CN101974537A - 玉米耐渍性相关的转录因子基因zm-bRLZ及分子标记与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。涉及一种玉米耐渍性相关的转录因子基因zm-bRLZ的克隆及应用，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，全长4027bp，含6个外显子。其cDNA序列如SEQ ID NO：2所示，编码282个氨基酸。在淹水胁迫下，该基因在玉米自交系Hz32幼苗根系中上调表达，在Mo17中其表达水平不变。基因蛋白质产物与ADH启动子厌氧响应因子体外结合，表明zm-bRLZ基因对厌氧诱导基因具有调控作用。利用玉米耐渍性自交系Hz32和高度敏感系K12中zm-bRLZ基因序列差异，开发了一对CAPS标记。利用K12×Hz32 F₂群体，将该基因定位于9.04bin耐渍性QTL峰值处。候选基因关联分析证实，zm-bRLZ基因启动子区域及3′-UTR区的多个SNP位点与多个耐渍性指标均极显著关联。

Description

玉米耐渍性相关的转录因子基因zm-bRLZ及分子标记与应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域。具体涉及到一个位于玉米第9染色体上，与玉米苗期耐渍性相关的转录因子基因zm-bRLZ的克隆及其功能标记的开发与应用。

背景技术

南方春玉米和北方夏玉米在正常的栽培季节中，经常遭受洪涝和渍害，因长期渍水使玉米根系处于低氧状态，导致玉米减产。渍害已成为制约玉米高产稳产的重要非生物逆境因子。培育耐渍性玉米品种是减少淹水胁迫带来损失的有效途径。

许多研究表明，玉米自交系间存在耐渍性的遗传差异，这为通过育种手段进行玉米耐渍性的遗传改良提供了基因资源。在建立玉米苗期耐渍性鉴定指标的基础上，我们对120份玉米自交系种质进行了耐渍性的鉴定筛选(姜华武，张祖新，1999)，以耐渍性显著差异的自交系(HZ32，Mo17，K12等)为材料，我们开展了控制玉米耐渍性的QTL定位、全基因组的表达谱分析、代谢途径中重要酶基因的表达和活性研究(张祖新等，2003；Zhang et al.，2005b；Tang et al.，2005)等。然而，由于玉米耐渍性为一复杂性状，存在显著的基因型与环境互作，同时胁迫强度和时间具有不可预测性，因此，使用常规育种技术对玉米耐渍性改良比较困难。近年来研究表明，分子设计育种将分子标记辅助选择技术、转基因技术和常规育种方法有机结合在一起，可为玉米耐渍性的遗传改良提供一套全新的技术方案。

优良耐渍基因的发掘、鉴定与克隆是开展玉米耐渍性分子设计育种的前提。近年来，模式植物(拟南芥和水稻)耐渍响应的关键代谢途径的阐明及其重要基因克隆(Hoeren et al.，1998；Xu et al.，2006；Hattori et al.，2009)，为植物耐渍性的遗传改良提供了基因资源。当今，在植物耐渍性改良探索中所使用的基因资源主要包括：1)导入发酵途径相关基因如Adh1、Pdc1、Pdc2、Ldh等，提高拟南芥植株对低氧胁迫的耐性；在棉花和水稻中也有类似的报道(Ellis et al.，2002；Dolferous et al.，2003；Ismond et al.，2003)。2)导入厌氧诱导的转录因子如AtMYB2基因，启动发酵途径和其他代谢途径中相关基因的表达，增强拟南芥对低氧胁迫的长期适应反应(Hoeren et al.，1998)，但AtMYB2的组成型超量表达导致转化植株夭折(Dolferous et al.，2003)。3)导入外源物种透明颤菌的血红蛋白基因vhb，提高植物根系对氧的捕获效率，以缓解长时间淹水造成的厌氧胁迫。因此，在育种实践中可用的基因资源非常有限，进一步鉴定并克隆玉米耐渍基因仍然十分必要。

鉴于此，本发明利用cDNA芯片技术，鉴定并克隆了一个玉米苗期耐渍性响应的转录因子基因zm-bRLZ，证实了该基因在玉米耐渍性形成中的功能及作用机理，基于基因序列开发了一对功能性分子标记，为玉米耐渍性的分子设计育种提供了新的基因资源和实用性标记。

发明内容

本发明的目的是从玉米中克隆一个玉米苗期耐渍性相关的基因的完整编码区DNA片段及其启动子，利用该基因开发实用性分子标记。我们将这个基因命名为zm-bRLZ。

本发明利用不同耐渍性的玉米自交系Mo17(引自国家农作物种质保存中心，渍水敏感)和Hz32(引自国家农作物种质保存中心，耐渍性强)为材料，其中Hz32在西南地区育种中被广泛应用。我们制作了玉米全生育期均一化cDNA芯片，通过对Hz32和Mo17在淹水胁迫条件下苗期根系的基因表达差异研究，鉴定得到了一个耐渍性相关的转录因子基因zm-bRLZ。利用Real time PCR进一步验证了芯片结果，该基因在耐渍材料Hz32中受淹水胁迫诱导，而在敏感材料Mo17中则变化不明显。使用RACE技术获得了该基因的1199bp全长cDNA，序列分析显示，该cDNA序列含有1个869bp的开放阅读框，编码282个氨基酸；预测的蛋白质序列中有一个bZip/bRLZ结构域和一个DNA结合结构域，具有真核生物Leu Zipper类转录因子的典型特征。洋葱表皮的瞬时表达分析证实，该基因产物在细胞核内累积。凝胶滞后分析证实，该基因蛋白质产物与ADH启动子(M32984.1)厌氧响应元件(anaerobic responsive element：ARE)体外结合。另外，通过对K12(引自国家农作物种质保存中心，渍水敏感)及Hz32两个材料之间的比较测序，成功开发了一对基于zm-bRLZ基因序列的CAPS标记，利用K12×Hz32 F2群体，将该基因定位于9.04bin耐渍性QTL峰值处，该QTL贡献率为7.0％。候选基因的关联分析证实，zm-bRLZ基因启动子区域与3′-非转录区区的多个单核苷酸多态性(SNP)位点与多个耐渍性指标(如地上部长度、地上部鲜重及地上部长度系数)均极显著关联。

本发明的优点在于：

(1)本发明首次在玉米中克隆并证实了一个耐渍性相关的转录因子基因，为玉米耐渍性遗传改良提供了新的基因资源；

(2)基于本发明所克隆的基因开发了一对功能性分子标记，可为分子标记辅助育种提供实用性的分子标记。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的与玉米耐渍性相关的转录因子基因zm-bRLZ的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：2是本发明克隆的与玉米耐渍性相关的转录因子基因zm-bRLZ编码区。

序列表SEQ ID NO：3是本发明克隆的与玉米耐渍性相关的转录因子基因zm-bRLZ编码的氨基酸序列。

序列表SEQ ID NO：4-11是扩增玉米耐渍性相关的转录因子基因zm-bRLZ的引物序列。

序列表SEQ ID NO：12是基因zm-bRLZ的CAPS分子标记的核苷酸序列。

图1：是Real time PCR显示zm-bRLZ基因在淹水4h的Hz32被诱导表达情况。

图2：是zm-bRLZ基因的外显子、内含子所在位置的示意图。

图3：是pEGAD载体示意图。

图4：是zm-bRLZ表达产物的洋葱表皮定位。

图5：是pGEX-KG载体示意图。

图6：是zm-bRLZ蛋白质分离及其凝胶阻滞电泳分析结果，图中：泳道1：蛋白质分子量标记；泳道2：纯化的zm-bRLZ蛋白质；泳道3：纯化的zm-bRLZ蛋白质+含ARE元件的探针；泳道3：游离ARE元件探针。

图7：是CAPS标记电泳图，泳道：1：DNA分子量标记DL2000；泳道2：G型基因型；泳道3：G型基因型；泳道4：杂合基因型。

图8：是zm-bRLZ基因在第9染色体上的定位及耐渍QTL的定位，注：作图群体为K12×HZ32 F2群体，QTL定位群体为K12×HZ32 F2：3群体。

图9：是zm-bRLZ基因与玉米耐渍相关性状的关联分析，注：纵坐标表示解释的表型变异；横坐标表示DNA序列位置；T5表示地上部分长度；T6表示地上部长度系数。

具体实施方式

以下实施实例进一步定义本发明，并描叙了克隆zm-bRLZ基因、阐明基因功能及其功能标记开发的方法。根据以下的描述和实例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出适当的完善和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：利用cDNA芯片筛选得到zm-bRLZ

(1)芯片筛选得到差异表达基因zm-bRLZ

本发明选用耐渍性较差的Mo17和耐渍性强的Hz32两个玉米自交系为试材。种子萌发后，于沙钵盆栽培养至两叶一心期。挑选长势一致的若干单株平均分成两组。一组作为对照，在正常水分和管理条件下生长；另一组采用1×完全培养液[成分：Ca(NO₃)2 820.7mg/L，KNO₃ 505.6mg/L，MgSO₄·7H₂O 616.2mg/L，KH₂PO₄ 272.2mg/L，Fe-EDTA 13.02mg/L，H₃BO₃ 2.860mg/L，MnSO₄ 1.015mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.079mg/L，ZnSO₄·7H₂O 0.220mg/L，H₂MoO₄ 0.090mg/L]进行1h、2h、4h和8h的淹水处理，淹水深度以水面刚好淹没最下叶片基部为宜。分别剪取处理和对照的根系，于-70℃保存备用。

利用本申请人所在实验室构建的玉米自交系Mo17全生育期均一化cDNA文库(见Zhang et al.，2005a)，使用BioRobotics试剂盒(剑桥公司，英国)将10886个插入片段PCR产物点制于尼龙膜上，制成cDNA芯片(方法见Zhang et al.，2005b)。将Hz32和Mo17淹水处理1h、2h、4h和对照的总RNA样品，各自分离其mRNA并反转录，得到³³P标记的第一链cDNA产物做探针，用于与cDNA芯片杂交。预杂交液(6×柠檬酸盐缓冲液SSC，0.5％十二烷基硫酸钠SDS，5×Denhardt′s试剂，100μg/ml鲑鱼精DNA)中68℃预杂交3h，然后加入探针于杂交液(6×SSC，0.5％十二烷基硫酸钠，100μg/mL鲑鱼精DNA)中杂交过夜。杂交结束后洗膜液(0.1×SSC，0.5％十二烷基硫酸钠)中，65℃洗膜1h。洗好的膜用利用FLA-3000A Plate/Fluorescent Image Analyzer(东京电力，日本)扫描。选取处理与对照差异在3倍以上的克隆进行测序分析。其中，zm-bRLZ基因在HZ32中受淹水胁迫高效诱导表达，在Mo17中变化不显著。

(2)实时定量PCR验证

分别取Hz32和Mo17淹水1h、2h、4h和8h处理及对照的总RNA各5μg，进行cDNA第一链的合成。反转录选用RevertAid^TM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit(购自MBI，Lithuania公司试剂盒，按照试剂盒的说明书操作)进行。选取玉米看家基因actin(NM_001155179)AAGTACCCGATTGAGCATGG，GATGGAGTTGTACGTGGCCT为对照。PCR引物见表1.所示。荧光定量PCR使用CFX96 Real-TimeSystem C1000 Thermal Cycler(Bio-RAD，USA)，使用宝生物工程(大连)有限公司SYBRGreen PCR MasterMix试剂盒。荧光定量反应体系为20μL：含有SYBR Mix 10μL，正反向引物TTCATCCGGGAGAGCGGCGA，GCGAAACCGAAGCCGGGTGA(10μmoL/L)各0.8μL，模板2μL和焦碳酸二乙酯处理过的无菌水。扩增条件为：94℃预变性2min；94℃10s，60℃30s，72℃15s，38个循环。每组实验3个生物学重复，2次技术重复。结果表明，实时定量PCR与芯片结果相符合(图1)。

表1 zm-bRLZ基因组序列扩增引物

说明：表1中的引物已经转换成对应的SEQ ID NO：4-11的序列表。

实施例2：zm-bRLZ的基因结构和功能预测

(1)cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)分离zm-bRLZ全长cDNA

采用Trizol试剂盒(购自英杰公司，美国)分别提取Hz32幼苗根系总RNA(操作方法参照该试剂盒的使用手册)，用于5′-RACE及3′-RACE cDNA第一链合成，RACE技术分析各操作步骤、反应体系以及反应程序均按照SMART RACE cDNA Kit扩增试剂盒(购自英杰公司，美国)操作方法参照该试剂盒的使用手册。引物为GSP1：TCCCTAGTAAATCCAACCCTGTGAGC；NGSP1-1：TGCCTGTTTCCTCCTCCTAGACCGCC；GSP2：TCCAGCAACTTTCAGATGCCAACCAA；NGSP2-1：GGGGTCCAACCGCAGGTACACGAGTA。

(2)zm-bRLZ基因结构分析：

根据全长cDNA设计了4对引物(编号分别为bRLZ-1到bRLZ-8，引物的DNA序列见表1所示)，以玉米自交系Hz32 DNA为模板，扩增得到相应的基因组序列。通过比较该全长cDNA和DNA的序列得到了本发明的zm-bRLZ基因：该zm-bRLZ基因从翻译起始密码子至终止密码子，全长为1706bp，它包含6个外显子(exon)和5个内含子(intron)，其中第一至第六外显子长度分别为：318bp、84bp、134bp、76bp、126bp和760bp；第一至第五内含子长度分别为：152bp、397bp、105bp、101bp和102bp(如图2所示)。因此，zm-bRLZ基因的开放阅读框长为849bp，编码282个氨基酸(见序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示)。

(3)zm-bRLZ基因功能预测

zm-bRLZ蛋白质由282个氨基酸组成，经ComputepI/MW软件预测，其等电点为5.2，分子量为30.1kDa。根据InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/)对蛋白的结构域和功能位点分析，发现其含有bZIP(basic zipper)功能域，从第118位到第182位肽段与BRLZ5(AB053474，basic region leucine zipper)和bZIP高度同源，且含亮氨酸重复序列。

(4)zm-bRLZ编码产物的亚细胞定位

利用zm-bRLZ基因特异性引物5′-AGGAATTCATGAAGAAGTGCGCGTCGGAGC-3′(其中下划线为EcoR I酶切位点)和5′-GTGGATCCCTCAAGCCACCAGCTATTTGAG-3′(其中下划线为BamH I酶切位点)，扩增zm-bRLZ的开放阅读框(ORF)，PCR产物经EcoR I和BamH I双酶切后插入到pEGAD载体(图3；Cutler et al.，2000)中，产生zm-bRLZ：GFP融合蛋白。以融合载体热激转化(分子克隆第二版，科学出版社，PP822-849)大肠杆菌DH10B(上海雷浩信息科技有限公司，中国)，阳性克隆经PCR验证，进一步提取质粒，利用基因枪介导法(Klein et al.，1989)将zm-bRLZ：GFP转化至洋葱表皮细胞中，用聚光共聚焦显微镜观察。不含目的基因的空载体为对照。结果表明，该融合蛋白被定位在细胞核中，而不含zm-bRLZ的对照GFP蛋白分布在整个细胞中(图4)，说明zm-bRLZ基因编码产物位于细胞核。

实施例3：zm-bRLZ体外表达及其与厌氧应答元件的结合分析

上下游引物分别为：GTGGAATTCTAAGAAGTGCGCGTCGGAGCTG；TCAAGGCCAAATGTCCGCCGCCGAGCTCGA(其中下划线为酶切位点)，cDNA作为PCR扩增模板。PCR产物回收纯化经BamH I和Sac I双酶切后插入到pGEX-KG载体(图5)中，构建zm-bRLZ::GST结构，转化Rosseta宿主菌(英杰，美国)，氨苄青霉素浓度100μg/ml+LB平板筛选阳性克隆。阳性克隆LB液体中加入终浓度0.2mmoL/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4℃诱导过夜后，4℃8000g离心10分钟，收集沉淀菌体。取1-2g菌体加10mL破碎缓冲液(pH7.4，50mM磷酸缓冲液：含0.5M NaCl，0.5mg/mL溶菌酶，1mM苯甲基磺酰氟PMSF，1mM MgCl2，1.7U/mL核酸酶(Benzonase)在冰上混合45分钟，把混合菌体在冰水中用超声探头破碎，破碎液4℃12000g离心10分钟，取上清，加2M咪唑溶液0.12mL至终浓度为20mM，样品总体积为10mL，0.45μm的滤膜过柱。取1.0mL谷胱甘肽S转移酶琼脂糖凝胶预装柱，用10.0mL平衡缓冲液(pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5MNaCl，含20mM咪唑)平衡，然后取破碎上清10mL样品以0.5mL/min上样，然后2.0mL/管分管收集。用15.0mL平衡缓冲液洗去未吸附的样品，流速1-2mL/min，2ml/管收集。用5mL洗脱缓冲液(pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，含500mM咪唑)洗去未吸附的样品，流速1-2mL/min，2mL/管收集。

以引物：Adh-p1：TGCAGCCCCGGTTTCGCAAGCCGCGCCGTGGTTTGCTT；h-p2：GGGCAAGCAAAC

CACGGCGCGGCTTGCGAAACCGG作为双链探针，该序列包含Adh基因启动子中的2个厌氧应答元件(ARE)，采用宝生物工程(大连)有限公司的Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2.0，³²P标记探针。蛋白质和DNA结合反应体系：10×结合缓冲液，2μL(100mmol/L Tris-HCl，pH7.5，50％甘油，10mmol/LMgCl₂，10mmol/L乙二胺四乙酸四钠盐，10mmol/L二硫苏糖醇)；zm-bRLZ纯化蛋白约5μL；上述标记探针1μL；用去离子水补足至20μL；室温结合30分钟，加3μL上样缓冲液(0.025％溴酚蓝)，进行聚丙烯酰胺电泳分析。

配制聚丙烯酰胺胶(5％)：30％丙烯酰胺4.2mL，5×硼酸缓冲液5mL；10％AP 180μL；四甲基二乙胺16μL，去离子水15.7mL。待胶凝后，用1×电泳缓冲液电泳，预电泳20分钟(200V)；上样，电泳1小时(200V)；用滤纸粘下胶，保鲜膜封好后，压x光片1～2小时；洗片，显影2分钟，定影5分钟。结果表明，该蛋白与ARE元件具有特异结合(图6)，说明该基因可能在耐渍应答过程中直接调控厌氧应答基因的表达。

实施例4：zm-bRLZ基因功能性标记开发及其基因组定位

(1)玉米苗期耐渍QTL定位

以Hz32×K12构建包含288个家系的F_2:3耐渍性状分离群体。在正常水份和淹水胁迫6天两种环境条件下对该群体单株进行表型考察，包括地下部长度、地下部干重、地上部长度、地上部干重、总干重以及耐渍系数，于2004年和2005年分别进行2次生物学重复。利用两个亲本间具有多态性的177个SSR标记构建玉米分子连锁图谱(Qiu et al.，2007)，覆盖基因组的总长度为1710.5cM。采用复合区间作图法(Zeng，1994)进行QTL分析，在第4、7和9染色体上检测到3个一致性的QTL密集区域，其中，第九染色体的QTL密集区域贡献率为7％。

(2)zm-bRLZ基因功能标记开发及其基因组定位

对Hz32和K12的zm-bRLZ区段进行测序，序列结果分析发现，以引物bRLZ-7：CAACTCAAATAGCTGGTGGC；bRLZ-8：CCCGGTCAACCCTTGTTTTGTATG为引物的扩增片段，在Hz32中为772bp，在K12中长为777bp，二者之间存在5bp的插入缺失突变(Indel)和几个单碱基突变(SNPs)。进一步酶切分析发现，位于+607位的单碱基突变(C/G)位点恰好可以为Msp I所区分，该位点在Hz32中为CCGG，而在K12中则为CGGG，此外，在扩增区域还有该酶的另一个识别位点，但是此位点位于扩增产物末端，在Hz32的扩增产物中位于768bp处，而在K12中则位于772bp处，因此，2个Msp I不会相互干扰。

利用此对引物进行PCR扩增，PCR反应体系：10-50ng DNA，10×PCR缓冲液2μL，10mmoL/L dNTP0.2μL，上、下游引物(bRLZ-7和bRLZ-8，10μmoL/L)各1μL，1U Taq DNA聚合酶，ddH2O补足20μL。PCR程序为：94℃预变性2min；94℃变性10S，54℃，复性30S，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸5min。在玉米自交系Hz32和K12中均得到了一条大小为770bp左右的片段。此特异PCR产物经Msp I酶切，MspI酶切反应体系15μL：5μL PCR扩增产物，1×缓冲液R(含牛血清白蛋白(BSA)和25U限制性内切酶MspI(MBI Fermentas)，用ddH2O补足。酶切反应体系于37℃保温过夜至完全酶切，1％琼脂糖电泳检测酶切产物。电泳结果发现，在玉米自交系Hz32中呈现600bp和160bp的两条带(C基因型)，而在玉米自交系K12中则为770bp的一条带型(G基因型)(参见图7)。这是因为当位点为C时，正好为限制性内切酶MspI的识别位点(CCGG)，Msp I识别该位点并将其酶切，电泳后可以见到两条带；而当该位点有C→G变化(CGGG)时，Msp I限制性酶切位点失去，Msp I不能识别，电泳后只能见到一条带。据此可判断zm-bRLZ基因在该位点的G-C突变，该标记命名为zmbRC/G，其核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：12所示。CAPS标记zmbRC/G对40份测序单株的酶切结果表明，酶切的结果与测序结果完全一致，即所有在该位点为C的材料，酶切后全部为二条带，该位点为G的材料只显示一条带，杂合基因型则为三条带。因此，可以用该标记判断zm-bRLZ基因的G-C变异位点。进一步地，利用Hz32×K12作图群体将此标记定位于玉米第9连锁群上，位于SSR标记umc1743和umc1107之间，距离分别4.6和1.6cM，该区段为1个玉米耐渍性QTL的密集区域(见图8)。

实施例5：zm-bRLZ基因与耐渍表型的关联分析

以长约4027bp的zm-bRLZ基因序列(见序列表SEQ ID NO：1，含编码区、5′-非编码区、3′-非编码区和启动子区)，使用育种上常用的79个玉米自交系，开展该基因与玉米耐渍性的关联分析。表型调查参照Qiu et al.(2007)的方法进行，考察性状包括正常和淹水处理6天幼苗的地上部长度、鲜重及干重和地下部长度、鲜重及干重。对zm-bRLZ基因序列多样性分析，在编码区共检测到了66处核苷酸变异，包括54个SNP(平均每74bp一个SNP)和12个Indel(平均每355bp一个Indel)。候选基因的关联分析共检测出7个多态性位点与表型性状显著关联。其中，启动子区域的一个C/G突变与地上部长度系数显著相关，一个G/A突变与地上部长度显著相关(图9)。

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15.张祖新，姜华武，魏中一，郑用琏.淹水胁迫下不同耐渍性玉米自交系根系中的酶学研究.湖北农业科学，2003(3)：25-27.

Claims (5)

1.一个分离克隆的控制玉米耐渍性的转录因子基因zm-bRLZ，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的基因，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

3.一种控制玉米耐渍性的转录因子基因zm-bRLZ的CAPS标记，其PCR引物组合为bRLZ-7：CAACTCAAATAGCTGGTGGC，bRLZ-8：CCCGGTCAACCCTTGTTTTGTATG，PCR产物酶切所用的限制性核酸内切酶为Msp I。

4.权利要求1或2所述的基因在玉米遗传改良中的应用。

5.权利要求3所述的标记在玉米分子标记辅助育种中的应用。

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