CN101967148B

CN101967148B - 新的18F取代对甲苯磺酰氧基标记的吡唑并[1,5-a]嘧啶类化合物及制备和应用

Info

Publication number: CN101967148B
Application number: CN200910157360.1A
Authority: CN
Inventors: 齐传民; 刘航; 李桂霞; 贺勇; 许荆立; 丁瑞; 张淑婷; 王潇; 冯曼
Original assignee: Beijing Normal University
Current assignee: Beijing Normal University
Priority date: 2009-07-28
Filing date: 2009-07-28
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2029-07-28
Also published as: CN101967148A

Abstract

本发明设计了一类新型以对甲苯磺酰氧基为标记位点进行¹⁸F标记的吡唑并[1，5-a]嘧啶类化合物，其特征在于：具有母体结构3-氰基吡唑并[1，5-a]嘧啶，其5位有取代基R，分别是甲基、氯甲基，其7位胺基通过碳原子数为n的碳链与氟-18相连，其结构如式A。该种化合物合成简单、标记简单易操作。该种化合物能在肿瘤组织维持较大浓度和较长时间，而在正常组织和血液中摄取低或清除快。尤其具有很高的肿瘤/血液比值和肿瘤/肌肉组织比值。本发明还涉及该种化合物作为PET脑肿瘤显像剂的应用。

R＝CH₃，CH₂Cln＝2，3式A。

Description

新的18F取代对甲苯磺酰氧基标记的吡唑并[1,5-a]嘧啶类化合物及制备和应用

技术领域：

本发明涉及一类新的以对甲苯磺酰氧基为离去基团进行¹⁸F标记的吡唑并[1，5-a]嘧啶类化合物及其化学制备方法和作为正电子发射断层显像(PET)的肿瘤(尤其是脑肿瘤)显像剂的应用。

背景技术：

肿瘤的早期诊断是当今医学的一大热点，而正电子发射断层显像(PET)作为一种越来越普及的手段受到极大重视，因而肿瘤的早期诊断的突破有赖于PET肿瘤显像剂的开发。

放射性核素¹⁸F因为其优良的核素性质，非常适合作为PET的显像核素。

肿瘤的发生与细胞周期直接相关。细胞周期蛋白E与细胞周期依赖性蛋白激酶2(CyclinE-CDK₂)复合物在细胞周期G₁/S期的转换点直接相关，是多种癌基因的下游靶点基因，在许多肿瘤发生中起关键作用。临床研究发现CDK₂在肿瘤细胞中有过量表达，其在肿瘤细胞中的含量与在正常组织细胞中的含量有明显差异。

吡唑并[1，5-a]嘧啶类化合物是一类新型的CDK₂抑制剂，是近年来抗肿瘤药物的研究热点之一。由于CDK₂单晶结构的测定，吡唑并[1，5-a]嘧啶类化合物作用于CDK₂的构效关系已较为明确，对这种CDK₂小分子抑制剂的研究已经到了比较成熟的阶段。虽然¹⁸F标记的吡唑并[1，5-a]嘧啶类化合物作为PET肿瘤显像剂的研究尚未见报道，但是CDK₂在肿瘤细胞中有过量表达，作为CDK₂抑制剂的吡唑并[1，5-a]嘧啶类化合物进行¹⁸F标记后，有其成为特异性和靶向性PET肿瘤显像剂的潜在可能性。

发明内容：

第一、本发明提供了肿瘤摄取高、特异性好的放射性¹⁸F标记的吡唑并[1，5-a]嘧啶类化合物。

其特征在于：具有母体结构3-氰基吡唑并[1，5-a]嘧啶，其5位有取代基R，分别是甲基、氯甲基，

其7位胺基通过碳原子数为n的碳链与氟-18相连，其结构如式A：

其制备主要分为标记前体化合物的合成及前体化合物的¹⁸F标记和后处理两个部分。具体步骤如下：

一.标记前体化合物(式B)的合成

1.1吡唑并[1，5-a]嘧啶母核(式C中标号4)的合成，合成路线如式C：

式C

1.1.1乙氧亚甲基丙二睛(式C中标号1)的合成：

将丙二睛9.9g(150mmol)、原甲酸三乙酯33.3g(225mmol)和醋酸酐38.4g(376.5mmol)加入到250ml单口烧瓶中。回流反应6h后，冷却，加入活性炭后加热回流30min，热过滤，用热乙醇洗涤滤饼后，滤液置于冰箱中过夜，抽滤得淡黄色片状晶体，产率84％。

1.1.2 3-氨基-4-氰基吡唑(式C中标号2)的合成：

乙氧亚甲基丙二睛(式C中标号1)15g(123mmol)在室温下缓慢加入到85％水合肼12ml(248mmol)中，水浴加热反应一小时，在反应体系中加入10ml水。冰箱中放置过夜，抽滤，水洗滤饼，烘干得淡黄色固体，产率81％。

1.1.3 3-氰基-5-(氯)甲基-7-羟基吡唑并[1，5-a]嘧啶(式C中标号3)的合成：

将3-氨基-4-氰基吡唑(式C中标号2)4g(37mmol)和(氯)乙酰乙酸乙酯38mmol加入33ml冰乙酸中，回流反应4h。反应完毕后冷却至室温，过滤，依次用冰醋酸和水淋洗滤饼各3次，得黄色固体。用乙酸乙酯重结晶得到纯品。

1.1.4 3-氰基-5-(氯)甲基-7-氯吡唑并[1，5-a]嘧啶(式C中标号4)的合成：

在250ml的四颈瓶中加入3-氰基-5-(氯)甲基-7-羟基吡唑并[1，5-a]嘧啶(C中标号3)9.95mmol后，加入吡啶0.82ml(10.55mmol)后，缓慢滴加三氯氧磷4.05ml(43.2mmol)，加毕缓慢加热至85℃后开始搅拌，于120℃反应1h。冷却至60℃以下后加入氯仿150ml。回流反应1h。冷却至0-5h加入冷水90ml，抽滤除去不溶物，分出有机相，水洗两次，每次水90ml。悬蒸除去氯仿后得固体3-氰基-5-(氯)甲基-7-氯吡唑并[1，5-a]嘧啶(式C中标号4)。

1.2对母核的支链进行修饰，合成标记前体化合物(式B)，合成路线如式D：

式D

1.2.1式D中化合物5的合成：

将3-氰基-5-(氯)甲基-7-氯吡唑并[1，5-a]嘧啶(5)2mmol加入到碳链长度为n的醇胺4mmol的12ml乙醇溶液中，加热回流反应4h，TLC显示反应结束后，旋蒸除去溶剂，得絮状固体，用甲醇和乙醚的混合溶剂重结晶，得产物晶体。

1.2.2式D中化合物6(标记前体化合物)的合成：

将3-氰基-5-(氯)甲基-7-(2-羟基乙基氨基)吡唑并[1，5-a]嘧啶(7)lmmol加入到20ml重蒸CH₂Cl₂中，冰浴下加入TEA 0.21ml(1.5mmol)，并与冷却到0℃以下后，加入DMAP 0.03g(0.2mmol)和纯化处理过的TsCl 0.29g(1.5mmol)，继续低温反应30min后升至室温反应过夜。TLC显示反应完全之后，抽滤得产物固体，用乙腈重结晶。

二.¹⁸F目标化合物(式A)的放射化学合成

前体化合物的¹⁸F标记，标记路线如式E：

式E

¹⁸F^-被阴离子柱QMA捕获后，用含10mg K2.2.2和3mg K₂CO₃的lmL乙腈和0.5mL水的混合液将其冲洗到反应瓶中，向反应瓶中加入0.5mL的无水乙腈，加热到100℃，不断的通入氮气，利用乙腈和水共沸除水，待将溶剂吹干后，再分别加入0.5mL的无水乙腈，重复此操作两次，将5mg前体化合物(式B)溶于1.5mL无水乙腈并加入反应瓶中，适当降低温度(保持在乙腈沸点以上)，密闭反应容器，维持该温度反应30min左右，停止反应，加入大约10mL水将反应体系稀释，再通过Sep-Pak C18柱，将滤液收集到1号瓶中(主要是没有参与反应的¹⁸E^-)，然后再用10ml水洗涤柱子，将滤液收集到2号瓶中(确保将没有参与反应的¹⁸F^-彻底淋洗干净)，用氮气将Sep-Pak C18柱吹干，用2ml乙腈洗涤C18柱，将滤液收集到3号瓶中，得到¹⁸F标记产物，HPLC纯化后，放射化学纯度＞99％。

第二、本发明上述¹⁸F标记对硝基苯甲酰基氨基酸衍生物物作为PET肿瘤显像剂的应用。

本发明具有以下优良特性：

1)本发明中用于进行¹⁸F标记前体化合物合成简便，原料廉价易得。标记总时间短，有效放射性损失少。

2)本发明的¹⁸F标记的化合物具有适宜肿瘤显像，特别是脑肿瘤显像的优良生物性能。主要有以下几点：

2.1本发明的化合物在血液、肌肉组织和脑内清除速率很快，在肿瘤中有较高初始摄取且清除相对较慢，在其它脏器中初始摄取低或清除很快，从而能在注射后较短时间达到一个肿瘤/背景高比值的时段，尤其是在半小时和一小时之间，肿瘤和相关组织的比值较大，有实验为证：

按实施例制得的¹⁸F标记化合物的乙腈溶液，用氮气吹干乙腈，再用生理盐水将产物稀释为8-10μCi/0.1mL作为注射液。取出三份0.1mL的注射液，分别加入9.9mL生理盐水，混匀后，从每份中分别再取出0.1mL，作为标准溶液，待测定小鼠各组织和脏器的放射性计数的同时测定其放射性计数，取平均值即1％ID使用。

将昆明鼠随机分为五组，每组3只。从尾静脉注射¹⁸F标记产物的注射液0.1mL(8-10μCi)，分别于注射后的5min、15min、30min、60min、120min将各组小鼠断头处死，将其迅速解剖，取脑、心、肝、肺、肾、后腿骨、肌肉、小肠、大肠、脾、血液、肿瘤等组织和脏器，擦干后称重，并测量其各自的放射性计数，计算出其各组织和脏器的放射性摄取量％ID/g，每次实验取三组平行数据。

实施例中¹⁸F标记产物(式A中R＝CH₃、n＝2)实验结果如表1所示：

表1¹⁸F标记产物(式A中R＝CH₃、n＝2)的荷S180瘤小鼠的体内生物分布数据

(％ID/g±SD，n＝3)

整理后得到的该¹⁸F标记产物各时项肿瘤与正常组织比值如表2：

表2¹⁸F标记产物(式A中R＝CH₃、n＝2)的荷S180瘤小鼠体内的肿瘤/正常组织比值

以上数据显示，该¹⁸F标记产物在各个组织和器官都有较大的吸收。但是非靶组织中的摄取量随着时间的推移，都有逐渐较少的趋势。其中，肝脏和肾脏在5min都显示出了最高的放射性活度摄取量即6.99％ID/g和7.93％ID/g，在60min时只有2.45％ID/g和2.58ID％/g的绝对摄取量，即34％和32％的放射性活度残留，显示了较好的代谢速率。肿瘤中的初始摄取量较小，但是随时间推移而变大，在30min时达到峰值5.51ID％/g，随后再慢慢变小，显示了肿瘤中较好的滞留效果。另外在放射性初始摄取较为浓集的心、肺等非靶组织和器官中，该化合物都具有很好的清除速率与效果。但是血液中清除速率较慢，且大、小肠中的摄取量异常偏大，且代谢速率较慢，这可能是因为，该放射性标记物的酯水分配系数所决定。该化合物的酯水分配系数为0.68，而文献显示的肠道吸收最佳的酯水分配系数为0.5-2。尽管如此，该¹⁸F标记产物在30min时不仅出现了放射性活度摄取量峰值5.51ID％/g，而且是该时相下除小肠(放射性活度摄取量峰值6.86ID％/g)外，所有器官中放射性活度绝对摄取最大的组织(各器官或组织放射性活度绝对摄取值对比如Figure 31所示)。说明该¹⁸F标记产物有可能成为PET全身PET肿瘤显像剂，而30min可以作为该 ¹⁸F标记产物PET肿瘤显像的首选时间。

2.2与目前技术相比，本发明的¹⁸F标记化合物具有创新性，体现在生物性能一些方面的明显的优势，举例如下：

2.2.1与目前临床上PET肿瘤显像应用最广泛的¹⁸F-FDG相比，本发明的¹⁸F标记化合物在肿瘤与脑正常组织的区分上，有一些方面的优势。有实验为证：

按2.1相同实施方法进行¹⁸F-FDG的荷瘤小鼠体内分布实验，整理数据后得到的¹⁸F-FDG的肿瘤/脑比值和肿瘤/肉比值如表3所示：

表3¹⁸F-FDG在荷S180瘤小鼠体内的肿瘤/脑和肿瘤/肉比值

对比表2、表3可以看出：本发明的¹⁸F标记化合物比¹⁸F-FDG的肿瘤/正常脑组织区分度好；本发明的 ¹⁸F标记化合物比¹⁸F-FDG的肿瘤/正常肌肉组织区分度好，可能在外周肿瘤显像上也有一定潜力。

2.2.2与目前具有很大应用潜力的PET肿瘤显像剂¹⁸F-FET相比，本发明的¹⁸F标记化合物在肿瘤与正常组织的区分上，也有明显优势。有实验为证：

按2.1相同实施方法进行¹⁸F-FET的荷瘤小鼠体内分布实验，整理数据后得到的¹⁸F-FDG的肿瘤/正常组织(选取对显像效果影响最明显的脑、血和肌肉组织)比值如表4所示：

表4¹⁸F-FET在荷S180瘤小鼠体内的肿瘤/正常组织比值

对比表2、表4可以看出，本发明的¹⁸F标记化合物在30-60min区段肿瘤/脑、肿瘤/血比值明显高于 ¹⁸F-FET相应值，但是肿瘤/脑比值不如¹⁸F-FET相应值。这使得本发明的¹⁸F标记化合物进行外周肿瘤显像特别可能得到比¹⁸F-FDG更高质量的图像，但对于脑肿瘤显像不具备特别的优势。

综上所述，本发明所提供的¹⁸F标记吡唑并[1，5-a]嘧啶类化合物与现有技术相比，在肿瘤与某些正常组织的对比上，具有一定优势，具有作为外周肿瘤显像剂的潜力，又具有制备简单、标记步骤短、耗时少的特点。

具体实施方式：

以下通过具体实施方式可以使本发明得到更清楚的说明，但本发明并不局限于以下实施例。

实施例

按照以下步骤制备的是式A中R₁＝H、R₂＝2-氟18-4-硝基、n＝1的化合物，包括标记前体(式B中R₁＝H、R₂＝2-氟18-4-硝基、n＝1的化合物)的合成和前体化合物的¹⁸F标记两个部分。

1)标记前体(式B中R₁＝H、R₂＝2-氟18-4-硝基、n＝1化合物)的合成

1.1乙氧亚甲基丙二睛的合成，见式F：

式F

1.2 3-氨基-4-氰基吡唑的合成，见式G：

式G

乙氧亚甲基丙二睛15g(123mmol)在室温下缓慢加入到85％水合肼12ml(248mmol)中，水浴加热反应一小时，在反应体系中加入10ml水。冰箱中放置过夜，抽滤，水洗滤饼，烘干得淡黄色固体，产率81％。

1.3 3-氰基-5-甲基-7-羟基吡唑并[1，5-a]嘧啶的合成，式H：

式H

将3-氨基-4-氰基吡唑4g(37mmol)和乙酰乙酸乙酯5g(4.2ml，38mmol)加入33ml冰乙酸中，回流反应4h。反应完毕后冷却至室温，过滤，依次用冰醋酸和水淋洗滤饼各3次，得黄色固体。用乙酸乙酯重结晶得到纯品，产率78％。

1.4 3-氰基-5-甲基-7-氯吡唑并[1，5-a]嘧啶的合成，见式I：

式I

在250ml的四颈瓶中加入3-氰基-5-甲基-7-羟基吡唑并[1，5-a]嘧啶1.67g(9.95mmol)后，加入吡啶0.82ml(10.55mmol)后，缓慢滴加三氯氧磷4.05ml(43.2mmol)，加毕缓慢加热至85℃后开始搅拌，于120℃反应1h。冷却至60℃以下后加入氯仿150ml。回流反应1h。冷却至0-5h加入冷水90ml，抽滤除去不溶物，分出有机相，水洗两次，每次水90ml。悬蒸除去氯仿后得橙黄色固体3-氰基-5-甲基-7-氯吡唑并[1，5-a]嘧啶(式C中标号4)，产率87％。

1.5 3-氰基-5-甲基-7-(2-羟基-乙氨基)吡唑并[1，5-a]嘧啶的合成，见式J：

式J

将3-氰基-5-甲基-7-氯吡唑并[1，5-a]嘧啶(5)0.38mg(2mmol)加入到乙醇胺0.24ml(4mmol)的12ml乙醇溶液中，加热回流反应4h，TLC显示反应结束后，旋蒸除去溶剂，得黄色絮状固体，用甲醇和乙醚的混合溶剂重结晶，得紫色晶体，产率54％。mp：192-194℃；IR(KBr)υ(cm^-1)：3267.9，3093.1，2928.2，2222.0，1627.5，1588.6，1533.6，1452.0，1314.7，1193.9，1070.4；¹H-NMR(DMSO，400MHz)δ(ppm)：8.55(s，1H，Pyrazole-H)，8.19-8.16(m，1H，-NHCH₂-)，6.41(s，1H，Pyrimidine-H)，4.89-4.86(m，1H，OHCH₂-)，3.63-3.60(m，2H，OHCH₂CH₂-)，3.46-3.42(m，2H，OHCH₂CH₂-)，2.43(s，3H，-CH₃)；¹³C-NMR(DMSO，100MHz)δ(ppm)：162.51，150.46，147.34，146.09，114.41，88.60，77.70，59.19，44.05，24.36；MS(EI)m/z：217.10，found：217.16[M]⁺；Anal.calcd for C₁₀H₁₁N₅O：C 55.29，H 5.10，N 32.24，found：C 55.33，H 5.29，N32.12.

1.62-(3-氰基-5-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶7-氨基)乙基对甲苯磺酸酯的合成，见式K：

式K

将3-氰基-5-甲基-7-(2-羟基乙基氨基)吡唑并[1，5-a]嘧啶(7)0.22mg(1mmol)加入到20ml重蒸CH₂Cl₂ 中，冰浴下加入TEA 0.21ml(1.5mmol)，并与冷却到0℃以下后，加入DMAP 0.03g(0.2mmol)和纯化处理过的TsCl 0.29g(1.5mmol)，继续低温反应30min后升至室温反应过夜。TLC显示反应完全之后，抽滤得淡黄色固体，用乙腈重结晶，产率45％。mp：大于250℃分解变黑；IR(KBr)υ(cm^-1)：3444.4，3320.3，3110.3，2948.1，2223.2，1615.8，1581.1，1531.3，1448.4，1351.1，1313.6，1174.6，1006.6；¹H-NMR(DMSO，400MHz)δ(ppm)：8.54(s，1H，Pyrazole-H)，8.31-8.28(m，1H，-NHCH₂-)，7.49(d，2H，J＝8.2Hz，Ar-H)，6.98(d，2H，J＝8.1Hz，Ar-H)，6.21(s，1H，Pyrimidine-H)，4.26(t，2H，J＝4.8Hz，-OCH₂CH₂-)，3.63-3.59(m，2H，-NHCH₂CH₂-)，2.36(s，3H，-CH₃)，2.36(s，3H，-CH₃)；¹³C-NMR(DMSO，100MHz)δ(ppm)：162.42，150.25，146.31，145.95，144.50，131.58，129.24，127.18，114.34，88.40，77.91，67.76，59.70，24.33，20.87；MS(EI)m/z：371.1，found：372.1[M+H]⁺；Anal.calcd for C₁₇H₁₇N₅O₃S：C 54.97，H 4.61，N 18.86，found：C 55.03，H4.78，N 18.55.

2)前体2-(3-氰基-5-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶7-氨基)乙基对甲苯磺酸酯的标记的¹⁸F标记，见式L：

式L

¹⁸F^-被阴离子柱QMA捕获后，用含10mg K2.2.2和3mg K₂CO₃的1mL乙腈和0.5mL水的混合液将其冲洗到反应瓶中，向反应瓶中加入0.5mL的无水乙腈，加热到100℃，不断的通入氮气，利用乙腈和水共沸除水，待将溶剂吹干后，再分别加入0.5mL的无水乙腈，重复此操作两次，将5mgN-(2-(3-氰基-5-甲基吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-氨基)乙基-2，4-二硝基苯甲酰胺溶于1.5mL无水乙腈加入反应瓶中适当降低温度(保持在乙腈沸点以上)，密闭反应容器，维持该温度反应30min左右，停止反应，加入大约10mL水将反应体系稀释，再通过Sep-Pak C18柱，将滤液收集到1号瓶中(主要是没有参与反应的¹⁸F^-)，然后再用10mL水洗涤柱子，将滤液收集到2号瓶中(确保将没有参与反应的¹⁸F^-彻底淋洗干净)，用氮气将Sep-Pak C18柱吹干，用2mL乙腈洗涤C18柱，将滤液收集到3号瓶中，得到¹⁸F标记产物3-氰基-5-甲基-7-(2-氟-18-乙基氨基)吡唑并[1，5-a]嘧啶，经HPLC(带放射性探头)分离纯化(HPLC条件：流速5mL/min，流动相为乙腈∶水＝70％∶30％，保留时间为3.1min)。

脂水分配系数是生物活性化合物的一项重要理化参数，对2-(2-氟18-4-二硝基)苯甲酰胺基-3-甲基丁酸脂水分配系数测定实施如下：

在离心试管中依次加入2ml正辛醇和1.9mL pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液，以及放射性活度约为8-10μCi的3-氰基-5-甲基-7-(2-氟-18-乙基氨基)吡唑并[1，5-a]嘧啶的0.1mL水溶液，充分振荡后离心分层5min，分别取有机相和水相各0.1mL于干净试管中，分别测定其放射性计数N，计算分配系数P＝N_有/N_水，重复本操作3次后取平均值，对P取对数，logP即为该¹⁸F标记产物的脂水分配系数。测得3-氰基-5-甲基-7-(2-氟-18-乙基氨基)吡唑并[1，5-a]嘧啶的脂水分配系数为0.68。

异常毒性检查：

按中华人民共和国药典2005年版所述方法进行。将10只正常昆明小鼠(18-20g)尾静脉注入0.5mL(37MBq)3-氰基-5-甲基-7-(2-氟-18-乙基氨基)吡唑并[1，5-a]嘧啶注射液(相当于数百倍于成人用量)，观察48小时。小鼠生长正常，无死亡及不良反应现象发生。解剖后观察，未见任何器官损伤。异常毒性检查符合放射性药物质量要求。

Claims

1.一种新的¹⁸F标记吡唑并[1，5-a]嘧啶类化合物，其特征是：具有母体结构3-氰基吡唑并[1，5-a]嘧啶，其5位有取代基R，分别是甲基、氯甲基，其7位胺基通过碳原子数为n的碳链与氟-18相连，其结构如式A：

2.权利要求1所述的¹⁸F标记吡唑并[1，5-a]嘧啶类化合物的前体化合物，其特征是：具有母体结构3-氰基吡唑并[1，5-a]嘧啶，其5位有取代基R，分别是甲基、氯甲基，其7位胺基通过碳原子数为n的碳链与对甲苯磺酰氧基相连，其结构如式B：

3.权利要求1所述的¹⁸F标记吡唑并[1，5-a]嘧啶类化合物在制备正电子发射断层显像肿瘤显像剂中的应用。