CN101955912B

CN101955912B - 具有骨转移特性的中国人肺腺癌细胞株

Info

Publication number: CN101955912B
Application number: CN2009100547402A
Authority: CN
Inventors: 杨顺芳
Original assignee: Shanghai Chest Hospital
Current assignee: Shanghai Chest Hospital
Priority date: 2009-07-14
Filing date: 2009-07-14
Publication date: 2012-02-22
Anticipated expiration: 2029-07-14
Also published as: CN101955912A

Abstract

本发明属微生物动物细胞系领域。本发明采用肺腺癌首诊患者的胸水作细胞原代培养，该人肺腺癌细胞保藏编号：CGMCC No.3139，分类命名：人肺腺癌细胞系CPA-Yang5，具有肱骨转移骨转移，细胞形态完整，呈椭圆形或部分梭形，细胞经肺原位接种后在核素骨显像能检测出骨转移，X线不能检出，荷瘤CPA-Yang5小鼠骨转移病理特征典型，首次转移时间短、速度快的生物学特性。本发明是一个较好的人肺腺癌的转移研究的细胞模型，在揭示人肺腺癌的骨转移机制和抗转移药物筛选的应用中将有着广阔的前景。

Description

具有骨转移特性的中国人肺腺癌细胞株

技术领域

本发明属生物技术、微生物动物细胞系领域，具体涉及一种具有骨转移潜能的中国人肺腺癌细胞株及其用途。

背景技术

肺癌是严重威胁人类生存和发展的恶性疾病之一，已成为肿瘤疾病中的头号杀手。2006年，美国确诊肺癌新病例约174470人，约占全部肿瘤的13％(男性)和12％(女性)，发病率仅次于皮肤癌；死于肺癌者约162460人，约占全部肿瘤的31％(男性)和26％(女性)，死亡率位居第一^[1～2]。日本每年肺癌新发病例超过50000人，死亡率近90％^[3]。上海市近年的恶性肿瘤发病调查显示，肺癌(21.56％)高居上海男性恶性肿瘤发病率榜首，在女性则仅次于乳腺癌^[4]。肺癌死亡率长期居高不下的主要原因在于难以早期诊断和它的高转移性，许多患者首诊时即发现有多器官转移^[3]。骨转移占肺癌病人的30～70％，仅次于乳腺癌和前列腺癌^[5～7]。超过1/3的患者会发展成溶骨性病变，引起疼痛、病理性骨折、脊髓压迫和高钙血症。使患者的生活质量严重下降，最后导致死亡，病程一般不超过6个月^[3，8]。由于肺癌骨转移的生物学机制至今尚不明确，临床缺乏有效的治疗方法，因此，研究肺癌骨转移发病机制并探索有效的诊疗方法是国内外学者长期以来的努力方向。尽管随着分子生物学、信号传导途径、蛋白功能研究等基础学科的发展，人类对疾病发病机理的研究手段有了突飞猛进的发展，但由于种种客观限制，该领域的研究仍未有重要突破。

虽然宿主微环境因素，包括破骨细胞以及一些具有生长因子功能的基质蛋白等对肿瘤的转移具有一定的作用^[3，9～10]。肿瘤细胞自身生物学特性无疑是骨转移发生更为主要而直接的原因。

由于肺癌骨转移的发生大多见于晚期的手术禁忌患者，临床标本取材受限，这在很大程度上迟滞了肺癌骨转移诊疗研究的进展。因此，如能建立有效的人肺癌转移细胞模型，这不仅能更接近人类本身的生物学特性，而且所建的人肺腺癌细胞模型可以更有效地发现人肺腺癌骨转移的肿瘤生物学特性，，进而利用所建细胞模型研发相关的功能基因，直接进行干预性治疗研究或将与病人相对应的转移细胞灭活作为抗原做生物免疫治疗，其优越性是临床标本及其他模型所难以企及的。

肿瘤转移动物模型的理论基础在于肿瘤细胞体内自发转移大多具有相对固定的靶组织。经研究发现，这一特性是由肿瘤组织中少量亚群细胞所决定的。在一定的条件下，该类细胞会按相对固定的模式在特定靶组织形成肿瘤转移灶。因此，以肿瘤细胞株反复多代接种免疫缺陷动物筛选后，此类亚群细胞得到有效的富集，靶组织转移率渐进升高。但是本发现和建立的人肺腺癌细胞经动物实验证实该亲代细胞已具有仅限于骨转移的生物学特性，这将有助于提升肺癌转移的基础研究水平和临床诊疗水平。与本发明相关的现有技术有(已引入上文中)：

参考文献

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发明内容

本发明的目的是提供一种具有骨转移特性的中国人肺腺癌细胞株(CPA-Yang5)。本发明的进一步目的是提供该肺癌细胞株的医用用途。

本发明采用取自肺腺癌患者(48岁男性，病情已属晚期)的心包积液作细胞原代培养。四天后光镜下发现细胞培养瓶底约有20％的面积已长满细胞，10天后光镜下，发现细胞培养瓶底约有20％的面积已长出细胞，细胞呈贴壁生长；贴壁细胞形态不规则，有园形、梭形。培养初期细胞生长缓慢；细胞形态欠稳定，传至第9代，细胞形态和生长速度未改变。冻存复苏后性状不变。

在相差倒置显微镜下观察CPA-Yang5细胞生长情况：贴壁细胞中不规则梭形(有分叉)和圆形约各占50％。其中梭形细胞都有链接，细胞生长缓慢，可见分裂相，分裂后细胞呈圆形，细胞异质性明显。

该细胞培养至今已20代，仍未见该细胞接种裸小鼠皮下致瘤。但在第十二代时经肺部原位建模方法经原位肺癌小鼠模型核素微孔针孔显像，培养结果显示有肱骨转移细胞，骨转移达到20％(1/5)。骨转移细胞再经肺原位种植后达50％，3个cycles后骨转移达70％。该细胞已于2009年7月2日保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，北京市朝阳区大屯路甲3号，北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101，保藏编号：CGMCC No.3139，分类命名：人肺腺癌细胞系CPA-Yang5(The Chinese Human Lung Adenocarcinoma cell withBone Metastases，CPA-Yang5)。

本细胞株具有以下生物学特性：

1，致瘤率：肱骨转移骨转移达到20％(1/5)

自采集新鲜心包积液做细胞培养至今皮下种植未见致瘤，经本发明改良式肺原位接种能引起肱骨骨转移发生。

2，细胞形态完整，呈椭圆形或部分梭形。

3、CPA-Yang5细胞经肺原位接种后在核素骨显像能检测出小鼠骨转移的情况下X线不能检出。

4，荷瘤CPA-Yang5小鼠骨转移病理特征典型。

5、首次转移时间短、速度快。

本发明提供的的一个具有骨转移潜能的中国人肺腺癌细胞株CPA-Yang5，其生长速度缓慢，细胞形态异常，二十代不致瘤，其中至十二代时经肺原位接种方法使其产生骨转移，但骨转移率仅20％，3个cycles后达到70％。

需要特别强调的是，本发明该细胞取自48岁男性肺腺癌首诊病人的心包积液，病情已属晚期，其放射免疫法检测肿瘤标志物均为强阳性；癌基因及雄激素受体相关基因(AR、SRC、SVIL)检测均呈上调趋势。本发明该细胞的生物学特性的异质性将为人肺腺癌癌症的研究和生物医药的开发提供重要的参考意义。

附图说明

图1是，CPA-Yang5细胞的相差倒置显微镜图，A为×100；B为×200。

图2为CPA-Yang5经肺原位种植方法肺致瘤图，(A)为小鼠肺后位。(B)为小鼠肺前位。

图3是荷瘤CPA-Yang5小鼠肱骨转移灶经原代细胞培养长出的骨转移细胞×100。

图4是荷瘤CPA-Yang5小鼠的X线片。

图5是CPA-Yang5原位接种后小鼠骨转移病理图，A：肱骨，B：腰椎(HE×200)。

图6是荷瘤CPA-Yang5小鼠核素微孔针孔骨显像图(post位)，其中可见胸椎、肱骨转移。

图7是是RT-PCR法比较CPA-Yang5与SPC-A-1部分基因IL-6、IL-8、SRC、CAV1、SVIL、VEGF-C、AR和ECM1的表达水平。

具体实施方式

实施例1

采集新鲜心包积液40毫升，每细胞培养瓶吸8毫升胸水加2毫升不含牛血清的RPMI1640培养液和双抗后稍摇匀，放入培养温度为37℃、CO2浓度为5％的德国贺利氏BB16型二氧化碳孵养箱内培养。四天后光镜下观察时发现细胞培养瓶底约有20％的面积已长满细胞。10天后光镜下观察时发现细胞培养瓶底约有20％的面积已长出细胞。细胞呈贴壁生长；贴壁细胞形态不规则，有园形、梭形。培养初期细胞生长缓慢；细胞形态欠稳定，传至第9代，细胞形态和生长速度未改变。冻存复苏后性状不变。

在相差倒置显微镜下观察CPA-Yang5细胞生长情况：贴壁细胞中不规则梭形(有分叉)和圆形约各占50％。园形细胞贴壁差，但梭形细胞都有链接。细胞生长缓慢，可见分裂相，分裂后细胞呈圆形，细胞异质性明显。胰酶消化后计数2×10⁵细胞加入一细胞培养瓶按常规细胞培养。在相差显微镜下，拍摄细胞生长图片。

实施例2

人肺腺癌细胞(CPA-Yang5)100×10⁴，注入免疫缺陷小鼠血液系统，两周后隔天称重，第三周起每周进行核素骨显像检测，核素骨显像能证实该细胞是高潜能骨转移肺癌细胞。所述的培养基为含10％胎牛血清RPMI1640或DMEM培养基，pH＝7，培养温度为37℃，5％CO₂。

实施例3 CPA-Yang5和SPC-A-1部分基因表达水平的比较

RT-PCR法对国人肺腺癌细胞CPA-Yang5和SPC-A-1进行IL-6、IL-8、SRC、CAV1、SVIL、VEGF-C、AR和ECM1基因表达水平的比较。CPA-Yang4和八十年代初已建的SPC-A-1国人肺腺癌相比，首次转移时间短、速度快。SPC-A-1首次骨转移为2/19且活到120天时才发现。CPA-Yang4以同样方法接种左心室，3周左右出现严重消瘦，奄奄一息。

Claims

1.一种具有骨转移特性的中国人肺腺癌细胞株，其特征是，所述细胞为具有骨转移特性的中国人肺腺癌细胞株CPA-Yang5，保藏编号：CGMCC No.3139，分类命名：人肺腺癌细胞系；具有以下生物学特性：

1)肱骨转移骨转移达到20％；

2)细胞形态完整，呈椭圆形或部分梭形；

3)细胞经肺原位接种后在核素骨显像能检测出骨转移，X线不能检出；

4)荷瘤CPA-Yang5小鼠骨转移病理特征典型；

5)首次转移时间短、速度快。