CN101974493B - 一种可降解棉籽壳的复合酶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可降解棉籽壳的复合酶及其制备方法和应用，该复合酶组分包括：纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶活力；其制备方法，包括：将里氏木霉种子接种到种子培养基于25～30℃，120～250r/min条件下培养24～48小时，以4～10％接种量转接至含1～10％棉籽壳的发酵培养基产酶，培养过程中可以通过添加棉籽壳进一步诱导产酶，在25～30℃，120～250r/min条件下培养4～8天，过滤，离心得粗酶。本发明制得的复合酶具有较高的酶活、更适合棉籽壳降解的复合酶体系，而且安全环保，操作简单，可控性强，相比常规的碱处理反应条件温和，对环境友好，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术中复合酶的发酵制备及其应用领域，特别涉及一种可降解棉籽壳的复合酶及其制备方法和应用。
背景技术
棉籽壳的化学成分、颜色和形态不同于棉纤维与织物，影响染色的均匀度以及织物的手感和外观，在进行织物的染色和整理前必须去除。但是棉籽壳的结构致密、成分复杂，是棉织物精练工艺中最难去除的非纤维素杂质。与棉纤维中其它杂质相比，它的降解通常需要更为剧烈的处理条件和更长的时间，因此如何去除棉织物表面的棉籽壳一直是染整工作中的难题。
当前为了应对我国传统工业转型和节能减排的低碳经济要求，纺织工业正在发展棉织物生物酶精练的新型前处理工艺。棉籽壳的去除是实现棉织物酶精练工艺大规模工业化的关键。棉纤维共生物和棉籽壳的化学成分复杂，而酶具有高度底物催化专一性，不同种类的酶只能降解不同的杂质组分。应用酶对棉织物进行精练，单一酶制剂难以完成棉籽壳的降解，难以达到理想的去除率和精练效果，因此需要筛选找到最适于降解某一组分的酶，再将这些酶进行复配，同时确保在同一条件下复合酶体系中不同的酶能发挥各自的功效，才能利用多种酶制剂的协同复合作用促进棉籽壳的降解和去除。研究表明纤维素酶和木聚糖酶对棉织物中的棉籽壳有一定的降解作用。通过研究可知棉籽壳由外表皮层、外色素层、无色层、栅栏层和内色素层组成；外表皮层均匀地分布着角质(类脂物)，此外纤维素、半纤维素、木质素(芳环类、多酚类)和果胶也是外表皮层的主要成分；栅栏层主要以果胶、半纤维素和木质素为主；内色素层和外色素层在结构和化学成分上相同，主要以带有酚羟基类化合物的木质素为主。化学组分上主要包含纤维素(约37％)、果胶和木聚糖等半纤维素(约25％)、木质素(约29％)，此外还含有灰分(约3％)、少量蛋白质以及脂类等化学物质。在棉籽壳的三大化学组分中，木聚糖等半纤维素通常与木质素之间存在化学键，构成了木质素——碳水化合物复合体(LCC)，木聚糖酶可以去除棉籽壳中的木聚糖，从而破坏LCC结构，有助于溶出木质素，而少量的纤维素酶也有助于降解棉籽壳中的纤维素，最终起到软化棉籽壳，利于在水洗中去除棉籽壳。
目前的关键问题是，虽然许多学者和机构采用了将单一纯酶复配以提高棉籽壳的降解，譬如将纤维素酶和木聚糖酶复配，或将木聚糖酶与果胶酶复配，但是仍旧但不到理想的棉籽壳去除和精练效果。这是因为棉籽壳是一种含有包括纤维素、半纤维素、木质素、果胶、角质、蛋白质以及灰分等复杂成分的复合物，酶的高度底物催化专一特性使得不同种类的酶只能降解各自不同的杂质组分。即使采用了酶的复配技术，由于不同生物来源的酶的特性不同，催化条件差异很大，再加上各种酶的配比很难掌握，因此达不到最佳协同处理效果。不同酶的活力及使用效果与使用条件有相当大的关系。不同酶的最适反应pH值和温度以及稳定pH值和温度等都各有不同，在同一条件下，发挥复合酶中各种酶的活力，确保在同一条件下复合酶体系中不同的酶能发挥各自的功效，是该工艺的一个技术难点。
自然界中某些微生物自身就能独立完成包括棉籽壳在内的复杂木质纤维素类物质的降解，因此筛选找到最适于降解棉籽壳的微生物，并通过发酵调控获得最佳的复合酶系以用于棉籽壳的降解是一条很好的途径。该技术能确保在同一催化反应条件下复合酶体系中不同的酶能充分和稳定地发挥各自的功效，利用各酶的协同复合作用来高效催化水解棉籽壳。里氏木霉能同时合成多种降解木质纤维素酶类，因此本发明提出诱导该菌发酵产酶并对该酶系中各种酶活进行调控以利于棉籽壳的降解。
采用高效生物催化剂群为主体的酶处理工艺替代传统的化学处理工艺，可以显著降低水耗、能耗，废水量显著减少并且容易处理；节省染料并获得更稳定的染色效果；织物的柔软度更好、强度更高；操作更加安全和简便；由于用量少，在使用成本上也具有竞争力，因而成为纺织工业清洁生产技术的未来发展方向。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可降解棉籽壳的复合酶及其制备方法和应用，本方法制得的复合酶具有较高的酶活、更适合棉籽壳降解的复合酶体系，而且安全环保，操作简单，可控性强，相比常规的碱处理反应条件温和，对环境友好，具有良好的应用前景。
本发明的一种可降解棉籽壳的复合酶，其组分主要包括：纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶，以及少部分脂肪酶、蛋白酶等；所述的复合酶由以下方法制得，包括：
将里氏木霉种子接种到种子培养基于25～30℃，120～250r/min条件下培养24～48小时，以4～10％接种量转接至含1～10％棉籽壳的发酵培养基产酶，培养过程中通过添加相对发酵培养基1～2％的棉籽壳进一步诱导产酶，在25～30℃，120～250r/min条件下培养4～8天，过滤，离心得粗酶液；
其中，种子培养基包含：1％葡萄糖，0.1～1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N的Vogel培养基，pH5.0，或者是包含1％葡萄糖，0.1～1％蛋白胨，终浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液，0.015％Tween 80，0.14％(NH4)2SO4，0.2％KH2PO4，0.03％尿素，0.04％CaCl2·2H2O，0.03％MgSO4·7H2O，0.0005％FeSO4·7H2O，0.00016％MnSO4·H2O，0.00014％ZnSO4·7H2O，0.00037％CoCl2·6H2O的Mandels培养基，pH4.8-5.0；
发酵培养基包含：0.1～1％葡萄糖，0.1～1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N，添加1～10％棉籽壳，pH5.0，或者是含0.1～1％葡萄糖，0.1～1％蛋白胨，终浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液，0.015％Tween 80，0.14％(NH4)2SO4，0.2％KH2PO4，0.03％尿素，0.04％CaCl2·2H2O，0.03％MgSO4·7H2O，0.0005％FeSO4·7H2O，0.00016％MnSO4·H2O，0.00014％ZnSO4·7H2O，0.00037％CoCl2·6H2O的Mandels培养基，添加1～10％棉籽壳，pH4.8-5.0。
本发明的一种可降解棉籽壳的复合酶的制备方法，包括：里氏木霉降解棉籽壳酶系的发酵制备
将里氏木霉种子接种到种子培养基于25～30℃，120～250r/min条件下培养24～48小时，以4～10％接种量转接至含1～10％棉籽壳的发酵培养基产酶，培养过程中通过添加相对发酵培养基1～2％的棉籽壳进一步诱导产酶，在25～30℃，120～250r/min条件下培养4～8天，过滤，离心得粗酶液；
所述的里氏木霉种子是里氏木霉Rut C30(Trichoderma reesei Rut C30)，购自美国ATCC，编号ATCC 56765，其种子培养基包含：1％葡萄糖，0.1～1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N的Vogel培养基，pH5.0，或者是包含1％葡萄糖，0.1～1％蛋白胨，终浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液，0.015％Tween 80，0.14％(NH4)2SO4，0.2％KH2PO4，0.03％尿素，0.04％CaCl2·2H2O，0.03％MgSO4·7H2O，0.0005％FeSO4·7H2O，0.00016％MnSO4·H2O，0.00014％ZnSO4·7H2O，0.00037％CoCl2·6H2O的Mandels培养基，pH4.8-5.0；
所述的里氏木霉产酶发酵培养基包含：0.1～1％葡萄糖，0.1～1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N，添加1～10％棉籽壳，pH5.0，或者是含0.1～1％葡萄糖，0.1～1％蛋白胨，终浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液，0.015％Tween 80，0.14％(NH4)2SO4，0.2％KH2PO4，0.03％尿素，0.04％CaCl2·2H2O，0.03％MgSO4·7H2O，0.0005％FeSO4·7H2O，0.00016％MnSO4·H2O，0.00014％ZnSO4·7H2O，0.00037％CoCl2·6H2O的Mandels培养基，添加1～10％棉籽壳，pH4.8-5.0；
发酵培养基中优选以0.1％葡萄糖加上1～10％棉籽壳是最佳的速效碳与诱导物的产酶碳源配比。
所述的棉籽壳是购自山东聊城，风干后经过粉碎机粉碎，用筛子将棉籽壳与棉短绒分离，收集小于40目的棉籽壳颗粒；
所述的在发酵培养基产酶过程中，采用的是间歇分批式、连续培养式或分批补料式的培养方法。
测定纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶活力
①纤维素酶活力测定
(a)粗酶液中还原糖的测定：0.2mL粗酶液+0.8mL蒸馏水+3mL 3，5-二硝基水杨酸(DNS)，沸水浴5min，冷却后加蒸馏水至25mL，550nm处测得OD1；
(b)粗酶液与羧甲基纤维素钠(CMC-Na)反应后总还原糖的测定：0.2mL粗酶液+0.8mL 1％CMC-Na溶液(用50mM，pH4.8的醋酸缓冲液配制)，50℃水浴10min后加入3mLDNS，沸水浴5min；冷却后加蒸馏水至25mL，550nm处测得OD2；
(c)ΔOD＝OD2-OD1，1个酶活力单位(1U)定义为每分钟水解羧甲基纤维素钠产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)的酶量，
式中，K为葡萄糖标准曲线斜率，N为稀释倍数，1000为mg转化为μg的系数，180为葡萄糖的分子量，10为反应时间(min)。
②果胶酶酶活的测定
(a)底物空白：0.2mL 0.1M柠檬酸缓冲液(pH5.0)+0.8mL 5g/L果胶+3mLDNS，沸水煮5min，冷却加水至25mL，550nm测吸光值，记为OD1；
(b)酶液空白：0.2mL酶液+0.8mL缓冲液+3mLDNS，沸水煮5min，冷却加水至25mL，550nm测吸光值，记为OD2；
(c)反应液：0.2mL酶液+0.8mL果胶；
(d)50℃水浴60min，然后迅速加入3mLDNS，沸水煮沸5min，冷却后加水至25mL，550nm处测吸光值，记为OD3；
(e)ΔOD＝OD3-OD2-OD1，一个果胶酶活力单位(U)定义为每分钟生成1μmol D-半乳糖醛酸所需的酶量。
式中：K为D-半乳糖醛酸标准曲线斜率，N为稀释倍数，1000为mg转化为μg的系数，212为D-半乳糖醛酸的分子量，60为反应时间(分钟)。
③木聚糖酶活测定
(a)在25mL刻度试管中加入0.5mL适当稀释的酶液和1mL用0.1M(pH4.8)柠檬酸配制的1％(w/v)燕麦木聚糖(Sigma公司制造)溶液；每个酶样至少做3个不同的稀释度，使反应条件下测得的木糖量在2mg左右；
(b)50℃保温30min；
(c)加DNS试剂3mL，沸水中煮5min，冷却后加水至25mL，混匀后在550nm测吸光值，每次应做有酶无底物和有底物无酶的空白试验；
(d)根据木糖标准曲线，找出反应所产生的木糖量(扣除空白值)；
(e)在半对数坐标纸上，查找释放2mg木糖所需要的酶量，按下式计算酶活力：
一个木聚糖酶活力单位(U)定义为每分钟生成1μmol木糖所需的酶量。
④发酵液残糖测定
(a)粗酶液中还原糖的测定：0.4mL粗酶液+0.6mL蒸馏水+3mL 3，5-二硝基水杨酸(DNS)，沸水浴5min，冷却后加蒸馏水至25mL，550nm处测得OD1；
(b)1mL蒸馏水+3mLDNS，沸水浴5min，冷却后加蒸馏水至25mL，550nm处测得OD2；
(c)ΔOD＝OD1-OD2，根据葡萄标准曲线，计算出发酵液中还原糖的量。
本发明提供的复合酶在水解棉籽壳中的应用，包括，用发酵获得的粗酶液水解棉籽壳
(a)用已烘干至恒重的陶瓷坩埚，质量为G0，装入一定量的棉籽壳颗粒(小于40目)后称重，质量记为G1，105℃烘至恒重，在干燥器中平衡半小时，称重，质量记为G2。
(b)在10mL获得的粗酶液原液或者经1～8倍稀释的酶液中，加入1g棉籽壳，在pH3.0-5.0、40-60℃、100-200rpm条件下水浴振荡反应10h，每隔1小时取样测酶解液中还原糖的量。
棉籽壳中含纤维素约37％，半纤维素约25％，因此还原糖理论总量为水解前的棉籽壳质量×62％，还原糖得率＝水解后水解液中还原糖的总量(g)/还原糖理论总量(g)×100％。(c)水解10h后，用已烘至恒重的G3玻砂坩埚质量记为M1，收集酶解残渣，105℃烘至恒重，取出在干燥器中平衡半小时，称重，质量记为M2，计算棉籽壳水解率。以仅用缓冲液处理的做参照。
a％为棉籽壳的含水率，m为棉籽壳水解前的质量。
本发明针对棉籽壳中各种成分，以棉籽壳为原料对菌种进行诱导产酶，获得可降解棉籽壳中多组分的复合酶并以多酶协同作用以达到最优的降解效果。本发明中里氏木霉木聚糖酶等半纤维素酶的产量较高，且能产生纤维素酶和果胶酶，可以通过调节产酶培养基中的碳氮比和葡萄糖与棉籽壳的比例进而调控纤维素酶和木聚糖酶的活力比例，达到最佳降解棉籽壳的效果。
有益效果
本发明利用方便易得且价格低廉的棉籽壳为原料诱导里氏木霉生产水解棉籽壳的复合酶系。通过对发酵原料及其各成分配比的控制，生产出适合于水解棉籽壳的混合酶，并用生产的酶水解棉籽壳，为纺织工业中去除棉籽壳提供新的思路和途径。利用发酵制得的粗酶液处理棉籽壳，比常规的碱处理反应条件温和；对环境友好。本方法可得到较高的酶活、更适合棉籽壳降解的复合酶体系，与复配的市售商品酶相比，该复合酶降解棉籽壳效果显著，而且安全环保，操作简单，可控性强。
附图说明
图1是实施例1-3中纤维素酶活力测定结果；
图2是实施例1-3中果胶酶活力测定结果；
图3是实施例1-3中木聚糖酶活力测定结果；
图4是实施例1-3中发酵液残糖变化；
图5是实施例1-3获得的粗酶液水解棉籽壳生成还原糖浓度的变化；
其中，图1-5中，(◆)代表实施例1，(■)代表实施例2，(▲)代表实施例3。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1.里氏木霉的种子培养
(1)里氏木霉种子培养基：1％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N(125g/L二水柠檬酸钠，250g/LKH2PO4，100g/LNH4NO3，10g/LMgSO4·7H2O，250μg/L生物素，5g/L CaCl2·2H2O，5mL/L微量元素溶液)；其中，微量元素溶液含50g/L一水柠檬酸，50g/L ZnSO4·7H2O，10g/L Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O，2.5g/LCuSO4·5H2O，0.5g/L MnSO4·H2O，0.5g/L H3B03，0.5g/L Na2MoO4·2H2O；
(2)以里氏木霉(T.reesei)Rut C30为生产菌株，在pH5.0，30℃，200r/min条件下培养36h。
2.里氏木霉发酵产酶
(1)里氏木霉产酶培养基：0.1％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N，添加2％棉籽壳，pH5.0；
(2)以10％接种量，未加棉籽壳的培养为对照，在28℃，160r/min条件下培养8d发酵产酶；
(3)过滤或离心收集的发酵液清液就是降解棉籽壳复合酶液。
3.纤维素酶活力测定
(1)粗酶液中还原糖的测定：0.2mL粗酶液+0.8mL蒸馏水+3mL 3，5-二硝基水杨酸(DNS)，沸水浴5min，冷却后加蒸馏水至25mL，550nm处测得OD1；
(2)粗酶液与羧甲基纤维素钠(CMC-Na)反应后总还原糖的测定：0.2mL粗酶液+0.8mL1％CMC-Na溶液(用50mM，pH4.8的醋酸缓冲液配制)，50℃水浴10min后加入3mL DNS，沸水浴5min；冷却后加蒸馏水至25mL，550nm处测得OD2；
(3)ΔOD＝OD2-OD1，1个酶活力单位(1U)定义为每分钟水解羧甲基纤维素钠产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)的酶量，
式中，K为葡萄糖标准曲线斜率，N为稀释倍数(5倍)，1000为mg转化为μg的系数，180为葡萄糖的分子量，10为反应时间(min)。
4.果胶酶酶活的测定
(1)底物空白：0.2mL0.1M柠檬酸缓冲液(pH5.0)+0.8mL 5g/L果胶+3mLDNS，沸水煮5min，冷却加水至25mL，550nm测吸光值，记为OD1：
(2)酶液空白：0.2mL酶液+0.8mL缓冲液+3mLDNS，沸水煮5min，冷却加水至25mL，550nm测吸光值，记为OD2：
(3)反应液：0.2mL酶液+0.8mL果胶
(4)50℃水浴60min，然后迅速加入3mLDNS，沸水煮沸5min，冷却后加水至25mL，550nm处测吸光值，记为OD3。
(5)ΔOD＝OD3-OD2-OD1，一个果胶酶活力单位(U)定义为每分钟生成1μmol D-半乳糖醛酸所需的酶量。
式中：K为D-半乳糖醛酸标准曲线斜率，N为稀释倍数，1000为mg转化为μg的系数，212为D-半乳糖醛酸的分子量，60为反应时间(分钟)。
5.木聚糖酶活测定
(1)在25mL刻度试管中加入0.5mL适当稀释的酶液和1mL用0.1M(pH4.8)柠檬酸配制的1％(w/v)燕麦木聚糖(Sigma公司制造)溶液。每个酶样至少做3个不同的稀释度，使反应条件下测得的木糖量在2mg左右。
(2)50℃保温30min。
(3)加DNS试剂3mL，沸水中煮5min，冷却后加水至25mL，混匀后在550nm测吸光值，每次应做有酶无底物和有底物无酶的空白试验。
(4)根据木糖标准曲线，找出反应所产生的木糖量(扣除空白值)。
(5)在半对数坐标纸上，查找释放2mg木糖所需要的酶量，按下式计算酶活力：
一个木聚糖酶活力单位(U)定义为每分钟生成1μmol木糖所需的酶量。
6.发酵液残糖测定
(1)粗酶液中还原糖的测定：0.4mL粗酶液+0.6mL蒸馏水+3mL 3，5-二硝基水杨酸(DNS)，沸水浴5min，冷却后加蒸馏水至25mL，550nm处测得OD1；
(2)1mL蒸馏水+3mLDNS，沸水浴5min，冷却后加蒸馏水至25mL，550nm处测得OD2；
(3)ΔOD＝OD1-OD2，根据葡萄标准曲线，计算出发酵液中还原糖的量。
7.粗酶液水解棉籽壳
(1)用已烘干至恒重的陶瓷坩埚，质量为G0，装入一定量的棉籽壳后称重，质量记为G1，105℃烘至恒重，在干燥器中平衡半小时，称重，质量记为G2.
(2)将发酵获得的粗酶液用0.1M柠檬酸缓冲液(pH5.0)经适当稀释后，取10mL酶液，水解1g棉籽壳，在pH5.0、50℃、100rpm条件下水浴振荡反应10h，每隔1小时取样测酶解液中还原糖的量。
棉籽壳中含纤维素约37％，半纤维素约25％，因此还原糖理论总量为水解前的棉籽壳质量×62％，还原糖得率＝水解后水解液中还原糖的总量(g)/还原糖理论总量(g)×100％。(3)水解10h后，用已烘至恒重的G3玻砂坩埚质量记为M1，收集酶解残渣，105℃烘至恒重，取出在干燥器中平衡半小时，称重，质量记为M2，计算棉籽壳水解率。以仅用缓冲液处理的做参照。
a％为棉籽壳的含水率，m为棉籽壳水解前的质量。
实验结果见图1-图4，在培养2天后，纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶几乎同步上升(图1-图3)，这说明因为培养基中可供直接利用的单糖比较少，1天后残糖几乎为零(图4)，产酶菌需要合成降解酶来利用较难消化的棉籽壳，棉籽壳含有纤维素、半纤维素、木质素和果胶等物质，可以为产酶菌提供碳源。棉籽壳中纤维素的含量比较高，产酶菌利用其中的纤维素分泌出纤维素酶，酶活最高可达3.63U/mL；果胶在棉籽壳中含量不高，所以产酶菌分泌的果胶酶也不算很高，最大酶活出现在培养第7天，达0.022U/mL；在培养的前4天木聚糖酶活力急剧上升，在第4天达到最高值3.55U/mL。
实施例2
1.里氏木霉的种子培养
(1)里氏木霉种子培养基：1％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N；
(2)以里氏木霉Rut C30为生产菌种，在pH5.0，30℃，200r/min条件下培养36h。
2.里氏木霉发酵产酶
(1)里氏木霉产酶培养基：0.5％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N，添加2％棉籽壳，pH5.0；
(2)以5％接种量，未加棉籽壳的培养为对照，在30℃，160r/min条件下培养8d发酵产酶；
(3)过滤或离心收集的发酵液清液就是水解棉籽壳的复合酶液。
3.纤维素酶活力测定，详见实施例1。
4.木聚糖酶活力测定，详见实施例1。
5.果胶酶活力测定，详见实施例1。
6.发酵液残糖测定，详见实施例1。
7.粗酶液水解棉籽壳，详见实施例1。水解条件为：在pH5.0、50℃、200rpm条件下水浴振荡反应10h，每隔1小时取样测酶解液中还原糖的量。
实验结果见图1-图4，实施例2比实施例1中速效碳(葡萄糖)浓度提高了5倍，但是两者的纤维素酶酶活相差不大(图1)，其果胶酶最大酶活为0.017U/mL，木聚糖酶活力是2.15U/mL。在整个培养产酶过程中，实施例1产的果胶酶和木聚糖酶活力均比实施例2大。
实施例3
1.里氏木霉的种子培养
(1)里氏木霉种子培养基：10g/L葡萄糖，1g/L蛋白胨，终浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液，0.15g/L Tween 80，1.4g/L(NH4)2SO4，2.0g/L KH2PO4，0.3g/L尿素，0.4g/LCaCl2·2H2O，0.3g/L MgSO4·7H2O，0.005g/L FeSO4·7H2O，0.0016g/L MnSO4·H2O，0.0014g/L ZnSO4·7H2O，0.0037g/L CoCl2·6H2O的Mandels培养基，pH4.8-5.0；
(2)以里氏木霉Rut C30为生产菌种，在pH5.0，30℃，200r/min条件下培养36h。
2.里氏木霉发酵产酶
(1)里氏木霉产酶培养基：10g/L葡萄糖，1g/L蛋白胨，终浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液，0.15g/L Tween 80，1.4g/L(NH4)2SO4，2.0g/L KH2PO4，0.3g/L尿素，0.4g/LCaCl2·2H2O，0.3g/L MgSO4·7H2O，0.005g/L FeSO4·7H2O，0.0016g/L MnSO4·H2O，0.0014g/L ZnSO4·7H2O，0.0037g/L CoCl2·6H2O的Mandels培养基，添加2％棉籽壳，pH4.8-5.0；
(2)以10％接种量，未加棉籽壳的培养为对照，在28℃，160r/min条件下培养8d发酵产酶；
(3)过滤或离心收集的发酵液清液就是水解棉籽壳的复合酶液。
3.纤维素酶活力测定，详见实施例1。
4.木聚糖酶活力测定，详见实施例1。
5.果胶酶活力测定，详见实施例1。
6.发酵液残糖测定，详见实施例1。
7.粗酶液水解棉籽壳，详见实施例1。
实验结果见图1-图4，在发酵的前6天，实施例3产的纤维素酶比前两者都低(图1)，但是后期就相差不大了；在培养2天后，其果胶酶酶活力达到最大，为0.026U/mL，均比实施例1和实施例2的高，发酵后期果胶酶趋于平缓，略有下降(图2)。木聚糖酶是三个实施例当中最低的，最高酶活为1.76U/mL(图3)。这可能是由于实施例3中单糖浓度比较高，4天后培养基中残余葡萄糖浓度才几乎接近零(图4)，所以产酶菌不需要利用比较难消化的棉籽壳，从而使得纤维素酶和木聚糖酶的产量都比前两个实施例低。
通过比较实施例1至实施例3的酶活结果可知(见图1、图2和图3)，在里氏木霉培养基中添加棉籽壳可诱导发酵产生降解棉籽壳的复合酶系，用发酵产生的酶液水解棉籽壳，降解效果显著，水解率可达8.1-20.4％(表1)，实施例1产的复合酶降解棉籽壳产生的还原糖浓度最高(图5)；而未加棉籽壳发酵的粗酶液处理效果远不如诱导发酵产生的酶液。此外，发酵培养基中的碳氮比和葡萄糖与棉籽壳的比例也会影响到纤维素酶和木聚糖酶的产量，生产中可以根据需要调整碳氮比例以及葡萄糖与棉籽壳的比例以获得最佳的酶系。如表1，初始糖浓比较低时(实施例1)，可以得到较高的木聚糖酶，降解棉籽壳的效果也最好。
表1棉籽壳水解效果比较
| 水解率(％) | 还原糖得率(％) | |
| 实施例1 | 20.4 | 23.4 |
| 实施例2 | 12.6 | 13.7 |
| 实施例3 | 8.1 | 8.1 |
实施例4
1.里氏木霉的种子培养
(1)里氏木霉种子培养基：10g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，终浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液，0.15g/L Tween 80，1.4g/L(NH4)2SO4，2.0g/L KH2PO4，0.3g/L尿素，0.4g/LCaCl2·2H2O，0.3g/L MgSO4·7H2O，0.005g/L FeSO4·7H2O，0.0016g/L MnSO4·H2O，0.0014g/L ZnSO4·7H2O，0.0037g/L CoCl2·6H2O的Mandels培养基，pH4.8-5.0；
(2)以里氏木霉Rut C30为生产菌种，在pH5.0，25℃，120r/min条件下培养24h。
2.里氏木霉发酵产酶
(1)里氏木霉产酶培养基：10g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，终浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液，0.15g/L Tween 80，1.4g/L(NH4)2SO4，2.0g/L KH2PO4，0.3g/L尿素，0.4g/LCaCl2·2H2O，0.3g/L MgSO4·7H2O，0.005g/L FeSO4·7H2O，0.0016g/L MnSO4·H2O，0.0014g/L ZnSO4·7H2O，0.0037g/L CoCl2·6H2O的Mandels培养基，添加2％棉籽壳，pH4.8-5.0；
(2)以5％接种量，未加棉籽壳的培养为对照，在30℃，250r/min条件下培养4d发酵产酶，培养过程中通过添加相对发酵培养基1～2％的棉籽壳进一步诱导产酶；
(3)过滤或离心收集的发酵液清液就是水解棉籽壳的复合酶液。
3.纤维素酶活力测定，详见实施例1。
4.木聚糖酶活力测定，详见实施例1。
5.果胶酶活力测定，详见实施例1。
6.发酵液残糖测定，详见实施例1。
7.粗酶液水解棉籽壳，详见实施例1。
Claims (5)
1.一种可降解棉籽壳的复合酶，其组分主要包括：纤维素酶、木聚糖酶以及果胶酶；所述的复合酶由以下方法制得，包括：
将里氏木霉种子接种到种子培养基于25～30℃，120～250r/min条件下培养24～48小时，以4～10%接种量转接至含2%棉籽壳的发酵培养基产酶，培养过程中通过添加相对发酵培养基1～2%的棉籽壳进一步诱导产酶，在25～30℃，120～250 r/min条件下培养4～8天，过滤，离心得粗酶液；所述的里氏木霉种子是里氏木霉Rut C30，购自美国ATCC，编号ATCC 56765；
其中，种子培养基包含：1%葡萄糖，0.1%蛋白胨，0.05%柠檬酸，0.015%Tween 80，2%Vogel’s mediumN的Vogel培养基，pH5.0；或者是包含1%葡萄糖，0.1%蛋白胨，终浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液，0.015%Tween 80，0.14%(NH4)2SO4，0.2%KH2PO4，0.03%尿素，0.04%CaCl2·2H2O，0.03%MgSO4·7H2O，0.0005%FeSO4·7H2O，0.00016%MnSO4·H2O，0.00014%ZnSO4·7H2O，0.00037%CoCl2·6H2O的Mandels培养基，pH4.8-5.0；
发酵培养基包含：0.1~0.5%葡萄糖，0.1%蛋白胨，0.05%柠檬酸，0.015%Tween 80，2%Vogel’s mediumN，添加2%棉籽壳，pH5.0；或者是包含1%葡萄糖，0.1%蛋白胨，终浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液，0.015%Tween 80，0.14%(NH4)2SO4，0.2%KH2PO4，0.03%尿素，0.04%CaCl2·2H2O，0.03%MgSO4·7H2O，0.0005%FeSO4·7H2O，0.00016%MnSO4·H2O，0.00014%ZnSO4·7H2O，0.00037%CoCl2·6H2O的Mandels培养基，添加2%棉籽壳，pH4.8-5.0。
2.如权利要求1所述的一种可降解棉籽壳的复合酶的制备方法，包括：
里氏木霉降解棉籽壳酶系的发酵制备：
将里氏木霉种子接种到种子培养基于25～30℃，120～250r/min条件下培养24～48小时，以4～10%接种量转接至含2%棉籽壳的发酵培养基产酶，培养过程中通过添加相对发酵培养基1～2%的棉籽壳进一步诱导产酶，在25～30℃，120～250 r/min条件下培养4～8天，过滤，离心得粗酶液；所述的里氏木霉种子是里氏木霉Rut C30，购自美国ATCC，编号ATCC 56765；
其中，种子培养基包含：1%葡萄糖，0.1%蛋白胨，0.05%柠檬酸，0.015%Tween 80，2%Vogel’s mediumN的Vogel培养基，pH5.0；或者是包含1%葡萄糖，0.1%蛋白胨，终浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液，0.015%Tween 80，0.14%(NH4)2SO4，0.2%KH2PO4，0.03%尿素，0.04%CaCl2·2H2O，0.03%MgSO4·7H2O，0.0005%FeSO4·7H2O，0.00016%MnSO4·H2O，0.00014%ZnSO4·7H2O，0.00037%CoCl2·6H2O的Mandels培养基，pH4.8-5.0；
发酵培养基包含：0.1~0.5%葡萄糖，0.1%蛋白胨，0.05%柠檬酸，0.015%Tween 80，2%Vogel’s mediumN，添加2%棉籽壳，pH5.0；或者是包含1%葡萄糖，0.1%蛋白胨，终浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液，0.015%Tween 80，0.14%(NH4)2SO4，0.2%KH2PO4，0.03%尿素，0.04%CaCl2·2H2O，0.03%MgSO4·7H2O，0.0005%FeSO4·7H2O，0.00016%MnSO4·H2O，0.00014%ZnSO4·7H2O，0.00037%CoCl2·6H2O的Mandels培养基，添加2%棉籽壳，pH4.8-5.0。
3.如权利要求2所述的一种可降解棉籽壳的复合酶的制备方法，其特征在于：所述的棉籽壳为40目筛截留下的，目数小于40目。
4.如权利要求2所述的一种可降解棉籽壳的复合酶的制备方法，其特征在于：在发酵培养基产酶过程中，采用的是间歇分批式、连续培养式或分批补料式的培养方法。
5.如权利要求1所述的复合酶在水解棉籽壳中的应用，包括：
用发酵获得的粗酶液水解棉籽壳，在10 mL粗酶液原液或者经1~8倍稀释的酶液中加入1g棉籽壳，在pH3.0-5.0、40-60℃、100-200 rpm条件下水浴振荡反应10h。
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