区基因与按上面所讨论合成的重链和轻链恒定区基因(优选为人类的)一起插入表达载体中。在一个实施方案中，使用Biogen IDEC，Inc.的被称作NEOSPLA的有专利权的表达载体(公开于美国专利第6,159,730号)来使其实现。该载体含有细胞巨化病毒启动子/增强子、小鼠β珠蛋白主要启动子、SV40复制起点、牛生长激素多腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。已经发现，在并入可变区和恒定区基因、转染进CHO细胞然后在含有G418的培养基中选择并用氨甲蝶呤扩增时，该载体导致非常高水平的抗体表达。当然，能够在真核细胞中引发表达的任何表达载体可被用于本发明。适合的载体的例子包括但不限于质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1和pZeoSV2(可从Invitrogen，San Diego，CA获得)以及质粒pCI(可从Promega，Madison，WI获得)。通常，筛选大量的转化细胞中表达适当高水平的那些细胞，如果免疫球蛋白重链和轻链是可通过例如机器人系统进行的常规实验的话。还在美国专利第5,736,137号和5,658,570号中教导了载体系统，其中每个的全文均以引用的方式并入本文。该系统提供了高表达水平，例如＞30pg/细胞/天。其它示例性的载体系统被公开于例如美国专利第6,413,777号中。
在其它优选的实施方案中，可以使用多顺反子构建体来表达本发明的RON抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，所述多顺反子构建体为例如在2002年11月18日提交并且其全文以引用的方式并入本文的美国专利申请公布第2003-0157641A1号中所公开的那些。在这些全新的表达系统中，可以从单个多顺反子构建体来产生感兴趣的多种基因产物例如抗体的重链和轻链。这些系统有利地使用内部核糖体进入位点(IRES)以在真核宿主细胞中提供相对高水平的RON抗体，例如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段。相容的IRES序列公开在美国专利第6,193,980号中，其也被并入本文。本领域技术人员将了解，这种表达系统可用来有效地产生公开在本申请中的全范围的RON抗体。
更通常地，制备了编码RON抗体的单体亚基的载体或DNA序列之后，可将表达载体引入适合的宿主细胞中。可通过本领域技术人员熟知的各种技术来实现质粒向宿主细胞的引入。这些技术包括但不限于转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、用有包膜的DNA的细胞融合、微注射和用完整病毒感染。参见Ridgway，A.A.G.“Mammalian ExpressionVectors(哺乳动物表达载体)”Vectors(载体)，Rodriguez和Denhardt编辑，Butterworths，波士顿，马萨诸塞州，第24.2章，第470-472页(1988)。通常，质粒引入到宿主中是通过电穿孔。使含有表达构建体的宿主细胞在适合产生轻链和重链的条件下生长，并且测定了重链和/或轻链蛋白的合成。示例性的测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或荧光激活细胞分选器分析(FACS)、免疫组织化学以及诸如此类。
通过常规技术将表达载体转移进宿主细胞，然后通过常规技术培养转染的细胞以产生用于本文所述方法的抗体。因此，本发明包括含有编码本发明抗体或其重链或轻链的多核苷酸的宿主细胞，其中所述多核苷酸被可操作地连接至异源性启动子。在用于表达双链抗体的优选的实施方案中，编码重链和轻链二者的载体可被共表达在宿主细胞中以表达完整免疫球蛋白分子，如下所详述。
如本文所用，“宿主细胞”是指含有使用重组DNA技术构建的并编码至少一个异源性基因的载体的细胞。在描述从重组宿主中分离抗体的步骤中，术语“细胞”和“细胞培养物”可被互换地使用以表示抗体的来源，除非它被另外清楚地说明。换言之，从“细胞”中回收多肽可以指从全细胞的旋转沉淀物或从含有培养基和悬浮细胞二者的细胞培养物中。
可以利用各种宿主表达载体系统来表达用于本文所述方法的抗体分子。这种宿主表达系统表示感兴趣的编码序列可通过其而产生并接着被纯化的媒介物，但是也代表当用适合的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本发明的抗体分子的细胞。这些包括但不限于微生物，例如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或黏粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酵母属、毕赤酵母属)；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或者包括含有来源于哺乳动物细胞(例如金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(例如腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子)基因组的启动子的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BLK、293、3T3细胞)。优选地，细菌细胞例如大肠杆菌，以及更优选地，特别是用来表达整个重组抗体分子的真核细胞被用来表达重组抗体分子。例如，与载体(例如来自人类细胞巨化病毒的主要立即早期基因启动子元件)结合在一起的哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是抗体的有效表达系统(Foecking等人，Gene 45：101(1986)；Cockett等人，Bio/Technology 8：2(1990))。
用于蛋白表达的宿主细胞系通常具有哺乳动物来源；相信本领域技术人员具有优先地确定最适合于期望的基因产物在其中表达的特定宿主细胞系的能力。示例性的宿主细胞系包括但不限于CHO(中国仓鼠卵巢)、DG44和DUXB 11(中国仓鼠卵巢系、二氢叶酸还原酶负)、HELA(人宫颈癌)、CVI(猴肾系)、COS(含SV40T抗原的CVI衍生物)、VERY、BHK(幼仓鼠肾)、MDCK、293、WI38、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)和293(人肾)。CHO细胞是特别优选的。宿主细胞系通常是可以从商业服务即美国典型培养物保藏中心或者从发表的文献获得。
此外，可以选择调节插入序列的表达或以期望的特定形式来修饰并加工基因产物的宿主细胞株。蛋白产物的这种修饰(例如糖基化)和加工(例如剪切)对于蛋白的功能可能是重要的。不同宿主细胞对于蛋白和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性的且特别的机制。可以选择适合的细胞系或宿主系统来保证所表达的外来蛋白的正确修饰和加工。为此目的，可以使用具有初级转录物适当加工、糖基化和基因产物磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。
对于长期、高产率的重组蛋白产生，稳定的表达是优选的。例如，稳定表达抗体分子的细胞系可被工程化。并非使用含有病毒复制起点的表达载体，可将宿主细胞用DNA和选择性标记转化，其中所述DNA是由适当的表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)控制的。在引入外来DNA之后，可允许工程化的细胞在营养丰富的培养基中生长1-2天，然后被换成选择性培养基中。重组质粒中的选择性标记给予对选择的抗性，并允许细胞稳定地将质粒整合进它们的染色体中并生长以形成集中点(foci)，其反过来又能被克隆并扩展进细胞系中。该方法可被有利地用来对稳定表达抗体分子的细胞系进行工程化。
可以使用若干选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell 11：223(1977))、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska &Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：202(1992))和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人，Cell 22：817 1980)，其可被分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。而且，抗代谢物抗性可被用作选择下述基因的基础：dhfr，其赋予对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等人，Natl.Acad.Sci.USA 77：357(1980)；O′Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527(1981))；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072(1981))；neo，其赋予对氨基葡糖苷G-418的抗性(Clinical Pharmacy 12：488-505；Wu和Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science 260：926-932(1993)；以及Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；TIB TECH 11(5)：155-215(1993年5月))；以及hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人，Gene30：147(1984))。可以使用的重组DNA技术的领域中通常已知的方法被描述在Ausubel等人(编辑)，Current Protocols is Molecular Biology(分子生物学最新实验方案)，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transferand Expression，A Laboratory Manual(基因转移和表达的实验手册)，Stockton Press，NY(1990)；以及第12和13章，Dracopoli等人(编辑)，Current Protocols in Human Genetics(人类遗传学最新实验方案)，JohnWiley & Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.150：1(1981)中，其全文以引用的方式并入本文。
可通过载体扩增来增加抗体分子的表达水平(关于综述，参见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplification forthe expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning(基于基因扩增的载体用于在DNA克隆中在哺乳动物细胞中表达克隆的基因的用途)，Academic Press，New York，第3卷(1987))。当表达抗体的载体系统中的标记是可扩增的时，存在于宿主细胞培养物中的抑制剂水平的增加将增加标记基因的拷贝数。因为扩增的区域与抗体基因相关，抗体的产生也将增加(Crouse等人，Mol.Cell.Biol.3：257(1983))。
体外生产允许规模扩大以便得到大量的期望多肽。在组织培养条件下培养哺乳动物细胞的技术是本领域已知的并且包括在例如气升式反应器中或在连续的搅拌反应器中的均质悬浮培养，或者在例如空心纤维、微囊、琼脂糖微珠或陶瓷管壳中的固定化或截留的细胞培养。如果必要和/或期望，可在例如合成的铰链区多肽的优先生物合成之后或在本文所述的HIC色谱步骤之前或之后使用通常的色谱方法来纯化多肽的溶液，其中所述方法例如凝胶过滤、离子交换色谱、DEAE-纤维素上的色谱或者(免疫)亲和色谱。
编码本发明的RON抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的基因还可被表达在非哺乳动物细胞例如细菌或昆虫或酵母或植物细胞中。容易地吸收核酸的细菌包括肠杆菌科的成员，例如大肠杆菌或沙门氏菌(Salmonella)等菌株；芽胞杆菌科的成员，例如枯草芽孢杆菌；肺炎球菌、链球菌和流感嗜血杆菌。还将理解的是，当在细菌中表达时，异源性多肽通常变为包涵体的一部分。异源性多肽必须被分离，纯化然后组装成功能性分子。当期望四价形式的抗体时，亚基然后将自装配为四价抗体(WO02/096948A2)。
在细菌系统中，取决于被表达的抗体分子期望的用途，可以有利地选择若干表达载体。例如，当大量这种蛋白待产生时，为了产生抗体分子的药物组合物，可以期待指导融合蛋白产物高水平表达的载体，其中所述融合蛋白产物被容易地纯化。这种载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人，EMBO J.2：1791(1983))，在其中抗体编码序列可被个别地连接至载体而与lacZ编码区同在框内以便产生融合蛋白；pIN载体(Inouye & Inouye，Nucleic Acids Res.13：3101-3109(1985)；Van Heeke &Schuster.J.Biol.Chem.24：5503-5509(1989))；以及诸如此类。还可使用pGEX载体来表达作为与谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白的外来多肽。通常，这种融合蛋白是可溶的并且可容易地从溶解的细胞来纯化，其中所述纯化是通过吸附和结合至基质谷胱甘肽琼脂糖珠并接着在游离谷胱甘肽存在下洗脱。设计pGEX载体而包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点以致于可从GST部分释放克隆的靶基因产物。
除了原核生物之外，还可使用真核微生物。酿酒酵母或普通面包酵母是真核微生物中最常用的，虽然若干其它株系也常用，例如毕赤酵母。
为了在酵母属中表达，常用例如质粒YRp7(Stinchcomb等人，Nature282：39(1979)；Kingsman等人，Gene 7：141(1979)；Tschemper等人，Gene10：157(1980))。该质粒已经含有TRP1基因，所述TRP1基因给缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株例如ATCC第44076或PEP4-1号提供选择性标记(Jones，Genetics 85：12(1977))。然后，作为酵母宿主细胞基因组的特征的trp1损伤的存在提供有效的环境以通过在不含色氨酸条件下生长来检测转化。
在昆虫系统中，夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)通常被用作载体来表达外来基因。该病毒生长在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中。编码抗体的序列可被个别地克隆进病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)并被置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
重组地表达本发明的抗体分子后，可通过本领域任何已知的纯化免疫球蛋白分子的方法来将它纯化，例如通过色谱法(例如离子交换色谱、亲和色谱，特别是对蛋白A后的特异性抗原的亲和性色谱以及分筛柱色谱)、离心、差异溶解或蛋白纯化的任何其它标准技术。或者，增加本发明抗体亲和力的优选的方法公开在US 20020123057A1。
VIII.使用治疗性RON特异性抗体或其免疫特异性片段的治疗方法
本发明的一个实施方案提供用于治疗患有过度增生性疾病或病症如癌症、恶性肿瘤、肿瘤、或其转移或倾向于感染所述疾病的动物的所述疾病的方法，该方法包括、基本上由或由向动物施用有效量的结合RON或RON变体的抗体或其免疫特异性片段组成。合适的抗体包括本文描述的所有抗体和其抗原特异性片段。实例包括但不限于，特异性地结合至与选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的参考单克隆Fab抗体片段或选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的参考单克隆抗体相同的RON表位的分离的抗体或其抗原结合片段、特异性地结合至RON的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段竞争性地抑制选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的参考单克隆Fab抗体片段或选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的参考单克隆抗体与RON结合、或特异性地结合至RON的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含与选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的单克隆Fab抗体片段或选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的参考单克隆抗体相同的抗原结合结构域。
在某些实施方案中，特异性地结合至RON或其变体的本发明的抗体抑制MSP与RON的结合。在另外的实施方案中，与细胞，特别是肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞上表达的RON或其变体特异性地结合的本发明的抗体抑制牵涉在细胞增殖、活动性和/或转移中的下游信号转导分子的活化。这样的分子包括但不限于PI3-K、Akt、mTOR和Rac。在另外的实施方案中，与细胞，特别是肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞上表达的RON或其变体特异性地结合的本发明的抗体抑制Ras/MAPK信号传导途径的活化。在另外的实施方案中，与细胞，特别是肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞上表达的RON或其变体特异性地结合的本发明的抗体抑制src信号传导途径的活化。在另外的实施方案中，与细胞，特别是肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞上表达的RON或其变体特异性地结合的本发明的抗体抑制β-连环蛋白信号传导途径的活化。在又另外的实施方案中，与细胞，特别是肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞上表达的RON或其变体特异性地结合的本发明的抗体抑制RON与MSP的相互作用。在另一实施方案中，与细胞，特别是肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞上表达的RON或其变体特异性地结合的本发明的抗体抑制包括PI3-K/Akt途径、Ras/MAPK途径、src途径、Fak途径和β-连环蛋白信号传导途径的RON活化的途径的活化。在另一实施方案中，与细胞，特别是肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞上表达的RON或其变体特异性地结合的本发明的抗体抑制Erk 1/2的磷酸化或活化。在又另外的实施方案中，与细胞，特别是肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞上表达的RON或其变体特异性地结合的本发明的抗体抑制细胞增殖、活动性和/或转移。在又另外的实施方案中，与细胞，特别是肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞上表达的RON或其变体特异性地结合的本发明的抗体促进凋亡或失巢凋亡。在又另外的实施方案中，与细胞，特别是肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞上表达的RON或其变体特异性地结合的本发明的抗体阻断VEGF分泌。在又另外的实施方案中，与细胞，特别是肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞上表达的RON或其变体特异性地结合的本发明的抗体阻断包括但不限于EGFR、TGFβ受体和Met的其它受体激酶的活性。在又另外的实施方案中，与细胞，特别是肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞上表达的RON或其变体特异性地结合的本发明的抗体诱导细胞毒性一氧化氮(NO)分泌。在又另外的实施方案中，与细胞，特别是肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞上表达的RON或其变体特异性地结合的本发明的抗体诱导IL-12分泌。在又另外的实施方案中，与细胞，特别是肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞上表达的RON或其变体特异性地结合的本发明的抗体阻断MSP分泌。
待用于本文公开的治疗方法的特异性地结合至RON的本发明的抗体或其变体可被制备并用作治疗剂，其终止、减少、阻止或抑制牵涉在细胞过度增生中的细胞活动，例如诱导通常与过度增生性疾病或病症相关的改变的或异常的类型的血管化作用的细胞活动。
本发明的抗体或其免疫特异性片段包括但不限于特异性地结合肿瘤相关蛋白诸如RON的单克隆抗体、嵌合抗体或人源化的抗体、和抗体片段。抗体可以是单价、二价、多价或双功能抗体，并且抗体片段包括Fab、F(ab’)2和Fv。
根据本发明的治疗性抗体能够以未标记的或未轭合的形式被使用，或者可被偶联或连接至细胞毒性部分(例如放射性标记和生化细胞毒素)以产生发挥治疗作用的剂。
在某些实施方案中，本发明的抗体或其免疫特异性片段包括抗原结合结构域。抗原结合结构域由在抗体之间不同的抗体可变区形成。天然产生的抗体包括至少两个抗原结合结构域，即，它们是至少二价的。如本文所用，术语“抗原结合结构域”包括特异性地结合抗原(例如，细胞表面或可溶性抗原)上的表位的位点。抗体的抗原结合结构域通常包括至少一部分的免疫球蛋白重链可变区和至少一部分的免疫球蛋白轻链可变区。由这些可变区形成的结合位点决定抗体的特异性。
本发明提供用于治疗哺乳动物的各种过度增生性病症的方法，例如通过抑制肿瘤生长，所述方法包括、基本上由或者由对哺乳动物施用有效量的特异性地或优先地结合RON(例如人类RON)的抗体或其抗原结合片段组成。
本发明更具体地针对治疗动物(例如哺乳动物，如人类)的过度增生性疾病的方法，例如抑制或阻止肿瘤形成、肿瘤生长、肿瘤侵入和/或转移形成，所述方法包括、基本上由或者由向对其有需要的动物施用有效量的特异性结合或优先结合RON的一个或多个表位的抗体或其免疫特异性片段组成。
在其它实施方案中，本发明包括用于治疗动物(例如人类患者)的过度增生性疾病的方法，例如抑制肿瘤形成、肿瘤生长、肿瘤侵入和/或转移形成，其中所述方法包括对需要这种治疗的动物施用有效量的组合物，所述组合物除了药学上可接受的载体之外，包括、基本上由或者由特异性结合RON的至少一个表位的抗体或其免疫特异性片段所组成，其中所述表位包括、基本上由或者由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：113的至少四个到五个氨基酸氨基酸、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：113的至少七个、至少九个或至少约15个到至少约30个氨基酸所组成。如所述的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：113的给定表位的氨基酸可以是连续的但不必是连续的。
在某些实施方案中，RON的至少一个表位包括、基本上由、或由细胞表面上表达的RON的胞外结构域形成的非线性表位组成。因此在某些实施方案中，RON的至少一个表位包括、基本上由、或由SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：113的至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、约15至约30、或至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个连续或不连续氨基酸组成，其中不连续氨基酸通过蛋白折叠形成表位。
在其它实施方案中，本发明包括用于治疗动物(例如人类患者)的过度增生性疾病的方法，例如抑制肿瘤形成、肿瘤生长、肿瘤侵入和/或转移形成，其中所述方法包括对需要这种治疗的动物施用有效量的组合物，所述组合物除了药学上可接受的载体之外，包括、基本上由或者由特异性结合RON的至少一个表位的抗体或其免疫特异性片段(其中所述表位包括、基本上由或者由除了如上所述的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：113的一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个连续或不连续氨基酸以外所组成)以及修饰蛋白的另外部分所组成，例如，碳水化合物部分可被包括以使结合分子以高于对未修饰形式蛋白的亲和力与修饰的靶蛋白相结合。可选择地，结合分子根本不结合未修饰形式的靶蛋白。
更具体地，本发明提供治疗人类癌症的方法，包括对需要治疗的人类施用一种组合物，所述组合物包括有效量的RON特异性抗体或其免疫特异性片段，以及药学上可接受的载体。待治疗的癌症类型包括但不限于胃癌、肾癌、脑癌、膀胱癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌。
在某些实施方案中，抗体或其片段特异性地结合至上述RON或片段或变体的至少一个表位，即，与结合至不相关的或随机的表位相比更容易地结合至这样的表位；优先地结合至上述RON或片段或变体的至少一个表位，即与结合至相关的、相似的、同源的或类似的表位相比更容易地结合至这样的表位；竞争性地抑制参考抗体的结合，其中所述参考抗体自身与上述RON或片段或变体的某表位特异性地或优先地结合；或者以由解离常数KD所表征的亲和力结合至上述RON或片段或变体的至少一个表位，其中所述KD小于约5×10-2M、约10-2M、约5×10-3M、约10-3M、约5×10-4M、约10-4M、约5×10-5M、约10-5M、约5×10-6M、约10-6M、约5×10-7M、约10-7M、约5×10-8M、约10-8M、约5×10-9M、约10-9M、约5×10-10M、约10-10M、约5×10-11M、约10-11M、约5×10-12M、约10-12M、约5×10-13M、约10-13M、约5×10-14M、约10-14M、约5×10-15M或约10-15M。如在抗体结合解离常数的范畴中使用的，术语“约”允许用于测量抗体亲和力的方法中固有的变化程度。例如，取决于所用的仪器的精密水平、基于所测量的样品数目的标准差、和舍入误差，术语“约10-2M”可以包括例如，从0.05M到0.005M。在某些实施方案中，本发明的抗体和其片段与其所来源的其它物种的RON蛋白交叉反应，例如与人类RON特异性地结合的抗体或其片段还与鼠RON结合。本发明的其它适合的抗体或其片段包括高度物种特异性的那些。
在特定的实施方案中，本文公开的抗体或其免疫特异性片段以小于或等于5×10-2sec-1、10-2sec-1、5×10-3sec-1或10-3sec-1的解离速率(k(off))结合RON多肽或其片段或变体。本文公开的其它抗体或其免疫特异性片段以小于或等于5×10-4sec-1、10-4sec-1、5×105sec-1或10-5sec-15×10-6sec-1、10-6sec-1、5×10-7sec-1或10-7sec-1的解离速率(k(off))结合RON多肽或其片段或变体。
在其它的实施方案中，本文公开的抗体或其免疫特异性片段以大于或等于103M-1sec-1、5×103M-1sec-1、104M-1sec-1或5×104M-1sec-1的结合速率(k(on))结合RON多肽或其片段或变体。用于本文公开的诊断和治疗方法中的其它抗体或其免疫特异性片段以大于或等于105M-1sec-1、5×105M-1sec-1、106M-1sec-1或5×106M-1sec-1或107M-1sec-1的结合速率(k(on))结合RON多肽或其片段或变体。
在各个实施方案中，上述的一种或多种结合分子是RON活性的拮抗剂，例如，拮抗剂RON抗体与肿瘤细胞上表达的RON的结合抑制MSP的结合，抑制信号转导途径中下游分子如PI3-K、Akt、Ras、MAPK、src、Fak、β-连环蛋白和ERK 1/2的活化，或抑制肿瘤细胞的增殖、活动性或转移。
IX.使用RON特异性结合分子和核酸扩增测定的诊断或预后方法
RON特异性抗体、或其片段、衍生物或类似物可被用于诊断目的以检测、诊断或监测与RON的异常的表达和/或活性相关的疾病、病症和/或病况。RON表达在肿瘤组织和其它瘤病况中增加。
RON特异性抗体或其片段对于哺乳动物(优选地为人类)中过度增生性病症的诊断、治疗、预防和/或预后是有用的。这种病症包括但不限于癌症、赘生物、肿瘤和/或如本文下面其它地方所述的特别是RON相关的癌症，例如胃癌、脑癌、膀胱癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌。
例如，如本文所公开，RON的表达至少与胃、脑、膀胱、结肠、肺、乳腺、胰腺、卵巢和前列腺肿瘤组织相关。因此，针对RON的抗体(和抗体片段)可被用来检测表达升高水平的RON的特定组织。这些诊断测定可以在体内或在体外例如在血液样品、活检组织或尸检组织上进行。
因此，本发明提供在诊断癌症和其它过度增生性病症过程中有用的诊断方法，其包括测量来自个体的组织或其它细胞或体液中的RON蛋白或转录物的表达水平，以及将所测量的表达水平与正常组织或体液中标准的RON表达水平进行比较，由此，表达水平与标准相比的增加病症。
一个实施方案提供了检测液体或组织样品中异常的过度增生细胞例如癌症前期细胞或癌细胞的存在的方法，其包括测定个体的组织或体液样品中RON的表达，以及将样品中RON表达的存在或水平与一组标准组织或体液样品中RON表达的存在或水平进行比较，其中RON表达的检测或者RON表达与标准相比的增加表明了异常的过度增生细胞生长。
更具体地，本发明提供检测体液或组织样品中异常的过度增生细胞的存在的方法，其包括(a)使用本发明的RON特异性抗体或其免疫特异性片段来测定个体的组织或体液样品中RON的表达，以及(b)将样品中RON表达的存在或水平与一组标准组织或体液样品中RON表达的存在或水平进行比较，由此，RON表达的检测或者RON表达与标准相比的增加表明了异常的过度增生细胞生长。
关于癌症，来自个体的活检组织中的相对高含量的RON蛋白的存在可表明肿瘤或其它恶性生长的存在，可表明这种恶性肿瘤或肿瘤的发展的素因，或者可提供在实际的临床症状显现之前检测疾病的手段。此类型的更确定的诊断可允许健康专业人士更早地使用预防措施或大胆治疗，从而预防癌症的形成或进一步演变。
本发明的RON特异性抗体可被用来使用本领域技术人员已知的经典的免疫组织化学方法测定生物样品中的蛋白水平(例如，参见Jalkanen等人，J.Cell.Biol.101：976-985(1985)；Jalkanen等人，J.Cell.Biol.105：3087-3096(1987))。对于检测蛋白表达有用的其它基于抗体的方法包括免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。适合的抗体测定标记物是本领域已知的，并且包括酶标记物，例如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，例如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99Tc)；发光标记物，例如鲁米诺；以及荧光标记物，例如荧光素和若丹明，以及生物素。适合的测定在本文其它地方更详细地描述。
本发明的一个方面是用于体内检测或诊断过度增生疾病或病症的方法，其中所述过度增生性疾病或病症是与动物，优选地为哺乳动物，以及最优选地为人类的RON的异常表达相关的。在一个实施方案中，诊断包括：a)对受治疗者施用(例如，在肠胃外、皮下或腹膜内)有效量的特异性结合至RON的本发明的标记的抗体或其片段；b)施用后等待一段时间间隔以允许标记的结合分子优先地集中在受治疗者中RON被表达的位点(而且未结合的标记的分子被清除至背景水平)；c)确定背景水平；和d)检测受治疗者体内标记的分子，以至于背景水平以上的标记的分子的检测表明受治疗者具有与RON异常表达相关的特殊疾病或病症。可通过各种方法来确定背景水平，包括将所检测的标记的分子的量与之前在特定系统中确定的标准值进行比较。
本领域中将理解的是，受治疗者的个头和所用的成像系统将确定产生诊断图像所需的成像部分的量。在放射性同位素部分的情况下，对于人类受治疗者，所注入的放射性的量将通常是在从约5至20毫居里范围内的例如99Tc。然后，标记的结合分子例如抗体或抗体片段将优先地聚集在细胞中含有特定蛋白的位置处。体内肿瘤成像描述在S.W.Burchiel等人，“Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments(放射标记的抗体和其片段的免疫药代动力学)”，(第13章，TumorImaging：The Radiochemical Detection of Cancer(肿瘤成像：癌症的放射化学检测)，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes编辑，Masson Publishing Inc.(1982)。
取决于若干可变的因素，包括所用的标记物类型和施用方式，允许标记的分子优先地集中在受治疗者中的位点以及为了使未结合的标记的分子被清除至背景水平的施用后时间间隔是6至48小时或6至24小时或6至12小时。在另一个实施方案中，施用后的时间间隔是5至20天或7至10天。
可以使用本领域已知的用于体内扫描的方法来检测患者体内标记的分子的存在。这些方法取决于所用的标记物的类型。技术人员将能够确定用于具体特殊标记物的适合方法。可被用于本发明的诊断方法中的方法和装置包括但不限于计算机断层成像(CT)，全身扫描例如正电子发射断层成像(position emission tomography，PET)、磁共振成像(MRI)和超声波成像。
在特定的实施方案中，用放射性同位素标记结合分子，并且用辐射响应的外科仪器在患者中检测(Thurston等人，美国专利第5,441,050号)。在另一个实施方案中，用荧光化合物标记结合分子，并且用荧光响应的扫描仪器在患者中检测。在另一个实施方案中，用发射正电子的金属标记结合分子，并且用正电子发射断层成像在患者中检测。在再一个实施方案中，用顺磁标记物来标记结合分子，并且用磁共振成像(MRI)在患者中检测。
用于RON表达的体内成像的抗体标记物或标志物包括通过X-射线成像、核磁共振成像(NMR)、MRI、CAT扫描或电子自旋共振成像(ESR)可检测的那些。对于X-射线成像，适合的标记物包括放射性同位素例如钡或铯，其发射可检测的辐射但不明显地有害于受治疗者。对于NMR和ESR适合的标志物包括具有可检测的特征性自旋的那些，例如氘，其可通过对相关杂交瘤的营养物进行标记而被并入抗体。当为了在人体中诊断而使用体内成像来检测增高水平的RON表达时，可以优选地使用如本文其它地方所述的人类抗体或“人源化的”嵌合单克隆抗体。
在与上述的那些相关的实施方案中，通过重复任一个诊断疾病或病症的方法来对已经诊断的疾病或病症进行监测，其中所述重复是在例如最初诊断之后一个月、最初诊断之后六个月、最初诊断之后一年等等。
在已经根据传统方法进行了病症的诊断(包括肿瘤的诊断)的情况下，本文公开的检测方法作为预后的指示器是有用的，由此，继续展现增强的RON表达的患者将经历与表达水平降低到更接近标准水平的患者相比更糟的临床后果。
所谓“测定肿瘤相关的RON多肽的表达水平”是指以定性或定量方式直接地(例如通过确定或估计绝对蛋白水平)或间接地(例如通过与第二生物样品中癌症相关的多肽水平进行比较)测量或估计第一生物样品中RON多肽的水平。优选地，测量或估计第一生物样品中RON多肽的表达水平，并将其与标准RON多肽水平比较，所述标准是从第二生物样品取得的或通过将来自不具有该病症的个体的群体中的水平进行平均而确定的，其中所述第二生物样品是从不具有该病症的个体中获得的。本领域将会理解，一旦知道了“标准”RON多肽水平，它可被反复地用作比较的标准。
所谓“生物样品”是指从潜在表达RON的个体、细胞系、组织培养物或其它细胞来源获得的任何生物样品。如所指出，生物样品包括体液(例如血清、血浆、尿、滑液和脊髓液)和含有潜在表达RON的细胞的其它组织来源。从哺乳动物获得活检组织和体液的方法是本领域熟知的。
在另外的实施方案中，针对RON的构象表位的抗体或抗体的免疫特异性片段可被用来定量地或定性地检测RON基因产物或者其保守的变体或肽片段的存在。这可通过例如免疫荧光技术来完成，其利用与光学显微检测、流式细胞计量的检测或荧光的检测相结合的荧光标记的抗体。
可使用上述方法诊断和/或预后的癌症包括但不限于胃癌、肾癌、脑癌、膀胱癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌。
X.免疫测定
可以通过本领域任何已知方法来测定本文公开的RON特异性抗体或其免疫特异性片段的免疫特异性结合。可以使用的免疫测定包括但不限于竞争性和非竞争性测定系统，其使用技术例如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“三明治”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定，仅举几个例子。这种测定是本领域中常规的和熟知的(参见例如Ausubel等人编辑，CurrentProtocols in Molecular Biology(分子生物学最新实验方案)，John Wiley &Sons，Inc.，New York，第1卷(1994)，其全文以引用的方式并入本文)。示例性的免疫测定简短地描述如下(但不旨在进行限制)。
免疫沉淀方案通常包括将细胞群体在裂解缓冲液例如补充有蛋白磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如EDTA、PMSF、抑酞酶、钒酸钠)的RIPA缓冲液(1％NP-40或Triton X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，0.15M NaCl，0.01M磷酸钠，pH 7.2，1％Trasylol)中裂解，将感兴趣的抗体加入细胞裂解产物，在4℃孵育一段时间(例如1-4小时)，将蛋白A和/或蛋白G琼脂糖珠加至细胞裂解产物，在4℃孵育约1小时或更长，在裂解缓冲液中洗涤珠子并且将珠子重新悬浮在SDS/样品缓冲液中。可通过例如蛋白质印迹分析来评估感兴趣的抗体将特定抗原免疫沉淀的能力。本领域技术人员将知道可修改参数以增加抗体与抗原的结合以及减少背景(例如用琼脂糖珠预先清除细胞裂解产物)。关于免疫沉淀方案的进一步讨论，参见例如Ausubel等人编辑，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新实验方案)，John Wiley & Sons，Inc.，New York，第1卷(1994)章节10.16.1。
蛋白质印迹分析通常包括制备蛋白样品，在聚丙烯酰胺凝胶(例如8％-20％SDS-PAGE，取决于抗原的分子量)中进行蛋白样品的电泳，将蛋白样品从聚丙烯酰胺凝胶转移至膜例如硝酸纤维素、PVDF或尼龙上，在封闭溶液(例如含有3％BSA或脱脂奶的PBS)中封闭所述膜，在洗涤缓冲液(例如PBS-吐温20)中洗涤所述膜，用在封闭缓冲液中稀释的第一抗体(感兴趣的抗体)封闭所述膜，在洗涤缓冲液中洗涤所述膜，用在封闭缓冲液中稀释的轭合至酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(例如32p或1251)的第二抗体(其识别第一抗体，例如抗人类抗体)封闭所述膜，在洗涤缓冲液中洗涤所述膜，以及检测抗原的存在。本领域技术人员将知道可被修改以增加检测的信号并减少背景噪声的参数。关于蛋白质印迹方案的进一步讨论，参见例如Ausubel等人编辑，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新实验方案)，JohnWiley & Sons，Inc.，New York，第1卷(1994)章节10.8.1。
ELISA包括制备抗原，用所述抗原包被96孔微量滴定板的孔，将轭合至可检测的化合物例如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的感兴趣的抗体加入孔中并孵育一段时间，以及检测抗原的存在。在ELISA中，感兴趣的抗体不必轭合至可检测的化合物；相反，可将轭合至可检测的化合物的第二抗体(其识别感兴趣的抗体)加入孔中。进一步地，可将抗体包被于孔中，而不是用抗原来包被孔。在这种情况下，在将感兴趣的抗原加入包被的孔中之后，可加入轭合至可检测的化合物的第二抗体。本领域技术人员将知道可被修改以增加检测的信号的参数，以及本领域已知的其它改进形式的ELISA。关于ELISA的进一步讨论，参见例如Ausubel等人编辑，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新实验方案)，John Wiley & Sons，Inc.，New York，第1卷(1994)章节11.2.1。
可通过竞争性结合测定来确定抗体对抗原的结合亲和力以及抗体-抗原相互作用的解离速率。竞争性结合测定的一个例子是放射免疫测定，其包括用感兴趣的抗体在逐渐增加量的未标记抗原的存在下孵育被标记的抗原(例如3H或125I)，以及检测结合至被标记的抗原的抗体。可以从Scatchard图形分析的数据来确定感兴趣的抗体对特定抗原的亲和力以及结合的解离速率。可使用放射免疫测定来确定与第二抗体的竞争。在这种情况下，在逐渐增加量的未标记的第二抗体的存在下，将抗原与轭合至标记的化合物(例如3H或125I)的感兴趣的抗体一起孵育。
RON特异性抗体可被另外地用于组织学，如在免疫荧光、免疫电子显微术或非免疫测定中，以原位检测癌症抗原基因产物或者其保守的变体或肽片段。可通过从患者取出组织学标本并对其应用标记的RON特异性抗体或其片段来完成原位检测，其中所述应用优选地是通过将被标记的抗体(或片段)覆盖在生物样品上。通过使用这种步骤，不仅可能确定RON蛋白或者保守的变体或肽片段的存在，而且可能确定它在被检验的组织中的分布。使用本发明，普通技术人员将容易理解，可以修改许多组织学方法(例如染色步骤)中的任一种以便实现这种原位检测。
RON基因产物或者其保守的变体或肽片段的免疫测定和非免疫测定通常将包括在能够结合至RON或者其保守的变体或肽片段的可检测地标记的抗体的存在下孵育一种样品例如生物液、组织提取物、新鲜收集的细胞或在细胞培养物中培养的细胞的溶解产物，以及通过本领域熟知的若干技术中的任一种来检测结合的抗体。
可将生物样品与固相支撑物或载体(例如硝酸纤维素或者能够固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白的其它固体支撑物)接触并固定于其上。然后可用适合的缓冲液洗涤所述支撑物，之后用可检测地标记的RON特异性抗体进行处理。然后可用缓冲液再一次洗涤所述固相支撑物以除去未结合的抗体。任选地，接下来对抗体进行标记。然后可通过传统方法来检测固体支撑物上的结合的标记物的量。
所谓“固相支撑物或载体”是指能够结合抗原或抗体的任何支撑物。熟知的支撑物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然的和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿石。出于本发明的目的载体的性质可以是在某种程度上可溶的或是不可溶的。支撑物质实际上可具有任何可能的结构构型，只要偶联的分子能够结合至抗原或抗体。因此，支撑物的构型可以是如珠子般的球形的，或者如试管的内表面或棒的外表面一样的圆柱状的。或者，表面可以是如纸张、测试条等一样的平的。优选的支撑物包括聚苯乙烯珠子。本领域技术人员将知道用来结合抗体或抗原的许多其它适合的载体，或通过使用常规实验将能够确定结合抗体或抗原的许多其它适合的载体。
可根据熟知的方法来确定给定批量的RON特异性抗体的结合活性。本领域技术人员通过使用常规的实验方法将能够针对每次测定来确定可操作的和最佳的测定条件。
有许多方法可用来测量抗体-抗原相互作用的亲和力，但用于确定速率常数的方法相对较少。大多数方法依赖于对抗体或抗原进行标记，其不可避免地使常规测量变得复杂，并且给被测量的量带来不确定性。
在BIAcore上进行的表面等离子体共振(SPR)提供优于测量抗体-抗原相互作用亲和力的传统方法的许多优点：(i)不需要标记抗体或抗原；(ii)不需要提前纯化抗体，并可直接使用细胞培养物上清液；(iii)使得允许对不同单克隆抗体相互作用进行快速的半定量比较的实时测量变得可能，而且足以用于许多评估目的；(iv)可重新产生双特异性表面以便可在相同条件下容易地比较一系列不同的单克隆抗体；(v)分析步骤完全是自动化的，并且不需要使用者介入就能进行广泛系列的测量。BIAapplications手册，第AB版(1998年重印)，BIACORE序号BR-1001-86；BIAtechnology手册，第AB版(1998年重印)，BIACORE序号BR-1001-84。
基于SPR的结合研究需要结合对儿的一个成员被固定在传感器表面上。被固定的结合配偶体被称作配体。溶液中的结合配偶体被称作分析物。在一些情况下，通过结合至称作捕捉分子的另一个固定的分子而将配体间接地结合至表面上。SPR响应反映了在分析物结合或解离时检测器表面上的质量浓度的变化。
基于SPR，实时BIAcore测量在相互作用发生时直接监测它们。此技术十分适合于动力学参数的确定。进行比较亲和力的排序是极简单的，而且动力学和亲和力常数二者都可来源于感应图数据。
当在穿过配体表面的离散脉冲中注入分析物时，所得的感应图可被分成三个基本阶段：(i)在注射样品的过程中将分析物与配体缔合；(ii)在注射样品的过程中的平衡或稳态，其中分析物结合的速率是通过从复合物解离而平衡；(iii)在缓冲液流动过程中分析物从表面上解离。
缔合和解离阶段提供关于分析物-配体相互作用的动力学信息(ka和kd，复合物形成和解离的速率，kd/ka＝KD)。平衡阶段提供关于分析物-配体相互作用的亲和力信息(KD)。
BIAevaluation软件使用数值积分和全局拟合算法二者来为曲线拟合提供广泛的便利。通过数据的适当分析，可从简单的BIAcore研究中获得相互作用的单独速率和亲和力常数。通过该技术可测量的亲和力的范围是非常宽的，其从mM至pM变化。
表位特异性是单克隆抗体的重要特性。与使用放射免疫测定、ELISA或其它表面吸附方法的传统技术相反，使用BIAcore的表位定位不需要标记抗体或纯化的抗体，并且允许使用一系列的多种单克隆抗体来进行多位点特异性测试。另外，大量的分析可被自动处理。
配对的结合实验测试两个MAb同时与同一个抗原结合的能力。针对不同表位的MAb将独立地结合，而针对相同的或密切相关的表位的MAb将干扰彼此之间的结合。可以直截了当地进行使用BIAcore的这些结合实验。
例如，人们可使用捕捉分子来结合第一MAb，然后相继加入抗原和第二MAb。感应图将揭示：1.有多少抗原结合至第一MAb，2.第二MAb以什么程度结合至连接在表面的抗原，3.如果第二MAb不结合，配对测试的顺序的颠倒是否改变结果。
肽抑制是用于表位定位的另一种技术。此方法可为配对的抗体结合研究进行补充，并且在知道抗原的一级序列的时候能将功能性表位与结构特征相联系。测试了肽或抗原片段对于不同MAb与固定的抗原之间结合的抑制。据假设，干扰给定MAb的结合的肽与该MAb所确定的表位在结构上相关。
XI.药物组合物和施用方法
制备并将RON特异性抗体或其免疫特异性片段施用于需要其的受治疗者的方法是本领域技术人员所熟知或容易确定的。结合分子，例如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段的施用途径可以是例如口服、肠胃外、经吸入或局部。本文所用的术语肠胃外包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道施用。虽然所有这些施用方式都清楚地被认为是本发明范围内的，但一种施用形式是用于注射，特别是静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。一般来说，适用于注射的药物组合物可以包含缓冲液(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯)，任选稳定剂(例如人类白蛋白)等。然而，在与本文教导相容的其它方法中，可以将结合分子，例如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段直接递送到有害细胞群体的部位，从而提高患病组织暴露于治疗剂。
用于肠胃外给药的制品包括无菌的水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)以及可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲的介质。在主题发明中，药物上可接受的载体包括但不限于0.01-0.1M、并且优选0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其它常见肠胃外载体包括磷酸钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏溶液，或者不挥发油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，诸如那些基于林格氏右旋糖的等等。还可以存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
更具体地说，适用于注射用途的药物组合物包括无菌水性溶液(当是水溶性的时)或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在这些情况中，所述组合物必须是无菌的，并且应该是容易进行注射器操作的液体。它应当在制造和储存条件下是稳定的，并且优选抗微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用而保存。载体可以是溶剂或分散体介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)，和其合适的混合物。可以通过利用涂层(诸如卵磷脂)、通过在分散体的情况中维持所需颗粒大小，以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。用于本文公开的治疗方法的适合的制剂描述在Remington’sPharmaceutical Sciences(雷明登氏制药科学)，Mack Publishing Co.，第16版(1980)中。
防止微生物的作用可以通过各种抗细菌和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况中，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。通过在组合物中包含能延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以将注射组合物的吸收延长。
在任何情况中，可通过将所需量的活性化合物(例如，结合分子，如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段自身或联合其它活性剂)、与所需的如本文所列的一种成分或多种成分的组合一起引入合适溶剂中，随后过滤除菌制得无菌注射液。通常通过将活性化合物引入含有基本分散体介质的无菌载体和以上列举的其它所需成分，制得分散体。对于制备无菌注射液的无菌粉末来说，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这些方法由先前无菌过滤的溶液产生出活性成分和任何其它所需成分的粉末。用于注射的制品根据本领域已知的方法经过加工、装入容器(诸如安瓿、袋子、瓶子、注射器或小瓶)，在无菌条件下封口。进一步，可以将制剂包装，并以药盒的形式出售，象共同待审的U.S.S.N.09/259,337(US-2002-0102208A1)中描述的那些，该申请的全文以引用的方式并入本文。这类制造产品将优选带有标签或包装插页，表明相关组合物用于治疗患有或易患自身免疫或肿瘤病症的受治疗者。
对于本文所述的过度增生性病症的治疗，本发明组合物的有效剂量随着许多不同因素而变化，所述因素包括施用方式、靶位点、患者的生理学状况、患者是人类还是动物、施用的其它药物、以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人类，但是也可以治疗非人类哺乳动物包括转基因哺乳动物。可使用本领域技术人员已知的常规方法滴定治疗剂量以优化安全性和效力。
对于用抗体或其片段治疗过度增生性病症，剂量范围可以是宿主体重的大约0.0001至100mg/kg、以及更通常是0.01至5mg/kg(例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内的任何剂量，优选地至少1mg/kg。上述范围中的中间剂量也意为在本发明范围内。可以每日、隔日、每周、或根据任何其它通过经验性分析确定的方案，向受治疗者施用此剂量。一种示例性疗法需要长期，例如至少6个月的多剂量施用。其它示例性治疗方案需要每两周施用一次或每月施用一次或每3至6个月施用1次。示例性的剂量安排包括每日1-10mg/kg或15mg/kg、隔日30mg/kg、或每周60mg/kg。在一些方法中，具有不同结合特异性的两种或两种以上单克隆抗体同时施用，这种情况施用的每种抗体的剂量落入所示范围内。
本文公开的RON特异性抗体或其免疫特异性片段可以多次施用。单次剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。间隔也可以是不规律的，如通过测量患者中靶多肽或靶分子的血液水平所示的。在一些方法中，调节剂量使血浆多肽浓度达到1-1000μg/ml和在一些方法中达到25-300μg/ml。或者，结合分子能够以缓释制剂施用，这种情况需要较低的施用频率。剂量和频率根据患者体内抗体的半衰期而不同。还可通过融合至稳定多肽或部分例如白蛋白或PEG来延长结合分子的半衰期。通常，人源化抗体表现出最长的半衰期，然后是嵌合抗体和非人类抗体。在一个实施方案中，能够以未轭合的形式施用本发明的结合分子。在另一实施方案中，结合分子，例如结合多肽，如用于本文公开方法中的RON特异性抗体或其免疫特异性片段能够以轭合形式多次施用。还有一实施方案中，本发明的结合分子能够以未轭合形式施用，然后施用轭合形式，或者反过来。
施用剂量和频率可以根据治疗是治疗性还是预防性的而变化。在预防性应用中，含有抗体或其鸡尾酒式混合物的组合物向还未在疾病状态或处于疾病前状态的患者施用以增强患者的抵抗力。这样的剂量定义为“预防有效量”。在此应用中，准确的量又取决于患者的健康状态和一般免疫状态，但是通常为0.1至25mg/剂的范围，尤其是0.5至2.5mg/剂。能够以相对稀疏的间隔长期施用相对低的剂量。一些患者可以在其有生之年持续接受治疗。
在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔施用相对高的剂量(例如，约1至400mg/kg结合分子如抗体/剂，对于放射免疫轭合物更通常使用5至25mg的剂量，并且对于细胞毒素-药物轭合的分子使用更高剂量)，直到减缓或终止疾病进程，并且优选地直到患者显示疾病症状的部分或完全的改善。之后，可患者可被施用预防性剂量方案。
在一个实施方案中，可以用编码RON特异性抗体或其免疫特异性片段的核酸分子(例如在载体中)来治疗受治疗者。编码多肽的核酸剂量在约10ng到1g、100ng到100mg、1μg到10mg或30-300μg DNA/患者的范围内。对于感染性病毒载体，剂量在每剂10-100或更多病毒粒子。
治疗剂可以通过肠胃外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或肌内的方式施用以用于预防性和/或治疗性的治疗。在一些方法中，将药剂直接注射进其中表达RON的细胞聚集的特定组织中，例如颅内注射。抗体的施用优选以肌内注射或静脉内输注进行。在一些方法中，特定的治疗抗体直接注射到颅内。一些方法中，抗体以缓释组合物或装置的形式施用，诸如MedipadTM装置。
任选地可将本发明的RON抗体或其片段与治疗需要治疗(例如，预防性或治疗性)的病症或病况有效的其它药剂一起联合施用。
90Y标记的结合多肽的有效单次治疗剂量(即治疗有效量)的范围在约5到约75mCi，更优选在约10到约40mCi。131I标记的抗体的单次治疗非骨髓清除性有效剂量的范围在约5到约70mCi，更优选约5到约40mCi。131I标记的抗体的单次治疗清除有效剂量(即，可能需要自体骨髓移植)在约30到约600mCi，更优选在约50到少于约500mCi的范围。就嵌合抗体而言，由于其循环半衰期比小鼠抗体长，碘-131标记的嵌合抗体的单次治疗非骨髓清除性有效剂量的范围在约5到约40mCi，更优选少于约30mCi。对于例如111In标记，成像标准通常少于5mCi。
虽然对于131I和90Y已取得了大量的临床经验，但其它放射标记也是本领域已知的，并且已被用于类似的目的。还有另外一些放射性同位素被用于成像。例如，其它与本发明范围相容的放射性同位素包括但不限于，123I、125I、32P、57Co、64Cu、67Cu、77Br、81Rb、81Kr、87Sr、113In、127Cs、129Cs、132I、197Hg、203Pb、206Bi、177Lu、186Re、212Pb、212Bi、47Sc、105Rh、109Pd、153Sm、188Re、199Au、225Ac、211At和213Bi。在这方面，α、β和γ放射源均与本发明相容。此外，鉴于本公开内容，应当认为本领域技术人员可以容易地确定哪些放射性核素与选定的治疗过程相匹配，而不需进行过多实验。为了这一目的，其它曾被用于临床诊断的放射性核素包括125I、123I、99Tc、43K、52Fe、67Ga、68Ga以及111In。抗体也已被标记上各种放射性核素，可能用于定向免疫治疗(Peirersz等人.Immunol.Cell Biol.65：111-125(1987))。这些放射性核素包括188Re和186Re，以及在较小程度上的199Au和67Cu。美国专利第5,460,785号提供了涉及到这些放射性同位素的另外数据，该专利以引用的方式并入本文。
无论以轭合形式或未轭合形式使用本文公开的RON特异性抗体或其免疫特异性片段，都应当意识到，本发明的主要优点是在骨髓抑制患者、特别是正在进行或已进行了辅助治疗(诸如放疗或化疗)的那些患者中使用这些分子的能力。即，在其它优选实施方案中，分子的有益的输送概况(即相对短的血清停留时间、高结合亲和力和增强的定位)使它们对于治疗具有减少的红骨髓储量并对骨髓毒性敏感的患者特别有用。在这点上，分子的独特输送概况使它们在将放射标记的轭合物施用于骨髓抑制的癌症患者时非常有效。像这样，本文公开的RON特异性抗体或其免疫特异性片段以轭合形式或未轭合形式在之前经受过辅助疗法例如外部照射放疗或化疗的患者中是有用的。在其它优选的实施方案中，结合分子，例如结合多肽，如RON特异性抗体或其免疫特异性片段(也是轭合或未轭合形式)可以与化疗剂一起用于联合治疗方案中。本领域技术人员明白，这类治疗方案可能包含相继、同时、并行或共同施用本文公开的抗体或其它结合分子与一种或多种化疗剂。本发明这个方面特别优选的实施方案包括施用放射标记的结合多肽。
虽然RON特异性抗体或其免疫特异性片段可以象上面描述的来施用，应当强调的是在其它实施方案中，可以将轭合和未轭合的结合分子施用给本来健康的患者作为一线治疗剂。在这类实施方案中，可以将结合分子施用给具有正常或平均的红骨髓储备的患者，和/或施用给未曾并且没有进行辅助疗法(诸如体外照射或化疗)的患者。
然而，象上面讨论过的，选择的本发明的实施方案包括将RON特异性抗体或其免疫特异性片段施用给骨髓抑制患者，或者与一种或多种辅助疗法，诸如放疗或化疗联合或共同使用(即联合治疗方案)。如本文所用，RON特异性抗体或其免疫特异性片段与辅助疗法的共同或联合施用意味着相继、同时、共同、并行、相伴或同期施用或应用所述疗法和本文公开的结合分子。本领域技术人员会理解，联合治疗方案的各种成分的施用或应用应当被定时以便增强治疗的整体效果。例如，应当以标准的公知治疗过程施用化疗剂，然后在几周内施用本文描述的放射免疫轭合物。相反，可以静脉内施用连接了细胞毒素的结合分子，然后进行肿瘤局限性的体外放射。还在其它实施方案中，可以将结合分子与一种或多种选定的化疗剂在一次就诊中并行施用。技术人员(例如，有经验的肿瘤医生)基于选定的辅助疗法和本说明书的教导能很容易地确定有效的联合治疗方案，而不需过多实验。
在此方面，可以理解，结合分子(带有细胞毒素或不带细胞毒素)和化疗剂的联合可能以任何次序并在向患者提供治疗益处的任何时间段内施用。即，化疗剂和RON特异性抗体或其免疫特异性片段可能以任何顺序或并行施用。在选定的实施方案中，本发明的RON特异性抗体或其免疫特异性片段将被施用给之前已经进行过化疗的患者。在其它实施方案中，本发明的RON特异性抗体或其免疫特异性片段将与化疗治疗基本上同时或并行地施用。例如，可以给予正在经历化疗疗程的患者结合分子。在优选的实施方案中，将在任何化疗剂或化疗治疗的1年内施用结合分子。在其它优选实施方案中，将在任何化疗剂或化疗治疗的10、8、6、4或2个月内施用多肽。还在其它优选的实施方案中，将在任何化疗剂或化疗治疗的4、3、2、或1周内施用结合分子。又在其它实施方案中，将在选定的化疗剂或化疗治疗的5、4、3、2或1天内施用结合分子。还可以理解，两种药剂或治疗法可以在大约数小时或数分钟内(即，基本上同时地)施用给患者。
此外，根据本发明，骨髓抑制患者意味着表现出任何血液计数下降的患者。本领域技术人员应当意识到，有多种血液计数参数被常规用作骨髓抑制的临床指标，并且人们可以很容易地测量患者体内出现的骨髓抑制程度。领域认同的骨髓抑制量度的例子是绝对中性粒细胞计数(ANC)或血小板计数。这种骨髓抑制或部分骨髓抑制可能是多种生化病症或疾病的结果，或者更有可能的，是之前化疗或放疗的结果。在这方面，本领域技术人员会明白，曾经接受常规化疗的患者一般会表现出红骨髓储备下降。正如上面讨论过的，这样的受治疗者通常不能用最佳水平的细胞毒素(即放射性核素)来治疗，因为会出现导致更高的死亡率或发病率的不能接受的副作用，诸如贫血或免疫抑制。
更具体的说，本发明所述轭合或未轭合的RON特异性抗体或其免疫特异性片段可以用来有效地治疗ANC低于约2000/mm3或血小板计数低于约150,000/mm3的患者。更优选地，本发明的RON特异性抗体或其免疫特异性片段可以用于治疗ANC低于约1500/mm3、低于约1000/mm3或者更优选低于约500/mm3的患者。类似的，本发明的RON特异性抗体或其免疫特异性片段可以用来治疗血小板计数低于约75,000/mm3、低于约50,000/mm3或者甚至低于约10,000/mm3的患者。更一般的来说，本领域技术人员可以容易地采用政府制定的指南和程序确定何时患者是骨髓抑制的。
如上文指出的，许多骨髓抑制患者已经经过了多个疗程，包括化疗、植入物放疗或体外放射。在后一种情况中，体外放射源是用于对恶性肿瘤的局部辐射。对于植入放疗法，放射性试剂通过手术被放置到恶性肿瘤内，从而选择性地辐射疾病部位。任何情况中，本发明的RON特异性抗体或其免疫特异性片段都可以用于治疗表现出骨髓抑制的患者的紊乱，而不管是什么原因引起的骨髓抑制。
在这方面，还应当意识到，本发明的RON特异性抗体或其免疫特异性片段可以与任何能消除、减少、抑制或控制赘生性细胞的体内生长的化疗剂被共同或联合使用(例如，提供联合治疗方案)。正如讨论过的，这类试剂经常导致红骨髓储备的下降。这种下降可全部或部分由本发明化合物的骨髓毒性的减少来补偿，这使得能够积极地治疗这些患者的瘤形成。在其它实施方案中，本文公开的放射标记的免疫轭合物可以有效地与能提高赘生性细胞对放射性核素的易感性的放射增敏剂一起使用。例如，可以在放射标记的结合分子已大部分从血流中清除，但在肿瘤部位仍维持在治疗有效水平之后施用放射增敏化合物。
考虑到本发明的这些方面，与本发明相容的示例性化疗剂包括烷化剂、长春花生物碱(例如，长春新碱、长春碱)、丙卡巴肼、甲氨蝶呤和强的松。四药物联合MOPP(mechlethamine(氮芥)、长春新碱(Oncovin)、丙卡巴肼和强的松)可以非常有效地治疗各种类型的淋巴瘤，并包括本发明的优选实施方案。在MOPP耐药性患者中，可以使用ABVD(例如，阿霉素、博来霉素、长春碱和达卡巴嗪)、CH1VPP(苯丁酸氮芥、长春碱、丙卡巴肼和强的松)、CABS(洛莫司汀、多柔比星、博来霉素和链脲佐菌素)、MOPP加ABVD、MOPP加ABV(多柔比星、博来霉素和长春碱)或BCVPP(卡莫司汀、环磷酰胺、长春碱、丙卡巴肼和强的松)的联合。对于标准给药剂量和进度，可参见Arnold S.Freedman和Lee M.Nadler，Malignant Lymphomas(恶性淋巴瘤)，在Harrison’s Principles ofInternal Medicine(哈里森内科学原理)1774-1788(Kurt J.Isselbacher等人编辑，第13版.1994)和V.T.DeVita等人，(1997)和其中引用的参考文献。这些疗法可以不经改变使用或者按照具体患者需要经过改变后与本发明的一种或多种RON特异性抗体或其免疫特异性片段联合使用。
可用于本发明范畴的其它方案包括使用单独烷化剂例如环磷酰胺或苯丁酸氮芥、或者药物联合如CVP(环磷酰胺、长春新碱和强的松)、CHOP(CVP和多柔比星)、C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、强的松和丙卡巴肼)、CAP-BOP(CHOP加丙卡巴肼和博来霉素)、m-BACOD(CHOP加甲氨蝶呤、博来霉素和甲酰四氢叶酸)、ProMACE-MOPP(强的松、甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷和甲酰四氢叶酸加标准MOPP)、ProMACE-CytaBOM(强的松、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、阿糖胞苷、博来霉素、长春新碱、甲氨蝶呤和甲酰四氢叶酸)以及MACOP-B(甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、固定剂量的强的松、博来霉素和甲酰四氢叶酸)。本领域技术人员能够容易地确定用于这些方案之中每一个的标准剂量和进度。CHOP也已经与博来霉素、甲氨蝶呤、丙卡巴肼、氮芥、胞嘧啶阿拉伯糖苷以及依托泊苷联合。其它相容的化疗剂包括但不限于2-氯脱氧腺苷(2-CDA)、2’-脱氧助间型霉素(Deoxycoformycin)和氟达拉滨。
对于不能实现疾病缓解或复发的中级和高级恶性肿瘤患者，使用救援治疗(salvage therapy)。救援治疗使用药物，例如胞嘧啶阿拉伯糖苷、顺铂、卡铂、依托泊苷和异环磷酰胺(单独地或联合地给予)。在复发或侵袭形式的某些肿瘤病症中，常常使用以下方案：IMVP-16(异环磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷)、MIME(甲基-gag、异环磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷)、DHAP(地塞米松、高剂量阿糖胞苷和顺铂)、ESHAP(依托泊苷、甲基强的松龙(methylpredisolone)、HD阿糖胞苷、顺铂)、CEPP(B)(环磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、强的松和博来霉素)和CAMP(洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和强的松)，每个均有熟知的给药速率和进度。
可以与本发明的RON特异性抗体或其免疫特异性片段联合使用的化疗剂的量可以随着受治疗者而变化，或者可以根据本领域熟知的方法施用。见例如，Bruce A Chabner等人，Antineoplastic Agents(抗肿瘤剂)，在Goodman & Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics(治疗的药理学基础)1233-1287(Joel G.Hardman等人编辑，第9版(1996))。
在另一个实施方案中，本发明的RON特异性抗体或其免疫特异性片段可以与生物制剂一起施用。可以用于治疗癌症的生物制剂是本领域已知的，本发明的结合分子可以与例如这些已知的生物制剂一起使用。
例如，FDA已批准以下用于治疗乳腺癌的生物制剂：
Figure BPA00001230452801331
(曲妥珠单抗，Genentech Inc.，South San Francisco，CA；在HER2阳性乳腺癌中有抗肿瘤活性的一种人源化单克隆抗体)；
Figure BPA00001230452801332
(氟维司群，AstraZeneca Pharmaceuticals，LP，Wilmington，DE；一种用于治疗乳腺癌的雌激素受体拮抗剂)；
Figure BPA00001230452801333
(阿那曲唑，AstraZeneca Pharmaceuticals，LP；一种非类固醇类芳香酶抑制剂，它能阻断产生雌激素所需要的芳香酶)；
Figure BPA00001230452801334
(依西美坦，Pfizer Inc.，New York，NY；一种用于治疗乳腺癌的不可逆的类固醇类芳香酶灭活剂)；
Figure BPA00001230452801335
(来曲唑，NovartisPharmaceuticals，East Hanover，NJ；一种由FDA批准的治疗乳腺癌的非类固醇类芳香酶抑制剂)；以及
Figure BPA00001230452801336
(他莫昔芬，AstraZenecaPharmaceuticals，LP；一种由FDA批准的治疗乳腺癌的非类固醇类抗雌激素)。其它能与本发明的结合分子联合使用的生物制剂包括：AvastinTM(贝伐单抗，Genentech Inc.；FDA批准的第一个设计用于抑制血管新生的疗法)；和
Figure BPA00001230452801337
(替伊莫单抗，Biogen Idec，Cambridge，MA；一种目前批准用于治疗B细胞淋巴瘤的放射标记的单克隆抗体)。
此外，FDA还批准了以下用于治疗结肠癌的生物制剂：AvastinTM；ErbituxTM(西妥昔单抗，ImClone Systems Inc.，New York，NY，和Bristol-Myers Squibb，New York，NY；是一种直接针对表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体)；(甲磺酸伊马替尼；蛋白激酶抑制剂)；和
Figure BPA00001230452801339
(盐酸左旋咪唑，Janssen Pharmaceutica Products，LP，Titusville，NJ；由FDA在1990年批准的一种免疫调节剂，与5-氟尿嘧啶联合用于Dukes’C期结肠癌患者手术切除后的辅助治疗)。
目前批准的用于治疗非霍奇金淋巴瘤的疗法包括：
Figure BPA000012304528013310
(托西莫单抗和碘I-131托西莫单抗，GlaxoSmithKline，Research Triangle Park，NC；一种多步骤治疗，涉及到连接有放射性分子(碘I-131)的小鼠单克隆抗体(托西莫单抗))；A(干扰素α-2b，Schering Corporation，Kenilworth，NJ；一类批准的与含有蒽环类抗生素的联合化疗(例如，环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松[CHOP]一起用于治疗滤泡性非霍奇金琳巴瘤的干扰素))；
Figure BPA00001230452801342
(利妥昔单抗，Genentech Inc.，South San Francisco，CA，和Biogen Idec，Cambridge，MA；一种批准用于治疗非霍奇金淋巴瘤的单克隆抗体；
Figure BPA00001230452801343
(地尼白介素毒素连接物，Ligand Pharmaceuticals Inc.，SanDiego，CA；由白喉毒素的一个片段与白细胞介素-2基因融合构成的融合蛋白)；以及
Figure BPA00001230452801344
(替伊莫单抗，Biogen Idec；由FDA批准用于治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤的放射标记的单克隆抗体)。
对于治疗白血病，能与本发明的结合分子联合使用的示例性生物制剂包括
Figure BPA00001230452801345
(阿仑单抗，Berlex Laboratories，Richmond，CA；一类用于治疗慢性淋巴细胞白血病的单克隆抗体)。此外，Genasense(奥利莫森(oblimersen)，Genta Corporation，Berkley Heights，NJ；可使用一种开发中的用于治疗白血病的BCL-2反义治疗剂(例如单独使用或者与一种或多种化疗药物，诸如氟达拉滨和环磷酰胺联合使用)可能与要求保护的结合分子一起施用。
对于治疗肺癌，示例性的生物制剂包括TarcevaTM(盐酸厄洛替尼，OSIPharmaceuticals Inc.，Melville，NY；一种设计用来靶向到人类表皮生长因子受体1(HER1)途径的小分子)。
对于治疗多发性骨髓瘤，示例性的生物制剂包括
Figure BPA00001230452801346
Velcade(硼替佐米，Millennium Pharmaceuticals，Cambridge MA；一种蛋白酶体抑制剂)。其它生物制剂包括
Figure BPA00001230452801347
(沙利度胺，Clegene Corporation，Warren，NJ；一种免疫调节剂，似乎具有多种作用，包括能抑制骨髓瘤细胞的生长和存活以及抗血管新生)。
其它示例性的生物制剂包括由ImClone Systems，Inc.，New York，NY开发的MOAB IMC-C225。
如前文所讨论的，可以将本发明的RON特异性抗体或其免疫特异性片段、或其重组体以药学上有效量施用以用于体内治疗哺乳动物的过度增生性病症。在这方面，应当意识到所公开的抗体要配制成能协助活性药剂的施用并提高其稳定性。优选地，符合本发明的药物组合物包含药学上可接受的无毒、无菌载体，诸如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂等。为了本申请的目的，与治疗剂轭合或未轭合的药物有效量的本发明的RON特异性抗体或其免疫特异性片段、或其重组体应该理解为这样的量，其足够实现与靶的有效结合，并取得益处，例如减轻疾病或病症的症状或者检测物质或细胞。在肿瘤细胞的情况中，优选所述结合分子能与赘生性或免疫反应性细胞上或非赘生性细胞(例如与赘生性细胞相伴的血管细胞)上的选定的免疫反应性抗原相互作用，并能引起这些细胞的死亡增加。当然，可以将本发明的药物组合物以单次剂量或多次剂量施用，从而提供药学上有效量的结合分子。
与本公开的范围保持一致，可以将本发明的RON特异性抗体或其免疫特异性片段按照前面提到的治疗方法以足够产生治疗或预防效果的用量施用给人类或其它动物。可以将本发明的RON特异性抗体或其免疫特异性片段以常规剂型给予这样的人类或其它动物，所述剂型是通过将本发明的抗体与常规的药学上可接受的载体或稀释剂按照已知技术结合在一起制备的。本领域技术人员会意识到，药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特点受到与之结合使用的活性成分的量、施用途径和其它公知变量支配。本领域技术人员还会意识到，包含一种或多种根据本发明的结合分子种类的混合物可能证明是特别有效的。
除非另外说明，否则本发明的实施将利用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常用技术，其在本领域的技术之内。这些技术在文献中被充分地解释。参见例如Molecular Cloning A Laboratory Manual(分子克隆实验手册)，第2版，Sambrook等人编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press：(1989)；MolecularCloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册)，Sambrook等人编辑，Cold Springs Harbor Laboratory，New York(1992)，DNA Cloning(DNA克隆)，D.N.Glover编辑，卷I和II(1985)；Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)，M.J.Gait编辑，(1984)；Mullis等人.美国专利第4,683,195号；Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交)，B.D.Hames & S.J.Higgins编辑(1984)；Transcription And Translation(转录和翻译)，B.D.Hames & S.J.Higgins编辑(1984)；Culture Of Animal Cells(动物细胞培养)，R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，(1987)；Immobilized Cells And Enzymes(固定化的细胞和酶)，IRL Press，(1986)；B.Perbal，A Practical Guide To MolecularCloning(分子克隆实用指南)(1984)；专题论文，Methods In Enzymology(酶学方法)，Academic Press，Inc.，N.Y.；Gene Transfer Vectors For MammalianCells(哺乳动物细胞的基因转移载体)，J.H.Miller和M.P.Calos编辑，ColdSpring Harbor Laboratory(1987)；Methods In Enzymology(酶学方法)，卷154和155(Wu等人编辑)；Immunochemical Methods In Cell And MolecularBiology(细胞和分子生物学中的免疫化学方法)，Mayer和Walker编辑，Academic Press，London(1987)；Handbook Of Experimental Immunology(实验免疫学手册)，卷I-IV，D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑，(1986)；Manipulating the Mouse Embryo(小鼠胚胎操作)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1986)；和在Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新实验方案)，JohnWiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)。
抗体工程的一般原理阐述在Antibody Engineering(抗体工程)，第2版，C.A.K.Borrebaeck编辑，牛津大学出版社(1995)中。蛋白质工程的一般原理阐述在Protein Engineering，A Practical Approach(蛋白工程的实用方法)，RickWood，D.等人编辑，IRL Press，牛津大学出版社，牛津，英格兰(1995)中。抗体和抗体-半抗原结合的一般原理阐述在：Nisonoff，A.，Molecular Immunology(分子免疫学)，第2版，Sinauer Associates，Sunderland，MA(1984)；和Steward，M.W.，Antibodies，Their Structure andFunction(抗体、其结构和功能)，Chapman和Hall，New York，NY(1984)。另外，本领域已知的和未特别描述的免疫学标准方法通常是按照CurrentProtocols in Immunology(免疫学最新实验方案)，John Wiley & Sons，NewYork；Stites等人(编辑)，Basic and Clinical-Immunology(基础和临床免疫学)(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)以及Mishell和Shiigi(编辑)，Selected Methods in Cellular Immunology(细胞免疫学中的精选方法)，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)。
阐述免疫学的一般原理的标准参考著作包括Current Protocols inImmunology(免疫学最新实验方案)，John Wiley & Sons，New York；Klein，J.，Immunology：The Science of Self-Nonself Discrimination(免疫学：辨别自身-非自身的科学)，John Wiley & Sons，New York(1982)；Kennett，R等人编辑，Monoclonal Antibodies，Hybridoma：A New Dimension in BiologicalAnalyses(单克隆抗体、杂交瘤：生物学分析的新尺度)，Plenum Press，NewYork(1980)；Campbell，A.，“Monoclonal Antibody Technology(单克隆抗体技术)”，Burden，R等人编辑，Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology(生物化学和分子生物学实验技术)，卷13，Elsevere，Amsterdam(1984)，Kuby Immunology第4版，编辑Richard A.Goldsby，Thomas J.Kindt和Barbara A.Osbome，H.Freemand&Co.(2000)；Roitt，I.，Brostoff，J.和Male D.，Immunology(免疫学)第6版London：Mosby(2001)；Abbas A.，Abul，A.和Lichtman，A.，Cellular and Molecular Immunology(细胞和分子免疫学)第5版，Elsevier Health Sciences Division(2005)；Kontermann和Dubel，A ntibodies Engineering(抗体工程)，Springer Verlan(2001)；Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验手册).Cold Spring Harbor Press(2001)；Lewin，Genes VIII(基因VIII)，Prentice Hall(2003)；Harlow和Lane，Antibodies：A LaboratoryManual(抗体实验手册)，Cold Spring Harbor Press(1988)；Dieffenbach和Dveksler，PCR Primer(PCR引物)Cold Spring Harbor Press(2003)。
上面所引用的所有参考文献，以及本文所引用的所有文献的全文均以引用的方式并入本文。
实施例
实施例1
噬菌体展示获得的Fab抗体的产生和转化
重组的人类和鼠RON胞外结构域蛋白用于筛选人类首次用于试验的包含3.5×1010个独特克隆的噬菌粒Fab文库(Nat Biotechnol.23(3)：344-8(2005))。将生物素化的RON蛋白捕获到抗生蛋白链菌素包被的磁珠上，随后与噬菌体文库一起孵育。如以前所述进行选择(Nat Biotechnol.23(3)：344-8(2005))。利用人类RON sema胞外结构域和融合于人类IgG1Fc的全长鼠胞外结构域(muRON-Fc)(R&D Systems，Inc.)进行三次不同的淘选臂。臂1淘选人类RON sema结构域蛋白3轮。臂2淘选muRON-Fc蛋白三轮。臂3淘选人类蛋白两轮，并且对鼠蛋白淘选第三轮。3轮淘选后，通过MluI消化除去479bp基因III残余端，并为了在TG1细胞中可溶性Fab的表达将载体重新连接。对来自人类RON sema结构域淘选(臂1)的960个克隆的ELISA分析产生含有52个独特序列的314个阳性克隆。对来自臂2和臂3的1920个克隆的ELISA分析产生含有65个独特序列的282个阳性克隆。纯化独特的克隆，由ELISA再次证实对重组人类RONsema胞外结构域和muRON-Fc以及稳定地转染全长人类和鼠RON的CHO细胞的结合。基于结合数据，选择从臂1分离的四个克隆和从臂2和3分离的五个克隆用于进一步分析：M93-D02、M96-C05、M97-D03、M98-E12、M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10和M80-B03。
实施例2
鼠单克隆抗体的产生
免疫和血液取样
对九周大的雌性Rbf小鼠(Jackson Labs，Bar Harbor，ME)用固定在25μl Talon金属螯合树脂(Clonetech)上的最终珠密度为1.6mg/ml树脂的40.5μg hRON-10His(R&D Systems，Inc.)腹膜内(IP)免疫。随后，以25μg IP施用两次另外的注射，最终珠密度也是1.6mg/ml树脂。两次25μg注射之后是融合前IP施用RIBI佐剂中的50μg，之后收集淋巴组织。
在第一次免疫之前、第一次加强免疫七天后、随后两次免疫的每一次之后和收集淋巴细胞之前通过眼窝后血管丛收集方法从免疫的小鼠收集血清样品。利用ELISA和FACS测定测量血清滴度。
固相测定(ELISA)
将96-孔微滴定板Maxisorp(Nunc)用50μl/孔的Dulbecco磷酸盐缓冲液，pH 7.2中的1μg/ml hRON-10His样品包被过夜。然后倒空板，用在PBS中的0.05％吐温-20溶液，pH 7.2利用Embla自动洗板器(Skatron)洗涤三次。在洗涤步骤之后，用在PBS中的过滤的1％BSA，pH 7.2封闭溶液充满孔并允许在室温孵育1小时。封闭板之后，将板弹空，立即加入在封闭缓冲液中的50μl血清、前血清、对照样品或稀释的mAb上清液(来自产生单克隆的杂交瘤)的连续稀释液；允许ELISA板在室温孵育1小时。如上述洗涤板四次，随后向每个孔加入50μl在封闭缓冲液中的1：5000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP(Jackson Labs)，再次允许在室温孵育1小时。如上述洗涤板五次，随后加入50μl Ultra TMB(Pierce)底物，然后允许催化大约10分钟。通过加入等体积的2.0N H2SO4来终止酶反应，在Spectramax 384Plus(Molecular Devices)自动板扫描机上在450nm读板。利用Softmax Pro(Molecular Devices)分析软件完成ELISA分析。
流式细胞术测定
流式细胞术测定在SW480和HT1080细胞系进行。通过首先除去生长培养基并用20ml无菌PBS轻柔洗涤细胞单层两次以除去细胞碎片和代谢的生长培养基来从T162烧瓶(Nunclon)抬升单层细胞来进行细胞分离。每次洗涤后，通过抽吸轻柔除去PBS洗液。然后向每个烧瓶加入10ml非酶促的细胞解离缓冲液(Sigma，目录号C5914)并允许孵育2-5分钟，伴随周期性的轻拍和摇动以从组织培养塑料瓶释放细胞单层。向每个烧瓶加入15至20ml的生长培养基，并轻柔混合细胞，然后转移到50ml无菌管中。在1200RPM离心细胞4分钟以沉淀细胞团块。在20ml无菌PBS中洗涤细胞两次，然后计数并悬浮到FACS缓冲液中(PBS中的1％BSA)。
为了使荧光可见，进行了细胞染色。所有细胞染色步骤在冰上或在4℃进行。首先，利用台盼蓝排除法将洗涤的细胞在血细胞计数器上计数，并在FACS缓冲液中悬浮1-2×106/ml，以每孔50ul铺板到96-孔V或U形底板中。然后，向每个孔加入50μl一抗(稀释的纯化的对照抗体、血清抗体或mAb上清液)，并将板保留在冰上30分钟。洗涤细胞三次。每个洗涤循环通过如下进行：向每个孔加入150μl FAC缓冲液，在1300rpm将板离心4分钟，丢弃上清液并将细胞团块轻拍松散，向每个孔加入200μlFACS缓冲液，然后在1300rpm将板离心4分钟。第三次洗涤之后，丢弃上清液，将细胞团块轻拍松散。然后，向每个孔加入50μl的二抗工作溶液(如制造商建议的1∶200)。使用来自Jackson Lab的物种特异性荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)-轭合的二抗。加入二抗之后，用箔覆盖板，摇动，然后在冰上或在4℃保存30分钟。然后洗涤细胞三次(如上所述)随后固定。为了固定细胞，向每个孔加入200μl固定缓冲液(PBS中的1％低聚甲醛)。然后摇动板并由流式细胞术读数或保存在4℃。48或72小时后读板。这些测定中使用以下抗体对照：小鼠免疫血清、小鼠前血清、鼠mAb 691(R&D)。
杂交瘤的产生
在淋巴细胞的细胞融合实验之前，将Ig-/HGPRT-Balb/c小鼠骨髓瘤细胞系的APRT-衍生物FL653和Ig-/HGPRT-Balb/c小鼠骨髓瘤细胞系的SP2/0-Ag14在包含4500mg/L葡萄糖、L-谷氨酰胺和20μg/ml 8-氮杂鸟嘌呤(Sigma Chemical Co.)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM，SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)中的10％胎牛血清中培养至少10天。将骨髓瘤细胞培养在Series IITM模型水套层培养箱(Forma Scientific，Marietta，OH)中，该培养箱程序设置为保持在37℃、98％湿环境、伴有大气环境中的7％CO2。
处死在ELISA和FACS中筛选为对hRON 10His抗原特异性抗体阳性的小鼠，无菌地收集脾脏B-淋巴细胞。洗涤脾脏B-淋巴细胞并制备为用于PEG介导的融合于FL653或SP2/0-Ag14骨髓瘤的淋巴细胞体细胞融合体，根据Kennett等人，(Monoclonal Antibody：A New Dimension in BiologicalAnalyses(单克隆抗体：生物学分析的新尺度)，Plenum Press，New York(1992))。将融合的细胞铺板到24-孔无菌组织培养板(Corning Glass Works，Corning，NY)，对于基于FL653或SP2/0-Ag14骨髓瘤的融合体分别向融合细胞提供含有腺嘌呤、氨基喋呤和胸苷(AAT)或次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基。细胞培养物环境保持在37℃、98％湿环境、伴有大气环境中的7％CO2。
10天后，分离AAT或HAT抗性培养物并如前所述由ELISA筛选对hRON的ELISA(R&D形式)和FACS(SW480hRON+/HT1080hRON-)形式具有特异性的免疫反应性。随后克隆阳性培养物，扩增并冷冻。通过有限稀释(约1个细胞/孔)进行克隆并在显微镜下记录生长以确保所选的克隆的克隆来源。扩增在ELISA和FACS形式测定上都被筛选为阳性的克隆用于冷冻，利用IsoStrip测定(Roche)表征亚类，测定单克隆产生水平并为了微克水平量的所选单克隆抗体将其转移到1升细胞袋(LampireBiologicals Laboratories，Inc.)。
实施例3
鼠抗人类RON功能阻断mAb的克隆
鼠杂交瘤免疫球蛋白可变区的克隆
按照制造商推荐的方案利用Qiagen RNeasy微型试剂盒从鼠杂交瘤细胞制备总细胞RNA。利用用于引发第一链cDNA的随机六聚物，通过RT-PCR从总细胞RNA中克隆编码重链和轻链的可变区的cDNA。对于PCR扩增带有完整信号序列的鼠免疫球蛋白可变结构域，与多种鼠免疫球蛋白基因家族信号序列杂交的简并正向引物和对鼠恒定结构域的5’端具有特异性的单种反向引物的混合物。凝胶纯化PCR产物并按照制造商推荐的方案利用TOPO克隆试剂盒将其亚克隆到Invitrogen的pCR2.1TOPO载体中。对来自多种独立亚克隆的插入物测序来确立共有序列。推测的成熟免疫球蛋白N端与通过Edman降解从杂交瘤确定的一致。利用来自Kabat数据库的共有的免疫球蛋白可变结构域序列基于BLAST分析分配到具体亚组。CDR利用Kabat定义来命名。
1P3B2.2
以下显示为SEQ ID NO：54的是1P3B2.2成熟重链可变结构域蛋白序列，CDR加下划线：
  1 EVQLQQSGPE LEKPGASVKI SCKASGYSFT GYNMNWVKQS NGESLEWIGD
 51 IDPYYGGTRY NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MQLKSLTSED SAVYYCAREG
101 RGFAYWGQGT LVTVSA
这是鼠亚组II(A)重链。以下显示为SEQ ID NO：53的是1P3B2.2重链可变结构域(来自pYL363)的DNA序列，其信号序列加下划线(编码重链的信号是MGWICIFLFLVSVTTGVHS(SEQ ID NO：103))：
 1  ATGGGTTGGATCTGTATCTTTCTCTTCCTCGTGTCAGTAACTACAGGTGT
51  CCACTCTGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGAGAAGCCTG
101 GCGCTTCAGTGAAAATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGC
151 TACAACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCAATGGAGAGAGCCTTGAGTGGAT
201 TGGAGATATTGATCCTTACTATGGTGGTACTAGGTACAACCAGAAGTTCA
251 AGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATG
301 CAACTCAAGAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAG
351 AGAGGGGAGGGGTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCT
401 CTGCA
以下显示为SEQ ID NO：59的是1P3B2.2成熟轻链可变结构域蛋白序列，其CDR加下划线：
  1 DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQKKQGKSPQLLVYN
 51 AKTSVEGVPSRFSGSGSGIQFSLKINSLQPEDFGSYYCHCQHHYGTLPTF
101 GGGTKLEIK
这是鼠亚组Vκ轻链。(注意CDR3中不常见的未配对的半胱氨酸。)以下显示为SEQ ID NO：58的是轻链可变结构域(来自pYL359)的DNA序列，其信号序列加下划线(编码轻链的信号是MRAPAQFLGLLLLWLTGARC(SEQ ID NO：104))：
 1  ATGAGGGCCCCTGCTCAGTTCCTTGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGG
51  TGCCAGATGTGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCAT
101 CTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTAC
151 AGTTATTTAGCATGGTATCAGAAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAACTCCT
201 GGTCTATAATGCAAAAACCTCAGTAGAAGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTG
251 GCAGTGGATCAGGCATACAGTTTTCTCTGAAGATCAATAGCCTGCAGCCT
301 GAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCACTGTCAACATCATTATGGTACTCT
351 TCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
1P4A3.3
以下显示为SEQ ID NO：64的是1P4A3.3成熟重链可变结构域蛋白序列，其CDR加下划线：
  1 EVQLQQSGPE LEKPGASVMI SCKASGYSFT GYNMNWVKQS TGKSLEWIGD
 51 IDPYYDGTRY NQKFKGKATL TADKSSSTAY MQLKSLTSED SAVYYCTREG
101 RGFAYWGQGT LVTVSA
这是鼠亚组II(A)重链。以下显示为SEQ ID NO：63的是1P4A3.3重链可变结构域(来自pYL367)的DNA序列，其信号序列加下划线(编码重链的信号是MGWSWVFLLI LSVTTGVHS(SEQ ID NO：105))：
  1 ATGGGATGGA GCTGGGTCTT TCTCTTAATC CTATCAGTAA CTACAGGTGT
 51 CCACTCTGAG GTCCAGCTGC AGCAGTCTGG ACCTGAGCTG GAGAAGCCTG
101 GCGCTTCAGT GATGATATCC TGCAAGGCTT CTGGTTACTC ATTCACTGGC
151 TACAACATGA ACTGGGTGAA GCAGAGCACT GGCAAGAGCC TTGAGTGGAT
201 TGGAGATATT GATCCTTACT ATGATGGTAC TAGGTACAAC CAGAAGTTCA
251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GCAGACAAAT CCTCCAGCAC AGCCTACATG
301 CAGCTCAAGA GCCTGACATC TGAAGACTCT GCAGTCTATT ACTGTACAAG
351 AGAGGGAAGA GGGTTTGCTT ACTGGGGCCA AGGGACTCTG GTCACTGTCT
401 CTGCA
以下显示为SEQ ID NO：69的是1P4A3.3成熟轻链可变结构域蛋白序列，其CDR加下划线：
  1 DIQMTQSPAS LSASVGETVT ITCRASENIY SYLAWYQQKQ GKSPQLLVYN
 51 AKTLAGGVPS RFSGSGSGTQ FSLKINSLQP EDFGSYYCQH YYGTPLTFGA
101 GTKLELK
这是鼠亚组Vκ轻链。以下显示为SEQ ID NO：68的是轻链可变结构域(来自pYL360)的DNA序列，其信号序列加下划线(编码轻链的信号是MRSPAQFLGL LLLWLTGARC(SEQ ID NO：106))：
  1 ATGAGGTCCC CAGCTCAGTT CCTTGGGTTG CTGCTGCTGT GGCTTACAGG
 51 TGCCAGATGT GACATCCAGA TGACTCAGTC TCCAGCCTCC CTATCTGCAT
101 CTGTGGGAGA AACTGTCACC ATCACATGTC GAGCAAGTGA GAATATTTAC
151 AGTTATTTAG CATGGTATCA GCAGAAACAG GGAAAATCTC CTCAGCTCCT
201 GGTCTATAAT GCAAAAACCT TAGCAGGAGG TGTGCCATCA AGGTTCAGTG
251 GCAGTGGATC AGGCACACAG TTTTCTCTGA AGATCAACAG CCTGCAGCCT
301 GAAGATTTTG GGAGTTATTA TTGTCAACAT TATTATGGTA CTCCTCTCAC
351 GTTCGGTGCT GGGACCAAGC TGGAGCTGAA A
1P3B2.2与1P4A3.3mAb是高度同源的。以下显示的是1P3B2.2(上)与1P4A3.3(下)的重链的比对，其共有94.8％同一性：
  1 EVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYNMNWVKQSNGESLEWIGD 50
    |||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| |.|||||||
  1 EVQLQQSGPELEKPGASVMISCKASGYSFTGYNMNWVKQSTGKSLEWIGD 50
 51 IDPYYGGTRYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCAREG 100
    ||||| ||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||| |||
 51 IDPYYDGTRYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCTREG 100
101 RGFAYWGQGTLVTVSA 116 (SEQ ID NO：54)
    ||||||||||||||||
101 RGFAYWGQGTLVTVSA 116 (SEQ ID NO：64)
以下显示的是1P3B2.2(上)与1P4A3.3(下)的轻链的比对，其共有90.7％同一性：
  1 DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQKKQGKSPQLLVYN 50
    |||||||||||||||||||||||||||||||||||||.||||||||||||
  1 DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYN 50
 51 AKTSVEGVPSRFSGSGSGIQFSLKINSLQPEDFGSYYCHCQHHYGTLPTF 100
    ||| |||||||||||||| |||||||||||||||||||  |||:||  ||
 51 AKTLAGGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYC..QHYYGTPLTF 98
101 GGGTKLEIK 109 (SEQ ID NO：59)
    | |||||:|
 99 GAGTKLELK 107 (SEQ ID NO：69)
1P5B10.3
以下显示为SEQ ID NO：74的是1P5B10.3成熟重链可变结构域蛋白序列，其CDR加下划线：
  1 EVQLQQSGPE LVKPGASMKI SCRAAGFSFT GYTMNWVKQS HGKSLEWIGL
 51 INLNNGGTSH NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MELLSLTSED SAVYYCARWL
101 RRGGYAMDYW GQGISVTVSS
这是鼠亚组II(A)重链。以下显示为SEQ ID NO：73的是1P5B10.3重链可变结构域(来自pYL358)的DNA序列，其信号序列加下划线(编码重链的信号是MGCSWVMLFL LSGTAGVHS(SEQ ID NO：107))：
  1 ATGGGATGCA GCTGGGTAAT GCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT
 51 CCACTCTGAG GTCCAGCTAC AACAGTCTGG ACCTGAACTG GTGAAGCCTG
101 GAGCTTCAAT GAAGATATCC TGCAGGGCTG CTGGTTTCTC ATTCACTGGC
151 TACACCATGA ACTGGGTGAA GCAGAGCCAT GGAAAGAGCC TTGAGTGGAT
201 TGGACTTATT AATCTTAACA ATGGTGGTAC TAGCCACAAC CAGAAGTTCA
251 AGGGCAAGGC CACATTAACT GTAGACAAGT CATCCAGCAC AGCCTACATG
301 GAGCTCCTCA GTCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG
351 ATGGTTACGT CGTGGGGGCT ATGCTATGGA CTACTGGGGT CAAGGAATTT
401 CAGTCACCGT CTCCTCA
以下显示为SEQ ID NO：79的是1P5B10.3成熟轻链可变结构域蛋白序列，其CDR加下划线：
  1 DILLTQSPAI LSVSPGERVS FSCRASQNIG TSIHWYQQRT NGSPRLLIKY
 51 ASESISGIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYCQQ SDSWPLTFGA
101 GTKLELK
这是鼠亚组Iκ轻链。以下显示为SEQ ID NO：78的是轻链可变结构域(来自pYL368)的DNA序列，其信号序列加下划线(编码轻链的信号是MVSS AQFLVF LLFWIPASRG(SEQ ID NO：108))：
  1 ATGGTGTCCT CAGCTCAGTT CCTTGTATTT TTGCTTTTCT GGATTCCAGC
 51 CTCCAGAGGT GACATCTTGC TGACTCAGTC TCCAGCCATC CTGTCTGTGA
101 GTCCAGGAGA AAGAGTCAGT TTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAACATTGGC
151 ACAAGCATAC ACTGGTATCA GCAAAGAACA AATGGTTCTC CAAGGCTTCT
201 CATAAAGTAT GCTTCTGAGT CTATCTCTGG GATCCCTTCC AGGTTTAGTG
251 GCAGTGGATC AGGGACAGAT TTTACTCTTA GCATCAACAG TGTGGAGTCT
301 GAAGATATTG CAGATTATTA CTGTCAACAA AGTGATAGCT GGCCACTCAC
351 GTTTGGTGCT GGGACCAAGC TGGAGCTGAA A
1P4A 12.2
以下显示为SEQ ID NO：84的是1P4A12.2成熟重链可变结构域蛋白序列，其CDR加下划线：
 1  EVQLQQSGPE LVKPGASMKI SCKASGYSFT GYTMNWVKQS HGKKLEWIGL
 51 INPYNGGTIY NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MELLSLTSED SAVYYCARWL
101 RRGGYAMDYW GQGASVTVSS
这是鼠亚组II(A)重链。以下显示为SEQ ID NO：83的是1P5B10.3重链可变结构域(来自pCN558)的DNA序列，其信号序列加下划线(编码重链的信号是MGCSCVMLFL LSGTAGVRS(SEQ ID NO：109))：
1ATGGGATGCAGCTGTGTAATGCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGT
51CCGCTCTGAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTG
101GAGCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGC
151TACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAAGCTTGAGTGGAT
201TGGACTTATTAATCCTTACAATGGTGGGACTATCTACAACCAGAAGTTCA
251AGGGCAAGGCCACATTAACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATG
301GAGCTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAG
351ATGGTTACGACGTGGGGGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAGCCT
401CAGTCACCGTCTCCTCA
以下显示为SEQ ID NO：89的是1P5B10.3成熟轻链可变结构域蛋白序列，其CDR加下划线：
  1 DILLTQSPAI LSVSPGERVS FSCRASQSIG TSIHWYQQRT NGSPRLLIKF
 51 ASESISGIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYCQQ SDSWPLTFGA
101 GTKLEVK
这是鼠亚组κI轻链。以下显示为SEQ ID NO：88的是轻链可变结构域(来自pCN559)的DNA序列，其信号序列加下划线(编码轻链的信号是MVSSAQFLVF LLFWIPASRG(SEQ ID NO：110))：
1ATGGTGTCCTCAGCTCAGTTCCTTGTATTTTTGCTTTTCTGGATTCCAGC
51CTCCAGAGGTGACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGCCATCCTGTCTGTGA
101GTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGCATTGGC
151ACAAGCATACACTGGTATCAGCAAAGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCT
201CATAAAGTTTGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGTG
251GCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTAGCATCAACAGTGTGGAGTCT
301GAAGATATTGCAGATTATTACTGTCAACAAAGTGATAGCTGGCCACTCAC
351GTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGGTGAAA
1P5B10.3与1P4A12.2mAb是高度同源的。以下显示的是1P5B10.3(上)与1P4A12.2(下)的重链的比对，其共有92.5％同一性：
  1 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCRAAGFSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGL 50
    ||||||||||||||||||||||:|.|:|||||||||||||||| ||||||
  1 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKKLEWIGL 50
 51 INLNNGGTSHNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARWL 100
    ||  |||| :||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
 51 INPYNGGTIYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARWL 100
101 RRGGYAMDYWGQGISVTVSS 120 (SEQ ID NO：74)
    ||||||||||||| ||||||
101 RRGGYAMDYWGQGASVTVSS 120 (SEQ ID NO：84)
以下显示的是1P5B 10.3(上)与1P4A12.2(下)的轻链的比对，其共有97.2％同一性：
  1 DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQNIGTSIHWYQQRTNGSPRLLIKY 50
    |||||||||||||||||||||||||||.|||||||||||||||||||||:
  1 DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGTSIHWYQQRTNGSPRLLIKF 50
 51 ASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSDSWPLTFGA 100
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
 51 ASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSDSWPLTFGA 100
101 GTKLELK 107 (SEQ ID NO：79)
    ||||| |
101 GTKLEVK 107 (SEQ ID NO：89
1P2E7.3
以下显示为SEQ ID NO：94的是1P2E7.3成熟重链可变结构域蛋白序列，其CDR加下划线：
1DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGDSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMG
51YISYSGSTSYNPSLKSRFSITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDSATYYCARGG
101FYYRYAGPGFAYWGQGTLVTVSA
这是鼠亚组I(A)重链。以下显示为SEQ ID NO：93的是1P2E7.3重链可变结构域(来自pCN556)的DNA序列，其信号序列加下划线(编码重链的信号是MRVLILLWLF TAFPGILS(SEQ ID NO：111))：
1 ATGAGAGTGC TGATTCTTTT GTGGCTGTTC ACAGCCTTCC CTGGTATCCT
51 GTCTGATGTG CAGCTTCAGG AGTCGGGACC TGGCCTGGTG AAACCTTCTC
101 AGTCTCTGTC CCTCACCTGC ACTGTCACTG GCGACTCAAT CACCAGTGAT
151 TATGCCTGGA ACTGGATCCG GCAGTTTCCA GGAAACAAAC TGGAGTGGAT
201 GGGCTACATA AGCTACAGTG GTAGCACTAG CTACAACCCA TCTCTCAAAA
251 GTCGATTCTC TATCACTCGA GACACATCCA AGAACCAGTT CTTCCTGCAG
301 TTGAATTCTG TGACTACTGA GGACTCAGCC ACATATTACT GTGCAAGAGG
351 GGGGTTCTAC TATAGGTACG CCGGGCCTGG GTTTGCTTAT TGGGGCCAAG
401 GGACTCTGGT CACTGTCTCT GCA
以下显示为SEQ ID NO：99的是1P2E7.3成熟轻链可变结构域蛋白序列，其CDR加下划线：
 1  DVVMTQTPLT LSVTIGQPAS ISCKSSQSLL YTNGKTYLNW LLQRPGQSPK
 51 RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCLQSTHFP
101 LTFGAGTKLE LK
这是鼠亚组IIκ轻链。以下显示为SEQ ID NO：99的是1P2E7.3轻链可变结构域(来自pCN557)的DNA序列，其信号序列加下划线(编码重链的信号是MMSPAQFLFL LVLSIQEING(SEQ ID NO：112))：
1ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTTTCTGTTAGTGCTCTCGATTCAGGA
51AATCAACGGTGATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTA
101CCATTGGACAACCAGCTTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTA
151TATACTAATGGAAAAACCTATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCA
201GTCTCCAAAACGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAATTGGACTCTGGAGTCC
251CTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATC
301AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTACTGCTTGCAGAGTAC
351ACATTTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
实施例4
由流式细胞术确定鼠单克隆抗体与表达RON的肿瘤细胞的结合
由流式细胞术分析RON抗体与表达RON的肿瘤细胞的结合，并计算表观亲和力。用5mM EDTA将汇合的SW480细胞分离，用FACS缓冲液(1％FCS，0.05％叠氮化钠，1×PBS)洗涤1次并以0.5-1.0×107/ml重悬。将细胞以100μl/孔加到96-孔V底聚丙烯板。在FACS缓冲液中以2×终浓度进行抗体稀释并以100μl/孔加入板。在4℃孵育板1小时，然后用FACS缓冲液洗涤3次。然后将细胞团块重悬在150μl 1/200稀释的PE标记的山羊抗鼠IgG H&L二抗中，并在4℃孵育1小时。然后用FACS缓冲液洗涤细胞1次，并在室温用150μl 3％甲醛固定10分钟。将细胞团块重悬在150μl FACS缓冲液中并通过FACS分析。抗体1P5B10、1P4A3、1P2E7、1P3B2和1P4A12在SW480-RON细胞上的代表性的FACS滴定显示在图1中。利用标准4P拟合等式从结合曲线计算结合的EC50。多种抗体的表观亲和力显示在表5中。这些数据表示，抗体结合至人类RON。
表5：通过FACS利用标准4P拟合等式计算的抗体与肿瘤细胞的结合的表观亲和力(参见图1)
  亚克隆   EC50nM
  1P2E7   0.09
  1P3B2   0.04
  1P4A3   0.07
  1P4A12   0.07
  1P5B10   0.34
实施例5
抗RON抗体阻断MSP-RON结合
利用标准ELISA方案测量抗体或Fab阻断MSP与RON结合的能力。简单地说，将可溶性RON蛋白(R&D Systems，目录号1947)以PBS中1μg/ml的浓度在4℃在Nunc Maxisorb ELISA板上包被过夜。用自动洗板器在PBS、0.05％吐温20中洗涤板4次。然后在室温(RT)在PBS+1％无蛋白酶的、无IgG的BSA(Jacksan Labs 001-000-162)中封闭板1-2小时。洗涤后，将抗体或Fab在封闭缓冲液中的连续稀释液加到板中(200μl/孔)。将在封闭液中200ng/ml浓度的MSP(R&D Systems目录号4306-MS)加到板中(10μl/孔)并在室温孵育混合物1-2小时。再次用自动洗板器(PBS，0.05％吐温20)洗涤板4次。然后，在室温以在封闭液中0.5μg/ml浓度的生物素化的山羊抗MSP多克隆抗体(R&D Systems BAF 352)孵育板0.5-1小时。在另外的洗涤步骤之后，加入在封闭液中1∶200稀释的抗生蛋白链菌素-HRP(DY998，R&D Systems)并在室温孵育0.5-1小时。在最终洗涤步骤之后，用TMB溶液(25ml100mM醋酸钠，用柠檬酸调整pH至6，4ul 30％H2O2，250μl在DMSO中的42mM TMB)将板显色5分钟，用100ul H2SO4终止反应。在Molecular Devices Spectramax M5上在450nm波长读板，且Softmax pro V5软件用于分析数据。利用鼠单克隆抗体和人类Fab的ELISA测定结果分别显示在图2A和2B中，并证明鼠单克隆抗体和人类Fab可阻断MSP与RON的结合。
实施例6
抗RON抗体阻断MSP依赖性RON活性
为了测量抗体阻断MSP诱导的磷酸化RON，使用ELISA捕获方法，其中将总RON蛋白捕获在ELISA板上，随后用抗磷酸-酪氨酸抗体(pRONDuoSet IC ELISA，R&D Systems，目录号DYC1947)检测。对于这些实验，将MDA-MB-453乳腺癌细胞(图3A-B)或BxPC-3(图3C)胰腺癌细胞以大约8×105个细胞/孔铺板到6-孔组织培养盘内的RPMI/10％FCS中并允许粘附过夜。第二天，将细胞血清饥饿2.5小时。然后将抗体以终浓度10μg/ml(图3A和3C)或以不同浓度(图3B)加到盘中并孵育15分钟，且然后以终浓度100ng/ml加入MSP另外15分钟。然后按照制造商的方案收集板。抗磷酸-酪氨酸抗体检测的结果显示在图3A-C中并证明鼠单克隆抗体阻断MDA-MB-453乳腺癌细胞中MSP诱导的RON磷酸化，MDA-MB-453细胞中有RON磷酸化的剂量依赖性阻断，且抗体阻断BxPC-3胰腺癌细胞中MSP诱导的RON磷酸化。
实施例7
抗RON抗体阻断非MSP依赖性RON活性
为了测量抗RON抗体对非MSP依赖性信号传导的阻断潜力，使用pERK ELISA测定(pERK 1/2免疫测定，R&D Systems目录号KCB1018)。磷酸-ERK是RON途径的已知下游信号介质。将293E细胞铺板用于转染(10cm盘中3×106个细胞)并允许在DMEM/10％FBS中粘附过夜。第2天，用空载体、编码野生型RON的质粒(图4A)、或编码RONCA的质粒(组成型活化的M1254T激酶结构域突变体；图4B)转染细胞。第3天，将转染的细胞铺板到黑色/透明底的96-孔组织培养板并用无血清培养基中的抗体以30μg/ml或3μg/ml(或MSP以200ng/ml)处理。第4天和第5天，根据制造商的说明书处理板。野生型RON和组成型活化的RON的结果分别显示在图4A和4B中，并证明鼠单克隆抗体阻止pERK的磷酸化。这些数据表明抗体阻断非MSP依赖性RON信号传导。
利用BxPC-3胰腺癌细胞进行类似实验。在这些实验中，将细胞直接铺板到黑色/透明底的96-孔板中，并且不进行转染步骤。结果显示在图4C中。MSP与抗体一起加到孔时，观察到抗体的类似的阻断活性(数据未显示)。
实施例8
抗RON抗体阻断肿瘤细胞中的pAKT
利用两种肿瘤细胞系评价抗RON抗体对肿瘤细胞中pAKT信号传导的阻断潜力：BXPC3和MDA-MB-453。在这些实验中，在早上将1百万个细胞/孔铺板到6孔盘中，然后在DMEM+1％BSA中血清饥饿过夜18小时。除去培养基并以DMEM中的10ug/ml加入抗RON抗体。在37℃孵育细胞30分钟。将MSP以终浓度200ng/ml加入并在37℃孵育30分钟。制备细胞裂解物并将15ug在10％tris-甘氨酸凝胶上电泳，转移到硝酸纤维素。用磷酸化-AKT(Ser473)抗体(Cell Signalling#9271)(图5，上图)探测蛋白质印迹，然后剥除并用AKT抗体(Cell Signalling#9272)(图5，下图)再次探测。利用抗体1P3B2和1P4A3获得的结果显示在图5中并证明鼠单克隆抗体阻止pAKTin肿瘤细胞的磷酸化。
实施例9
抗RON抗体结合至RON剪接变体
为了确定抗RON抗体是否与人类RON剪接变体RONδ160结合，用Hu-RON-P160(MZ236)构建体或单独的载体(模拟品)转染293E细胞。转染后二十四小时，用PBS-5mM EDTA从板除去细胞并用浓度为5ug/ml的抗体、随后是轭合到PE的抗小鼠二抗染色，并通过FACS分析。FACS分析的结果显示在图6中并证明鼠单克隆抗体结合至RONδ160。
实施例10
抗RON抗体以高亲和力结合至可溶抗原
利用标准ELISA方案测量抗体与可溶性RON结合的能力。简单地说，将可溶性RON蛋白(R&D Systems，目录号1947)以PBS中1mg/ml的浓度在4℃在Nunc Maxisorb ELISA板上包被过夜。用自动洗板器在PBS、0.05％吐温20中洗涤板4次。然后在室温(RT)在PBS+1％BSA中封闭板1-2小时。洗涤后，将抗体在封闭缓冲液中的连续稀释液加到板中(100μl/孔)并在室温孵育1-2小时。再次用自动洗板器洗涤板4次(PBS，0.05％吐温20)。接下来，在室温以在封闭缓冲液(100μl/孔)中1∶4000稀释的HRP-标记的驴抗小鼠多克隆抗体(Jackson Labs 715-035-130)的稀释液孵育板0.5-1小时。再次用自动洗板器(PBS，0.05％吐温20)洗涤板4次。在最终洗涤步骤之后，用TMB溶液(25ml100mM醋酸钠，用柠檬酸调整pH至6，4ul 30％H2O2，250μl DMSO中的42mM TMB)将板显色5分钟。用100ul H2SO4终止反应。在Molecular Devices Spectramax M5上在450nm波长读板，且Softmax pro V5软件用于分析数据。结果显示在图7中并证明抗体以高亲和力结合可溶性RON。
实施例11
抗RON抗体结合表达RON的细胞
由流式细胞术分析RON抗体与表达RON的293E细胞的结合，并计算表观亲和力。用胰蛋白酶将汇合的293E/人类RON细胞分离，并用FACS缓冲液(1％FCS，0.05％叠氮化钠，1×PBS)以0.6×107/ml重悬。将细胞以50μl/孔加到96-孔圆底聚丙烯板中。在FACS缓冲液中以2×终浓度进行抗体稀释并以50μl/孔加入板中。在4℃孵育板1小时，然后用FACS缓冲液洗涤3次。然后将细胞团块重悬在100μl藻红蛋白(PE)Fab’2片段山羊抗小鼠IgG Fcg二抗(1/200稀释的)中，并在黑暗中在4℃孵育1小时。然后用FACS缓冲液洗涤细胞3次，并用200μl在PBS中的1％低聚甲醛固定，并通过FACS分析。从结合曲线计算结合的EC50。结果显示在图8中并证明抗体以高亲和力结合表达RON的293细胞。
实施例12
抗RON抗体阻断MSP与表达RON的细胞的结合
由流式细胞术分析RON抗体阻断MSP与表达RON的CHO细胞结合的能力。用胰蛋白酶将汇合的CHO/人类RON细胞分离，用FACS缓冲液(1％FCS，0.05％叠氮化钠，1×PBS)以0.6×107/ml重悬。将细胞以50μl/孔加到96-孔圆底聚丙烯板中。在FACS缓冲液中以2×终浓度进行抗体稀释并以50μl/孔加入板。在4℃孵育板1小时，然后用FACS缓冲液洗涤1次。将MSP(1ug/ml)以50ul/孔的体积加到细胞团块中并在室温孵育30分钟，随后用FACS缓冲液洗涤1次。在室温将山羊抗人类MSP(10ug/ml)加到细胞团块中30分钟，随后在FACS缓冲液中洗涤2次。然后将细胞团块重悬在100μlPE Fab’2片段驴抗山羊IgG(H+L)二抗(1/200稀释的)中，并在黑暗中在室温孵育30分钟，然后用FACS缓冲液洗涤2次。随后用200μl在PBS中的1％低聚甲醛固定细胞，并通过FACS分析。结果显示在图9中并证明抗RON抗体减少MSP与表达RON蛋白的CHO细胞结合。
实施例13
抗RON抗体阻断肿瘤细胞中MSP诱导的pERK和pAKT信号传导
为了测量抗体对MSP诱导的pERK和pAKT信号传导的阻断，使用双色红外荧光蛋白质印迹方法。对于这些实验，将细胞以大约5×105细胞/孔铺板到12-孔组织培养盘内的完全培养基/10％FBS中并允许粘附过夜。第二天，将细胞在DMEM中血清饥饿3小时。然后将抗体以图10所示的浓度加到盘中并孵育15分钟。然后以终浓度200ng/ml加入MSP并孵育细胞另外15分钟。制备总细胞裂解物并在10％tris-甘氨酸凝胶上分析20ug样品，转移到硝酸纤维素上。
为了评估磷酸化-ERK水平，用磷酸化-p44/42Map激酶(Thr 202/Tyr204)兔抗体(Cell Signalling#9101)和p44/42Map激酶(L34F12)小鼠mAb(Cell Signalling#4696)同时探测各印迹点。为了评估磷酸-AKT水平，用磷酸化-AKT(Ser473)(587F11)小鼠mAb(Cell Signalling#9271)和AKT兔抗体(Cell Signalling#9272)同时探测各印迹点。IR染料标记的二抗用于检测pERK和pAKT印迹点，并利用Odyssey成像仪(Li-corBiosciences)扫描各印迹点。如图10和11所示的结果证明，抗RON抗体减少磷酸化-ERK(phoso-ERK)和磷酸化-AKT的水平。这表明，抗RON抗体能在MDA-MB-453细胞中阻断ERK和AKT信号传导。还在其它肿瘤细胞类型中进行这些实验，并且如图12所示，抗RON抗体还减少其它肿瘤细胞中的ERK和AKT信号传导。
实施例14
人类MSP结合可溶的人类和食蟹猴RON
利用标准ELISA方案测量人类MSP(R&D systems目录号4306)结合可溶性人类和食蟹猴(Macaca fascicularis)RON(“cyno RON”)的能力。简单地说，将可溶性人类RON蛋白(R&D Systems，目录号1947)或可溶性cyno RON蛋白以PBS中1mg/ml的浓度在4℃在Nunc MaxisorbELISA板上包被过夜。对于cyno RON ELISA，从CHO细胞产生和纯化来自cyno RON的相应蛋白序列。用自动洗板器在PBS、0.05％吐温20中洗涤板4次。然后在室温(RT)在PBS+1％无蛋白酶的、无IgG的BSA(JacksanLabs 001-000-162)中封闭板1-2小时。洗涤后，将MSP(R&D Systems目录号4306-MS)在封闭缓冲液中的连续稀释液加到板中(100μl/孔)并在室温孵育1-2小时。再次用自动洗板器(PBS，0.05％吐温20)洗涤板4次。接下来，在室温以在封闭缓冲液中0.5mg/ml浓度的生物素化的山羊抗MSP多克隆(R&D Systems BAF 352)抗体孵育板0.5-1小时。在另外的洗涤步骤之后，加入在封闭缓冲液中1∶200稀释的抗生蛋白链菌素-HRP(DY998，R&D Systems)并在室温孵育0.5-1小时。在最终的洗涤步骤之后，用TMB溶液(25ml 100mM醋酸钠，用柠檬酸调整pH至6，4ul 30％H2O2，250μl DMSO中的42mM TMB)将板显色5分钟，并用100ul H2SO4终止反应。在Molecular Devices Spectramax M5上在450nm波长读板，且Softmax pro V5软件用于分析数据。如图13B和13C所示，MSP结合至cynoRON和人类RON二者。图13A证明，抗RON抗体结合至cynoRON以及结合至人类RON。抗体结合实验如实施例10所述的进行。
实施例15
抗RON抗体阻断细胞的侵入
为了测量抗体对胎牛血清(FBS)诱导的或MSP诱导的肿瘤细胞侵入的阻断，使用8.0微米基质胶包被的FluoroblokTM transwell插入物(BD目录号354166)。简单地说，在37℃无CO2环境中用500ul PBS将基质胶包被的插入物再水合2小时。在再水合之后，除去PBS。用胰蛋白酶将已经血清饥饿的肿瘤细胞分离并以5×104细胞/ml重悬在无血清培养基中。然后将肿瘤细胞与抗体一起预孵育30分钟，随后加入到该测定中。接下来，将750ul化学引诱物(10％热灭活的FBS或200ng/ml MSP)加到底部小室，并将500ul的细胞+/-抗体加到顶部小室。将细胞和化学引诱物在37℃在5％CO2中孵育48小时。孵育后，从顶部小室除去培养基。然后将插入物转移到包含500ul/孔的Hanks平衡盐溶液(HBSS)中的4ug/ml钙黄绿素乙酰氧基甲酯(AM)的第二个24孔板并在37℃、5％CO2孵育1小时。利用TECAN GENios Pro荧光读板器在波长494/517nm(Ex/Em)读取侵入的细胞的荧光。结果显示在图14中并证明抗RON抗体可阻断肿瘤细胞的侵入。
实施例16
定位抗RON抗体
将RON的PSI结构域(G502-P544)在大肠杆菌中表达为硫氧还蛋白(thiroedexin)-融合蛋白。在NiNTA琼脂糖(qiagen)上、随后通过制备型尺寸排阻色谱(SEC)纯化蛋白。这种蛋白用于包被ELISA板并利用与上述实施例10中抗体对可溶性RON的结合的相同方案分析抗体的结合。图15显示的结果证明尽管抗RON抗体与包含SEMA和PSI结构域的可溶性RON蛋白结合，但抗体不与单独的PSI结构域结合。
实施例17
抗鼠RON抗体结合至293细胞上的小鼠RON
由流式细胞术分析RON抗体与表达鼠的RON的293E细胞的结合，并计算表观亲和力。用胰蛋白酶将汇合的293E/鼠RON细胞分离，并用FACS缓冲液(1％FCS，0.05％叠氮化钠，1×PBS)以0.6×107/ml重悬。将细胞以50μl/孔加到96-孔圆底聚丙烯板。在FACS缓冲液中以2×终浓度进行抗体稀释并以50μl/孔加入板。在4℃孵育板1小时，然后用FACS缓冲液洗涤3次。然后将细胞团块重悬在100μlPE Fab’2片段山羊抗小鼠IgGFcg二抗(1/200稀释的)中，并在黑暗中在4℃孵育1小时。然后用FACS缓冲液洗涤细胞3次，并用200μl PBS中的1％低聚甲醛固定，并通过FACS分析。从结合曲线计算结合的EC50。数据显示在图16中并证明抗体以高亲和力结合表达鼠RON的细胞。
实施例18
抗鼠RON抗体阻断pAKT信号传导
为了确定抗鼠RON抗体是否还能阻断RON信号传导，在表达鼠RON的CHO细胞系中测量pAKT信号传导。在MSP存在或不存在和不同浓度的抗鼠RON抗体的条件下培养细胞。利用实施例13中所述的方案评价磷酸化AKT的水平。结果显示在图17中。RON抗体存在时磷酸化-AKT的水平减少表明抗鼠RON抗体阻断pAKT信号传导。
实施例19
抗鼠RON抗体微弱地结合人类RON
为了确定抗鼠RON抗体是否还结合人类RON，将鼠和人类的RON蛋白表达在293细胞中。利用如以上在实施例8和16中所述的FACS分析确定抗体与表达RON的细胞的结合。图18中显示的结果证明抗鼠RON抗体结合至鼠和人类RON蛋白二者，但对鼠RON具有更大亲和力。
实施例20
RON在多种人类肿瘤细胞系上表达和传达信号
由流式细胞术分析RON抗体与表达RON的肿瘤的结合。在这些实验中，用胰蛋白酶将汇合的肿瘤细胞分离，并用FACS缓冲液(1％FCS，0.05％叠氮化钠，1×PBS)以0.6×107/ml重悬。将细胞以50μl/孔加到96-孔圆底聚丙烯板中。在FACS缓冲液中以2×终浓度进行抗体稀释并以50μl/孔加入板。在4℃孵育板1小时，然后用FACS缓冲液洗涤2次。然后将细胞团块重悬在100μlPE Fab’2片段山羊抗小鼠IgG Fcg二抗(1/200稀释的)中，并在黑暗中在室温孵育30分钟。然后用FACS缓冲液洗涤细胞2次，并用200μl PBS中1％低聚甲醛固定，并通过FACS分析。细胞上RON表达的相对水平从MFI确定。结果概述在图19所示的表格中。检验的大多数人类肿瘤细胞系表达RON。另外，确定MSP诱导的pAKT和pERK水平的实验如实施例13所述的进行。图19显示MSP诱导的pAKT和pERK相对于未处理的样品中pAKT和pERK成倍增加。MSP诱导的pAKT和pERK的高水平表明这些肿瘤细胞系中的许多肿瘤细胞系的RON信号。
实施例21
抗RON抗体减慢肿瘤生长
为了确定抗RON抗体对肿瘤生长的作用，观察了抗人类RON抗体对乳腺肿瘤模型的作用。将MDA-MB-231细胞(ATCC)乳腺癌细胞保持在37℃、5％CO2环境中并培养在包含10％FBS、无抗生素的RPMI-1640培养基中。用悬浮在与基质胶基质(BD)1∶1混合的200μl培养基(无血清)中的5×106细胞对7周大的雌性CB17SCID小鼠(CB17-Prkdcscid/NCrCrl)皮下(SC)接种到右胁中。每周至少两次记录体重和肿瘤测量值(长度(L)和宽度(W))。利用下式计算肿瘤体积：L×W2/2＝mm3。当大多数肿瘤达到150-300mmW(第29天)时，将小鼠分到治疗组和对照组。肿瘤在各组间是大小匹配的。从第29天开始，以40mg/kg经腹膜内(IP)注射施用1P3B2，每周两次，共13个剂量。按照相同时间表向对照组IP施用(10ml/kg)无菌盐水(0.9％)。此外，在第29天和第50天向对照组静脉内(IV)施用(10ml/kg)柠檬酸盐赋形剂(10mM柠檬酸缓冲液，pH 5.5、135mM氯化钠)。对照组的给药模拟本研究中所用的最严格的给药方案，并反映此处未提及的本研究中包含的其它组的方案。
在每个数据点，Student’s T检验(单向、双尾)用于确定1P3B2测试组的平均肿瘤体积与对照组的平均肿瘤体积的差异的统计显著性。结果图示在图20中并显示1P3B2-处理的小鼠中的肿瘤显著地小于盐水处理的小鼠中的肿瘤。这种数据证明，抗人类RON抗体减少肿瘤生长。
Figure IPA00001230452200011
Figure IPA00001230452200021
Figure IPA00001230452200031
Figure IPA00001230452200041
Figure IPA00001230452200051
Figure IPA00001230452200061
Figure IPA00001230452200071
Figure IPA00001230452200081
Figure IPA00001230452200091
Figure IPA00001230452200101
Figure IPA00001230452200111
Figure IPA00001230452200131
Figure IPA00001230452200141
Figure IPA00001230452200151
Figure IPA00001230452200161
Figure IPA00001230452200171
Figure IPA00001230452200191
Figure IPA00001230452200201
Figure IPA00001230452200211
Figure IPA00001230452200221
Figure IPA00001230452200231
Figure IPA00001230452200241
Figure IPA00001230452200251
Figure IPA00001230452200271
Figure IPA00001230452200281
Figure IPA00001230452200291
Figure IPA00001230452200301
Figure IPA00001230452200311
Figure IPA00001230452200321
Figure IPA00001230452200331
Figure IPA00001230452200341
Figure IPA00001230452200351
Figure IPA00001230452200361
Figure IPA00001230452200371
Figure IPA00001230452200381
Figure IPA00001230452200401
Figure IPA00001230452200411
Figure IPA00001230452200421
Figure IPA00001230452200431
Figure IPA00001230452200441
Figure IPA00001230452200451
Figure IPA00001230452200461
Figure IPA00001230452200471
Figure IPA00001230452200481
Figure IPA00001230452200491
Figure IPA00001230452200501
Figure IPA00001230452200521
Figure IPA00001230452200531
Figure IPA00001230452200551
Figure IPA00001230452200571
Figure IPA00001230452200581
Figure IPA00001230452200591
Figure IPA00001230452200601
Figure IPA00001230452200611
Figure IPA00001230452200621
Figure IPA00001230452200631
Figure IPA00001230452200641
Figure IPA00001230452200651
Figure IPA00001230452200661
Figure IPA00001230452200671
Figure IPA00001230452200681
Figure IPA00001230452200691
Figure IPA00001230452200701
Figure IPA00001230452200721
Figure IPA00001230452200741

Claims (239)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合至与选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的参考单克隆Fab抗体片段或选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的参考单克隆抗体相同的RON表位。
2.一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段竞争性地抑制选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的参考单克隆Fab抗体片段或选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的参考单克隆抗体与RON结合。
3.一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段包含与选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的单克隆Fab抗体片段或选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B 10组成的组的参考单克隆抗体的抗原结合结构域相同的抗原结合结构域。
4.一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的重链可变区(VH)包含与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：115、SEQ IDNO：125、SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：145。
5.一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的轻链可变区(VL)包含与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：120、SEQ IDNO：130、SEQ ID NO：140和SEQ ID NO：150。
6.一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH包含除了20个或更少的保守性氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：94、SEQ IDNO：115、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：145。
7.一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VL包含除了20个或更少的保守性氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：140和SEQ ID NO：150。
8.一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：54、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：145。
9.一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VL包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49、SEQ IDNO：59、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：140和SEQ ID NO：150。
10.一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH和VL分别包含与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：34和SEQID NO：39；SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：49；SEQ ID NO：54和SEQ IDNO：59；SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：69；SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：79；SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：89；SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：99、SEQ IDNO：115和SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：130、SEQ IDNO：135和SEQ ID NO：140、以及SEQ ID NO：145和SEQ ID NO：150。
11.一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH和VL各自除了20个或更少的保守性氨基酸取代以外，分别包含与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列相同的氨基酸序列：SEQID NO：4和SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：44和SEQTD NO：49；SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：59；SEQ ID NO：64和SEQ IDNO：69；SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：79；SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：89；SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120、SEQID NO：125和SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：140、以及SEQ ID NO：145和SEQ ID NO：150。
12.一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH和VL分别包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：44和SEQID NO：49；SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：59；SEQ ID NO：64和SEQ IDNO：69；SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：79；SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：89；SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120、SEQID NO：125和SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：140、以及SEQ ID NO：145和SEQ ID NO：150。
13.一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH包含除了两个或更少的氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考重链互补决定区-1(VH-CDR1)氨基酸序列相同的KabatVH-CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：65、SEQ IDNO：75、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：136和SEQ ID NO：146。
14.根据权利要求13所述的抗体或其片段，其中所述VH-CDR1氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：116、SEQ IDNO：126、SEQ ID NO：136和SEQ ID NO：146。
15.一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH包含除了四个或更少的氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考重链互补决定区-2(VH-CDR2)氨基酸序列相同的KabatVH-CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：66、SEQ IDNO：76、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：147。
16.根据权利要求15所述的抗体或其片段，其中所述VH-CDR2氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：117、SEQID NO：127、SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：147。
17.一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH包含除了四个或更少的氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考重链互补决定区-3(VH-CDR3)氨基酸序列相同的KabatVH-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：67、SEQ IDNO：77、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：138和SEQ ID NO：148。
18.根据权利要求17所述的抗体或其片段，其中所述VH-CDR3氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：118、SEQID NO：128、SEQ ID NO：138和SEQ ID NO：148。
19.一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VL包含除了四个或更少的氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考轻链互补决定区-1(VL-CDR1)氨基酸序列相同的KabatVL-CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：70、SEQ IDNO：80、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：121、SEQ IDNO：131、SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：151。
20.根据权利要求19所述的抗体或其片段，其中所述VL-CDR1氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：121、SEQID NO：131、SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：151。
21.一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VL包含除了两个或更少的氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考轻链互补决定区-2(VL-CDR2)氨基酸序列相同的KabatVL-CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：71、SEQ IDNO：81、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：122、SEQ IDNO：132、SEQ ID NO：142和SEQ ID NO：152。
22.根据权利要求21所述的抗体或其片段，其中所述VL-CDR2氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：122、SEQID NO：132、SEQ ID NO：142和SEQ ID NO：152。
23.一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VL包含除了四个或更少的氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考轻链互补决定区-3(VL-CDR3)氨基酸序列相同的KabatVL-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：72、SEQ IDNO：82、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：153。
24.根据权利要求23所述的抗体或其片段，其中所述VL-CDR3氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：123、SEQID NO：133、SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：153。
25.一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中除了在所述VH-CDR中的至少一个上的一个、二个、三个或四个氨基酸取代以外，所述抗体或其片段的VH包含选自由以下组成的组的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：5、6和7；SEQ ID NO：15、16和17；SEQ ID NO：25、26和27；SEQ ID NO：35、36和37；SEQ ID NO：45、46和47；SEQ ID NO：55、56和57；SEQ ID NO：65、66和67；SEQ ID NO：75、76和77；SEQ ID NO：85、86和87；SEQ ID NO：95、96和97；SEQID NO：116、117和118；SEQ ID NO：126、127和128；SEQ ID NO：136、137和138；以及SEQ ID NO：146、147和148。
26.一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH包含选自由以下组成的组的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：5、6和7；SEQ ID NO：15、16和17；SEQ ID NO：25、26和27；SEQ ID NO：35、36和37；SEQ ID NO：45、46和47；SEQ ID NO：55、56和57；SEQ ID NO：65、66和67；SEQ ID NO：75、76和77；SEQ ID NO：85、86和87；SEQ ID NO：95、96和97；SEQID NO：116、117和118；SEQ ID NO：126、127和128；SEQ ID NO：136、137和138；以及SEQ ID NO：146、147和148。
27.一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中除了在所述VL-CDR中的至少一个上的一个、二个、三个或四个氨基酸取代以外，所述抗体或其片段的VL包含选自由以下组成的组的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：10、11和12；SEQ ID NO：20、21和22；SEQ ID NO：30、31和32；SEQ ID NO：40、41和42；SEQ ID NO：50、51和52；SEQ ID NO：60、61和62；SEQ ID NO：70、71和72；SEQID NO：80、81和82；SEQ ID NO：90、91和92；SEQ ID NO：100、101和102；SEQ ID NO：121、122和123；SEQ ID NO：131、132和133；SEQ IDNO：141、142和143；以及SEQ ID NO：151、152和153。
28.一种特异性地结合至RON的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VL包含选自由以下组成的组的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：10、11和12；SEQ ID NO：20、21和22；SEQ ID NO：30、31和32；SEQ ID NO：40、41和42；SEQ ID NO：50、51和52；SEQ ID NO：60、61和62；SEQ ID NO：70、71和72；SEQ ID NO：80、81和82；SEQ ID NO：90、91和92；SEQ ID NO：100、101和102；SEQ ID NO：121、122和123；SEQ ID NO：131、132和133；SEQ ID NO：141、142和143；以及SEQ ID NO：151、152和153。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的抗体或其片段，其中除了五个或更少的氨基酸取代以外，所述VH构架区是人类的。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的抗体或其片段，其中除了五个或更少的氨基酸取代以外，所述VL构架区是人类的。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段结合至线性表位。
32.根据权利要求1至30中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段结合至非线性构象表位。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段是多价的，并包含至少两条重链和至少两条轻链。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段是多特异性的。
35.根据权利要求34所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段是双特异性的。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段是双特异性的。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的抗体或其片段，其中所述重链和轻链可变结构域是鼠的。
38.根据权利要求37所述的抗体或其片段，其中所述重链和轻链可变结构域来自选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的单克隆抗体。
39.根据权利要求1至36中任一项所述的抗体或其片段，其中所述重链和轻链可变结构域是完全人类的。
40.根据权利要求39所述的抗体或其片段，其中所述重链和轻链可变结构域来自选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的单克隆Fab抗体片段。
41.根据权利要求1至36中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段是人源化的。
42.根据权利要求1至36中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段是嵌合的。
43.根据权利要求1至36中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段是灵长源化的。
44.根据权利要求1至36中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段是完全人类的。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段是Fab片段。
46.根据权利要求1至44中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段是Fab’片段。
47.根据权利要求1至44中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段是F(ab)2片段。
48.根据权利要求1至44中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段是Fv片段。
49.根据权利要求1至44中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段是单链抗体。
50.根据权利要求1至46和49中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含选自由人类κ恒定区和人类λ恒定区组成的组的轻链恒定区。
51.根据权利要求1至46和49中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含重链恒定区或其片段。
52.根据权利要求51所述的抗体或其片段，其中所述重链恒定区或其片段选自由人类IgG4、IgG4agly、IgG1和IgG1agly组成的组。
53.根据权利要求1至52中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段以小于所述参考单克隆抗体的解离常数(KD)的KD所表征的亲和力特异性地结合至RON多肽或其片段、或RON变体多肽。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段以解离常数(KD)所表征的亲和力特异性地结合至RON多肽或其片段、或RON变体多肽，其中所述解离常数(KD)不大于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段相对于鼠RON多肽或其片段优先地结合至人类RON多肽或其片段。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段结合至细胞表面上表达的RON。
57.根据权利要求56所述的抗体或其片段，其中所述细胞是恶性细胞、赘生性细胞、肿瘤细胞、转移性细胞或肿瘤相关巨噬细胞。
58.根据权利要求1至57中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段阻断MSP与RON结合。
59.根据权利要求1至58中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段抑制MSP依赖性RON活化。
60.根据权利要求1至59中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段抑制非MSP依赖性RON活化。
61.根据权利要求1至60中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段抑制RON介导的RAS/MAPK信号传导途径的活化。
62.根据权利要求1至61中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段抑制RON介导的ERK或AKT的磷酸化。
63.根据权利要求1至62中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段抑制RON介导的细胞增殖。
64.根据权利要求1至63中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段抑制肿瘤细胞生长、肿瘤细胞侵入或肿瘤细胞转移。
65.根据权利要求1至64中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段诱导凋亡。
66.根据权利要求1至65中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段还包含与其融合的异源性多肽。
67.根据权利要求1至66中任一项所述的抗体或其片段，其中所述抗体轭合于选自由以下组成的组的剂：细胞毒性剂、治疗剂、细胞抑制剂、生物毒素、前体药物、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药物剂、淋巴因子、异源性抗体或其片段、可检测标记、聚乙二醇(PEG)、和两种或两种以上任何所述剂的组合。
68.根据权利要求67所述的抗体或其片段，其中所述细胞毒性剂选自由以下组成的组：放射性核素、生物毒素、酶促活性的毒素、细胞抑制性或细胞毒性治疗剂、前体药物、免疫活性的配体、生物反应调节剂、或者两种或两种以上任何所述细胞毒性剂的组合。
69.根据权利要求68所述的抗体或其片段，其中所述可检测标记选自由以下组成的组：酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记、或者两种或两种以上任何所述可检测标记的组合。
70.一种组合物，所述组合物包含权利要求1至69中任一项所述抗体或其片段和载体。
71.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码抗体VH多肽的核酸，其中所述VH多肽的氨基酸序列与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列至少90％相同：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：74、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO125、SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：145；并且其中包含所述VH多肽的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。
72.根据权利要求71所述的多核苷酸，其中所述VH多肽的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：74、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：145。
73.根据权利要求71或72所述的多核苷酸，其中编码所述VH多肽的核苷酸序列被优化以增加所述VH多肽的表达而不改变其氨基酸序列。
74.根据权利要求73所述的多核苷酸，其中所述优化包括识别和移除剪接供体位点和剪接受体位点。
75.根据权利要求73或74所述的多核苷酸，其中所述优化包括表达所述多核苷酸细胞的密码子使用的优化。
76.根据权利要求71至75中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ IDNO：63、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：134和SEQ ID NO：144。
77.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码抗体VL多肽的核酸，其中所述VL多肽的氨基酸序列与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列至少90％相同：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：69、SEQ IDNO：79、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：140和SEQ ID NO：150；并且其中包含所述VL多肽的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。
78.根据权利要求77所述的多核苷酸，其中所述VL多肽的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：69、SEQ IDNO：79、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：140和SEQ ID NO：150。
79.根据权利要求77或78所述的多核苷酸，其中编码所述VL多肽的核苷酸序列被优化以增加所述VL多肽的表达而不改变其氨基酸序列。
80.根据权利要求79所述的多核苷酸，其中所述优化包括识别和移除剪接供体位点和剪接受体位点。
81.根据权利要求79或80所述的多核苷酸，其中所述优化包括表达所述多核苷酸细胞的密码子使用的优化。
82.根据权利要求77至81中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：58、SEQ IDNO：68、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：149。
83.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码抗体VH多肽的核酸，其中所述VH多肽的氨基酸序列除了20个或更少的保守性氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列相同：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：54、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：145；并且其中包含所述VH多肽的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。
84.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码抗体VL多肽的核酸，其中所述VL多肽的氨基酸序列除了20个或更少的保守性氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列相同：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49、SEQ IDNO：59、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：140和SEQ ID NO：150；并且其中包含所述VL多肽的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。
85.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码VH-CDR1氨基酸序列的核酸，其中所述VH-CDR1氨基酸序列除了两个或更少的氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考VH-CDR1氨基酸序列相同：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：35、SEQ IDNO：45、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：136和SEQ ID NO：146；并且其中包含所述VH-CDR1的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。
86.根据权利要求85所述的多核苷酸或其片段，其中所述VH-CDR1氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：116、SEQID NO：126、SEQ ID NO：136和SEQ ID NO：146。
87.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码VH-CDR2氨基酸序列的核酸，其中除了四个或更少的氨基酸取代以外，所述VH-CDR2氨基酸序列与选自由以下组成的组的参考VH-CDR2氨基酸序列相同：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：76、SEQ IDNO：86、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：147；并且其中包含所述VH-CDR2的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。
88.根据权利要求87所述的多核苷酸或其片段，其中所述VH-CDR2氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：117、SEQID NO：127、SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：147。
89.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码VH-CDR3氨基酸序列的核酸，其中所述VH-CDR3氨基酸序列除了四个或更少的氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考VH-CDR3氨基酸序列相同：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：37、SEQ IDNO：47、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：128；SEQ ID NO：138和SEQ ID NO：148；并且其中包含所述VH-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。
90.根据权利要求89所述的多核苷酸或其片段，其中所述VH-CDR3氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：118、SEQID NO：128；SEQ ID NO：138和SEQ ID NO：148。
91.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码VL-CDR1氨基酸序列的核酸，其中所述VL-CDR1氨基酸序列除了四个或更少的氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考VL-CDR1氨基酸序列相同：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：50、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：131、SEQ FD NO：141和SEQ ID NO：151；并且其中包含所述VL-CDR1的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。
92.根据权利要求91所述的多核苷酸或其片段，其中所述VL-CDR1氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：121、SEQID NO：131、SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：151。
93.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码VL-CDR2氨基酸序列的核酸，其中所述VL-CDR2氨基酸序列除了两个或更少的氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考VL-CDR2氨基酸序列相同：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：51、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：101；SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：142和SEQ ID NO：152；并且其中包含所述VL-CDR2的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。
94.根据权利要求93所述的多核苷酸或其片段，其中所述VL-CDR2氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：101；SEQ ID NO：122、SEQID NO：132、SEQ ID NO：142和SEQ ID NO：152。
95.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码VL-CDR3氨基酸序列的核酸，其中所述VL-CDR3氨基酸序列除了四个或更少的氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考VL-CDR3氨基酸序列相同：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：42、SEQ IDNO：52、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：153；并且其中包含所述VL-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。
96.根据权利要求95所述的多核苷酸或其片段，其中所述VL-CDR3氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：123、SEQID NO：133、SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：153。
97.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码抗体VH多肽的核酸，其中所述VH多肽包含选自由以下组成的组的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：5、6和7；SEQ ID NO：15、16和17；SEQ ID NO：25、26和27；SEQ ID NO：35、36和37；SEQID NO：45、46和47；SEQ ID NO：55、56和57；SEQ ID NO：65、66和67；SEQ ID NO：75、76和77；SEQ ID NO：85、86和87；SEQ ID NO：95、96和97；SEQ ID NO：116、117和118；SEQ ID NO：126、127和128；SEQID NO：136、137和138；以及SEQ ID NO：146、147和148；并且其中包含所述VH-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。
98.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码抗体VL多肽的核酸，其中所述VL多肽包含选自由以下组成的组的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：10、11和12；SEQ ID NO：20、21和22；SEQ ID NO：30、31和32；SEQ ID NO：40、41和42；SEQID NO：50、51和52；SEQ ID NO：60、61和62；SEQ ID NO：70、71和72；SEQ ID NO：80、81和82；SEQ ID NO：90、91和92；SEQ ID NO：100、101和102；SEQ ID NO：121、122和123；SEQ ID NO：131、132和133；SEQ ID NO：141、142和143；以及SEQ ID NO：151、152和153；并且其中包含所述VL-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RON。
99.根据权利要求71至98中任一项所述的多核苷酸，还包含编码融合于所述抗体VH多肽的信号肽的核酸。
100.根据权利要求71至98中任一项所述的多核苷酸，还包含编码融合于所述抗体VL多肽的信号肽的核酸。
101.根据权利要求71至100中任一项所述的多核苷酸，还包含编码融合于所述VH多肽的重链恒定区CH1结构域的核酸。
102.根据权利要求71至101中任一项所述的多核苷酸，还包含编码融合于所述VH多肽的重链恒定区CH2结构域的核酸。
103.根据权利要求71至102中任一项所述的多核苷酸，还包含编码融合于所述VH多肽的重链恒定区CH3结构域的核酸。
104.根据权利要求71至103中任一项所述的多核苷酸，还包含编码融合于所述VH多肽的重链铰链区的核酸。
105.根据权利要求101至104中任一项所述的多核苷酸，其中所述重链恒定区选自由以下组成的组：人类IgG4、IgG4agly、IgG1和IgG1agly。
106.根据权利要求71至105中任一项所述的多核苷酸，还包含编码融合于所述VL多肽的轻链恒定区结构域的核酸。
107.根据权利要求106所述的多核苷酸，其中所述轻链恒定区是人类κ。
108.根据权利要求71至107中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段特异性地结合与选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的参考单克隆Fab抗体片段或选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的参考单克隆抗体相同的RON表位。
109.根据权利要求71至108中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段竞争性地抑制选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的参考单克隆Fab抗体片段或选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的参考单克隆抗体。
110.根据权利要求71至109中任一项所述的多核苷酸，其中除了五个或更少的氨基酸取代以外，所述VH多肽的构架区是人类的。
111.根据权利要求71至110中任一项所述的多核苷酸，其中除了五个或更少的氨基酸取代以外，所述VL多肽的构架区是人类的。
112.根据权利要求71至111中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段结合于线性表位。
113.根据权利要求71至112中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段结合于非线性构象表位。
114.根据权利要求71至113中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是多价的，并包含至少两条重链和至少两条轻链。
115.根据权利要求71至114中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是多特异性的。
116.根据权利要求71至115中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是双特异性的。
117.根据权利要求71至116中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段包含为完全人类的重链和轻链可变结构域。
118.根据权利要求117所述的多核苷酸，其中所述重链和轻链可变结构域与选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的单克隆Fab抗体片段的重链和轻链可变结构域相同。
119.根据权利要求71至116中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段包含鼠的重链和轻链可变结构域。
120.根据权利要求119所述的多核苷酸，其中所述重链和轻链可变结构域与选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的单克隆抗体的重链和轻链可变结构域相同。
121.根据权利要求71至116中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是人源化的。
122.根据权利要求71至116中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
123.根据权利要求71至116中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是灵长源化的。
124.根据权利要求71至116中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是完全人类的。
125.根据权利要求71至124中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是Fab片段。
126.根据权利要求71至124中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是Fab’片段。
127.根据权利要求71至124中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是F(ab)2片段。
128.根据权利要求71至124中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是Fv片段。
129.根据权利要求71至124中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是单链抗体。
130.根据权利要求71至129中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段以解离常数(KD)所表征的亲和力特异性地结合至RON多肽或其片段、或RON变体多肽，所述解离常数(KD)不大于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M。
131.根据权利要求71至130中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段相对于鼠RON多肽或其片段优先地结合至人类RON多肽或其片段。
132.根据权利要求71至131中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段结合于细胞表面上表达的RON。
133.根据权利要求132所述的多核苷酸，其中所述细胞是恶性细胞、赘生性细胞、肿瘤细胞、转移性细胞或肿瘤相关巨噬细胞。
134.根据权利要求71至133中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段阻断MSP与RON结合。
135.根据权利要求71至134中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制MSP依赖性RON活化。
136.根据权利要求71至135中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制抑制非MSP依赖性RON活化。
137.根据权利要求71至136中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制RON介导的Ras/MAPK信号传导途径的活化。
138.根据权利要求71至137中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制RON介导的ERK或AKT的磷酸化。
139.根据权利要求71至138中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制RON介导的细胞增殖。
140.根据权利要求71至139中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制肿瘤细胞生长、肿瘤细胞侵入或肿瘤细胞转移。
141.根据权利要求71至140中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段诱导凋亡。
142.根据权利要求71至141中任一项所述的多核苷酸，还包含编码异源性多肽的核酸。
143.根据权利要求71至142中任一项所述的多核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段轭合于选自由以下组成的组的剂：细胞毒性剂、治疗剂、细胞抑制剂、生物毒素、前体药物、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药物制剂、淋巴因子、异源性抗体或其片段、可检测标记、聚乙二醇(PEG)、以及两种或两种以上任何所述剂的组合。
144.根据权利要求143所述的多核苷酸，其中所述细胞毒性剂选自由以下组成的组：放射性核素、生物毒素、酶促活性的毒素、细胞抑制性或细胞毒性治疗剂、前体药物、免疫活性的配体、生物反应调节剂、或者两种或两种以上任何所述细胞毒性剂的组合。
145.根据权利要求143所述的多核苷酸，其中所述可检测标记选自由以下组成的组：酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记、或者两种或两种以上任何所述可检测标记的组合。
146.一种组合物，所述组合物包含权利要求71至145中任一项的多核苷酸和载体。
147.一种载体，所述载体包含权利要求71至145中任一项的多核苷酸。
148.根据权利要求147所述的载体，其中所述多核苷酸可操作地与启动子相缔合。
149.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求147或权利要求148的载体。
150.一种产生特异性地结合RON的抗体或其片段的方法，所述方法包括培养权利要求149的宿主细胞，并回收所述抗体或其片段。
151.一种分离的多肽，所述分离的多肽由权利要求150的方法产生。
152.一种分离的多肽，所述分离的多肽由权利要求71至145中任一项的多核苷酸编码。
153.根据权利要求152所述的分离的多肽，其中包含所述多肽的抗体或其片段特异性地结合至RON。
154.一种分离的抗体或其片段，所述分离的抗体或其片段包含权利要求152或153的多肽。
155.一种组合物，所述组合物包含分离的VH编码多核苷酸和分离的VL编码多核苷酸，其中所述VH编码多核苷酸和所述VL编码多核苷酸分别包含编码与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的核酸：SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：14和SEQ IDNO：19；SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：49；SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：59；SEQ IDNO：64和SEQ ID NO：69；SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：79；SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：89；SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：99；SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：130；SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：140和SEQ ID NO：145和SEQ ID NO：150；并且其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段特异性地结合RON。
156.根据权利要求155所述的组合物，其中所述VH编码多核苷酸和所述VL编码多核苷酸分别包含编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：39；SEQ IDNO：44和SEQ ID NO：49；SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：59；SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：69；SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：79；SEQ ID NO：84和SEQID NO：89；SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：99；SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：130；SEQ ID NO：135和SEQ IDNO：140；以及SEQ ID NO：145和SEQ ID NO：150。
157.一种组合物，所述组合物包含分离的VH编码多核苷酸和分离的VL编码多核苷酸，其中所述VH编码多核苷酸和所述VL编码多核苷酸分别包含编码除了少于20个保守性氨基酸取代以外与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列相同的氨基酸序列的核酸：SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：9；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：49；SEQ IDNO：54和SEQ ID NO：59；SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：69；SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：79；SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：89；SEQ ID NO：94和SEQID NO：99；SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；SEQ ID NO：125和SEQ IDNO：130；SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：140；以及SEQ ID NO：145和SEQID NO：150；并且其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段特异性地结合RON。
158.一种组合物，所述组合物包含分离的VH编码多核苷酸和分离的VL编码多核苷酸，其中所述VH编码多核苷酸编码包含选自由以下组成的组的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列的VH多肽：SEQ IDNO：5、6和7；SEQ ID NO：15、16和17；SEQ ID NO：25、26和27；SEQID NO：35、36和37；SEQ ID NO：45、46和47；SEQ ID NO：55、56和57；SEQ ID NO：65、66和67；SEQ ID NO：75、76和77；SEQ ID NO：85、86和87；以及SEQ ID NO：95、96和97；其中所述VL编码多核苷酸编码包含选自由以下组成的组的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列的VL多肽：SEQ ID NO：10、11和12；SEQ ID NO：20、21和22；SEQ ID NO：30、31和32；SEQ ID NO：40、41和42；SEQ ID NO：50、51和52；SEQ ID NO：60、61和62；SEQ ID NO：70、71和72；SEQ ID NO：80、81和82；SEQ ID NO：90、91和92；SEQ ID NO：100、101和102；SEQ ID NO：116、117和118；SEQ ID NO：126、127和128；SEQ ID NO：136、137和138；以及SEQ ID NO：146、147和148；并且其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段特异性地结合RON。
159.根据权利要求155至158中任一项所述的组合物，其中所述VH编码多核苷酸还包含编码融合于所述抗体VH多肽的信号肽的核酸。
160.根据权利要求155至158中任一项所述的组合物，其中所述VL编码多核苷酸还包含编码融合于所述抗体VL多肽的信号肽的核酸。
161.根据权利要求155至160中任一项所述的组合物，其中所述VH编码多核苷酸还包含编码融合于所述VH多肽的重链恒定区CH1结构域的核酸。
162.根据权利要求155至161中任一项所述的组合物，其中所述VH编码多核苷酸还包含编码融合于所述VH多肽的重链恒定区CH2结构域的核酸。
163.根据权利要求155至162中任一项所述的组合物，其中所述VH编码多核苷酸还包含编码融合于所述VH多肽的重链恒定区CH3结构域的核酸。
164.根据权利要求155至163中任一项所述的组合物，其中所述VH编码多核苷酸还包含编码融合于所述VH多肽的重链铰链区的核酸。
165.根据权利要求155至164中任一项所述的组合物，其中所述重链恒定区选自由人类IgG4、IgG4agly、IgG1和IgG1agly组成的组。
166.根据权利要求155至165中任一项所述的组合物，其中所述VL编码多核苷酸还包含编码融合于所述VL多肽的轻链恒定区结构域的核酸。
167.根据权利要求166所述的组合物，其中所述轻链恒定区是人类κ。
168.根据权利要求155至167中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段特异性地结合与选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的参考单克隆Fab抗体片段或选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的参考单克隆抗体相同的RON表位。
169.根据权利要求155至167中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段竞争性地抑制选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的参考单克隆Fab抗体片段或选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的参考单克隆抗体。
170.根据权利要求155至169中任一项所述的组合物，其中除了五个或更少的氨基酸取代以外，所述VH和VL多肽的构架区是人类的。
171.根据权利要求155至170中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段结合于线性表位。
172.根据权利要求155至170中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段结合于非线性构象表位。
173.根据权利要求155至170中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段是多价的，并包含至少两条重链和至少两条轻链。
174.根据权利要求155至173中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段是多特异性的。
175.根据权利要求155至174中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段是双特异性的。
176.根据权利要求155至175中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段包含为完全人类的重链和轻链可变结构域。
177.根据权利要求176所述的组合物，其中所述重链和轻链可变结构域与选自由M14-H06、M15-E10、M16-C07、M23-F10、M80-B03、M93-D02、M96-C05、M97-D03和M98-E12组成的组的单克隆Fab抗体片段的重链和轻链可变结构域相同。
178.根据权利要求155至175中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段包含为鼠的重链和轻链可变结构域。
179.根据权利要求178所述的组合物，其中所述重链和轻链可变结构域与选自由1P2E7、1P3B2、1P4A3、1P4A12和1P5B10组成的组的单克隆抗体的重链和轻链可变结构域相同。
180.根据权利要求155至175中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段是人源化的。
181.根据权利要求155至175中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段是嵌合的。
182.根据权利要求155至175中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段是灵长源化的。
183.根据权利要求155至175中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段是完全人类的。
184.根据权利要求155至183中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段是Fab片段。
185.根据权利要求155至183中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段是Fab’片段。
186.根据权利要求155至183中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段是F(ab)2片段。
187.根据权利要求155至183中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段是Fv片段。
188.根据权利要求155至183中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段是单链抗体。
189.根据权利要求155至188中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段以解离常数(KD)表征的亲和力特异性地结合至RON多肽或其片段、或RON变体多肽，其中所述解离常数(KD)不大于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M。
190.根据权利要求155至189中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段相对于鼠RON多肽或其片段优先地结合至人类RON多肽或其片段。
191.根据权利要求155至190中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段结合至细胞表面上表达的RON。
192.根据权利要求191所述的组合物，其中所述细胞是恶性细胞、赘生性细胞、肿瘤细胞、转移性细胞或肿瘤相关巨噬细胞。
193.根据权利要求155至192中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段阻断MSP与RON结合。
194.根据权利要求155至193中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段抑制MSP依赖性RON活化。
195.根据权利要求155至194中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段抑制非MSP依赖性RON活化。
196.根据权利要求155至195中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段抑制RON介导的Ras/MAPK信号传导途径的活化。
197.根据权利要求155至196中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段抑制RON介导的ERK或AKT的磷酸化。
198.根据权利要求155至197中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段抑制RON介导的细胞增殖。
199.根据权利要求155至198中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段抑制肿瘤细胞生长、肿瘤细胞侵入或肿瘤细胞转移。
200.根据权利要求155至199中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段诱导凋亡。
201.根据权利要求155至200中任一项所述的组合物，其中所述VH编码多核苷酸、所述VL编码多核苷酸、或所述VH编码多核苷酸与所述VL编码多核苷酸二者还包含编码异源性多肽的核酸。
202.根据权利要求155至201中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段轭合于选自由以下组成的组的剂：细胞毒性剂、治疗剂、细胞抑制剂、生物毒素、前体药物、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药物剂、淋巴因子、异源性抗体或其片段、可检测标记、聚乙二醇(PEG)、和两种或两种以上任何所述剂的组合。
203.根据权利要求202所述的组合物，其中所述细胞毒性剂选自由以下组成的组：放射性核素、生物毒素、酶促活性的毒素、细胞抑制性或细胞毒性治疗剂、前体药物、免疫活性的配体、生物反应调节剂、或者两种或两种以上任何所述细胞毒性剂的组合。
204.根据权利要求202所述的组合物，其中所述可检测标记选自由以下组成的组：酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记、或者两种或两种以上任何所述可检测标记的组合。
205.根据权利要求155至204中任一项所述的组合物，其中所述VH编码多核苷酸被包含在第一载体上并且所述VL编码多核苷酸被包含在第二载体上。
206.根据权利要求205所述的组合物，其中所述VH编码多核苷酸可操作地与第一启动子相缔合并且所述VL编码多核苷酸可操作地与第二启动子相缔合。
207.根据权利要求206所述的组合物，其中所述第一启动子和所述第二启动子是同一启动子的拷贝。
208.根据权利要求206所述的组合物，其中所述第一启动子和所述第二启动子是不相同的。
209.根据权利要求205至208中任一项所述的组合物，其中所述第一载体和所述第二载体被包含在单个宿主细胞中。
210.根据权利要求205至208中任一项所述的组合物，其中所述第一载体和所述第二载体被包含在分别的宿主细胞中。
211.一种产生特异性地结合RON的抗体或其片段的方法，所述方法包括培养权利要求209的宿主细胞，并回收所述抗体或其片段。
212.一种产生特异性地结合RON的抗体或其片段的方法，所述方法包括共培养权利要求210的分别的宿主细胞，并回收所述抗体或其片段。
213.一种产生特异性地结合RON的抗体或其片段的方法，所述方法包括分别培养权利要求210的分别的宿主细胞，组合所述VH和VL编码多肽，并回收所述抗体或其片段。
214.一种特异性地结合RON的抗体或其片段，所述抗体或其片段由权利要求211至213中任一项的方法产生。
215.根据权利要求155至204中任一项所述的组合物，其中所述VH编码多核苷酸和所述VL编码多核苷酸在同一载体上。
216.权利要求215的载体。
217.根据权利要求216所述的载体，其中所述VH编码多核苷酸和所述VL编码多核苷酸各自可操作地与启动子缔合。
218.根据权利要求216所述的载体，其中所述VH编码多核苷酸和所述VL编码多核苷酸在框内融合，从与其可操作地缔合的单个启动子共转录，并共翻译为单链抗体或其抗原结合片段。
219.根据权利要求216所述的载体，其中所述VH编码多核苷酸和所述VL编码多核苷酸从与其可操作地缔合的单个启动子共转录，但分别翻译。
220.根据权利要求219所述的载体，还包含设置在所述VH编码多核苷酸和所述VL编码多核苷酸之间的IRES序列。
221.根据权利要求216所述的载体，其中各自与分别的启动子可操作地缔合的所述编码VH的多核苷酸和所述编码VL的多核苷酸被分别转录。
222.根据权利要求221所述的载体，其中所述分别的启动子是同一启动子的拷贝。
223.根据权利要求221所述的载体，其中所述分别的启动子是不相同的。
224.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求216至223中任一项的载体。
225.一种产生特异性地结合RON的抗体或其片段的方法，所述方法包括培养权利要求224的宿主细胞，并回收所述抗体或其片段。
226.一种特异性地结合RON的抗体或其片段，所述抗体或其片段由权利要求225的方法产生。
227.一种用于治疗动物的过度增生性病症的方法，所述方法包括向需要治疗的动物施用包含以下组分的组合物：
a)权利要求1至69、154、214和226中任一项的分离的抗体或其片段；和
b)药学上可接受的载体。
228.根据权利要求227所述的方法，其中所述过度增生性疾病或病症选自由癌症、赘生物、肿瘤、恶性肿瘤、或其转移组成的组。
229.根据权利要求228所述的方法，其中所述抗体或其片段特异性地结合至恶性细胞表面上表达的RON。
230.根据权利要求229所述的方法，其中所述抗体或其片段与所述恶性细胞的结合使得所述恶性细胞的生长受抑制。
231.根据权利要求227至230中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段抑制肿瘤细胞增殖。
232.根据权利要求231所述的方法，其中通过阻止或阻滞转移性生长来抑制肿瘤细胞增殖。
233.根据权利要求227至230中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段抑制肿瘤细胞迁移。
234.根据权利要求231所述的方法，其中通过阻止或阻滞肿瘤向相邻组织扩散来抑制肿瘤细胞增殖。
235.根据权利要求228所述的方法，其中所述过度增生性疾病或病症是位于以下位置的赘生物：前列腺、结肠、腹部、骨、乳房、消化系统、肝脏、胰、腹膜、肾上腺、甲状旁腺、垂体腺、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺、眼、头、颈、中枢神经系统、周围神经系统、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部、或泌尿生殖道。
236.根据权利要求228所述的方法，其中所述过度增生性疾病是癌症，所述癌症选自由以下组成的组：上皮鳞状细胞癌、黑素瘤、白血病、骨髓瘤、胃癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌和头颈癌。
237.根据权利要求236所述的方法，其中所述癌症选自由胃癌、肾癌、脑癌、膀胱癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌组成的组。
238.根据权利要求227至237中任一项所述的方法，其中所述动物是哺乳动物。
239.根据权利要求238所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。
CN2009801102175A 2008-01-22 2009-01-22 Ron抗体及其用途 Pending CN101977937A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2277908P 2008-01-22 2008-01-22
US61/022,779 2008-01-22
PCT/US2009/000376 WO2009094148A2 (en) 2008-01-22 2009-01-22 Ron antibodies and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101977937A true CN101977937A (zh) 2011-02-16

Family

ID=40901578

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009801102175A Pending CN101977937A (zh) 2008-01-22 2009-01-22 Ron抗体及其用途

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20090226442A1 (zh)
EP (1) EP2245066A2 (zh)
JP (1) JP2011509687A (zh)
KR (1) KR20100106590A (zh)
CN (1) CN101977937A (zh)
AU (1) AU2009206724A1 (zh)
BR (1) BRPI0906498A2 (zh)
CA (1) CA2712697A1 (zh)
IL (1) IL207129A0 (zh)
MX (1) MX2010008025A (zh)
WO (1) WO2009094148A2 (zh)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI480050B (zh) 2009-02-10 2015-04-11 Daiichi Sankyo Co Ltd 抗－ｍｓｔ１ｒ抗體及其用途
WO2011090762A1 (en) * 2009-12-29 2011-07-28 Emergent Product Development Seattle, Llc Heterodimer binding proteins and uses thereof
BR112012018914A2 (pt) * 2010-01-28 2017-07-25 Glaxo Group Ltd "anticorpo humanizado, proteína de ligação de antígeno, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, proteína de ligação de anticorpo ou de antígeno, métodos para a produção de uma proteína de ligação de antígeno e para tratar um sujeito afetado por uma doença autoimune ou inflamatória, e, composição farmacêutica."
EP3443981B1 (en) 2010-06-29 2021-03-10 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Llt-1 antibodies with new functional properties
AR082194A1 (es) 2010-07-06 2012-11-21 Aveo Pharmaceuticals Inc Anticuerpos anti-ron
CN103857700A (zh) 2011-08-26 2014-06-11 梅里麦克制药股份有限公司 串联fc双特异性抗体
CN105017420B (zh) * 2012-02-17 2019-05-28 西雅图基因公司 针对整联蛋白αvβ6的抗体和使用该抗体治疗癌症
WO2014138449A1 (en) 2013-03-06 2014-09-12 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Anti-c-met tandem fc bispecific antibodies
KR102131371B1 (ko) * 2013-07-02 2020-07-08 삼성전자주식회사 Ang-2 특이적 항체 및 그의 용도
CN105504049B (zh) * 2014-09-26 2019-07-05 艾托金生物医药（苏州）有限公司 宫颈癌相关的hpv e7蛋白单克隆抗体及其应用
CN110799211A (zh) 2016-09-08 2020-02-14 美国德州精准药靶有限公司 特异性识别丛蛋白-信号素-整合素结构域的抗ron单克隆抗体的药物呈递作用及其在肿瘤治疗中的应用
EP3579848A4 (en) 2017-02-08 2021-03-03 Dragonfly Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC BINDING PROTEINS FOR ACTIVATING NATURAL KILLER CELLS AND THEIR THERAPEUTIC USES FOR TREATING CANCER
DK3582806T3 (da) 2017-02-20 2023-09-11 Dragonfly Therapeutics Inc Proteiner, der binder her2, nkg2d og cd16
BR112020016190A2 (pt) 2018-02-08 2020-12-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Domínios variáveis de anticorpos direcionando o receptor nkg2d
WO2019157332A1 (en) * 2018-02-08 2019-08-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Combination therapy of cancer involving multi-specific binding proteins that activate natural killer cells
JP2022544393A (ja) 2019-08-12 2022-10-18 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド マクロファージ刺激１受容体（ｍｓｔ１ｒ）バリアント及びその使用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6294330B1 (en) * 1997-01-31 2001-09-25 Odyssey Pharmaceuticals Inc. Protein fragment complementation assays for the detection of biological or drug interactions
US20020002276A1 (en) * 1997-02-10 2002-01-03 Genentech, Inc. Chimeric heteromultimer adhesins
EP1115847A1 (en) * 1998-09-25 2001-07-18 Children's Medical Center Corporation Short peptides which selectively modulate the activity of protein kinases
WO2002083074A2 (en) * 2001-04-13 2002-10-24 Children's Hospital Medical Center Methods for the treatment of hepatic disorders
WO2002087618A1 (fr) * 2001-04-27 2002-11-07 Takeda Chemical Industries, Ltd. Methode de prevention et de traitement du cancer
AU2002329540A1 (en) * 2001-06-20 2003-01-02 Morphosys Ag Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
US6867005B2 (en) * 2001-10-24 2005-03-15 Beckman Coulter, Inc. Method and apparatus for increasing the dynamic range and accuracy of binding assays
US20030157082A1 (en) * 2002-01-31 2003-08-21 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating cancer using 140, 1470, 1686, 2089, 2427, 3702, 5891, 6428, 7181, 7660, 25641, 69583, 49863, 8897, 1682, 17667, 9235, 3703, 14171, 10359, 1660, 1450, 18894, 2088, 32427, 2160, 9252, 9389, 1642, 85269, 10297, 1584, 9525, 14124, 4469, 8990, 2100, 9288, 64698, 10480,20893, 33230,1586, 9943, 16334, 68862, 9011, 14031, 6178, 21225, 1420, 32236, 2099, 2150, 26583, 2784, 8941, 9811, 27444, 50566 or 66428 molecules
JP2007508801A (ja) * 2003-10-24 2007-04-12 エスバテック・アーゲー 受容体チロシンキナーゼ阻害剤の同定および／または確認のための方法
WO2005120557A2 (en) * 2004-05-13 2005-12-22 Imclone Systems Incorporated Inhibition of macrophage-stimulating protein receptor (ron)
JP2008506366A (ja) * 2004-05-14 2008-03-06 レセプター バイオロジックス インコーポレイテッド 細胞表面受容体アイソフォームならびにその同定および使用方法
EP1864130A2 (en) * 2005-03-02 2007-12-12 Acadia Pharmaceuticals Inc. Functional bioluminescence energy resonance transfer (bret) assay to screen, identify and characterize receptor tyrosine kinase ligands
GEP20135917B (en) * 2006-03-17 2013-09-10 Biogen Idec Inc Stabilized polypeptide compositions
US7452985B2 (en) * 2006-08-17 2008-11-18 Visgeneer, Inc. Human Ron-related gene variant associated with cancers
UY31478A1 (es) * 2007-11-21 2009-07-17 Inhibicion del receptor para la proteina estimulante del macrofago (ron) y métodos para el tratamiento de lo mismo

Also Published As

Publication number Publication date
JP2011509687A (ja) 2011-03-31
AU2009206724A1 (en) 2009-07-30
BRPI0906498A2 (pt) 2015-07-14
MX2010008025A (es) 2010-08-04
KR20100106590A (ko) 2010-10-01
EP2245066A2 (en) 2010-11-03
CA2712697A1 (en) 2009-07-30
WO2009094148A2 (en) 2009-07-30
US20090226442A1 (en) 2009-09-10
IL207129A0 (en) 2010-12-30
WO2009094148A3 (en) 2010-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101977937A (zh) Ron抗体及其用途
JP6420379B2 (ja) ヒトｏｘ４０受容体に対する結合分子
JP6006284B2 (ja) 疾病に特異的な結合分子および標的を提供する方法
CN104231084B (zh) 抗人cd52免疫球蛋白
CN103608040B (zh) 结合b7‑h1和pd‑1的抗体和其他分子
JP5398545B2 (ja) 疾病に特異的な結合分子および標的を提供する方法
JP2021531826A (ja) 栄養膜細胞表面抗原２（ｔｒｏｐ２）に対する特異的な抗体
CN102458468A (zh) 抗-cd100抗体和其使用方法
JP2021513331A (ja) 抗ｂ７−ｈ４抗体、その抗原結合断片及びその医薬用途
CN105745224B (zh) 用于治疗癌症的针对ly75的偶联抗体
US20140079716A1 (en) Anti-lymphotoxin antibodies
CN111329994A (zh) 与炎性肠病有关的抗原
WO2008127655A1 (en) Anti-alpha 6 beta 4 integrin antibodies and uses therof
CN101505793A (zh) 用于治疗癌症的抗c35抗体
US11028176B2 (en) Anti-peripheral lymph node addressin antibodies and uses thereof
AU2013204503A1 (en) Anti-lymphotoxin antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20110216