CN101955455B - 由三孢布拉霉菌发酵生产的天然β-胡萝卜素或蕃茄红素发酵液的样品处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种由三孢布拉霉菌发酵生产的天然β-胡萝卜素或蕃茄红素发酵液的样品处理方法，所述样品处理方法包括以下步骤：定量吸取发酵液置于聚塑试管中，将其在-10℃以下冷冻；自然解冻发酵液，加定量水，超声处理，离心，弃上清液；向上述离心后的发酵液中加无水乙醇，离心，弃上清液；再加乙酸乙酯，45～80℃浸泡，定容过滤后送样检测。本发明工艺流程短，过程易于控制，样品浸泡完全，提取效率高，且使用溶剂毒性小，适于三孢布拉霉菌发酵生产的天然β-胡萝卜素、蕃茄红素发酵液的样品处理。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵液的样品处理方法，尤其是涉及一种由三孢布拉霉菌发酵生产的天然β-胡萝卜素或蕃茄红素发酵液的样品处理方法。
背景技术
类胡萝卜素(包括β-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素等)具有增强免疫、抗氧化等多种重要的生理作用。其中，β-胡萝卜素是一种广泛存在的脂溶性类胡萝卜素，与人体的健康密切相关，不仅具有抗癌、抗氧化、抗辐射等很高的药用价值，而且在人和动物体内可转化为维生素A，是人体必需的维生素A的重要来源。因此，β-胡萝卜素已被作为食品添加剂添加于各种食品中起色素和营养强化剂作用，联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)食品添加剂委员会一致推荐并认定β-胡萝卜素为A类营养色素。另外，其中的蕃茄红素是胡萝卜素的异构体，由于它没有β-胡萝卜素中的β-芷香环结构，不具有维生素A原活性，但它具有很强的抗氧化、防紫外线辐射等功能，是目前自然界发现的最强的抗氧化剂之一。二者不仅对前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等癌细胞具有抑制作用，而且对血管硬化和冠心病均有防治作用，因而在食品、化妆品以及医药领域具有重要用途。现β-胡萝卜素和番茄红素已被广泛用作食品添加剂、医药原料，或者被制成功能性食品。
丝状真菌三孢布拉霉菌(Blakesleatrispora)是国际公认的实现工业化生产天然β-胡萝卜素、蕃茄红素的优良菌种。现已知该发酵菌菌株有正、负两种，一种为诱导菌，另一种为生产菌，当在麦芽汁琼脂培养基上培养48小时时，会形成2～4厘米的不均匀菌斑，正菌株和负菌株只是在培养和形态上稍微有差异，正菌株菌丝呈灰色，负菌株菌丝呈黄色到褐色。但由于它所生产的β-胡萝卜素和蕃茄红素均为胞内产物，所以在样品检测之前通常要采用菌体研磨提取或高速匀浆机匀浆浸泡，所用溶剂毒性大，且容易造成提取不完全。
本发明在对本公司三孢布拉霉菌生产的β-胡萝卜素和蕃茄红素发酵液研究的基础上，开发了一种β-胡萝卜素和蕃茄红素的样品处理方法，此方法快速简便、提取效率高。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供了一种工艺流程短、提取效率高的三孢布拉霉菌发酵生产的天然β-胡萝卜素、蕃茄红素发酵液的样品处理方法。
根据本发明的一方面，本发明提供了一种由三孢布拉霉菌发酵生产的天然β-胡萝卜素或蕃茄红素发酵液的样品处理方法，所述样品处理方法包括以下步骤：
(1)定量吸取所述发酵液置于聚塑试管中，并在-10℃以下冷冻；
(2)自然融解步骤(1)中冷冻后的发酵液，加入定量水，20khz频率以上超声波处理，离心，弃上清液；
(3)向步骤(2)中离心后的发酵液中加入无水乙醇，离心，弃上清液；
(4)向步骤(3)中离心后的发酵液中加入乙酸乙酯，45～80℃浸泡，用于定容过滤检测。
最好，步骤(1)中将装有发酵液的聚塑试管在-10℃以下冷冻至少1小时，其中，聚塑试管的容积为15ml。
最好，步骤(1)中将装有发酵液的聚塑试管在-10～-33℃冷冻1～24小时。
最好，步骤(2)中使用所述超声波处理加水后的发酵液5～25分钟。
最好，步骤(2)中将超声波处理后的发酵液在3000～5000rpm离心10分钟。
最好，步骤(2)中融解后的发酵液的加水量与步骤(1)中定量吸取的所述发酵液体积比为1∶5～10。
最好，步骤(3)中所述无水乙醇与步骤(2)中离心后的发酵液体积比为1∶5～10。
最好，步骤(3)中将添加无水乙醇后的发酵液在3000～5000rpm离心10分钟。
最好，步骤(4)中所述乙酸乙酯与步骤(3)中离心后的发酵液体积比为1∶5～10。
最好，步骤(4)中将加入乙酸乙酯后的溶液在45～80℃浸泡15～50分钟。
本发明提供的三孢布拉霉菌发酵生产的天然β-胡萝卜素、蕃茄红素发酵液的样品处理方法，通过将发酵液冷冻和超声破碎细胞后用无水乙醇脱水，再用乙酸乙酯加热浸泡的方法处理β-胡萝卜素和蕃茄红素的发酵液样品，与现有技术相比，具有以下有益效果：本发明的处理方法工艺流程短，快速简便、过程易于控制，样品浸泡完全，提取效率高，并且处理过程中使用的溶剂毒性较小。
具体实施方式
下面将通过本发明的具体实施例来进一步详细阐述本发明，但实施例不是对本发明的限制。实施例采用同一罐批β-胡萝卜素发酵液进行样品处理比较，蕃茄红素实施例样品比较也为同一罐批发酵液。现有条件实施例：
分别精确吸取2ml β-胡萝卜素发酵液和蕃茄红素发酵液放入50ml聚塑试管中，加入20ml溶液(5ml吡啶用氯仿稀释至1000ml)。用匀浆机(从最小速度逐渐增加至最大速度15000rpm)匀浆3分钟，用15ml+15ml丙酮洗涤器具(包括匀浆机)两次，一同并入50ml聚塑试管中，将聚塑试管放在水平摇床上240rpm振摇60分钟后将该试管中所有液体转入100ml容量瓶，用丙酮洗涤原试管并定容。β-胡萝卜素样品定容过滤稀释后用455nm波长分光光度检测，β-胡萝卜素发酵水平分别为2728，2804，2756，平均2763μg/ml。同理，按上述方法，蕃茄红素样品定容过滤后用HPLC检测，蕃茄红素发酵水平分别为1032、1058、1087，平均为1059μg/ml。
实施例1
定量吸取1ml三孢布拉霉菌发酵的β-胡萝卜素发酵液至15ml聚塑试管中，吸取三份；定量吸取1ml三孢布拉霉菌发酵的蕃茄红素发酵液至15ml聚塑试管中，吸取三份。将试管分别置于-10℃冰箱冷冻1小时，取出自然融解，加入10ml水超声处理5分钟，3000rpm离心10分钟，弃上清，加入5ml无水乙醇，3000rpm离心10分钟，弃上清，加入5ml乙酸乙酯45℃浸泡50分钟，β-胡萝卜素样品定容过滤稀释后用455nm波长分光光度检测，β-胡萝卜素发酵水平分别为2920，2840，3000，平均2920μg/ml。蕃茄红素样品定容过滤后用HPLC检测，蕃茄红素发酵水平分别为1148、1132、1086，平均为1122μg/ml。
实施例2
定量吸取1ml三孢布拉霉菌发酵的β-胡萝卜素发酵液至15ml聚塑试管中，吸取三份；定量吸取1ml三孢布拉霉菌发酵的蕃茄红素发酵液至15ml聚塑试管中，吸取三份。将试管分别置于-10℃冰箱冷冻1小时，取出自然融解，加入10ml水超声处理25分钟，5000rpm离心10分钟，弃上清，加入10ml无水乙醇，5000rpm离心10分钟，弃上清，加入10ml乙酸乙酯45℃浸泡40分钟，β-胡萝卜素样品定容过滤稀释后用455nm波长分光光度检测，β-胡萝卜素发酵水平分别为2884，3020，2926，平均2943μg/ml。蕃茄红素样品定容过滤后用HPLC检测，蕃茄红素发酵水平分别为1157、1179、1084，平均为1140μg/ml。
实施例3
定量吸取1ml三孢布拉霉菌发酵的β-胡萝卜素发酵液至15ml聚塑试管中，吸取三份；定量吸取1ml三孢布拉霉菌发酵的蕃茄红素发酵液至15ml聚塑试管中，吸取三份。将试管分别置于-18℃冰箱冷冻1小时，取出自然融解，加入10ml水超声处理5分钟，5000rpm离心10分钟，弃上清，加入5ml无水乙醇，5000rpm离心10分钟，弃上清，加入10ml乙酸乙酯65℃浸泡25分钟，β-胡萝卜素样品定容过滤稀释后用455nm波长分光光度检测，β-胡萝卜素发酵水平分别为2966，3040，2984，平均2997μg/ml。蕃茄红素样品定容过滤后用HPLC检测，蕃茄红素发酵水平分别为1159、1156、1213，平均为1176μg/ml。
实施例4
定量吸取1ml三孢布拉霉菌发酵的β-胡萝卜素发酵液至15ml聚塑试管中，吸取三份；定量吸取1ml三孢布拉霉菌发酵的蕃茄红素发酵液至15ml聚塑试管中，吸取三份。将试管分别置于-18℃冰箱冷冻24小时，取出自然融解，加入10ml水超声处理5分钟，3000rpm离心10分钟，弃上清，加入10ml无水乙醇，3000rpm离心10分钟，弃上清，加入10ml乙酸乙酯80℃浸泡25分钟，β-胡萝卜素样品定容过滤稀释后用455nm波长分光光度检测，β-胡萝卜素发酵水平分别为3012，2980，2944，平均2979μg/ml。蕃茄红素样品定容过滤后用HPLC检测，蕃茄红素发酵水平分别为1174、1167、1139，平均为1160μg/ml。
实施例5
定量吸取1ml三孢布拉霉菌发酵的β-胡萝卜素发酵液至15ml聚塑试管中，吸取三份；定量吸取1ml三孢布拉霉菌发酵的蕃茄红素发酵液至15ml聚塑试管中，吸取三份。将试管分别置于-33℃冰箱冷冻10小时，取出自然融解，加入10ml水超声处理5分钟，3000rpm离心10分钟，弃上清，加入5ml无水乙醇，3000rpm离心10分钟，弃上清，加入10ml乙酸乙酯80℃浸泡15分钟，β-胡萝卜素样品定容过滤稀释后用455nm波长分光光度检测，β-胡萝卜素发酵水平分别为3016，3004，2976，平均2999μg/ml。蕃茄红素样品定容过滤后用HPLC检测，蕃茄红素发酵水平分别为1183、1203、1175，平均为1188μg/ml。
实施例6
定量吸取1ml三孢布拉霉菌发酵的β-胡萝卜素发酵液至15ml聚塑试管中，吸取三份；定量吸取1ml三孢布拉霉菌发酵的蕃茄红素发酵液至15ml聚塑试管中，吸取三份。将试管分别置于-33℃冰箱冷冻24小时，取出自然融解，加入10ml水超声处理25分钟，3000rpm离心10分钟，弃上清，加入5ml无水乙醇，3000rpm离心10分钟，弃上清，加入5ml乙酸乙酯45℃浸泡50分钟，β-胡萝卜素样品定容过滤稀释后用455nm波长分光光度检测，β-胡萝卜素发酵水平分别为2972，2960，3000，平均2977μg/ml。蕃茄红素样品定容过滤后用HPLC检测，蕃茄红素发酵水平分别为1139、1156、1203，平均为1166μg/ml。
实施例7
定量吸取2ml三孢布拉霉菌发酵的β-胡萝卜素发酵液至15ml聚塑试管中，吸取三份；定量吸取2ml三孢布拉霉菌发酵的蕃茄红素发酵液至15ml聚塑试管中，吸取三份。将试管分别置于-10℃冰箱冷冻1小时，取出自然融解，加入10ml水超声处理5分钟，3000rpm离心10分钟，弃上清，加入10ml无水乙醇，3000rpm离心10分钟，弃上清，加入10ml乙酸乙酯45℃浸泡40分钟，β-胡萝卜素样品定容过滤稀释后用455nm波长分光光度检测，β-胡萝卜素发酵水平分别为2956，2968，2896，平均2940μg/ml。蕃茄红素样品定容过滤后用HPLC检测，蕃茄红素发酵水平分别为1135、1158、1097，平均为1130μg/ml。
实施例8
定量吸取2ml三孢布拉霉菌发酵的β-胡萝卜素发酵液至15ml聚塑试管中，吸取三份；定量吸取2ml三孢布拉霉菌发酵的蕃茄红素发酵液至15ml聚塑试管中，吸取三份。将试管分别置于-33℃冰箱冷冻10小时，取出自然融解，加入10ml水超声处理25分钟，5000rpm离心10分钟，弃上清，加入10ml无水乙醇，5000rpm离心10分钟，弃上清，加入10ml乙酸乙酯80℃浸泡20分钟，β-胡萝卜素样品定容过滤稀释后用455nm波长分光光度检测，β-胡萝卜素发酵水平分别为2996，3008，2984，平均2996μg/ml。蕃茄红素样品定容过滤后用HPLC检测，蕃茄红素发酵水平分别为1167、1138、1159，平均为1155μg/ml。
实施例9
定量吸取2ml三孢布拉霉菌发酵的β-胡萝卜素发酵液至15ml聚塑试管中，吸取三份；定量吸取2ml三孢布拉霉菌发酵的蕃茄红素发酵液至15ml聚塑试管中，吸取三份。将试管分别置于-18℃冰箱冷冻3小时，取出自然融解，加入10ml水超声处理10分钟，4000rpm离心10分钟，弃上清，加入10ml无水乙醇，4000rpm离心10分钟，弃上清，加入10ml乙酸乙酯60℃浸泡30分钟，β-胡萝卜素样品定容过滤稀释后用455nm波长分光光度检测，β-胡萝卜素发酵水平分别为3008，2976，2952，平均2979μg/ml。蕃茄红素样品定容过滤后用HPLC检测，蕃茄红素发酵水平分别为1184、1146、1173，平均为1168μg/ml。
需要声明的是，上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换、或改进。本发明的保护范围以所附权利要求书为准。
Claims (2)
1.一种由三孢布拉霉菌发酵生产的天然β-胡萝卜素或蕃茄红素发酵液的样品处理方法，其特征在于，所述样品处理方法包括以下操作步骤：
(1)定量吸取所述发酵液置于聚塑试管中，并在-10～-33℃冷冻1～24小时；
(2)自然融解步骤(1)中冷冻后的发酵液，加入定量水，20kHz频率以上超声波处理5～25分钟，3000～5000rpm离心10分钟，弃上清液；
(3)向步骤(2)中离心后的发酵液中加入无水乙醇，离心，弃上清液；其中，所述无水乙醇与步骤(2)中离心后的发酵液体积比为1∶5～10，并将添加无水乙醇后的发酵液在3000～5000rpm离心10分钟；
(4)向步骤(3)中离心后的发酵液中加入乙酸乙酯，45～80℃浸泡，用于定容过滤检测；其中，所述乙酸乙酯与步骤(3)中离心后的发酵液体积比为1∶5～10，并将加入乙酸乙酯后的溶液在45～80℃浸泡15～50分钟。
2.根据权利要求1所述的样品处理方法，其特征在于，步骤(2)中融解后的发酵液的加水量与步骤(1)中定量吸取的所述发酵液体积比为1∶5～10。
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