CN101951942A - Mntf肽组合物及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新型运动神经元营养因子(MNTF)及其类似物，其包括能促进神经元生长和存活的组合物。提供了长度为二至六个氨基酸之间的MNTF肽及通过共价连接至另一部分而被修饰的所述MNTF肽的类似物。本文描述了其他实施方式。

Description

MNTF肽组合物及使用方法

本公开内容总的涉及使用MNTF肽及其类似物治疗神经元疾病的组合物及方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求2008年2月21日提交的题为“MNTF肽组合物及使用方法”的美国临时专利申请No.61/066,669的优先权，其内容通过引用整体并入本文。

背景技术

下述包括在理解本公开内容上有用的信息。不承认本文提供的任何信息为现有技术或与现有的公开内容相关，或不承认明确或隐含引用的任何出版物或文件为现有技术。

已发现胚胎运动神经元的存活取决于源自相关的发育中骨骼肌的特定营养物质。已报道某些骨骼肌产生能够通过防止胚胎运动神经元的衰退和随后的自然细胞死亡来增强运动神经元存活和发育的物质。这些物质被广泛称为神经营养因子(NTF)，其为对选定神经元群的存活、生长、维持及功能性能力起促进作用的一类专化蛋白质(例如Chau，R.M.W.，et al.，6 Chin.J Neuroanatomy 129，1990)。

可通过功能性神经组织的急性或进行性丧失来整体或部分表征影响中枢和/或外周神经系统的各种神经退行性、神经肌肉和神经元疾病、疾病或病况。

US 6309877、US 7183373、US 6841531、US 6759389和US 20060052299报道了被称为运动神经元营养因子(MNTF)的特定神经营养因子(NTF)，其具有在运动神经元上发挥营养作用的能力，所述文献内容通过引用整体并入本文。

发明概述

本文所述内容为具有包括但不限于所述发明概述中阐述、描述或引用的许多特性和实施方式的技术。不希望其为包含全部的且所述权利要求不为所述发明概述确定的特征或实施方式所限制，其仅因说明而非限制的目的而被包括。

因此，一方面，本公开内容涉及新型肽和组合物，其包含对调节神经元细胞的活力和增殖有用的MNTF分子的一部分，从而提供易于合成及在治疗中枢和/或外周神经系统中的广泛的神经退行性、神经肌肉疾病、疾病或病况上为治疗有效的神经营养肽。

一方面，本公开内容涉及包含至少两个连续残基的合成和/或纯化的MNTF肽或其类似物，其包括在LGTFWGDTLN CWMLSAFSRY ARCLAEGHDGPTQ(SEQ ID NO：1)的位置17和18处的FS残基，且对诱导或调节神经元细胞的活力和生长有用。

在某些实施方式中，MNTF肽或其类似物包括包含SEQ ID NO：1～22的序列类似物。在某些实施方式中，MNTF肽或其类似物为2聚体、3聚体、4聚体或5聚体非棕榈酰化肽。在某些其他实施方式中，MNTF肽或其类似物为2聚体、3聚体、4聚体、5聚体或6聚体棕榈酰化肽。在某些方面中，本公开内容提供组合物，其包含通过与渗透增强剂共价键合(bonding)/键合(linkage)或缀合，或者在固相合成期间通过经由肽键添加所述渗透增强剂而被N-末端修饰的MNTF肽或其类似物。

在某些实施方式中，MNTF肽由下列构成：i)SEQ ID NO：1的2个和6个之间的连续氨基酸；ii)SEQ ID NO：1的2个和5个之间的连续氨基酸；iii)SEQ ID NO：1的3个和5个之间的连续氨基酸；iv)SEQ ID NO：1的至少2个连续氨基酸；v)SEQ ID NO：1的至少3个连续氨基酸；或vi)它们中任一项的类似物，例如i)～v)中任一项的功能衍生物。在i)、iv)和v)中所述MNTF肽不具有由SEQ IDNO：2构成的氨基酸序列。在某些其他实施方式中，MNTF肽或其类似物具有选自SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：22或它们的功能衍生物的氨基酸序列。优选MNTF肽或其类似物具有MNTF活性。

在一些方面中，将所述MNTF肽类似物共价连接(例如在N-末端处通过肽键)至2～22碳的脂肪酸分子(例如棕榈酸)。一方面，本公开内容提供了皮肤药学组合物，其包含：具有选自LGTFWGDTLNCWMLSAFSRYARCLAEGHDGPTQ(SEQ ID NO：1)的至少2个连续氨基酸残基(包括FS)的肽或其类似物，及药学可接受载质。

在一些实施方式中，所述MNTF肽或其类似物包含：SEQ ID NO：1的苯丙氨酸-丝氨酸二肽和SEQ ID NO：1中的1～30个额外的氨基酸，任选具有在SEQ ID NO：1中所述序列的1～5个连续氨基酸取代的所述MNTF肽或其类似物、或酯、酰胺、前药和/或它们的盐形式。

在另一实施方式中，所述MNTF肽类似物在N-末端处被缀合或共价连接或通过肽键连接至2～22碳的脂肪酸分子(例如棕榈酸)以增强皮肤渗透性和/或油溶解性。

LGTFWGDTLN CWMLSAFSRY ARCLAEGHDG PTQ(SEQ ID NO：1)

FSRYAR(SEQ ID NO：2)

FS(SEQ ID NO：3)

FSR(SEQ ID NO：4)

AFS(SEQ ID NO：5)

FSRY(SEQ ID NO：6)

SAFS(SEQ ID NO：7)

AFSR(SEQ ID NO：8)

LSAFS(SEQ ID NO：9)

SAFSR(SEQ ID NO：10)

AFSRY(SEQ ID NO：11)

FSRYA(SEQ ID NO：12)

MLSAFS(SEQ ID NO：13)

LSAFSR(SEQ ID NO：14)

SAFSRY(SEQ ID NO：15)

AFSRYA(SEQ ID NO：16)

SRYAR(SEQ ID NO：17)

RYAR(SEQ ID NO：18)

YAR(SEQ ID NO：19)

SRYA(SEQ ID NO：20)

RYA(SEQ ID NO：21)

SRY(SEQ ID NO：22)

另一方面，提供用于通过给细胞培养物体外施用所述MNTF肽或其类似物，或者给遭受神经损伤或神经退行性疾病的个体体内施用所述MNTF肽或其类似物，以促进细胞增殖或稳定不适当的细胞死亡，和/或在两种情况下恢复正常细胞行为来调节神经元细胞的活力和/或生长的组合物和方法。另一方面，提供了提高有神经通路损伤症状的受试者的运动功能的方法，其包括给有需要的受试者施用运动神经元营养因子(MNTF)肽或其类似物。

因此，一方面，本公开内容涉及新型肽和组合物，其包含对调节神经元细胞的活力和增殖有用的MNTF分子的一部分，从而提供易于合成及在治疗广泛的皮肤疾病(包括皮下区域神经和肌肉的神经移植术)上为治疗有效的神经营养肽。

一方面，本公开内容涉及合成和/或纯化的MNTF肽或其的类似物，其包含对诱导或调节邻近皮肤的神经元细胞的活力和生长有用的FS结构域。

另一方面，通过给细胞培养物体外施用所述MNTF肽或其类似物，或者给遭受神经损伤或神经退行性疾病的个体体内施用所述MNTF肽或其类似物，以促进细胞增殖或稳定不适当的细胞死亡，和/或在两种情况下恢复正常细胞行为来调节神经元细胞的活力和/或生长的组合物和方法。

一方面，提供了修复受试者中损伤的神经通路的方法，其包含给有需要的受试者施用MNTF肽或其类似物，其中所述损伤的神经通路与皮肤损伤或病况相关，其中以对治疗所述皮肤病况或疾病，由此在所述受试者中损伤的神经通路被修复来说有效的量施用所述MNTF肽或其类似物。

附图说明

图1示例示MNTF肽对运动神经元存活的存活测定。从大鼠脊髓中培养运动神经元，并在BDNF、GDNF和CNTF存在下于培养基中生长3天。3天后，所述细胞在无常规营养因子但有指定的10μg/ml的MNTF肽下生长。48小时后确定活细胞数。所述坐标图示五个样品的平均+/-SD值(BDNF＝脑源性神经营养因子；GDNF＝胶质细胞源性神经营养因子；CNTF＝睫状神经营养因子)。

发明详述

已发现胚胎运动神经元的存活取决于源自相关的发育中骨骼肌的特定营养物质。已报道某些骨骼肌产生能够通过防止胚胎运动神经元的衰退和随后的自然细胞死亡来增强运动神经元存活和发育的物质。(O′Brian，R.J.and Fischbach，G.D.，6J.Neurosci.3265(1986)；Hollyday，M.and Hamburger，V.，170J.Comp.Neurol.311(1976).McManaman，J.L.，et al.，263J.Biol.Chem.5890(1988)；Oppenheim，R.W.，et al.，240Science，919(1988)；及Smith，R.G.，et al.，6J.Neurosci.439(1986))。

人运动神经元营养因子(MNTF)为源自骨骼肌组织的特定NTF，已显示其可减少运动神经元损伤位点的发炎，加强神经再生并促进运动神经元的存活。已在各种大鼠神经系统(包括：外周坐骨神经(控制下肢肌肉)、外周肌皮神经(控制上肢肌肉)、颅面神经(控制面部和头部肌肉)、颅舌下神经(控制舌)及控制颈部、胸部和上肢肌肉的脊髓的一部分)中检测了MNTF。在所述脊髓模型中，在大鼠半节脊髓中的神经移植上使用MNTF；MNTF减少发炎、限制变性及加强所述移植神经的再生。大量研究已证明，当在神经上直接使用本文所述的合成的MNTF或肽类似物时，所述合成的MNTF或肽类似物在大鼠外周神经模型系统中对于营养(trophic)和营养(tropic)作用的功效。此外，已显示MNTF可促进运动神经元的再生和存活。

在某些生长和发育阶段期间在脊椎动物的神经系统中发生神经元细胞的死亡。因此，来自相关靶组织的可溶性神经元营养因子的添加有助于缓解神经元死亡的所述现象。

因此，本公开内容的方面和实施方式为神经元疾病的治疗提供了包含所述MNTF肽或其类似物的方法和组合物。

本公开内容的方面和实施方式涉及与运动神经元营养因子的作用相关的功能蛋白结构域，其已被鉴定且定位于MNTF分子中的短重叠序列。包括SEQ ID NO：2～22中结构域的所述蛋白结构域足以调节神经元细胞的活力和增殖。此外，包含所述结构域的截短的MNTF肽或类似物本身足以显示在运动神经元/神经母细胞瘤细胞杂交物中的刺激生物活性。

定义

阐述了在本公开内容涉及的所述技术中使用的某些术语。除另有说明外，在本文和随附的权利要求中使用时下列术语具有下列含义。在说明书下文或其他地方没有定义的那些术语应具有其公认的含义。

本文所用“运动神经元营养因子或运动神经元营养因子”包括在运动神经元的营养和维持中涉及的因子。本文所用术语“运动神经元营养因子”、“MNTF”、“MNTF肽”、“运动神经元营养因子类似物”和“MNTF类似物”分别涉及本文所述的肽及其类似物且具有本文所定义的功能特性。其可包括所述参照MNTF序列的序列和功能同源物。运动神经元营养因子可促进定向神经前体细胞的发育和分化，或其可诱导或加强分化神经细胞的生长(如神经轴突突起)和存活。“MNTF活性”包括下列活性的一种或多种：促进神经元的生长，促进神经元的维持，促进神经轴突突起，促进经轴突切断的运动神经元的轴突再生，促进运动功能，修复损伤的神经通路，再生神经通路或缓解神经元缺陷。通常以以对产生CNS或PNS的完全分化神经细胞(例如，运动神经元)来说有效的量提供本公开内容的运动神经元营养因子。本文提供了所述量的指导且基于本文公开的方案和方法其可由本领域技术技术人员轻易确定。

在Chau，R.M.W.，et al，Muscle Neuronotrophic Factors Specific for Anterior Horn Motoneurons of Rat Spinal Cord、Recent Advances in Cellular and Molecular Biology，Vol.5，Peeters Press，Leuven，Belgium，pp.89-94(1992)中已报道了MNTF肽，及在例如US 6309877、US 7183373、US 6841531、US 6759389和US 20060052299中发现的MNTF肽，其内容通过引用整体并入本文。在某些实施方式中，样本包括合成和/或纯化的MNTF肽或其类似物，其包含SEQ ID NO：2～22结构域的一部分和模拟其结构和/或功能的分子，其包括截短的序列同源物和类似物，且其对诱导或调节神经元细胞的活力和生长有用。

此外，MNTF肽也包括在Chau，R.M.W.，et al.，The Effect of a 30kD Protein from Tectal Extract of Rat on Cultured Retinal Neurons，34Science in China，Series B，908(1991)、Chau，R.M.W.，et al.，Muscle Neuronotrophic Factors Specific for Anterior Horn Motoneurons of RatSpinal Cord、Recent Advances in Cellular and Molecular Biology，Vol.5，Peeters Press，Leuven，Belgium，pp.89-94(1992)、Chau，R.M.W.，et al.，The Effectof a 30kD Protein from Tectal Extract of Rat on Cultured Retinal Neurons，34Science in China，Series B，908(1991)、Chau，R.M.W.，et al.，Cloning of Genes for Muscle-Derived Motoneuronotrophic Factor 1(MNTF1)and Its Receptor by Monoclonal Antibody Probes，(abstract)19Soc.for Neurosci.part1，252(1993)、Chau，R.M.W.，et al.，Cloning of Genes for Muscle-Derived Motoneuronotrophic Factor1(MNTF1)and Its Receptor by Monoclonal Antibody Probes，(abstract)19Soc.for Neurosci.part1，252(1993)中所述的MNTF肽，其内容通过引用整体并入本文。

在某些实施方式中，MNTF肽或其类似物可包括自MNTF结构域活性位点之一的序列(例如两个氨基酸的MNTF肽，如SEQ ID NO：3)。

在某些实施方式中，所述MNTF肽由在SEQ ID NO：2～22中所述的序列构成。在其他一些实施方式中，所述MNTF肽类似物包括在SEQID NO：2～22中所述的MNTF肽的功能衍生物。

本文所述MNTF肽及其类似物包括源自MNTF(即源自SEQ ID NO：1)的肽和它们的功能衍生物。所述化合物包括具有SEQ ID NO：2～22之一的氨基酸序列的肽和具有在SEQ ID NO：2～22中提供的氨基酸序列的肽的功能衍生物。

本申请所用“类似物”包括已被修饰但保留MNTF活性(例如相对于33聚体MNTF，SEQ ID NO：1，通过截短、取代、共价连接至另一部分等)的肽。MNTF肽类似物包括例如MNTF肽的酯、酰胺、前药和/或盐形式。MNTF肽类似物包括通过连接至另一部分而被共价修饰的MNTF肽，例如将MNTF肽共价连接至亲脂部分(例如脂肪酸)、载质分子或异源多肽以产生融合蛋白。在某些实施方式中，本发明所述的类似物包括“保守”取代(例如相对于SEQ ID NO：1)。保守的氨基酸取代包括使用同组内的同义氨基酸的氨基酸替换，其具有足够相似的物理化学特性即组成员间的取代会保持分子的生物学功能(Grantham，Science，Vol.185，pp.862-864(1974))。MNTF类似物还包含本文所述的肽或类似物的MNTF功能衍生物。在一些实施方式中，与在SEQ ID NO：1或其截短形式(包括SEQ ID NO：2～22)所示的序列相比，所述MNTF类似物包括20％、25％、30％、35％或多达40％的保守氨基酸取代。

本文所用MNTF的“功能衍生物”指依据已知方法从氨基酸部分侧链或末端的N-或C-基上存在的功能基制备的衍生物且当其为药学可接受时即当其不破坏蛋白/肽活性或不把不可接受的毒性给予包含它们的药物组合物时其被包含在本公开内容中。所述衍生物包括例如羧基的脂肪酯或酰胺和游离氨基的N-酰基衍生物、及游离羟基的O-酰基衍生物和用酰基形成的例如链烷酰基或芳酰基、前药、功能基的盐或它们的组合。

同义氨基酸组包括在表I、II和III中所定义的组

表I

同义氨基酸的广义组

氨基酸---同义组

Ser---Ser、Thr、Gly、Asn

Arg---Arg、Gln、Lys、Glu、His

Leu---Ile、Phe、Tyr、Met、Val、Leu

Pro---Gly、Ala、Thr、Pro

Thr---Pro、Ser、Ala、Gly、His、Gln、Thr

Ala---Gly、Thr、Pro、Ala

Val---Met、Tyr、Phe、Ile、Leu、Val

Gly---Ala、Thr、Pro、Ser、Gly

Ile---Met、Tyr、Phe、Val、Leu、Ile

Phe---Trp、Met、Tyr、Ile、Val、Leu、Phe

Tyr---Trp、Met、Phe、Ile、Val、Leu、Tyr

Cys---Ser、Thr、Cys

His---Glu、Lys、Gln、Thr、Arg、His

Gln---Glu、Lys、Asn、His、Thr、Arg、Gln

Asn---Gln、Asp、Ser、Asn

Lys---Glu、Gln、His、Arg、Lys

Asp---Glu、Asn、Asp

Glu---Asp、Lys、Asn、Gln、His、Arg、Glu

Met---Phe、Ile、Val、Leu、Met

Trp---Trp

表II

同义氨基酸的中义组

氨基酸-同义组

Ser---Ser

Arg---His、Lys、Arg

Leu---Ile、Phe、Met、Leu

Pro---Ala、Pro

Thr---Thr

Ala---Pro、Ala

Val---Met、Ile、Val

Gly---Gly

Ile---Ile、Met、Phe、Val、Leu

Phe---Met、Tyr、Ile、Leu、Phe

Tyr---Phe、Tyr

Cys---Ser、Cys

His---Arg、Gln、His

Gln---Glu、His、Gln

Asn---Asp、Asn

Lys---Arg、Lys

Asp---Asn、Asp

Glu---Gln、Glu

Met---Phe、Ile、Val、Leu、Met

Trp---Trp

表III

同义氨基酸的狭义组

氨基酸-同义组

Ser---Ser

Arg---Arg

Leu---Ile、Met、Leu

Pro---Pro

Thr---Thr

Ala---Ala

Val---Val

Gly---Gly

Ile---Ile、Met、Leu

Phe---Phe

Tyr---Tyr

Cys---Ser、Cys

His---His

Gln---Gln

Asn---Asn

Lys---Lys

Asp---Asp

Glu---Glu

Met---Ile、Leu、Met

Trp---Trp

在本文所提供的化合物(例如肽和蛋白)中使用的氨基酸可为基因编码的氨基酸、天然存在的非基因编码的氨基酸或合成的氨基酸。可将上述之任一种的L-和D-对映体用于所述化合物。对下列基因编码的氨基酸(和它们的残基)本文使用下列缩写：丙氨酸(Ala，A)；精氨酸(Arg，R)；天冬酰胺(Asn，N)；天冬氨酸(Asp，D)；半胱氨酸(Cys，C)；甘氨酸(Gly，G)；谷氨酸(Glu，E)；谷氨酰胺(Gln，Q)；组氨酸(His，H)；异亮氨酸(Ile，I)；亮氨酸(Leu，L)；赖氨酸(Lys，K)；蛋氨酸(Met，M)；苯丙氨酸(Phe，F)；脯氨酸(Pro，P)；丝氨酸(Ser，S)；苏氨酸(Thr，T)；色氨酸(Trp，W)；酪氨酸(Tyr，Y)及缬氨酸(Val，V)。

非基因编码和在本文所述化合物中存在的某些常见氨基酸包括，但不限于：β-丙氨酸(b-Ala)及其他ω-氨基酸(如3-氨基丙酸(Dap)、2，3-二氨基丙酸(Dpr，Z)、4-氨基丁酸等)、α-氨基异丁酸(Aib)、ε-氨基己酸(Aha)、δ-氨基戊酸(Ava)、甲基甘氨酸(MeGly)、鸟氨酸(Orn)、瓜氨酸(Cit)、叔丁基丙氨酸(t-BuA)、叔丁基甘氨酸(t-BuG)、N-甲基异亮氨酸(MeIle)、苯基甘氨酸(Phg)、环己丙氨酸(Cha)、正亮氨酸(Nle，J)、2-萘丙氨酸(2-Nal)、4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))、2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))、3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))、4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))、青霉胺(Pen)、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)、β-2-噻吩丙氨酸(Thi)、蛋氨酸亚砜(MSO)、高精氨酸(hArg)、N-乙酰赖氨酸(AcLys)、2，3-二氨基丁酸(Dab)、2，3-二氨基丁酸(Dbu)、对氨基苯基丙氨酸(Phe(pNH₂))、N-甲基缬氨酸(MeVal)、高半胱氨酸(hCys)、3-苯并噻唑-2-基-丙氨酸(BztAla，B)和高丝氨酸(hSer)。涉及的更多氨基酸类似物包括：磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、羟脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、马尿酸、八氢吲哚-2-羧酸、抑胃酶氨酸、α-甲基-丙氨酸、对苯甲酰-苯基丙氨酸、炔丙基甘氨酸和肌氨酸。无论现在还是将来，本文所述肽可有任何L-或D-构型的上述氨基酸、或本文所述或本领域已知的任何其他氨基酸。

可互相取代的氨基酸通常属于相似的类或亚类。如本领域任一技术人员所知，主要取决于所述氨基酸侧链的化学和物理特性而将氨基酸分进不同类中。例如，通常认为一些氨基酸为亲水性或极性氨基酸而认为其他的为疏水性或非极性氨基酸。极性氨基酸包括有酸性、碱性或亲水性侧链的氨基酸而非极性氨基酸包括有芳香族或疏水性侧链的氨基酸。可进一步将非极性氨基酸细分成包括尤其是脂肪族氨基酸。本文所用的氨基酸种类的定义如下：

“非极性氨基酸”指具有在生理pH下不带电、非极性且通常被水溶液排斥的侧链的氨基酸。基因编码的疏水性氨基酸的例子包括：Ala、Ile、Leu、Met、Trp、Tyr和Val。非基因编码的非极性氨基酸的例子包括：t-BuA、Cha和Nle。

“芳香族氨基酸”指具有包含至少一个具有共轭π-电子系统的环的侧链(芳香基)的非极性氨基酸。所述芳香基可用取代基(如烷基、烯基、炔基、羟基、磺基、硝基和氨基及其他基团)进一步取代。基因编码的芳香族氨基酸的例子包括：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。通常遇到的非基因编码的芳香族氨基酸包括：苯基甘氨酸、2-萘丙氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、3-苯并噻唑-2-基-丙氨酸、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。

“脂肪族氨基酸”指具有饱和或不饱和直链、支链或环烃侧链的非极性氨基酸。基因编码的脂肪族氨基酸的例子包括：Ala、Leu、Val和Ile。非编码的脂肪族氨基酸的例子包括Nle。

“极性氨基酸”指具有在生理pH下带电或不带电的侧链的亲水性氨基酸，且其具有其中由两个原子共用的电子对被所述原子中的一个更近占有的键。极性氨基酸通常为亲水性的，即其具有具有可被水溶液吸引的侧链的氨基酸。基因编码的极性氨基酸的例子包括：天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和丝氨酸。非基因编码的极性氨基酸的例子包括：瓜氨酸、高半胱氨酸、N-乙酰赖氨酸和蛋氨酸亚砜。

“酸性氨基酸”指具有小于7的侧链pK值的亲水性氨基酸。由于氢离子的丧失，酸性氨基酸在生理pH下通常具有带负电荷的侧链。基因编码的酸性氨基酸的例子包括：天冬氨酸和谷氨酸。

“碱性氨基酸”指具有大于7的侧链pK值的亲水性氨基酸。由于水合氢离子的结合，碱性氨基酸在生理pH下通常具有带正电荷的侧链。基因编码的碱性氨基酸的例子包括：精氨酸、赖氨酸和组氨酸。非基因编码的碱性氨基酸的例子包括：鸟氨酸、2，3-二氨基丁酸、2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。

“可电离氨基酸”指在生理pH下可带电的氨基酸。所述可电离氨基酸包括酸性和碱性氨基酸，例如：D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-精氨酸、D-赖氨酸、D-羟赖氨酸、D-鸟氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-羟赖氨酸或L-鸟氨酸。

如本领域技术人员所了解，所述分类不是绝对的。许多氨基酸显示出多于一种的特征性质，且可因此被包括在多于一种分类中。例如酪氨酸既有非极性芳香环又有极性羟基。因此，酪氨酸具有可被描述为非极性、芳香化和极性的多种特征。然而，非极性环是占优势的，因此普遍认为酪氨酸是非极性的。同样，除了能形成二硫键之外，半胱氨酸也具有非极性的特征。因此，虽然半胱氨酸没有被严格划分为疏水性氨基酸或非极性氨基酸，但在许多情况下，可用其来为肽赋予疏水性或非极性。

在一些实施方式中，本文所述极性氨基酸可包括例如：精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、高半胱氨酸、赖氨酸、羟赖氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、苏氨酸及结构相关的氨基酸。在一实施方式中，所述极性氨基酸为可电离氨基酸(如精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、羟赖氨酸、赖氨酸或鸟氨酸。

可使用的极性或非极性氨基酸残基的例子包括，例如：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸等。

本文术语“盐”指本文所述肽或其类似物的羧基盐和氨基的酸加成盐。可通过本领域已知的方法形成羧基盐，且其包括无机盐(例如钠、钙、铵、铁或锌盐等)和与有机碱(例如，与胺(如三乙醇胺、精氨酸或赖氨酸、哌啶、普鲁卡因等))所形成的盐。酸性盐包括，例如无机酸(如盐酸或硫酸)盐和有机酸(如醋酸或草酸)盐。当然，所述的任何盐必须保留本文所述的肽或其类似物的活性。

“前体”为在人体或动物体中可被转换成本文所述的肽的化合物。

可通过本领域熟知的任何方案(如固相合成或液相合成)制备本公开内容的肽。作为固相合成，例如对应于要合成的肽C末端的氨基酸被结合至不溶于有机溶剂的支持物上，并通过反应的交替重复，其中一个反应为具有用适当的保护基保护的α-氨基和侧链功能基的氨基酸以C-末端至N-末端的顺序依次被缩短，而其中另一个为释放结合至树脂或肽α-氨基的保护基的氨基酸，所述肽链从而以此方式延伸。取决于使用的保护基的类型，在很大程度上由tBoc方法和Fmoc方法分类固相合成方法。

通常使用的保护基包括：对于氨基的tBoc(叔丁氧羰基)、Cl-Z(2-氯苄氧羰基)、Br-Z(2-溴苄氧羰基)、Bzl(苄基)、Fmoc(9-芴甲氧羰基)、Mbh(4，4′-二甲氧基二苯甲基)、Mtr(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基)、Trt(三苯甲基)、Tos(甲苯磺酰基)、Z(苄氧羰基)和C12-Bzl(2，6二氯苄基)；对于胍基的NO₂(硝基)和Pmc(2，2，5，7，8-五甲基色烷-6-磺酰基；及对于羟基的tBu(叔丁基)。

在所需肽的合成后，其要经受去保护反应并从固体支持物上切割出。可用Boc方法的氟化氢或三氟甲烷磺酸及用Fmoc方法的TFA进行所述肽切割反应。

然后获得的粗肽要经受纯化。通过所述目的已知的任一方法即包括提取、沉淀、色谱、电泳等的任何常规方案进行纯化。例如，可使用HPLC(高效液相色谱)。可使用常用于蛋白纯化的基于水-乙腈的溶剂进行所述洗脱。

基本上以纯化的形式提供本文所述的肽，以适于在药物组合物中、作为活性成分、在需要MNTF活性和/或由此的调节的病变中使用。

本文所用术语“生物活性肽”和“生物活性片段”指依据上述运动神经元分化因子(MNDF)和/或运动神经元营养因子(MNTF)的肽或多肽，其中MNDF可使干细胞分化成运动神经元，而其中MNTF显示出神经保护、修复和治疗功能。

本文所用例示MNTF肽及其类似物包括本文已证明的足以使干细胞分化成运动神经元的那些。

本文所用“预防”指整体或部分预防、或改善或控制。

本文所用术语“治疗”指治疗性治疗和预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施。需要治疗者包括已患所述疾病者和易于患所述疾病者，或者诊断患所述疾病者或要预防所述疾病者。

本文所用参照本文所述的化合物或组合物的“有效量”指对于诱导所需的生物学、药学或治疗结果有效的量。所述结果可为病征、症状的缓解、或疾病、疾病或病况的原因、或生物系统所需的其他任何改变。

术语“百分比(％)同一性”指在两个或多个序列的比较中发现的序列相似性的百分比。例如，可使用任何合适的软件电子化确定百分比同一性。同样，通过将一个序列的序列与第二个序列相比较来确定两个序列(或两个序列中各个或两个的一个或多个部分)间的相似性。

本文所用术语“同源性和同源物”包括包含同源于目的蛋白序列的氨基酸序列的肽。所述肽与相关序列(例如超过所述同源序列的至少约15、20、30、40、50、100个以上的连续氨基酸/多肽的区域)通常具有至少约70％的同源性，并可为至少约80％、90％、95％、97％或99％同源性。取决于所述肽和参照序列的长度，相对于参照序列(例如SEQID NO：1)其还可包含多达约25％、30％、40％或50％的保守氨基酸变化。

治疗的一般方面

提供了治疗患有神经元疾病的患者的方法，其包含给患者施用运动神经元营养因子(MNTF)肽或其类似物。

本文所用神经元疾病可包括通过功能神经组织的急性、进行性或逐渐丧失整体或部分表征或相关联的疾病、疾病或病况。

“神经退行性疾病”指通过功能神经组织的进行性、逐渐丧失表征的与中枢或外周神经系统相关的疾病。

总述

在美国专利No.6,309,877、6,759,389和6,841,531(及共同在审美国专利申请系列No.10/858,144、10/858,286、10/858,543和10/858,545)中描述了来自大鼠肌肉组织的两种运动神经元营养因子(MNTF1和MNTF2)的分离和鉴定及源自人视网膜母细胞瘤cDNA文库的重组MNTF1～F6基因的随后克隆，将这些文献通过引用整体并入本文。如在国际申请No.PCT/US2004/038651中所述，发现定位于人染色体22q 22内的MNTF1～F6基因序列编码33个氨基酸的MNTF1多肽，将所述文献通过引用整体并入本文。

MNTF1～F6分子内对MNTF1的已知生物活性似乎足够的两个重叠结构域被确认。(见国际申请No.PCT/US04/01468或美国专利申请系列No.10/541,343(被授权为美国专利No7,183,373)，将这些文献通过引用整体并入本文)。被命名为“WMLSAFS”和“FSRYAR”结构域的所述结构域的每一个足以用类似于MNTF1～F6 33聚体的方式刺激源自细胞系的运动神经元的增殖。同样地，所述“FSRYAR”结构域足以用类似于MNTF1～F6 33聚体的方式由运动神经元体内指导肌肉目标的选择性再神经切除。另外，当使用所述“FSRYAR”结构域来引发免疫应答时，其提供了足以产生识别包含“FSRYAR”序列的MNTF肽(包括MNTF1～F6 33聚体)的抗体的抗原表位。

此外，可如本文所述的使用包含SEQ ID NO：1的至少两个连续残基的所述MNTF肽，只要所述肽至少包含在SEQ ID NO：1的位置17和位置18处分别存在的苯丙氨酸和丝氨酸残基。

在人胎儿孕育期中的第9周期间运动神经元营养因子(MNTF)在表达上达到峰值(Di，X.et al.，Acta Anatomica Sinica 29：86-89，1998)。基于在发育的人体中MNTF的表达，我们推断MNTF可促进运动神经元的分化和/或存活。

使用方法

MNTF1和/或其肽类似物促进哺乳动物运动神经元在体外的存活。因此，本文所述技术提供了作为神经元细胞培养物的生长因子/补充物的MNTF肽或其类似物的使用、包括用于促进干细胞衍生的神经元细胞系的存活的方法、通过用有效量的MNTF肽或其类似物体外培养干细胞衍生的神经元细胞。

如美国专利申请No.12/093,452、PCT/US06/043874所述，其他的MNTF肽已在干细胞的分化中显示出功效。本文所提供的MNTF肽具有相似的生物活性，并因此调节多能胚胎干细胞至运动神经元的分化，且增强ES细胞衍生的运动神经元的存活。ES细胞与RA和MNTF类似物的接触可指导所述细胞产生运动神经元。

MNTF和截短的MNTF分子包括但不限于包含MLSAFSRYAR结构域的分子、被称作运动神经元分化因子(MDNF)的分子、在美国专利申请No.12/093,452、PCT/US06/043874中被证明可诱导干细胞或部分分化的神经元细胞分化成运动神经元的分子。所述制剂提供了从干细胞培养物中产生和/或分离一群运动神经元的新型方法。

所述方法包括胚胎干细胞与视黄酸(RA)和运动神经元分化因子(MNDF)的接触。在本文所述的一实施方式中，用RA同时用运动神经元分化因子接触胚胎干细胞。另外，所述方法包括部分分化的神经元细胞与运动神经元分化因子的接触。以对产生分化的神经细胞有效的量提供所述因子。基于本文所公开的方案和方法，可由本领域技术人员轻易确定所述量。

例如可通过FACS分选分离或富集分化的运动神经元。例如基于GFP的运动神经元标记方法的使用允许纯的ES细胞衍生的运动神经元群的表征。我们已使用了从自胚状体的细胞的混合群中分离纯的运动神经元细胞群的所述规程。使用胶原酶和分散酶将胚状体分解成单个细胞。然后用GFP来FACS分选所述单个细胞，因为在群中表达由HB9启动子控制的GFP的细胞为真的运动神经元。

因此，本技术另一方面涉及如下分离和/或纯化一群分化的神经细胞的方法：(a)获得或产生在运动神经元特异性启动子控制下表达增强的绿色荧光蛋白(eGFP)的胚胎干细胞培养物；(b)将胚胎干细胞的培养物与对于产生表达eGFP的分化的神经细胞有效的量的RA和MNTF相接触；(d)在分化的神经细胞中检测eGFP的表达；和(f)分离表达eGFP的分化的神经细胞。

MNTF肽及其类似物

如熟知本领域和本公开内容的技术人员所了解，包含MNTF活性结构域及其肽类似物的序列可将神经保护、修复和治疗功能体内和体外给予运动神经元。可合成或重组产生、或从自然细胞中分离本文所述的MNTF因子。

本文经由常用的三字母命名的使用或通过其单字母命名来命名包含本公开内容的MNTF肽或其类似物的蛋白或肽中的氨基酸残基的序列。在教课书(如Biochemistry，Second Edition，Lehninger，A.，Worth Publishers，New York，N.Y.(1975))中可发现所述三字母和单字母命名的一览表。当氨基酸序列被水平列出时，希望氨基末端在左边而希望羧基末端在右端。

技术人员应了解，取决于大量因素，包含各种MNTF肽或其类似物的肽的准确化学结构会有所不同。例如，因为在分子中发现了可电离的羧基和氨基，可以酸性盐或碱性盐、或以中性形式获得给定的多肽。由于本发明的目的，从而希望包含SEQ ID NO：2～22中列出的序列/结构域的保留MNTF肽生物活性的肽的任何形式在本文所述技术的范围内。在某些实施方式中，所述公开内容包括基本上由SEQ ID NO：2～22中列出的序列/结构域构成的保留MNTF肽的生物活性的肽组合物。

本公开内容包括保留MNTF的能力的MNTF肽类似物的使用，所述MNTF的能力是施行神经保护、促进运动神经元的存活、维持和/或修复，或在某些情况下使干细胞分化成运动神经元的能力。

可使用可从美国生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)公共可得的BLAST程序进行序列的全面比对，以将多肽序列与相应的SEQID NO：1片段相比较。在进行全面比对之前，可将SEQ ID NO：1提交至GenBank。可将美国生物技术信息中心提供的默认参数用于全面比对。

应了解本文所述技术包括肽类似物的使用，其中用其他的氨基酸取代一个或多个氨基酸。在一些实施方式中，运动神经元营养因子肽类似物包含对SEQ ID NO：1的至少2个连续氨基酸残基的片段的一个或多个保守氨基酸取代。在一些实施方式中，所述2个连续氨基酸残基为F-S。

基于模型(实验确定的)肽结构，技术人员可使用已知的合理药物设计方法进行MNTF及其他类似的结构域模拟物或结合分子的合理设计。合理药物设计的目标为制备生物活性肽或靶化合物的结构类似物。通过创造所述类似物，改造药物成为可能，其比天然分子更有活性或更稳定，其对改变有不同的易感性，或其影响各种其他分子的功能。在一方法中，可产生靶分子或其片段的三维结构。这可通过X射线晶体学、计算机模拟或通过两种方法的组合完成。

可在计算机化的合理药物设计(即分子模拟和分子-分子互作模拟)方法中使用本文所公开的三维MNTF分子和相关结构，以确认与MNTF的活性部分结合的候选化合物。在本领域中已知能模拟候选化合物与例如本文所述的原子坐标间互作的各种计算机化药物设计程序，且所述程序的操作在合理药物设计领域普通技术人员的理解内。

制备方法

应了解可通过本领域熟知的方法(包括但不限于通过固相合成的化学合成和通过HPLC从化学反应的其他产物的纯化、或通过在体外翻译系统或在活细胞中表达编码包含本文所述的MNTF肽或其类似物的肽或多肽的核酸序列(例如DNA序列)的制备)制备包含本公开内容所述MNTF肽或其类似物的组合物。可分离和大规模透析组合物的MNTF肽或其类似物以去除一种或多种不需要的小分子量分子和/或被冻干以使更易配入所需媒质。还应了解在制备入MNTF肽成分中的额外氨基酸、突变、化学修饰等(无论何者)应基本上不干扰MNTF对接序列的受体识别。

对应于MNTF的一种或多种片段的肽或多肽在长度上通常应为至少两个氨基酸残基，且可包含2、3、4或5个氨基酸残基。在某些实施方式中，所述MNTF肽类似物包含6个氨基酸残基及功能衍生物，例如棕榈酰化物。可通过本领域普通技术人员已知的方法(如使用自动化肽合成机器(如从Applied Biosystems(Foster City，CA)可得的机器)的肽合成)合成肽序列。本文所述技术包括源自SEQ ID NO：1～22的环肽的合成和使用。

通过靶氨基酸与能与选定的侧链或末端残基反应的有机衍生化试剂间的反应将共价修饰引入肽中。使用有机衍生化试剂共价修饰多肽为本领域技术人员所熟知。例如，用α-卤代乙酸(和相应的胺)(如氯乙酸或氯乙酰胺)与半胱氨酰残基反应以给出羧甲基或甲酰胺基甲基衍生物。可通过与pH 5.5～7.0的焦碳酸二乙酯或与pH 6的对溴苯酰甲基溴在1M二甲胂酸钠溶液中反应而将组氨酰残基衍生化。赖氨酰和氨末端残基可与琥珀酸或其他羧酸酐反应。可通过与苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮、茚三酮之中的一种或多种常规试剂的反应修饰精氨酰残基。通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反应将谱标记引入至酪氨酰残基；最常见的是，使用N-乙酰咪唑和四硝基甲烷来分别形成0-乙酰酪氨酰类和3-硝基衍生物。可通过与碳二亚胺类(R’-N-C-N-R’)(如1-环己基-3-(2-吗啉-(4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3(4氮鎓4，4-二甲基戊基)碳二亚胺)反应来选择性地修饰羧基侧基(天冬氨酰或谷氨酰)。此外，通过与铵离子反应使天冬氨酰和谷氨酰残基转换成天冬酰胺酰或谷氨酰胺酰残基。谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基可被去酰胺至相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。其他修饰包括：脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，1983，Proteins：Structure and Molecule Properties，W.H.Freeman& Co.，San Francisco，pp.79-86)，N-末端胺的乙酰化和在一些情况下、C-末端羧基的酰胺化。

可在测定和用于测定的试剂盒中以游离的形式或连接至载质分子(如蛋白或固体颗粒)的形式及连接至标记物或示踪物(例如生物素或荧光素异硫氰酸酯)的修饰的肽使用本文所述的MNTF肽或其类似物。

可用本领域熟知的双功能试剂(包括1，1双(重氮乙酰基)2乙苯、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如4-叠氮基水杨酸酯、同型双功能酰亚胺酯(包括双琥珀酰亚胺酯(如3，3’-二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸))和双功能马来酰亚胺(如双-N-马来酰亚胺基-1，8-辛烷))))进行MNTF肽或其类似物与水不溶性支持基质间的交联。甲基-3-[(对叠氮基苯基)二硫代]丙亚胺酸酯之类的双功能试剂产生在光存在下能形成交联的光活性中间体。另外，可将反应性水不溶性基质(如溴化氰活化的碳水化合物)用于蛋白固定。

可使用本文所述的双功能试剂进行MNTF肽或其类似物与包括第二MNTF肽或其类似物的第二蛋白间的交联。在一些实施方式中，有插入的间隔基，例如二巯基或二氨基或多个氨基酸残基(例如，甘氨酸)。所述间隔基也可为同型或异型双功能交联剂，例如异型双功能交联剂N-(4-羧基-环己基-甲基)-马来酰亚胺。

可通过标准的重组DNA技术制备长肽或多肽(如融合蛋白)。例如，用已包含异源蛋白的商用表达载体克隆编码MNTF1肽片段的DNA片段，其结果为MNTF1肽片段框内融合进异源蛋白。

在某些实施方式中，可使用编码MNTF1肽的核酸和/或本文所述成分例如来体外或体内产生用于本文所述各种组合物和方法的肽。例如，在某些实施方式中，编码MNTF1肽的核酸为例如重组细胞中的载体成分。可表达所述核酸以产生包含MNTF1肽序列的肽或多肽。所述肽或多肽可从细胞中分泌、或作为细胞的一部分或在细胞内。

化合物筛选

基于其在本领域可接受的动物细胞培养疾病(disease)和病症(disorder)模型系统中治疗神经元疾病的能力，由本文所述的筛选方案确认的化合物可进一步被区分且所述化合物的功效可被评估。在测试化合物和天然提取物库的许多药物筛选测定中，需要高通量的测定以使在给定的时间段内调查的化合物的量最大化。通常使用在无细胞系统(如可用纯化或部分纯化的蛋白得到的系统)中进行的测定作为“主要”筛选，其中所述筛选可产生以允许由测试化合物介导的分子靶中改变的快速发展和相对容易检测。此外，在体外系统中一般忽略测试化合物细胞毒性和/或生物利用度的影响，而主要着重于药物对分子靶的作用，如可表现在与受体蛋白的结合亲和力的改变。

因此另一方面，提供了鉴定用于促进运动神经元生长或存活的化合物的方法。在一实施方式中，所述方法包括下列步骤：i)制备包含候选化合物的样品，ii)将细胞与所述样品接触，iii)确定涉及在信号传导通路中化合物的表达或活性是否被调节，及iv)确定所述样品是否能促进运动神经元的生长或存活的步骤。在其他实施方式中，所述方法还包括确定包含候选化合物的样品是否被MNTF肽或其类似物所调控，或调控MNTF肽或其类似物(例如活性、表达等)。另一方面，本文所述技术包括促进运动神经元生长或存活的方法或通过施用由本文所述筛选方案鉴定的化合物进行神经元疾病治疗的方法。

在一例示筛选测定中，在其中所述化合物一般能结合MNTF肽的条件下使目的化合物与包含MNTF结合蛋白(例如表达MNTF肽受体的细胞)和MNTF肽的混合物接触。然后添加包含测试化合物的组合物至所述混合物中。受体/MNTF肽复合物的检测和定量为确定测试化合物在抑制(或强化)受体蛋白和MNTF肽间复合物形成上的功效提供了方法。可进行对照测定以为比较提供基线，其中添加分离和纯化的MNTF肽至受体蛋白中，且在无测试化合物下定量受体/MNTF肽复合物的形成。

可通过各种技术检测MNTF肽和MNTF肽间的复合物形成。例如，可使用例如以可检测的方式标记的蛋白(如放射性标记、荧光标记或酶标记的MNTF肽)通过免疫测定或通过色谱检测定量复合物形成的调节。对于无细胞测定，通常需要固定MNTF肽或MNTF肽结合蛋白以便于从蛋白之一的非复合物形式中分离受体/MNTF肽复合物，及便于适应测定的自动化。例如，可提供融合蛋白，其添加了允许将蛋白结合至基质的结构域。例如可将谷胱甘肽-S-转移酶/受体(GST/受体)融合蛋白吸收到谷胱甘肽琼脂糖珠(Sigma Chemical，St.Louis，Mo.)或谷胱甘肽衍生化微滴度板上，然后将其与MNTF肽(例如³⁵S标记的MNTF肽)和测试化合物相结合，并在有助于复合物形成的条件(例如在盐和pH的生理条件下，尽管需要稍微更严格的条件)下温育。温育后，洗涤所述珠以去除任何未结合的MNTF肽，并直接(例如，在闪烁器中放置的珠)或在复合物解离之后的悬液中确定基质珠-结合的放射性标记。或者从所述珠上解离所述复合物，通过SDS-PAGE胶分离，并使用标准的电泳技术从胶上定量珠级分中发现的MNTF肽的水平。

用于在基质上固定蛋白的其他技术适于在受试者测定中使用。例如，可利用生物素和链酶亲和素的缀合固定MNTF肽蛋白的可溶部分。例如，可使用本领域熟知的技术(例如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，I11.)由生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备生物素化的受体分子，并在用链酶亲和素包被的96孔板(Pierce Chemical)的孔中将其固定。或者与MNTF肽反应但不干扰配体结合的抗体可被衍生至板的孔中，且通过抗体缀合在孔中捕获所述受体。如上所述，MNTF肽制剂和测试化合物在存在受体的板孔中温育，且可定量孔中捕获的受体/hedgehog复合物的量。除了上文所述的GST固定复合物的方法之外，检测所述复合物的例示方法包括：使用与MNTF肽反应或与受体蛋白反应且与MNTF肽竞争性结合的抗体的复合物免疫检测；及依赖于检测与MNTF肽相关的酶活性的酶联测定。在后一种情况下，可化学缀合或以与MNTF肽的融合蛋白提供所述酶。有这样一个例子，所述MNTF肽可被化学交联或与碱性磷酸酶基因融合，并可用酶的显色底物(例如对硝基苯碱性磷酸酯)评估复合物中捕获的MNTF肽的量。同样地，可提供包含MNTF肽和谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白，且通过使用1-氯-2，4-二硝基苯检测GST活性来定量复合物的形成(Habig et al.，J Biol Chem，249：7130(1974))。对于用于定量在复合物中捕获的蛋白之一的免疫检测，可使用抗所述蛋白的抗体(如抗MNTF肽抗体)。或者，在复合物中要被检测的蛋白可为以融合蛋白形式“附加表位标签的”，其除了所述MNTF肽或MNTF肽序列之外，包括针对易得(例如，来自商业来源)抗体的第二多肽。例如，也可使用抗GST部分的抗体将上文所述GST融合蛋白用于结合的定量。其他有用的表位标签包括：包括从c-myc的10个残基序列的myc表位(例如见Ellison et al.，J Biol Chem 266：21150-21157(1991))及pFLAG系统(International Biotechnologies，Inc.)或pEZZ蛋白A系统(Pharamacia，N.J.)。

组合物

药物组合物包括与药学可接受稀释剂和/或载质一起的本文所公开的一种或多种MNTF肽或其类似物。合适的载质/稀释剂为本领域所熟知，且包括盐水或其他无菌水介质，其任选包括更多的成分，如盐缓冲液和防腐剂、或糖、淀粉、盐或其混合物。

可以适于施用方案和/或患者需要的任何合适形式提供包含MNTF肽的组合物来使用。

本文所述技术包括对建立和繁殖干细胞、神经前体细胞、分化的神经细胞和干细胞衍生的运动神经元有用的培养基。所述培养基特别适于干细胞的分化和干细胞衍生的运动神经元的长期培养。

需要用成形素和/或生长因子补充所述细胞培养基，并依据希望培养的个体细胞类型对其进行优化。所述补充和优化在本领域普通技术人员了解内。在一些实施方式中，可用在下列近似水平(或在一有效数字内)的任何或全部下列成形素和/或生长因子补充所述细胞培养基：0.001～1μM的RA，0.001～1μM的Shh或Shh拮抗剂和/或0.01～250μg/ml的一种或多种MNTF肽或其类似物。

本文所述的药物制剂包括作为可选成分的药学可接受载质、稀释剂、增溶剂或乳化剂及在本领域可用的盐类型。所述物质的例子包括正常的盐溶液(如生理缓冲的盐溶液和水)。在药物制剂中有用的载质和/或稀释剂的具体非限制性例子包括水和生理可接受的缓冲盐溶液(如pH 7.0～8.0的磷酸盐缓冲溶液)。适合的药用载质包括，但不限于：无菌水、盐溶液(如Ringer’s溶液)、醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物(如乳糖、直链淀粉或淀粉)、硬脂酸镁、滑石粉、硅酸、粘性石蜡，脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。所述药用制剂可为无菌和需要的，且其可与不与活性化合物发生有害反应的助剂(例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂，着色剂和/或芳香物质等)混合。如需要，其也可与其他活性物质(例如酶抑制剂)结合以降低代谢降解。

可在药物组合物中配制本文所提供的化合物，其除了所述肽之外，可包括药学可接受载质、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、中性或阳离子脂质、脂质复合物、脂质体、渗透增强剂、载质化合物及其他药学可接受的载质或赋形剂等。

一般以为了治疗目的的施用制备药物组合物。药物组合物也包括一种或多种有效成分(如干扰素、抗菌药物、消炎剂、麻醉剂等)。胃肠外递送的制剂可包括还可包含缓冲剂、脂质体、稀释剂及其他合适的添加剂的无菌水溶液。包含本文所提供的肽的药物组合物包括渗透增强剂以加强肽的消化道递送。渗透增强剂可被分类为属于五个大类别即脂肪酸、胆汁盐、螯合剂、表面活性剂和非表面活性剂之一(Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems8，91-192(1991)；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 7，1-33(1990))。可包括来自所述大类别的一个或多个的一种或多种渗透增强剂。

作为渗透增强剂的各种脂肪酸及它们的衍生物包括例如：cabrylic酸、戊酸、油酸、月桂酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、蓖酸酯、甘油单油酸酯(又名1-单油酰基-消旋-甘油酯)、二月桂精、辛酸、花生四烯酸、甘油1-癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱、单-和二-甘油酯及它们的生理可接受的盐(即油酸盐、月桂酸盐、癸酸盐、肉豆蔻酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、亚油酸盐等)。(Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems page 92(1991)；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 7，1(1990)；El-Hariri et al.，J.Pharm.Pharmacol.44，651-654(1992))。

在某些实施方式中，例示MNTF肽类似物包括具有渗透增强剂(例如被共价连接至所述肽上的一个或多个功能基的一种或多种脂肪酸)的MNTF肽的功能衍生物。在一些实施方式中，所述MNTF肽类似物包括在SEQ ID NO：1～22中所示且还具有用渗透增强剂(例如脂肪酸和/或从2～22个碳原子的烷羰基(Alk-C(O)-))的N-末端修饰的肽，和/或具有保护基(其选自：苄氧羰基、叔丁氧羰基、芴-甲氧羰基和烯丙氧基羰基)的MNTF肽的功能衍生物，且Y为OH或NH₂。在一些实施方式中，所述烷羰基包含10～20、12～18或2～22个碳。在某些实施方式中，在MNTF肽类似物上适合的N末端修饰为通过棕榈酰化(例如棕榈酸)。

胆汁的生理作用包括脂质和脂溶性维生素分散和吸收的促进作用(Brunton，Chapter 38In：Goodman  & Gilman’s ThePharmacological Basis of Therapeutics，9th Ed.，Hardman et al.McGraw-Hill，New York，N.Y.，pages 934-935(1996))。各种天然胆汁盐及其合成衍生物可作为渗透增强剂。因此，术语“胆汁盐”包括天然存在的任何胆汁成分及任何其合成的衍生物。

可使用包含一种或多种渗透增强剂的复合物制剂。例如可使用胆汁盐与脂肪酸组合来制备复合物制剂。螯合剂包括但不限于：乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(如水杨酸钠、5甲氧基水杨酸盐和高香草酸盐)、胶原的N-酰基衍生物、聚乙二醇单十二醚-9及β-二酮(烯胺)的N-氨酰基衍生物(Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems page 92(1991)；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 7，1-33(1990)；Buur et al.，J.Control Rel.14，43-51(1990))。螯合剂具有也充当DNA酶抑制剂的添加优势。

表面活性剂包括例如：十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂醚和聚氧乙烯-20-十六烷基醚(Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems page 92(1991))；及全氟化合物乳剂(如FC-43)(Takahashi et al.，J.Pharm.Phamacol.40，252-257(1988))。非表面活性剂包括例如：不饱和的环尿素、1-烷基-和1-烯基氮杂环-链烷酮衍生物(Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems page 92(1991))；及非甾体消炎剂(如双氯芬酸钠，吲哚美辛和保泰松)(Yamashita et al.，J.Pharm.Pharmacol.39，621-626(1987))。

通常的药学可接受的载质包括，但不限于：结合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)、填料(例如乳糖及其他糖类、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)、润滑油(例如，硬脂酸镁、滑石粉、氧化硅、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、醋酸钠等)、解体剂(例如淀粉、淀粉羟乙酸钠等)或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠等)。

本文所提供的组合物另外还包含在药物组合物中以其领域中建立的使用程度按惯例发现的其他辅助成分。因此，例如所述组合物可包含更多的兼容性药学活性材料(如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或消炎药)，或可包含在本文所述的物理配制的各种剂量形式的组合物中有用的更多材料，如染料、香料剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当添加所述材料时，其不应过度干扰本文所提供组合物成分的生物活性。

无论通过何种方法将化合物导入至患者内，可使用胶体分散系统作为递送媒质以增强肽的体内稳定性和/或使所述肽靶向特定的器官、组织或细胞类型。胶体分散系统包括但不限于：高分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束、脂质体和脂质：未鉴定结构的肽复合物)。胶体分散系统的例子为多种脂质体。脂质体为微观球体，其具有由双层构型中排列的脂质构成的一个或多个外层包围的水性核心(通常见Chonn et al.，Current Op.Biotech.6，698-708(1995))。

在某些实施方式中，可将MNTF肽及MNTF类似物并入生物分布导向部分(包括一种或多种聚合物)或与其结合使用，以导向本文提供的MNTF肽或MNTF类似物或其他化合物的生物分布邻近所需目标或允许它们的连续释放。活性剂包括例如对提高治疗效果、对优化生物分布和生物利用度、对减少组织损伤、对促进愈合或对提高患者的舒适度有用的化合物；例示活性剂包括：血管活性剂、麻醉剂，针对缺血的治疗剂、生长因子和细胞因子。或者，可在本文提供的组合物中使用微米颗粒或纳米颗粒聚合物珠剂型。本文所提供化合物可与活性剂结合使用，且可在具有大量连接至其上的配体或抗配体分子的颗粒剂型中被包裹。

本文单独或与其他的活性剂组合提供的MNTF肽和MNTF类似物及其他化合物以所述方式随着时间被释放来提供持续的治疗效果。对于在本文所述的方法中有用的其他活性剂(如生长因子、细胞因子等)，持续释放的剂型也是有用的。由于扩散和颗粒基质侵蚀，来自颗粒剂型的活性剂释放可发生。生物降解速度直接影响活性剂释放动力学。

在某些实施方式中，本文所述MNTF肽、MNTF类似物和化合物的控制释放的胃肠外制剂可被制成植入物、油性注射或颗粒体系。颗粒体系包括：微球、微颗粒、微囊、纳米囊、纳米球和纳米颗粒。微囊包含作为中央核心的治疗蛋白。在微球中所述治疗物被分散在整个颗粒中。可将脂质体用于控制的释放及捕获的药物的药物靶向。

在某些实施方式中，可局部(locally)、局部(topically)、经鼻、口服、胃肠道、气管内、膀胱内、阴道内、至子宫、皮下、肌肉、关节周围、关节腔内、至脑脊液(ICSF)、至脑组织(如颅内施用)、至脊髓、至伤口、腹膜内或胸腔内或全身(例如静脉内、动脉内、肝门内或直接至器官)施用本文所述的包含MNTF肽和MNTF类似物的药物组合物。

如本领域已知，可使用各种导管或递送途径来完成冠状动脉内递送。例如，适于本文所述用途的各种通用导管及改良导管可从商业供销商(如Advanced Cardiovascular Systems(ACS)、Target Therapeutics和Cordis)处获得。此外，如本领域已知，在通过直接注射进冠状动脉完成心肌递送的情况下，可使用大量方法来将导管导入到冠状动脉内。举例而言，可将导管便利的导入股动脉并将其逆行穿过髂动脉和腹主动脉而进入冠状动脉内。或者，最初将导管导入肱动脉或颈动脉内并使其逆行穿过至冠状动脉。本领域可发现所述及其他技术的详细描述(见例如Topol，E J(ed.)，The Textbook of Interventional Cardiology，2nd Ed.(W.B.Saunders Co.1994)；Rutherford，RB，Vascular Surgery，3rd Ed.(W.B.Saunders Co.1989)；Wyngaarden J Bet al.(eds.)，The Cecil Textbook of Medicine，19th Ed.(W.B.Saunders，1992)；及Sabiston，D，The Textbook of Surgery，14th Ed.(W.B.Saunders Co.1991))。

可胃肠外施用本文所提供的化合物。某些化合物可与药学可接受载质或稀释剂结合以制备药物组合物。合适的载质和稀释剂包括等渗盐溶液，例如磷酸盐缓冲液。可为胃肠外、肌肉内、脑内、静脉内、皮下或透皮施用制备所述组合物。施用的制剂可包含所述试剂。所述试剂的例子包括阳离子剂(例如磷酸钙和DEAE-葡聚糖)和脂转染剂(例如lipofectamTM和transfectamTM)。

局部施用的制剂可包括：贴剂、软膏、洗剂、乳剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规的药学载质、水、粉末或含油碱、增稠剂等可为必要和希望的。涂层手套、避孕套等也是有用的。口服施用的组合物包括粉末或颗粒、水或非水介质的悬液或溶液、胶囊、药囊或药片。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散剂或粘合剂是希望的。胃肠外施用的组合物可包括可包含缓冲剂、稀释剂或其他适合的添加剂的无菌水溶液。在一些情况下，将用肽治疗患者与其他传统的治疗方式相结合以提高治疗方案的功效。本文所用术语“治疗方案”应包含治疗性、姑息性和预防性方式。

剂量可取决于大量因素，其包括要治疗的病情的严重性和反应性，和持续数天至数月的治疗过程、或直到实现治疗或达到病情的减弱。可通过标准的药学方案在细胞培养物或实验动物中确定本文所提供的化合物的毒性和疗效。例如，可确定LD₅₀(致死群体的50％的剂量)和ED₅₀(对群体中50％治疗有效的剂量)。在毒性和疗效间的剂量比为治疗指数，且其可用LD₅₀/ED₅₀表示。显示出大治疗指数的化合物是有用的。当使用显示毒性副作用的化合物时，应小心设计递送系统，其可将所述化合物靶向至感染组织的位点以使其对未感染细胞的潜在损害最小化并由此减少副作用。

可在制备一系列人体中使用的剂量中使用从细胞培养物测定和动物研究中获得的数据。所述化合物的剂量在包括有很小或没有毒性的ED₅₀的一系列循环浓度内。取决于使用的剂型和使用的施用途径，所述剂量在所述范围内变化。对于本文所用的任何化合物，最初可由细胞培养物测定估计治疗有效剂量。可在动物模型中制定剂量以达到循环的血浆浓度范围，其包括在细胞培养物中确定的IC₅₀(即达到了症状的半-最大抑制的测试化合物的浓度)。可使用所述信息来更准确的确定在人体中有用的剂量。例如可通过高效液相色谱测量血浆中的水平。可从患者体内药物积累量的测量计算剂量方案。剂量可依个体化合物(包括MNTF肽和MNTF类似物)的相对功效而变化，且通常基于动物模型体内和体外发现的有效EC50s对其进行估计。本领域技术人员应理解所述剂量将依MNTF肽或其类似物如何和在哪里被施用(例如体外、体内、局部、全身等)而变化。

例如，一方面，可施用MNTF肽和MNTF类似物以在靶位点处(在ES干细胞的细胞培养物中)达到约0.01微克/毫升(μg/mL)～约1mg/ml、约0.1μg/mL～约50μg/mL、约0.1μg/mL～约150μg/mL、约1μg/mL～约200μg/mL及约0.1μg/mL～约500μg/mL(包括所述范围的任一范围)的最终浓度。

取决于施用的途径，替代性的合适剂量可从例如约0.1μg至约1g的总剂量而变化。在文献中提供了递送具体剂量和具体方法的指导且对于本领域从业者通常可得。本领域技术人员将使用不同的核苷酸制剂，而非蛋白或其抑制剂。同样地，本文所提供的多核苷酸、多肽和化合物的递送对具体的细胞、条件和位置是特异的。通常而言，剂量通常在0.01mg/kg～1000mg/kg体重的范围中，且更通常在例如0.1mg/kg～300mg/kg体重的范围中，并可以每天、每周、每月或每年一次或多次，或甚至在2～20年的时间跨度期间一次或多次递送。在某些实施方式中，可在手术后24小时即刻给定剂量。在另一实施方式中，可从2小时至达24小时间给定剂量。取决于颗粒制剂的半衰期和清除率，可每3～4天、每周或每两周施用长效组合物。基于在体液或组织中测量的药物残留时间和浓度，本领域普通技术人员可轻易估计给药的重复频率。成功治疗后，需要使患者经历维持性治疗以防止病情的复发，其中以在0.01mg/kg～100mg/kg体重的范围内的维持剂量、每天一次或多次至每20年一次施用所选定化合物。在某些疾病的治疗或预防中，适当的剂量水平通常应为约0.001mg/kg～100mg/kg患者体重/天，其可以单剂量或多剂量施用。合适的剂量水平可为约1～约40mg/kg/天。在某些实施方式中，以达到约1μmol～约1mmol、约10μmol～约500μmol、或约30μmol～约300μmol和约25μmol～约300μmol损伤位点上最终浓度的体内浓度，且包括约25μmol、或约220μmol或约300μmol损伤位点上的最终浓度，且仍更通常在约1μmol～约100μmol之间的量施用本文所提供的包括MNTF肽或其类似物的化合物。

在某些实施方式中，可施用1、5、10、20、50、100、150或200mg/kg的剂量。

可在诊断、治疗、预防中、及作为研究试剂和在试剂盒中使用本文所述化合物。可常规完成用于检测目的化合物(例如MNTF肽和MNTF类似物)的方法的规定。所述规定可包括酶缀合、放射性标记或任何其他合适的检测系统。也可制备用于检测目的化合物有无的试剂盒。

本文所用脊髓损伤可包括由肿瘤、机械性损伤和化学性损伤所致的损伤。

在某些方面，提供了组合物和治疗性治疗方法，其包含当神经通路被损伤或预期所述损伤时，以足以维持神经通路(包括修复损伤的通路或抑制其上的更多损伤)的时间和浓度给受试者施用本文所定义的治疗有效量的MNTF肽或其类似物。

另一方面，本文所述技术包括用于维持神经通路的组合物和治疗性治疗方法。所述治疗方法包括当神经通路被损伤或预期所述损伤时，给受试者施用可刺激内源性MNTF的治疗有效浓度的化合物。

本文所述的方面和实施方式提供了保护神经元不受与神经损伤的机体免疫和发炎反应有关的组织破坏性影响的方法。

在某些实施方式中，提供了刺激损伤的神经元和神经通路的细胞修复(包括再生损伤的树突或轴突)的方法、组合物和装置。

一方面，本发明的MNTF肽或其类似物在修复损伤的外周神经系统神经通路中是有用的。尤其，MNTF对修复损伤的神经通路(包括切断或损伤神经纤维)有用。具体而言，本文所述MNTF能刺激完整轴突的神经再生(其包括髓鞘的血管化和再造化)。可用能在位点处维持MNTF的生物兼容性、生物吸收性载质给损伤位点提供所述MNTF，且如果需要的话，可提供指导轴突从切断神经元的近端向远端生长的方法。例如，当要诱导的神经再生超过延伸距离，例如大于10mm时，需要指导轴突生长的方法。设想了能提供所述功能的许多载质。例如，有用的载质包括本文所公开的基本不溶性材料和粘性溶液，其包含：层粘连蛋白、透明质酸或胶原、或其他合适的合成、生物兼容性聚合物材料(如聚乳酸、聚羟基乙酸或聚丁酸和/或它们的共聚物)。

在某些实施方式中，在跨越损伤通路的神经向导通道中安置MNTF肽或其类似物。所述通道可起到保护覆盖和用于指导突起生长的物理方法的作用。有用的通道包含生物兼容性膜，其在结构上为管状的、具有足以横跨待修复神经中缺口的直径，且具有适于接受切断的神经末端的开口。所述膜可由任何生物兼容性、无刺激性材料(如硅酮或生物兼容性聚合物(如聚乙烯或聚乙烯醋酸乙烯酯))制成。所述外壳也由生物相容性、生物吸收性聚合物(包括例如胶原、透明质酸、聚乳酸、聚丁酸和聚羟基乙酸)组成。在一实施方式中，所述通道的外部表面基本上不通透。

另一方面，本文所述的MNTF肽及其类似物可被用于保护不受与响应针对初始神经组织的损伤的机体免疫/发炎应答有关的损伤。所述应答可后随例如由自身免疫功能障碍、肿瘤病变、感染、化学或机械损伤、疾病，由流向神经元或神经胶质细胞的血液的阻断，或由其他的神经创伤或周围材料引起的神经组织创伤。例如，认为在栓塞中风中由神经血液供应的阻断之后的缺氧或缺血再灌注所致的原发性损伤是免疫相关的。另外，与大量原发性脑肿瘤相关的至少部分损伤似乎也是免疫相关的。MNTF肽或其类似物的应用直接或系统的缓解和/或抑制针对神经损伤的免疫相关应答。

在一实施方式中，本文所述技术包含本文所述的MNTF因子中的任何一种的生物活性类(系统发育)变异体(其包括保守氨基酸序列变异体；由简并核苷酸序列变异体编码的蛋白；享有保守的MNTF结构域、且由在标准的严格条件下杂交至编码本文所公开、包含的MNTF因子的DNA的DNA编码的MNTF因子)的使用。

本文所述化合物也可用于研究的目的。因此，由所述肽显示的特异性杂交可被用于测定、纯化、细胞产品制备及在本领域普通技术人员所了解的其他方法中使用。

本文所用的技术性和科学性术语具有由本公开内容所属领域中的普通技术人员普遍理解的含义，除非另有定义。本文参考本领域技术人员已知的各种方法。阐述参考的所述已知方法的出版物及其他材料通过引用而像全面阐述样整体并入本文。阐述重组DNA技术的普遍原理的标准参考文献包括：Sambrook，J.，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Planview，N.Y.(1989)and Molecular Cloning：A Laboratory Manual，third edition(Sambrook and Russel，2001)，jointly and individually referred to herein as“Sambrook”；McPherson，M.J.，Ed.，Directed Mutagenesis：A Practical Approach，IRL Press，Oxford(1991)；Jones，J.，Amino Acid and Peptide Synthesis，Oxford Science Publications，Oxford(1992)；Austen，B.M.andWestwood，O.M.R.，Protein Targeting and Secretion，IRL Press，Oxford(1991)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，ed.，1987)；Handbook ofExperimental Immunology(D.M.Weir & C.C.Blackwell，eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller & M.P.Calos，eds.，1987)；Current Protocols in Molecular Biology (F.M.Ausubel et al.，eds.，1987，including supplementsthrough 2001)；PCR：The Polymerase Chain Reaction，(Mullis et al.，eds.，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.，eds.，1991)；The Immunoassay Handbook(D.Wild，ed.，Stockton Press NY，1994)；Bioconjugate Techniques(Greg T.Hermanson，ed.，Academic Press，1996)；Methods of Immunological Analysis(R.Masseyeff，W.H.Albert，and N.A.Staines，eds.，Weinheim：VCH Verlags gesellschaft mbH，1993)，Harlow and Lane(1988)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，New York，and Harlow and Lane(1999)UsingAntibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY(jointly and individually referred to herein as Harlow and Lane)，Beaucage et al.eds.，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons，Inc.，New York，2000)；and Agrawal，ed.，Protocols forOligonucleotides and Analogs，Synthesis and Properties Humana Press Inc.，New Jersey，1993)；Teratocarcinomas and embryonic stem cells：A practical approach(E.J.Robertson，ed.，IRL Press Ltd.(1987)；Guide to Techniques in Mouse Development(P.M.Wasserman et al.eds.，Academic Press(1993)；Embryonic StemCell Differentiation in vitro(M.V.Wiles，Meth.Enzymol.225：900(1993)；Properties and uses of Embryonic Stem Cells：Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy(P.D.Rathjen et al.，Reprod.Fertil.Dev.，10：31(1998))；CNS Regeneration：Basic Science and Clinical Advances，M.H.Tuszynski & J.H.Kordower，eds.，Academic Press，(1999)。

在各种专利和专利申请中描述了在本文所公开技术的应用中有用的某些技术，所述专利和专利申请包括：报道了从脑组织获得的多能神经干细胞的美国专利No.5,851,832；报道了从新生儿大脑半球产生神经母细胞的美国专利No.5,766,948；报道了哺乳动物神经嵴干细胞的使用的美国专利No.5,654,183和5,849,553；报道了从哺乳动物多能CNS干细胞培养物体外产生分化的神经元的美国专利No.6,040,180；报道了神经上皮干细胞、少突胶质细胞-星形胶质细胞前体、种系限制性的神经元前体的产生和分离的WO 98/50526和WO99/01159；及报道了从胚胎前脑获得并用包含葡萄糖、转铁蛋白、胰岛素、硒、孕酮及许多其他生长因子的培养基培养的神经干细胞的美国专利No.5,968,829。

可在实行本文所述技术中利用技术人员已知的任何合适材料和/或方法；然而，本文描述了材料和/或方法的非限制性例子。

可参考下列实施例、通过举例的方式而不通过限制的方式提供的某些方面中了解本文所述技术。可从商业来源获得在下列例子中参考的材料、试剂等，除非另有强调。

如本文所用，希望可通过在下列例子中所述的基本相似和/或相同的方案确定MNTF肽和序列和/或其功能类似物的功效。此外，希望可依据本文所述的实验条件确定在SEQ ID NO：1～22所述的任何MNTF肽及其类似物的效力。

实施例1

在大鼠运动神经元细胞体外存活模型中MNTF肽或其类似物减弱 细胞死亡的功效的测试

实施例1示在大鼠运动神经元细胞体外存活模型中运动神经元营养因子(MNTF)的6氨基酸类似物(GM6)和各种更短的肽类似物减弱细胞死亡的能力。以10μg/ml进行的GM6(SEQ ID NO：2)及其他类似物(3聚体、4聚体、5聚体)的施用证明了为类似物特异性的运动神经元细胞死亡的减弱。所述类似物显示了使用包含最有效的末端苯丙氨酸的类似物的营养作用的独特模式。所述数据表明在运动神经元细胞存活模型中GM6和一些类似物为有效的营养因子。

本实施例中的缩写/术语

“GM6”和“6聚体”指MNTF的例示6氨基酸肽类似物。

“Genervon”和“GB”指Genervon Biopharmaceuticals，LLC。

“I.V.”指静脉内。

“NTS”指Neurological Testing Service，其为约定研究组织。

GM6为合成的6氨基酸肽。以固体提供GM6，且通过NTS制备制剂(在4℃储存的溶液)。GM6类似物包括GM6肽的序列同源物。

“PD”指帕金森氏症。

“BDNF”指脑源性神经营养因子。

“GDNF”指胶质细胞源性神经营养因子。

“CNTF”指睫状神经营养因子

“Genervon”指Genervon Biopharmaceuticals，LLC

“GB”指Genervon Biopharmaceuticals，LLC

方法和材料

运动神经元的纯化和培养。从E14.5 Sprague-Dawley大鼠(Charles River Labs)中制备脊髓运动神经元培养物。简言之，在0.025％胰酶(Gibco)中于37℃消化解剖的脊髓8分钟。将组织转移至包含补充2％马血清(Gibco)、胰岛素(5μg/ml)；腐胺(1×10□4M)、伴清蛋白(100μg/ml)、亚硒酸钠(3×10□8M)、孕酮(2×10□8M)、葡萄糖(3.6mg/ml)、青霉素(100IU/ml)、链霉素(100μg/ml)、DNA酶(100μg/ml)和牛血清白蛋白(BSA；0.4％)的L-15培养基(Gibco)的溶液。然后用1-ml pipetman磨碎所述组织，并经在L-15中10.4％Optiprep(Nycomed Pharma)的缓冲垫在15mlFalcon管中分层所述悬液。将分层的悬液以830×g离心15分钟。在包含0.5％BSA的PBS中悬浮分界面处的细胞，并使用IgG-192 p75特异性抗体通过免疫亲和进行分离，随后通过使用磁微珠(Miltenyi Biotec)的细胞分选来纯化所述运动神经元。所述运动神经元培养基由补充B27补充物(Gibco)、谷氨酸(25μM)、2-巯基乙醇(25μM)和2％马血清的神经基础培养基(Gibco)构成。除非另有说明，所述运动神经元以3000细胞/盖玻片的密度被放置到包被层粘连蛋白的盖破片上。在细胞接种的时间添加神经营养因子的混合物(NTF：1ng/ml BDNF、100pg/ml GDNF、10ng/ml CNTF)。在培养24小时后，在缺乏NTF的运动神经元培养基中通过不同的稀释类似物的添加来处理运动神经元。

存活测定。如上所述从E14.5大鼠胚胎中制备脊髓运动神经元。在NTF存在下培养细胞24小时，且通过计算钙黄绿素AM-阳性细胞数来评估活力(V1)。为进行活力研究，在不存在NTF，但添加类似物或GM6下培养运动神经元。通过计算神经元数来计算存活的运动神经元的百分比。

统计学分析。以在NTF单独存在(对照)下存活的运动神经元数的百分比表示对于各处理的存活的运动神经元数。每种条件使用五个皿。通过用post hoc Tukey’s测试的单因素ANOVA分析了处理组间的差异的统计学意义。

处理组。所有组经受了GM6、类似物或对照。

GM6

2309

2308

2307

2312

2311

2310

3223

3222

3221

No NTF

结果

细胞存活。在大鼠运动神经元细胞体外存活模型中评估GM6和类似物的营养作用。以在NTF单独存在(对照)下存活的运动神经元数的百分比表示每个处理组存活的运动神经元数。在表1和图1中总结所述数据。

表1MNTF肽及其在运动神经元存活中营养功效的总结

CS货号#	SEQ ID NO：	MN存活率(％对照)	P值
				GM6(GMP014)	SEQ ID NO：2	94.02±3.53	＜0.0001
2309	SEQ ID NO：12	81.5±4.50	＜0.0001
				2308	SEQ ID NO：6	66.38±5.86	0.00012
2307	SEQ ID NO：4	35.00±5.28	0.017
				2312	SEQ ID NO：17	12.02±2.31	0.69
2311	SEQ ID NO：18	9.66±2.50	0.39
				2310	SEQ ID NO：19	12.26±1.70	0.70
3223	SEQ ID NO：20	15.46±1.82	0.73
				3222	SEQ ID NO：21	10.64±1.72	0.46

3221	SEQ ID NO：22	9.08±2.32	0.33
				No NTF		13.92±3.42	N/A

NA＝不适用的

使用10μg/mL的每种溶液。

通过固相合成制备3、4、5聚体组以代表由从N末端至C末端开始发生的6聚体序列Phe-Ser-Arg-Tyr-Ala-Arg的降解所致的6聚体的代谢产物。在最终产物中肽的量通常为约80％，水含量和醋酸离子通常占约20％。

以10μg/ml剂量进行的GM6(SEQ ID NO：2)或包含N-末端苯丙氨酸的类似物的施用证明了在缺乏常规NTF的培养基中免受神经元细胞损失的保护。这表明GM6及其类似物在维持细胞在大鼠运动神经元细胞培养物中存活上是有效的且对于治疗运动神经元相关疾病是有益的。

所有专利、出版物、科学文章、网站及本文参考或提及的其他文献和材料显示了本公开内容所属领域技术人员的技术水平，且各所述参考文献和材料通过引用以其已通过独立的整体并入或通过整体阐述本文的相同程度并入本文。申请者保留将来自任何所述专利、出版物、科学文章、网站、电子方式可得的信息及其他参考的材料或文献的任何和全部材料和信息完全并入本说明书的权利。

本文所述的具体方法和组合物为一些代表性的实施方式且为例示的且不希望其作为随附的权利要求的范围上的限制。本领域技术人员基于本说明书可想到其他的目的、方面和实施方式，且其被包含在通过权利要求的所述范围所定义的公开内容的精神内。本领域技术人员明晰对本文所公开技术做出的不同取代和修饰不背离其范围和精神。本文所述的适合的例示技术可在无任何一种或多种因素、或一种或多种限制下被应用，其在本文中不需要被具体公开。因此，例如，在本文的每一种情况中，在公开技术的实施方式或例子中，在说明书中术语“包含”、“基本由...构成”和“由...构成”的任一个可用其他两个的任一个来代替。同样，术语“包含”、“包括”、“含有”等可被广泛阅读且没有限制。本文所述的适合的例示方法和程序可以不同顺序的步骤应用，且其不必要限制于本文或权利要求中指明的步骤顺序。同样如在本文和在随附的权利要求中所用，“a”、“an”和“the”包括复数参考含义，除非文中另有明确规定。在任何情况下所述专利都不可被解释为限于本文所具体公开的具体例子或实施方式或方法。在任何情况下所述专利都不可被解释为由任何审查员或任何其他官员或专利和商标局的雇员做出的声明所限制，除非所述声明由申请人通过书面回应而具体地及没有资格或保留的明确采用。

已采用的术语和表达可被用作描述性而非限制性的术语，且不打算在所述术语和表达的使用中排除显示和描述功能的等效物或它们的一部分，认为各种修饰在权利要求所述技术的范围内是可能的。因此，认为尽管本技术已通过某些实施方式被具体公开，但可由本领域技术人员采取本文所公开概念的任选特征、修饰和变异，且认为所述修饰和变异在由随附的权利要求所定义的本发明范围内。

本文已广泛或笼统的描述了所述技术。在通用公开内容内的狭义种和亚属组的每一个也形成了部分公开内容。无论除去材料是否为具体描述的，其包括有从属中去除任何主题的附文或负面限制的技术的通用描述。

其他实施方式在下列权利要求内。此外，当由Markush组描述所述技术的特征或方面时，本领域技术人员认为从而也可由Markush组成员亚组或任何单独的组员描述所述技术。

Claims (17)

1.MNTF肽或其类似物，其选自由SEQ ID NO：1的2个和6个之间的连续氨基酸或其功能衍生物构成的肽，其中所述MNTF肽或其类似物表现出MNTF活性，且所述MNTF肽或其类似物不具有由SEQ ID NO：2构成的氨基酸序列。

2.权利要求1的MNTF肽或其类似物，其至少含SEQ ID NO：1的氨基酸残基17和18。

3.权利要求1的MNTF肽或其类似物，其选自SEQ ID NO：3～SEQID NO：22。

4.权利要求1的MNTF肽或其类似物，其由SEQ ID NO：1的至少3个连续氨基酸构成。

5.权利要求1的MNTF肽或其类似物，其由SEQ ID NO：1的2个和5个之间的连续氨基酸构成。

6.权利要求1的MNTF肽或其类似物，其由SEQ ID NO：1的3个和5个之间的连续氨基酸构成。

7.权利要求3的MNTF肽或其类似物，其具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

8.权利要求3的MNTF肽或其类似物，其具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

9.权利要求3的MNTF肽或其类似物，其具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列。

10.权利要求1～9中任一项的MNTF肽或其类似物，其中所述MNTF肽或其类似物通过与渗透增强剂共价键合而被修饰，由此所述组合物的组织渗透能力被提高。

11.权利要求10的MNTF肽或其类似物，其中所述MNTF肽或其类似物通过其N-末端与所述渗透增强剂共价键合而被修饰。

12.权利要求11的MNTF肽或其类似物，其中所述渗透增强剂通过一个或多个游离氨基的N-酰基衍生化与所述MNTF肽或其类似物共价连接。

13.权利要求10的MNTF肽或其类似物，其中所述渗透增强剂是任选被取代的2～22碳的烷基羧酸，其中所述烷基羧酸任选被羟基化、不饱和化和/或硫化。

14.权利要求13的MNTF肽或其类似物，其中所述渗透增强剂是选自下列的脂肪酸：cabrylic酸、油酸、月桂酸、癸酸、辛酸、己酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、戊酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、油酸、反油酸、芥酸和神经酸。

15.组合物，其含：

●权利要求1～14中任一项的MNTF肽或其类似物，和

●药学可接受载质。

16.促进神经元生长或维持的方法，所述方法包括：给神经元细胞施用权利要求16的组合物，其中所述组合物具有一种或多种选自下列的生物活性：促进神经元的生长，促进神经元的维持，促进神经轴突突起，促进经轴突切断的运动神经元的轴突再生，促进运动功能，修复损伤的神经通路，再生神经通路或缓解神经元缺陷。

17.缓解患病症动物的神经元病症的方法，所述方法包括：给所述动物施用对缓解所述病症而言有效量的权利要求16的含MNTF肽或其类似物的组合物。

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