CN101374537B - 干细胞的mntf分化和生长 - Google Patents

Abstract

本发明提供了使用运动神经元营养因子(MNTF)或其肽类似物用于诱导胚胎干细胞分化成运动神经元的方法。本发明进一步提供了用于分离干细胞衍生的运动神经元的群体和包含分化的神经细胞的细胞群的方法。此外，本发明指向增强分化的神经细胞在长期细胞培养中的存活的方法。最后，本发明提供了与干细胞结合用于治疗用途的包含MNTF或其肽类似物的组合物。

Description

干细胞的MNTF分化和生长

相关申请

本申请要求来自U.S.S.N.60/735,702、U.S.S.N.60/841,766和美国临时申请号60/XXX,XXX(待指定)的优先权，所述U.S.S.N.60/735,702于2005年11月10日提交，名称为“MNTFDifferentiationandGrowthofStemCells”；所述U.S.S.N.60/841,766于2006年9月1日提交，名称为“MotoneuronTropicfactorDifferentiatesMurineEmbryonicStemCellsIntoMotorNeuronsIndependentoftheSonicHedgehogReceptor”，所述美国临时申请号60/XXX,XXX由Ko，DorothyPui-Yuk于2006年11月10日提交，名称为“MethodsofTreatingNeuronalDisordersusingMNTFpeptidesandanaloguesthereof”，所述专利整体引入本文作为参考。

发明背景

下述包括在本发明理解中可能有用的信息。它并非承认本文提供的任何信息是目前描述或要求保护的发明的现有技术，或与目前描述或要求保护的发明相关，或者明确或含蓄地参考的任何出版物或文件是现有技术。

直到最近，神经科学的坚持见解是成人脑和脊髓中的神经元不能再生。然而，在20世纪90年代中期，神经科学家认识到实际上成人脑的某些部分的确产生新的神经元。这些新的神经元产生于胎儿以及成人脑中的“神经干细胞”。成人中枢神经系统中的再生力的发现提供了下述希望：可能最终能够修复来自神经变性疾病例如肌萎缩侧索硬化(ALS，也称为路-盖里格氏(LouGehrig’s)病)，以及来自起因于中风或创伤的脑和脊髓损伤的损害。然而，从脑中非侵袭性分离和纯化大量神经干细胞仍是具有挑战性的。

另一方面，胚胎干(ES)细胞是自我更新并且具有分化成人生物中的任何细胞类型的能力的多能细胞。它们可以在体外以未分化的状态繁殖长时间段，并且因此代表了用于发育研究和用于人疾病治疗的有吸引力的细胞来源。

ES细胞在移植后对环境引发物有反应，并且采用适合于移植区域的细胞命运。然而，依赖环境引发物以指导干细胞预先排除了神经元在CNS的非神经性区域中的有效产生。

近来，已变得能够离体指导干细胞的分化，在理论上使得这些细胞能够较不依赖于或不依赖于体内引发物。例如，通过使小鼠ES细胞暴露于视黄酸(RA)和音猬可以有效产生脊柱运动神经元。在这个例子中，RA用于神经化并建立关于多能ES细胞的尾部位置鉴定。音猬或猬激动剂(HhAg1.3)进一步指定了腹部位置鉴定，和在应答中大比例的ES细胞起始运动神经元特异性转录模式，并且获得成熟神经元的免疫组织化学特征。将ES细胞衍生的运动神经元移植到鸡胚脊髓内使轴突延伸到外周内并且形成神经肌肉结点[Wichterle，H.，Lieberam，I.，Porter，J.A.&Jessel，T.M.Directeddifferentiationofembryonicstemcellsintomotorneurons.Cell110，385-397(2002)]。

胚胎干(ES)细胞的治疗潜能是有希望的，但在许多情况下受到不能促进分化成特异性细胞类型例如运动神经元的限制。因此，迫切需要从多能干细胞产生更均质的分化细胞群的技术。

来自大鼠肌肉组织的2种运动神经元营养因子(MNTF1和MNTF2)的分离和表征以及衍生自人视网膜母细胞瘤cDNA文库的重组MNTF1-F6基因的随后克隆在美国专利号6,309,877、6,759,389和6,841,531(以及共同未决的美国专利申请序列号10/858,144、10/858,286、10/858,543和10/858,545)中得到描述。如国际申请号PCT/US2004/038651中所述，发现编码与MNTF1有关的多肽的核苷酸序列位于人染色体16q22内。

MNTF1-F6基因序列编码33个氨基酸的序列。天然存在的和重组MNTF1多肽显示选择性增强从大鼠腰脊髓外植体中分离的前角运动神经元的体外存活。处理的培养物的显微照片显示有髓鞘的神经纤维的神经突长出和非神经元细胞生长的显著降低，所述非神经元细胞例如神经胶质细胞和成纤维细胞。类似地，MNTF1体内施用于用手术切断轴突的大鼠周围神经导致比未处理的对照明显更高百分比的存活运动神经元，这可以通过共施用抗MNTF1单克隆抗体来阻断。

MNTF1的进一步有利效应在大鼠中得到证实，对大鼠实施脊髓半切除，通过周围神经自体移植修复，并且用包含MNTF1的凝胶段在紧密接近于脊髓与神经移植物的结点处植入。MNTF1处理的动物显示出更多数目的存活运动神经元，运动和感觉功能的改善恢复，在移植位点处减少的炎症应答(更少的浸润巨噬细胞和淋巴细胞)和减少的包含胶原的瘢痕组织形成，正常的许旺细胞形态和正常的有髓鞘的和无髓鞘的神经纤维形成。

MNTF在神经变性疾病治疗中的功效也在摇摆小鼠动物模型中得到证实。摇摆小鼠携带导致脊柱和脑干运动神经元的进行性变性的常染色体双隐性基因突变。在斜方肌和菱形肌与脊髓的C7-T3区域之间植入包含MNTF1的凝胶段延迟了摇摆小鼠中的症状进展，导致与对照组比较，生存期、健康、呼吸、体重、前肢力量以及其颈部运动神经元减少的空泡形成和染色质溶解的总体改善。

看起来对于MNTF1的已知生物活性足够的MNTF1-F6分子内的2个重叠结构域得到鉴定。参见，国际申请号PCT/US04/01468或美国专利申请序列号10/541,343。在本文中命名为“WMLSAFS”和“FSRYAR”结构域的这些结构域中的每一个足以刺激运动神经元衍生的细胞系增殖，其方式类似于MNTF1-F633-聚体。类似地，“FSRYAR”结构域足以在体内指导经由运动神经元的肌肉靶的选择性神经再支配，其方式类似于MNTF1-F633-聚体。此外，“FSRYAR”结构域提供了足以产生抗体的抗原表位，所述抗体识别包含“FSRYAR”序列的任何MNTF肽，包括MNTF1-F633-聚体。

明显地，需要更有效和选择性的方法以指导干细胞特别是ES细胞的增殖和分化，以产生运动神经元的均质群体。这不仅对于干细胞在神经变性病症治疗中的治疗用途可能是重要的，而且还将极大地促进发育的分子机制研究。

发明概述

本文描述和要求保护的本发明具有许多属性和实施方案，包括但不限于，在这个概述中阐述或描述或参考的那些。本文描述和要求保护的本发明不限于这个概述中鉴定的特征或实施方案，所述特征和实施方案被包括仅为了举例说明的目的并且不是限制性的。

在本文中描述了使用MNTF或MNTF肽类似物使ES细胞成功分化成显示成熟运动神经元特有的分子标记的细胞。本发明提供了用于制备和表征适合于用于治疗施用和药物筛选用途的干细胞衍生的运动神经元的组合物、方法和系统。

本发明还提供了用于治疗性干细胞应用或作为细胞培养基的包含MNTF肽的组合物，所述细胞培养基适合于干细胞衍生的运动神经元的分化和维持。关于干细胞的应用包括神经元病症的治疗，例如运动功能的改善。

本发明包括治疗神经元病症的方法。在某些实施方案中，这些方法包括给患者施用运动神经元营养因子(MNTF)肽或其类似物，以调节信号途径来改善或抑制神经元病症的进展。在这种方法的一个优选实施方案中，MNTF肽是长度为6-35个氨基酸，长度为6-33个氨基酸，长度为33个氨基酸(例如SEQIDNO：1)，长度为6个氨基酸(例如SEQIDNO：2)，长度为7个氨基酸(例如SEQIDNO：3)，长度为10个氨基酸(例如SEQIDNO：4)，长度为11个氨基酸(例如SEQIDNO：5)或另一种长度的MNTF类似物。在另一个方面，提供了包括施用这样的肽的方法，所述肽与SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5或本文描述的另一种肽至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％等同。

除了神经元病症的治疗外，本发明进一步包括促进哺乳动物神经元的存活、生长、增殖或维持的方法。在另一个方面，MNTF或MNTF类似物充当神经保护剂。在另一个方面，MNTF或MNTF类似物调节细胞的特定分化途径。在另一个方面，MNTF或MNTF类似物调节蛋白激酶途径或调节酪氨酸激酶或生长因子受体的表达或活性。得到调节的信号转导或蛋白激酶途径可以包括，例如音猬非依赖性途径，音猬依赖性途径或这些的组合。

在某些优选实施方案中，MNTF或MNTF类似物调节不依赖于音猬途径的途径。此类途径一般不依赖于由音猬蛋白与补充受体的结合和猬依赖性信号转导的相关促进所触发的信号转导事件。在其他实施方案中，MNTF或MNTF类似物调节至少部分不依赖于音猬途径的途径。此类途径一般部分不依赖于由音猬蛋白与补充受体的所述结合和猬依赖性信号转导的相关促进触发的信号转导事件。

尽管不希望被束缚于任何理论或机制，但认为本文提供的MNTF或MNTF类似物能够调节下述中的一种或多种的表达或活性：胰岛素受体、IGF-1受体、IGF-2受体、Shh、Akt、Bad(bcl-2的细胞死亡拮抗剂)、PI(3，4，5)P3依赖性激酶1(PDK1)、Bax、p53基因产物、pp60-Src、JAK2、一氧化氮合酶(NOS)、糖原合酶激酶3(GSK)、半胱天冬酶、PI3激酶(磷脂酰肌醇3-激酶)和Ras。在某些实施方案中，MNTF或MNTF类似物调节与酪氨酸-磷酸化的IRS-蛋白质(例如IRS-1、IRS-2、IRS-3和IRS-4)结合的一种或多种蛋白质的表达或活性。在其他实施方案中，下述中的一种或多种的表达或活性得到调节：PI3激酶、p85、P110、GRB2、SHP2、Nck、Crk和Fyn。

存在可以通过本文提供的组合物和方法进行治疗的几种神经元病症和相关适应症，所述组合物和方法促进神经元的分化、维持或存活。被认为从本文提供的MNTF肽或MNTF类似物的施用获益的病症和适应症包括，例如周围神经的再生、脊髓中的轴突再生、促进某些细胞的分化、靶神经元细胞存活的增加、脑血流量的增加、脊髓损伤的治疗、神经变性疾病的治疗、中风或脑缺血症的治疗、亨廷顿氏病的治疗、帕金森氏病的治疗、多发性硬化症的治疗、ALS的治疗、阿尔茨海默氏的治疗、糖尿病神经病变的治疗。本文提供的组合物和方法的另一个有利特征是穿透血脑屏障的能力。这些神经元病症的治疗在整体引入本文作为参考的共同未决申请U.S.S.N.(待指定)中进一步描述，所述共同未决申请U.S.S.N.由Ko，DorothyPui-Yuk于2006年11月10日提交，名称为“MethodsofTreatingNeuronalDisordersusingMNTFpeptidesandanaloguesthereof”。本发明还提供了用于治疗与神经元病症相关的病状和病症的组合物和方法。

此外，本发明提供了用于以干细胞衍生的运动神经元再驻脊髓的方法和用于治疗需要治疗的受试者中的神经组织变性的方法。

已发现当多能干细胞在选择的分化试剂例如单独或组合的RA和MNTF肽类似物的存在下进行培养时，获得含有非常高比例的具有运动神经元特有表型的细胞的细胞群。任选地，通过根据对运动神经元特异的分子标记给分化细胞分类可以增加神经细胞的比例。因为某些类型的多能干细胞(例如胚胎干细胞)可以在培养中增殖一年或更久，所以本公开内容中描述的本发明提供了几乎无限供应的干细胞衍生的运动神经元。

本发明提供了用于诱导胚胎干细胞分化成干细胞后代(例如分化的运动神经元)的方法。在一个实施方案中，第一个步骤是获得或产生胚胎干细胞的培养物。下一个步骤是使胚胎干细胞的培养物与有效产生神经元后代细胞量的视黄酸和有效产生运动神经元量的MNTF肽类似物接触。在另一个实施方案中，本发明旨在使用MNTF或其类似物作为细胞培养中的生长补充物增强干细胞衍生的运动神经元的存活。

本发明进一步提供了包含干细胞衍生的运动神经元的细胞群及其用途。

本发明进一步指向用于分离干细胞衍生的运动神经元的群体的方法。

还提供了将分化的神经干细胞后代(例如运动神经元)移植到宿主内的材料和方法。根据一个实施方案的方法包括下述步骤：i)获得衍生自哺乳动物神经组织(包含至少一种多潜能CNS神经干细胞)的细胞群；ii)在包含长度为6-35个氨基酸的运动神经元营养因子(MNTF)类似物的培养基中培养神经干细胞，所述MNTF类似物在合适的培养条件下诱导多潜能神经干细胞增殖；iii)诱导所述多潜能神经干细胞增殖，以产生包括多潜能神经干细胞后代细胞的神经干细胞后代；和iv)将所述神经干细胞后代移植给宿主。

附图简述

通过参考附图可以更好地理解本发明及其由相关领域中的技术人员理解的优点，其中：

图1显示了测试的MNTF肽的氨基酸序列；

图2比较了在运动神经元特异性HB9启动子的控制下，响应视黄酸(RA)、视黄酸和音猬(RA/Shh)、视黄酸和0.1μg/ml-50μg/ml的MNTF10-聚体(SEQIDNO：4)(MNTF10/0.1-50)以及0.1μg/ml-50μg/ml的MNTF33-聚体(SEQIDNO：1)(MNTF33/0.1-50)的GFP荧光表达；

图3比较了使用检测IR或胰岛素生长因子-1受体(IGF-1R)在pTyr1162/1163(3B)处的自磷酸化的抗体，关于用MNTF33聚体(MNTF33，(SEQIDNO：1)或MNTF33聚体和胰岛素受体(IR)的非特异性抑制剂HNMPA(AM)3处理的胚状体的免疫印迹结果，其作为相对条带强度进行描绘(3A)；

图4比较了用GDNF、NT3、dbcAMP或MNTF肽类似物处理的ES细胞衍生的运动神经元的增加存活，其中存活力百分比在第10天时通过计数具有现有轴突的细胞总数目进行计算；

图5举例说明了在运动神经元特异性HB9启动子的控制下在分化第5天时，响应对照(A)，RA(B)；RA/Shh(C)；环杷明-KAAD，RA/Shh(D)；RA和MNTF33聚体(SEQIDNO：1)(E)；环杷明-KAAD，RA和MNTF33聚体(SEQIDNO：1)(F)的GFP荧光表达的比较；

图6显示了如由响应RA/Shh(A)；RA/MNTF33(B)；RA/MNTF10(C)；HNMPA(AM)3(15μM)/Shh(D)；HNMPA(AM)3/MNTF33(E)；HNMPA(AM)3/MNTF10(F)；PPP(1μM)，RA/Shh(G)；PPP(1μM)，RA/MNTF33(H)；PPP(1μM)，RA/MNTF10(I)的第5天胚状体的GFP荧光表达指出的，IGF1-R抑制剂picrodophyllin不能有效地阻断MNTF诱导分化的活性；

图7举例说明了使用针对PI3激酶的p85亚单位的抗体的蛋白质印迹，所述PI3激酶来自用IGF-1(10nM)(泳道1)、Insulin(100nM)(泳道2)、MNTF6(泳道3)、MNTF10(泳道4)和MNTF33(泳道5)处理5分钟的细胞的ES细胞裂解物。随后使裂解物与蛋白A珠和抗IRS-1抗体一起温育。免疫复合物通过SDS-PAGE(10％)分开，转移至膜，并且通过蛋白质印迹使用针对PI3激酶的p85亚单位的抗体进行分析。

图8举例说明了关于MNTF诱导的ES细胞分化的可能途径。

详述

定义

在一般而言和就各种非限制性具体实施方案而言进一步描述本发明之前，阐述在本发明描述背景下使用的某些术语。除非另有说明，当在本文和附加权利要求中使用时，下述术语具有下述含义。下文或说明书其他地方中未限定的那些术语应具有其公认含义。

在本文提供的化合物(例如肽和蛋白质)中使用的氨基酸可以是遗传编码的氨基酸，天然存在的非遗传编码的氨基酸，或合成氨基酸。上述任何一种的L和D对映体都可以在化合物中使用。下述缩写可以在本文中用于下述遗传编码的氨基酸(及其残基)：丙氨酸(Ala，A)；精氨酸(Arg，R)；天冬酰胺(Asn，N)；天冬氨酸(Asp，D)；半胱氨酸(Cys，C)；甘氨酸(Gly，G)；谷氨酸(Glu，E)；谷氨酰胺(Gln，Q)；组氨酸(His，H)；异亮氨酸(Ile，I)；亮氨酸(Leu，L)；赖氨酸(Lys，K)；甲硫氨酸(Met，M)；苯丙氨酸(Phe，F)；脯氨酸(Pro，P)；丝氨酸(Ser，S)；苏氨酸(Thr，T)；色氨酸(Trp，W)；酪氨酸(Tyr，Y)；和缬氨酸(Val，V)。

并非遗传编码的并且存在于本发明的化合物中的某些常见氨基酸包括但不限于，β-丙氨酸(b-Ala)和其他ω-氨基酸例如3-氨基丙酸(Dap)，2，3-二氨基丙酸(Dpr，Z)，4-氨基丁酸等；α-氨基异丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；甲基甘氨酸(MeGly)；鸟氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；叔丁基丙氨酸(t-BuA)；叔丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基异亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；环己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle，J)；2-萘基丙氨酸(2-Nal)；4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))；青霉胺(Pen)；1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；β.-2-噻吩丙氨酸(Thi)；甲硫氨酸亚砜(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙酰赖氨酸(AcLys)；2，3-二氨基丁酸(Dab)；2，3-二氨基丁酸(Dbu)；p-氨基苯丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基缬氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)；3-苯并噻唑-2-基-丙氨酸(BztAla，B)；和高丝氨酸(hSer)。考虑的另外的氨基酸类似物包括磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、马尿酸、八氢吲哚-2-羧酸、statine、α-甲基丙氨酸、对苯甲酰苯丙氨酸、炔丙基甘氨酸和肌氨酸。包含在本发明范围内的肽可以具有L或D构型的任何前述氨基酸，或本文描述或本领域已知的任何其他氨基酸，无论是目前还是未来的。

可互相替代的氨基酸一般位于相似的种类或亚类内。如本领域技术人员已知的，主要取决于氨基酸侧链的化学和物理性质，可以将氨基酸置于不同的种类内。例如，某些氨基酸一般被视为亲水性或极性氨基酸，和其他的被视为疏水性或非极性氨基酸。极性氨基酸包括具有酸性、碱性或亲水性侧链的氨基酸，和非极性氨基酸包括具有芳香族或疏水性侧链的氨基酸。非极性氨基酸可以进一步再分成尤其包括脂肪族氨基酸。如本文所使用的，氨基酸种类的定义如下：

“非极性氨基酸”指具有在生理pH下不带电，非极性和一般被水溶液排斥的侧链的氨基酸。遗传编码的疏水性氨基酸的例子包括Ala、Ile、Leu、Met、Trp、Tyr和Val。非遗传编码的非极性氨基酸的例子包括t-BuA、Cha和Nle。

“芳香族氨基酸”指具有这样的侧链的非极性氨基酸，所述侧链包含至少一个具有缀合的π-电子系统(芳香族基团)的环。芳香族基团可以进一步替换为取代基例如烷基、烯基、炔基、羟基、磺酰基、硝基和氨基以及其他。遗传编码的芳香族氨基酸的例子包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。常见的非遗传编码的芳香族氨基酸包括苯基甘氨酸、2-萘基丙氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、3-苯并噻唑-2-基-丙氨酸、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。

“脂肪族氨基酸”指具有饱和或未饱和的直链、分支或环状烃侧链的非极性氨基酸。遗传编码的芳香族氨基酸的例子包括Ala、Leu、Val和Ile。非编码的芳香族氨基酸的例子包括Nle。

“极性氨基酸”指具有这样的侧链的亲水性氨基酸，所述侧链在生理pH下是带电的或不带电的，并且具有其中由2个原子共同分享的电子对通过原子之一保持更紧密的键。极性氨基酸一般是亲水性的，意指它们具有由水溶液吸引的侧链的氨基酸。遗传编码的极性氨基酸的例子包括天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和丝氨酸。非遗传编码的极性氨基酸的例子包括瓜氨酸、高半胱氨酸、N-乙酰赖氨酸和甲硫氨酸亚砜。

“酸性氨基酸”指具有小于7的侧链pK值的亲水性氨基酸。由于氢离子的丧失，酸性氨基酸在生理pH下一般具有带负电的侧链。遗传编码的酸性氨基酸的例子包括天冬氨酸(天冬氨酸盐)和谷氨酸(谷氨酸盐)。

“碱性氨基酸”指具有大于7的侧链pK值的亲水性氨基酸。由于水合氢离子的丧失，碱性氨基酸在生理pH下一般具有带正电的侧链。遗传编码的碱性氨基酸的例子包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。非遗传编码的碱性氨基酸的例子包括鸟氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。

“可电离的氨基酸”指在生理pH下可以带电的氨基酸。此类可电离的氨基酸包括酸性和碱性氨基酸，例如D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-精氨酸、D-赖氨酸、D-羟赖氨酸、D-鸟氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-羟赖氨酸或L-鸟氨酸。

如本领域技术人员应当理解的，上文分类法不是绝对的。几种氨基酸显示出超过一种的特征性质，并且因此可以包括在超过一种的类别中。例如，酪氨酸具有非极性芳香族环和极性羟基。因此，酪氨酸具有可以被描述为非极性、芳香族和极性的几个特征。然而，非极性环是占优势的并且因此酪氨酸一般被视为非极性的。类似地，除了能够形成二硫键外，半胱氨酸也具有非极性特性。因此，尽管没有严格分类为疏水性或非极性氨基酸，但在许多情况下半胱氨酸可以用于给肽赋予疏水性或非极性。

在某些实施方案中，由本发明考虑的极性氨基酸包括，例如，精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、高半胱氨酸、赖氨酸、羟赖氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、苏氨酸和结构上相关的氨基酸。在一个实施方案中，极性氨基酸是可电离的氨基酸，例如精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、羟赖氨酸、赖氨酸或鸟氨酸。

可以利用的极性或非极性氨基酸残基的例子包括例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸等。

如本文所使用的，术语“生物活性肽”和“生物活性片段”指依照上文描述的运动神经元分化因子(MNDF)或运动神经元营养因子(MNTF)的肽或多肽，其中MNDF使干细胞分化成运动神经元，和MNTF显示出对干细胞衍生的运动神经元的保护或增殖效应。

“细胞”意指适合于所需应用的任何活细胞。细胞包括真核和原核细胞。

术语“互补的”一般指例如在允许的盐和温度条件下，经由碱基配对的多核苷酸的天然结合。例如，序列“A-G-T”与互补序列“T-C-A”结合。2个单链分子之间的互补性可以是“部分的”，从而使得只有某些核酸结合，或它可以是“完全的”，从而使得总体互补性存在于单链分子之间。核酸分子之间的互补性程度对它们之间的杂交效率和强度具有显著影响。“可杂交的”和“互补的”是这样的术语，其用于指出互补性的足够程度，从而使得足以执行预期作用的结合优选地稳定的结合例如在核酸之间发生。应当理解寡核苷酸无需与其可杂交的靶核酸序列100％互补。

术语“组合物”预期包含含有一种或多种成分的产物。

术语“分化的”是相对术语，其中“分化细胞”是比待针对比较的细胞已沿着发育途径进一步进展的细胞。如本文进一步所使用的，“分化的神经细胞”一般指中枢神经系统(CNS)或周围神经系统(PNS)的部分分化或完全分化的细胞。祖细胞是在发育和分化期间通过一系列细胞分裂产生不同的细胞谱系的母细胞。例如，神经祖细胞被定型为最终将发育成CNS或PNS的完全分化的神经细胞的细胞谱系；然而，此类神经祖细胞可能尚未献身于特定类型，或亚类的神经细胞。神经祖细胞可能变得定型为这样的细胞系，其将分化成特定类型的神经细胞，并且其后产生完全分化的神经细胞。因此，本发明的部分分化的神经细胞可以是具有神经标识的细胞，其已获得定向或定位特性，或已定型为发育成特定种类的神经细胞，但并非完全分化的神经细胞。例如，依照本发明用单独或与成形素例如RA组合的MNTF肽处理ES细胞可以产生部分分化的神经细胞或神经祖细胞。

“病症”是将从使用本发明的分子或组合物的治疗中获益的任何病状，包括本文描述或要求保护的那些。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所述病症的那些病理学条件。

“饲养细胞”或“饲养物”包括一种类型的细胞，其与另一种类型的细胞共培养，一般用于提供其中第二种类型的细胞可以生长的环境。例如，某些类型的pPS细胞可以由原代小鼠胚胎成纤维细胞、或永生化小鼠胚胎成纤维细胞得到支持，其中所述pPS细胞为是非人来源的。

“功能等价物”意指具有基本上类似于MLSAFSRYAR结构域的那种的生物活性的肽，并且预期包括具有此类活性或特征的“片段”、“变体”、“类似物”、“同系物”或“化学衍生物”。MLSAFSRYAR结构域的功能等价物随后可以不共享相同的氨基酸序列，并且常规或非常规氨基酸的保守或非保守的氨基酸置换是可能的。

术语“基因产物”指由基因转录的RNA分子，或由基因编码或由RNA翻译的多肽。

“生长环境”是其中目的细胞在合适的条件下可以在体外增殖、分化或成熟的环境。此类条件可以包括例如，其中细胞进行培养的培养基，可以存在的任何生长因子或分化诱导因子，和固体表面或支持结构。

如本文所使用的，术语“MLSAFSRYAR结构域”指在本文中证实足以使干细胞分化成运动神经元的多肽结构域，并且指能够模拟其结构和/或功能的肽和/或分子。本发明的优选形式利用包含氨基酸序列：MLSAFSRYAR的肽，及其功能等价物。

如本文所使用的，各种形式的术语“调节剂”和“调节”预期包含特定靶的表达或作用或活性的全部或部分抑制。

如本文所使用的，“运动神经元营养因子”包括涉及运动神经元的营养或维持的那些因子。术语“运动神经元营养因子”、“MNTF”、“MNTF肽”、“运动神经元营养因子类似物”和“MNTF类似物”可以互换使用，只要它们具有本文限定的功能特性。运动神经元营养因子可以促进定型的神经祖细胞的发育和分化，或者它们可以诱导或增强分化的神经细胞的生长(例如神经突长出)和存活。本发明的运动神经元营养因子一般以有效产生CNS或PNS的完全分化的神经细胞(例如，运动神经元)的量提供。关于量的指导在本文中提供，并且可以由技术人员基于已知操作和本文公开的方法容易地确定。

为了本公开内容的目的，术语“神经祖细胞”或“神经前体细胞”包括可以产生这样的后代的细胞，所述后代是神经元细胞(例如，神经元前体或成熟神经元)或胶质细胞(例如神经胶质前体、成熟星形胶质细胞或成熟少突神经胶质细胞)。细胞一般表达具有神经谱系特征的某些表型标记，并且当在体外单独进行培养时，它们一般不产生其他胚胎胚层的后代。

“神经元祖细胞”或“神经元前体细胞”包括可以产生这样的后代的细胞，所述后代是成熟神经元并且有时还具有产生胶质细胞的能力。

“多潜能神经祖细胞群”包括具有产生这样的后代的能力的细胞群，所述后代是神经元细胞，是胶质细胞，并且有时是其他类型的细胞。这个术语不要求群体内的个别细胞具有形成2种类型的后代的能力，尽管可以存在是多潜能神经前体的个别细胞。

术语“拟肽”和“模拟物”包括可以基本上具有它们模拟的蛋白质区域相同的结构和功能特征的天然存在和合成的化学化合物。

具有类似于模板肽的那些的性质的肽类似物可以是非肽药物。“肽模拟物”或“拟肽”包括基于肽的化合物，还包括此类基于非肽的化合物(Fauchere，J.Adv.DrugRes.15：29(1986)；Veber和Freidinger；TINS；392(1985)；和Evans等人，J.Med.Chem.30：1229(1987)；BeeleyN.，TrendsBiotechnol.Jun；12(6)：213-6(1994)；Kieber-EmmonsT，等人；CurrOpinBiotechnol.Aug；8(4)：435-41(1997)。在结构上类似于治疗上有用的肽的肽模拟物可以用于产生等价的或增强的治疗或预防效果。一般而言，拟肽在结构上等同或类似于示例多肽(即，具有生物或药理学功能或活性的多肽)，但还可以具有任选地被选自下述的键替换的一个或多个肽键：例如，-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-。模拟物可以完全由天然氨基酸或氨基酸的非天然类似物组成，或者是部分天然的肽氨基酸和部分氨基酸的非天然类似物的嵌合分子。模拟物还可以包含任何量的天然氨基酸的保守置换，只要此类置换同样基本上不改变模拟物活性。

短语“同一性百分比(％)“指在2个或更多序列的比较中发现的序列相似性百分比。同一性百分比可以例如使用任何合适的软件电子地进行测定。同样地，2个序列(或它们中的任一或两者的一个或多个部分)之间的“相似性”通过比较一个序列的序列与第二个序列进行测定。

组合物或制剂的“药学上可接受的”化合物和其他成分，例如载体、稀释剂或赋形剂是适合于给其受体施用的那些。

一般而言，术语“蛋白质”指经由肽键连接的2个或更多单个氨基酸(无论是不是天然存在的)的任何聚合物，如在下述情况下发生的一样，当与1个氨基酸(或氨基酸残基)的α-碳键合的羧酸基团的羧基碳原子变得和与邻近氨基酸的α-碳键合的氨基的氨基氮原子共价结合时。这些肽键连接，和包含其的原子(即，α-碳原子、羧基碳原子(及其取代氧原子)，和氨基氮原子(及其取代氢原子)形成蛋白质的“多肽主链”。此外，如本文所使用的，术语“蛋白质”应当理解为包括术语“多肽”和“肽”(它们有时可以在本文中互换使用)。类似地，蛋白质片段、类似物、衍生物和变体在本文中可以被称为“蛋白质”，并且除非另有说明应被视为“蛋白质”。术语蛋白质的“片段”指包含少于蛋白质的所有氨基酸残基的多肽。蛋白质的“结构域”也是片段，并且包含通常是赋予活性或功能所需的蛋白质的氨基酸残基。

术语“严格条件”指允许多核苷酸之间杂交的条件。严格条件可以由盐浓度、有机溶剂(例如，甲酰胺)的浓度、温度和本领域众所周知的其他条件进行限定。通过减少盐的浓度、增加有机溶剂(例如，甲酰胺)的浓度、或提高杂交温度可以增加严格性。例如，严格盐浓度通常将小于约750mMNaCl和75mM柠檬酸三钠，优选地小于约500mMNaCl和50mM柠檬酸三钠，和最优选地小于约250mMNaCl和25mM柠檬酸三钠。低严格性杂交可以在不存在有机溶剂例如甲酰胺的情况下获得，而高严格性杂交可以在有机溶剂(例如，至少约35％甲酰胺，最优选地至少约50％甲酰胺)的存在下获得。严格温度条件通常将包括至少约30℃，更优选地至少约37℃，和最优选地至少约42℃的温度。各种附加参数，例如，杂交时间，去污剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度，以及载体DNA的包括或排除，是本领域技术人员众所周知的。各种水平的严格性通过使这些各种条件根据需要进行组合来完成，并且在本领域的技术内。严格杂交条件还可以由低于靶序列的解链温度(Tm)约5℃-约20℃或25℃中的条件，以及与靶具有精确或接近精确的互补性的探针来限定。如本文所使用的，解链温度是在其下双链核酸分子群体变得半解离成单链的温度。用于计算核酸的Tm的方法是本领域众所周知的(参见，例如，Berger和Kimmel，MethodsInEnzymology，第152卷：GuideToMoleecularCloningTechniques，SanDiego(1987)：AcademicPress，Inc.和Sambrook等人，MolecularCloning(1989)：ALaboratoryManual，第2版，第1-3卷，ColdSpringHarborLaboratory)。如由标准参考文献指出的，Tm值的简单估计可以通过下式进行计算：Tm＝81.5+0.41(％G+C)，当核酸在1MNaCl的水溶液中时(参见例如，Anderson和Young，“QuantitativeFilterHybridization”inNucleicAcidHybridization(1985))。杂合体的解离温度(和因此关于严格杂交的条件)受到各种因素的影响，例如探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和靶的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或固定的等)，以及盐和其他组分(例如，甲酰胺的存在或不存在，硫酸葡聚糖、聚乙二醇)的浓度。这些因素的效应是众所周知的并且在本领域的标准参考文献中得到讨论，参见，例如，Sambrook，同上，和Ausubel，同上。一般地，严格杂交条件是在pH7.0-8.3下小于约1.0M钠离子、一般约0.01-1.0M钠离子的盐浓度，和对于短探针(例如，10-50个核苷酸)至少约30℃和对于长探针(例如，大于50个核苷酸)至少约60℃的温度。如指出的，严格条件还可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来达到，在这种情况下可以使用较低的温度。在本发明中，多核苷酸可以是在中至高严格性的条件下与靶mRNA杂交的多核苷酸，所述条件例如0.03M氯化钠和0.03M柠檬酸钠在约50-约60摄氏度下。

如本文所使用的，“受试者”指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、驯养和农场动物、和动物园、运动或宠物动物，例如，犬、马、猫、绵羊、猪、牛等。优选受试者是人。

术语“治疗有效量”意指将引发所需应答的受试化合物的量，所述所需应答例如由例如研究者、兽医、医师或其他临床医生寻求的组织、系统、动物或人的生物学或医学应答。

“处理”指治疗处理和预防性或预防措施。需要处理的那些包括已具有病症的那些以及其中待预防病症的那些。

术语“载体”指用于将核酸递送给细胞的质粒、噬菌体、病毒或其他系统(它是天然存在或合成的)形式的核酸分子扩增、复制和/或表达媒介物，其中质粒、噬菌体或病毒可以与细菌、酵母、无脊椎动物和/或哺乳动物宿主细胞一起发挥作用。载体可以保持独立于宿主细胞基因组DNA或可以与基因组DNA全部或部分整合。载体一般将包含但不必包含所有必需元件，以便在它与之相容的任何宿主细胞中起作用。“表达载体”是在合适的条件下能够指导外源多核苷酸，例如编码结合结构域融合蛋白的多核苷酸表达的载体。

如本文所描述的，术语“同源性和同系物”包括可以是目的多核苷酸(例如mRNA)中的序列的同系物的多核苷酸。此类多核苷酸一般与相关序列具有至少约70％的同源性，优选地至少约80％、90％、95％、97％或99％的同源性，例如在至少约15、20、30、40、50、100或更多邻接核苷酸(同源序列的)的区域上。

同源性可以基于本领域的任何方法进行计算。例如UWGCGPackage提供了BESTFIT程序，其可以用于计算同源性(例如以其缺省设置使用)(Devereux等人，NucleicAcidsResearch12，第387-395页(1984))。PILEUP和BLAST算法可以用于计算同源性或排列序列(一般以其缺省设置)，例如，如AltschulS.F.；JMolEvol36：290-300(1993)；Altschul，S.F.等人；JMolBiol215：403-10(1990)中所述。用于执行BLAST分析的软件是可通过美国国立生物信息中心(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/L)公开获得的。这种算法包括首先通过鉴定查询序列中长度W的短字来鉴定高得分序列对，当与数据库序列中相同长度的字比对时，所述短字匹配或满足某些正值阈值得分T。T被称为邻近字得分阈值(Altschul等人，同上)。这些起始邻近字命中充当种子用于起始搜索以找到包含其的HSPs。字命中沿着每个序列在2个方向上进行延伸直至累积比对得分可以得到增加。关于字命中在每个方向上的延伸在下述情况下停止：累积比对得分与其达到的最大值减少量X；由于一个或多个负得分残基比对的积累，累积得分变成零或以下；或达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的敏感性和速度。BLAST程序使用字长(W)11、BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和HenikoffProc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915-10919(1992))比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝4和2条链的比较作为缺省值。

BLAST算法执行2个序列之间的相似性的统计分析；参见，例如，Karlin和AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5787(1993)。由BLAST算法提供的一种相似性测量是最小总和概率(P(N))，其提供了2个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配将偶然发生的概率指示。例如，如果在第一个序列的比较中最小总和概率小于约1、优选地小于约0.1、更优选地小于约0.01、和最优选地小于约0.001，那么序列被视为与另一个序列类似。

同源序列一般通过至少(或通过不超过)约1个、2个、5个、10个、15个或20个或更多突变(它可以是置换、删除或插入)不同于相关序列。这些突变可以在上文提及的任何区域上相对于计算的同源性进行测量。同源序列一般在显著超过背景的水平上与原始序列选择性杂交。选择性杂交一般使用中至高严格性(例如0.03M氯化钠和0.03M柠檬酸钠在约50℃-约60℃下)的条件达到。然而，此类杂交可以在本领域已知的任何合适的条件下进行(参见Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual(1989))。例如，如果需要高严格性，那么合适的条件包括0.2xSSC在60℃下。如果需要低严格性，那么合适的条件包括2xSSC在60℃下。

术语“重组”指在体外合成或以其他方式处理的多核苷酸(例如，“重组多核苷酸”)，指使用重组多核苷酸在细胞或其他生物系统中生产基因产物的方法，或指由重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白质”)。因此，“重组”多核苷酸由其生产方法或其结构来限定。关于其生产方法，该过程指重组核酸技术的使用，例如，涉及核苷酸序列中的人为干预，一般为选择或生产。备选地，它可以是通过产生包含2个或更多片段的融合物的序列制备的多核苷酸，所述片段并非天然地彼此邻接。因此，包含了例如通过用任何非天然存在的载体转化细胞制备的产物，如包含使用任何合成寡核苷酸方法衍生的序列的多核苷酸。类似地，“重组”多肽是由重组多核苷酸表达的多肽。

“重组宿主细胞”是包含载体例如克隆载体或表达载体的细胞，或已通过重组技术在其他方面进行处理以表达目的蛋白质的细胞。

I.概述

来自大鼠肌肉组织的2种运动神经元营养因子(MNTF1和MNTF2)的分离和表征以及衍生自人视网膜母细胞瘤cDNA文库的重组MNTF1-F6基因的随后克隆在美国专利号6,309,877、6,759,389和6,841,531(以及共同未决的美国专利申请序列号10/858,144、10/858,286、10/858,543和10/858,545)中得到描述；所述所有专利在此整体引入作为参考。MNTF1-F6基因序列编码在其中被称为SEQIDNO：4的33个氨基酸的序列。如国际申请号PCT/US2004/038651中所述，发现编码MNTF1多肽的核苷酸序列位于人染色体16q22内，所述专利在此整体引入作为参考。

看起来对于MNTF1的已知生物活性足够的MNTF1-F6分子内的2个重叠结构域得到鉴定。参见，国际申请号PCT/US04/01468或美国专利申请序列号10/541,343，所述专利在此整体引入作为参考。在本文中命名为“WMLSAFS”和“FSRYAR”结构域的这些结构域中的每一个足以刺激运动神经元衍生的细胞系增殖，其方式类似于MNTF1-F633-聚体。类似地，“FSRYAR”结构域足以在体内指导经由运动神经元的肌肉靶的选择性神经再支配，其方式类似于MNTF1-F633-聚体。此外，“FSRYAR”结构域提供了足以产生抗体的抗原表位，所述抗体识别包含“FSRYAR”序列的任何MNTF肽，包括MNTF1-F633-聚体。

运动神经元营养因子(MNTF)在人胎儿妊娠期中第9周时在表达中达到峰值(Di，X.等人，ActaAnatomicaSinica29：86-89，1998)。基于MNTF在发育中的人中的表达，推断MNTF可能促进运动神经元的分化和/或存活。为了检查这点，确定MNTF是否调节多能胚胎干细胞分化成运动神经元并且是否增强ES细胞衍生的运动神经元的存活。

如本文公开的，本发明人已确定ES细胞暴露于RA和MNTF类似物指导这些细胞产生运动神经元。

II.使用方法

包括但不限于包含MLSAFSRYAR结构域的那些的MNTF和截短的MNTF分子，所述MLSAFSRYAR结构域在本文中被称为运动神经元分化因子(MDNF)，在本文中被证实诱导干细胞或部分分化的神经元细胞分化成运动神经元。此类试剂提供了用于从干细胞培养物产生和/或分离运动神经元群体的新方法。

本发明的方法包括使胚胎干细胞与视黄酸(RA)和运动神经元分化因子(MNDF)接触。在本发明的一个优选实施方案中，使胚胎干细胞与RA连同运动神经元分化因子接触。备选地，该方法包括使部分分化的神经元细胞与运动神经元分化因子接触。因子以有效产生分化的神经细胞的量提供。这些量可以由技术人员基于已知操作和本文公开的方法容易地确定。

MNTF1和/或其肽类似物还在体外促进哺乳动物运动神经元的存活。因此，本发明提供了MNTF肽类似物作为关于神经元细胞培养物的生长因子/补充物的用途，包括通过在体外用有效量的MNTF肽类似物培养干细胞衍生的神经元细胞，用于促进干细胞衍生的神经元细胞系的存活的方法。

本发明人也已发现在神经营养因子的存在下培养的神经元存活并产生突起。因此，在另一个实施方案中，本发明的方法包括使干细胞衍生的运动神经元与至少一种MNTF肽类似物接触，例如，在与RA和运动神经元分化因子例如如本文所描述的MNTF肽类似物或备选地音猬(Shh)接触后，所述音猬包括Shh激动剂。

分化的运动神经元可以例如通过FACS分选进行分离或富集。例如基于GFP的运动神经元标记方法的使用允许表征ES细胞衍生的运动神经元的纯群体。已使用这种方案用于从来自胚状体的细胞混合群体中分离细胞的纯运动神经元群体。使用胶原酶和分散酶使胚状体分解成单细胞。这些单细胞随后对于GFP进行FACS分选，因为由HB9启动子控制表达GFP的细胞是群体中真正的运动神经元。

因此，本发明的另一个方面指向通过下述用于分离和/或纯化分化的神经细胞群的方法：(a)获得或产生在运动神经元特异性启动子的控制下表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的胚胎干细胞培养物；(b)使胚胎干细胞的培养物与有效产生表达eGFP的分化的神经细胞的量的RA和MNTF接触；(d)检测分化的神经细胞中的eGFP表达；和(f)分离表达eGFP的分化的神经细胞。

本发明人已发现由于其促进哺乳动物神经元的存活、生长、增殖和/或维持的能力，MNTF和某些MNTF类似物对于治疗神经元病症是有用的。本发明人已进一步发现根据某些实施方案，MNTF肽或MNTF类似物调节不依赖于音猬途径(例如取决于实施方案，部分或完全不依赖)的信号转导途径。同样地，本发明人已发现MNTF肽和MNTF类似物调节某些蛋白激酶途径，包括某些酪氨酸激酶和生长因子受体的表达或活性。得到调节的信号转导或蛋白激酶途径包括例如，音猬非依赖性途径。

音猬(Shh)是负责尾部化的(caudalized)神经元腹部化(ventralization)的关键组分，经由其跨膜受体组分patched-smoothened发挥作用。本文呈现的数据显示，在视黄酸的存在下鼠类ES细胞在体外分化成运动神经元方面，MNTF肽有效代替音猬(实施例5)。给这些ES培养物添加MNTF导致成熟运动神经元转录因子(HB9和Islet1/2)的表达、成熟运动神经元标记胆碱乙酰转移酶(ChAT)的表达、和能够传导动作电位的神经元的产生。数据还显示在smoothened受体信号的特异性抑制剂(环杷明-KAAD)的存在下，MNTF肽能够产生有丝分裂后的成熟运动神经元。尽管不希望被束缚于任何具体理论或机制，但本发明人认为数据显示MNTF通过与Shh或smoothened的下游不同的途径发信号。基于本文呈现的数据，本发明人已进一步确定MNTF肽通过本文描述的信号转导途径发挥作用，以促进哺乳动物神经元的存活、生长、增殖和/或维持。因此，在本发明的另一个方面，施用MNTF因子或MNTF类似物以调节某些信号转导组分的表达或活性。我们的数据进一步证实ES细胞的MNTF处理导致胰岛素受体(IR)的Tyr972和Tyr1162/1163的自磷酸化(实施例5)。这些残基是IR活化的标记。此外，免疫共沉淀研究显示由于对于ES细胞的MNTF处理，特异性SH2结构域与IR(关于PI3激酶的p85亚单位)的结合。实施例5还显示阻断IGF-1R对MNTF产生运动神经元的能力没有影响，但阻断IR消除了这种能力。

在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，胰岛素受体底物蛋白质的表达或活性得到调节。胰岛素受体底物蛋白质(IRS-蛋白质)是胰岛素和IGF起始信号的效应子。它们共享在其N末端附近的PH和PTB结构域，和在其C末端区域中的多个Tyr磷酸化基序。与酪氨酸-磷酸化的IRS-蛋白质结合的蛋白质包括PI3激酶p85、GRB2、SHP2、Nck、Crk和Fyn。IRS-1看起来主要涉及IGF信号和细胞支架生长。IRS-2看起来是胰岛素信号的重要介质，因为遗传除去导致II型糖尿病。IRS-3主要在脂细胞中表达，并且是PI3激酶的罕有地有效活化剂。IRS-4缺乏在其他IRS-蛋白质中与SHP2结合的酪氨酸残基。

在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，IGF-1、IGF-II或任一的受体的蛋白质表达或活性得到调节。IGF-I和-II通过与胰岛素受体同源的IGF-I受体发信号。IGF-II受体的高亲和力在发信号中不发挥直接的作用，但调节游离IGF-II的浓度。IGFs涉及骨骼生长，并且对于凋亡预防是必需的。游离IGFs的血清水平通过使隔离IGFs的IGF结合蛋白质(IGFBPs)的作用保持很低。IGFBPs的过量表达可以诱导凋亡，推测是通过游离IGF的减少；IGFBP水平在某些癌症中也是被改变的。IGF-I受体不象某些其他生长因子受体一样是促有丝分裂的，但其通过胰岛素受体底物(IRS)蛋白质激活PI3激酶途径的能力对于调节细胞存活是非常重要的。

在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，磷脂酰肌醇3-激酶蛋白质的表达或活性得到调节。PI3激酶(磷脂酰肌醇3-激酶)负责PI(4，5)P2的肌醇环的3位的磷酸化和胰岛素作用，以产生存活信号所需的有效第二信使PI(3，4，5)P3。PI3激酶是由85kDa调节亚单位和110kDa催化亚单位组成的异二聚复合物。生长因子受体的酪氨酸磷酸化产生停泊位点用于结合受体上的p85(通过其SH2结构域)；p85给其带来p110，所述p110随后接近于其在膜上的磷脂底物。PI3激酶还通过Ras，和异三聚的G蛋白质的β：γ亚单位得到激活。PI3激酶可被渥曼青霉素抑制，所述渥曼青霉素是用于研究PI3激酶信号途径的有用工具。

在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，Akt激酶蛋白质的表达或活性得到调节。Akt是PI3激酶途径的主要已知效应子。PIP3的产生导致使Akt上的Thr308磷酸化的PDK1，和使Akt上的Ser473磷酸化的另一种激酶(预期为PDK2)的活化。这些磷酸化另外激活AktSer/Thr激酶活性，和针对这些位点中任一的磷酸化状态特异性抗体的使用能意味着Akt活化。Akt的活化可以通过免疫沉淀随后为用放射性标记的ATP使已知底物磷酸化进行直接测量。Akt使Bad上的Ser136磷酸化，导致保护不受凋亡。Akt的其他底物包括GLUT4、心脏PFK2和GSK3，其通过这种磷酸化被灭活。

在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，Bad激酶蛋白质的表达或活性得到调节。Bad或“Bcl-2的细胞死亡拮抗剂”是Bcl-2家族的成员和生存对死亡的重要调节物。非磷酸化的Bad与Bcl-2和Bcl-XL成为二聚物，使其抗凋亡活性中和。PI3激酶途径的活化导致Akt的活化，这使Bad上的ser-136磷酸化。MAP激酶途径使BAD上的ser-112磷酸化，并且近来，PKA已显示使BAD上的ser-155磷酸化。磷酸化的Bad结合14-3-3蛋白质和可能的其他因子，所述14-3-3蛋白质和因子使Bad与其促凋亡作用隔离。使用对这些位点特异的磷酸化状态特异性抗体的测定法充当细胞存活途径活化的记录。

在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，PI(3，4，5)P3依赖性激酶蛋白质的表达或活性得到调节。PI(3，4，5)P3依赖性激酶1(PDK1)是具有PH结构域并且受PIP3强烈刺激的Ser/Thr激酶。PDK1的最佳表征的底物是Akt，所述Akt通过PDK1上的Thr308进行磷酸化，促成Akt活化。PDK1的2种同种型已得到鉴定。PDK1也被认为在p70S6激酶的活化中起作用，并且在T细胞活化期间对于从T细胞受体到NFκB发信号是重要的。

在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，Bax蛋白质的表达或活性得到调节。与Bcl-2共享高度保守的结构域的Bax蛋白质，可以在线粒体的脂双层中形成离子传导通道，这通过将凋亡基因蛋白质释放到细胞溶质内在许多细胞的凋亡途径中起必要作用。Bax呈现了关于许多疾病的有趣的治疗靶，所述疾病涉及凋亡例如癌症或神经变性病症。

在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，p53基因产物的表达或活性得到调节。p53具有在大约一半的所有人癌症中是突变的。它的基因产物涉及针对细胞毒性应激的细胞应答，并且连同p19ARF一起诱导p21Cip1的表达，以引起细胞周期停滞。此外，p53能够通过转录和非转录机制诱导凋亡。p53的氨基末端的83个氨基酸包含反式激活结构域，以及涉及转录非依赖性生长抑制的区域。羧基末端区域包含DNA结合结构域，其通过3种磷酸化事件，以及潜在地通过乙酰化得到调节。

在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，一氧化氮合酶蛋白质的表达或活性得到调节。一氧化氮合酶(NOS)是二聚的，含亚铁血红素的酶，所述酶产生一氧化氮，并且包含C末端还原酶和N末端氧合酶结构域。NOS的3个类别包括主要在神经元组织中表达的nNOS/NOSI/NOS1，通过炎症刺激在巨噬细胞和某些其他细胞中可诱导的iNOS/NOSII/NOS2，和组成性表达的NOS的上皮形式的eNOS/NOSIII/NOS3。组成性表达的nNOS和eNOS需要Ca2⁺用于活性，并且通过Ca2⁺流进行调节。iNOS不依赖于Ca2⁺。不同同种型在许多位点上的磷酸化对蛋白质活性具有不同的影响；某些是抑制的和某些是活化的。

在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，糖原合酶激酶3蛋白质的表达或活性得到调节。糖原合酶激酶3(GSK)不同于大多数丝氨酸/苏氨酸激酶的地方在于它在不存在信号途径作用的情况下是活性的。存在2种同种型，GSK3α和GSK3β。GSK3的功能是使糖原合酶磷酸化并且从而使其灭活。胰岛素作用刺激PI3激酶途径，导致Akt活化，这使GSK3磷酸化并且使其灭活。糖原合酶随后迅速地脱去磷酸并且被活化。其他GSK3底物包括Jun(在抑制位点上)和eIF2B。通过GSK3使Tau磷酸化可能涉及阿尔茨海默氏病的发展。针对GSK3上的Akt位点(Ser21)的磷酸化状态特异性抗体适合于代替测定途径的活化状态。

在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，半胱天冬酶蛋白质的表达或活性得到调节。涉及线虫(C.elegans)CED-3死亡蛋白质的半胱氨酸天冬氨酰蛋白酶包含半胱天冬酶家族。所有作为通过蛋白质水解活化的酶原被表达。就其在凋亡中的作用而言，取决于它们是通过受体群集(起始)还是通过线粒体通透性转变(效应)得到活化，可以将半胱天冬酶再分成起始(半胱天冬酶8、9、10)和效应(半胱天冬酶3、6、7)半胱天冬酶。效应半胱天冬酶，最特别地半胱天冬酶3，切割众多底物以实现与凋亡相关的形态学变化。在半胱天冬酶3的底物中有DFF45/ICAD，其释放DFF的DNA酶亚单位以引起染色质降解，以及凝溶胶蛋白、PAK2、D4GDI，所有这些都涉及细胞支架组构，核层纤蛋白和PARP。PARP切割的意义仍不明了，但它是关于半胱天冬酶活化的极佳标记和正在进行的凋亡的推测。

在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，RAS基因产物的表达或活性得到调节。Ras蛋白质是小GTP结合蛋白，其与异三聚的G蛋白质不同，在单个多肽内包含所有GTP酶和效应子作用。存在Ras的至少3种同种型，Ki-Ras、Ha-Ras和N-Ras，具有不同的表达模式但相似的信号活性。Ras在羧基末端处进行棕榈酰化和法尼基化，使其锚定在膜上。在静止细胞中，Ras装载GDP，并且在受体的生长受体刺激之后被活化，这将Ras鸟嘌呤核苷酸交换因子召募至膜的平面。交换因子与Ras蛋白质的接近引起GDP的释放，以及其的GTP替换。在其GTP结合形式中，Ras结合几种蛋白质，包括Raf、RalGDS和PI3激酶。Ras的灭活通过GTP水解发生，这极大地受到RasGAP或NF-1这2种已知的RasGTP酶活化蛋白的促进。通过使裂解物与Raf-1的Ras结合结构域一起温育可以测定Ras活化，所述Raf-1与Ras：GTP选择性结合。

III.干细胞培养

胚胎干(ES)细胞是培养的细胞，衍生自能够无限复制的胚泡期胚胎的多能内细胞群。一般而言，ES细胞具有分化成其他细胞的潜能(即，它们是多能的)；因此，它们可以充当新细胞的持续来源。用于在本发明中使用的胚胎干细胞优选得自非人哺乳动物(例如，驯养动物或商业动物)。在本发明的一个实施方案中，胚胎干细胞是鼠类胚胎干细胞。

用于培养哺乳动物干细胞的合适方法是本领域已知的，例如，如美国专利申请号10/362,437、10/789,266、10/789,308、10/928,805和美国专利号6,833,269中所述，所述专利全部整体引入本文。除非另有明确说明，本发明的方面可以使用任何非人脊椎动物种类的干细胞(例如非人灵长类动物、驯养动物、家畜和其他非人哺乳动物的干细胞)进行实践。非限制性例子是胚胎干细胞或胚胎生殖细胞的原代培养物或建立的系。

在某些实施方案中，使用原型“灵长类多能干细胞(pPS细胞)，其中所述灵长类多能干细胞是非人来源的。pPS细胞包括衍生自在受精后任何时候的胚胎前、或胚胎的多能细胞。在合适的条件下，它们能够产生三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)衍生物的几种不同细胞类型的后代。pPS细胞包含各种类型的胚胎细胞，包括如来自其他灵长类动物的胚胎干细胞，例如恒河猴干细胞(Thomson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：7844，(1995))、绒猴干细胞(Thomson等人，Biol.Reprod.55：254(1996)，以及本领域已知的其他类型的多能细胞。包括能够产生所有三个胚层衍生物的后代的灵长类动物起源的任何细胞，不管它们是衍生自胚胎组织还是其他来源，其中所述灵长类动物是非人灵长类动物。pPS细胞一般不衍生自恶性来源，并且优选细胞是核型正常的。

当群体中大比例的干细胞及其衍生物显示未分化细胞的形态特征时，pPS细胞培养物被描述为“未分化的”，当与胚胎或成人起源的分化细胞比较时，所述未分化细胞是显而易见的，其中所述pPS细胞是非人来源的。未分化的pPS细胞由本领域技术人员容易地识别，并且一般在具有高核/质比和明显核仁的细胞集落的显微镜视野的2个平面中出现，其中所述pPS细胞是非人来源的。群体内未分化细胞的集落通常由分化的邻近细胞围绕这是常见的。

IV.分化的神经细胞

用于培养前体、部分分化和完全分化的神经细胞的合适方法是本领域已知的，例如，如美国专利申请号10/362,437、10/789,266、10/789,308、10/928,805和美国专利号6,833,269中所述的，所述专利全部整体引入本文。

此外，如本文所使用的，“神经元细胞”或“神经元”是神经系统的传导或神经细胞，其一般由下述组成：包含核和周围细胞质的细胞体(核周体)；几个短的、照射状突起(树突)；以及于终止细枝样分支(终树突)，和可以具有沿着其路线伸出的分支(侧突)的一个长突起(轴突)。神经元的例子包括运动神经元。

V.分化的神经细胞的表征

通过已知的细胞和分子操作以及本文公开的测定法和方法可以检测分化成部分或完全分化的神经细胞的ES细胞。例如，可以就神经元标记例如NeuN(神经元标记)和/或特异性运动神经元标记如HB9或ChAT探测细胞培养物。

在本发明的另一个实施方案中，如本文所描述的，分化的神经细胞是遗传标记的，因为它表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)。eGFP遗传标记在用于分离和/或纯化分化的神经细胞群的方法中，或在用于监控脊髓再驻的方法中可以是特别有用的。

VI.视黄酸

视黄酸或维生素A是被认为是成形素的醛分子。RA是容易获得的；它可以例如得自SigmaChemicalCo.(St.Louis，Mo.)。用终浓度约0.0.001-1μM的RA处理导致干细胞有效分化成神经前体。

VII.MNTF和MNDF肽

如本领域和本发明的技术人员应当理解的，包含MLSAFSRYAR10聚体和33聚体的序列提供了用于在体外和体内使干细胞选择性分化成运动神经元中使用的MNTF肽类似物。本发明的运动神经元分化因子可以合成或重组生产，或从天然细胞中分离。

包含本发明的MDNF和MNTF肽类似物的蛋白质或肽中的氨基酸残基序列在本文中通过使用其常用的三字母命名法或通过其单字母命名法进行命名。这些三字母和单字母命名法的列表可以在教科书例如Biochemistry，第2版，Lehninger，A.，WorthPublishers，NewYork，N.Y.(1975)中找到。当氨基酸序列横向列出时，氨基末端预期位于左端，而羧基末端预期位于右端。

技术人员应当理解包含各种MDNF和MNTF肽类似物的肽的精确化学结构将依许多因素而变。例如，给定多肽可以作为酸性或碱性盐或以中性形式获得，因为在分子中发现可电离的羧基和氨基。因此，为了本发明的目的，保留MNTF133聚体肽的生物活性，包含WMLSAFS、FSRYAR或MLSAFSRYAR结构域的任何形式的肽，预期在本发明的范围内。

图1举例说明了依照本发明的MNDF和/或MNTF肽的某些优选实施方案。

A.MNTF1-F633-聚体

在美国专利号6,309,877中，提供了具有下述氨基酸序列的多肽(在本文中被称为SEQIDNO：4)：

LGTFWGDTLNCWMLSAFSRYARCLAEGHDGPTQ[SEQIDNO：1]

包含这种序列的重组蛋白质与针对MNTF-1的单克隆抗体反应，维持运动神经元的生存力，增加神经突的长出，减少运动神经元细胞死亡/凋亡，并且支持运动神经元生长和“扩展”到具有延伸的含生长锥轴突的巨大的、活性神经元内。

MNTF133聚体通过用于在下文实施例中使用的固相合成进行合成。这种MNTF-1分子在下文中将被称为“33聚体”。当与低浓度的RA结合使用时，线性33-聚体诱导ES细胞分化成运动神经元(参见图2)。此外，MNTF1诱导的ES细胞分化不受音猬信号转导途径抑制剂的阻断。如图3中所示，用MNTF133-聚体处理胚状体与胰岛素受体(IR)和/或胰岛素样生长因子受体(IGF-R)的自磷酸化相关，这意味着MNTF通过IR/IGF-R介导的信号转导途径起作用。

本发明包括了MNTF1的肽类似物的使用，所述MNTF1的肽类似物保留了MNTF1使干细胞分化成运动神经元和/或促进干细胞衍生的运动神经元的存活和维持的能力。依照本发明的MNTF肽类似物长度一般为6-33个氨基酸，并且包含2个氨基酸序列中的至少一个，即对应SEQIDNO：1的氨基酸残基12-18的WMLSAFS结构域(SEQIDNO：3)，或对应SEQIDNO：1的氨基酸残基17-22的FSRYAR结构域(SEQIDNO：2)。MNTF肽类似物的优选实施方案包括SEQIDNO：1的10-33个连续氨基酸残基的片段，所述片段包含MLSAFSRYAR结构域(SEQIDNO：4)。

在备选的实施方案中，如通过BLAST分析测定的，运动神经元营养因子肽类似物的氨基酸序列与SEQIDNO：1的9-32个连续氨基酸残基至少70％等同，与SEQIDNO：1的8-32个连续氨基酸残基至少80％等同，和最优选地，与SEQIDNO：1的7-32个连续氨基酸残基至少90％等同。

为了比较多肽序列与相应的SEQIDNO：1片段，可以使用可通过美国国立生物信息中心(在万维网上ncbi.nlm.nih.gov处)公开获得的BLAST程序进行序列的总体比对。在进行总体比对前，可以将SEQIDNO：1提交给GenBank。对于总体比对可以使用由美国国立生物信息中心提供的缺省参数。

B.10-聚体

在一个特别优选的实施方案中，提供了具有对应SEQIDNO：1的氨基酸残基13-22的下述氨基酸序列的肽：

MLSAFSRYAR[SEQIDNO：4]

MetLeuSerAlaPheSerArgTyrAlaArg

这种MNTF片段包括大部分WMLSAFS结构域以及整个FSRYAR结构域。MNTF10聚体在低至0.01μg/ml的浓度时在体外刺激胚胎干细胞分化成运动神经元方面至少与全长MNTF33聚体一样有效(参见图2)。此外，MNTF10聚体在增强干细胞衍生的运动神经元的存活方面几乎与MNTF33聚体一样有效(参见图4)。MNTF-1分子的这个部分在下文中将被称为“10聚体”。

C.6-聚体

在另一个实施方案中，提供了具有对应SEQIDNO：1的氨基酸残基17-22的下述氨基酸序列的肽：

FSRYAR[SEQIDNO：2]

Phe-Ser-Arg-Tyr-Ala-Arg

发现其足以增强干细胞衍生的运动神经元的存活(参见图4)。MNTF-1分子的这个部分在下文中将被称为“6聚体”。

D.7-聚体

在另一个优选实施方案中，提供了具有对应SEQIDNO：1的氨基酸残基12-18的下述氨基酸序列的肽：

WMLSAFS[SEQIDNO：3]

TrpMetLeuSerAlaPheSer

MNTF1的这种7氨基酸片段与FSRYAR结构域的FS残基重叠。还发现该肽足以增强干细胞衍生的运动神经元的存活(参见图4)。MNTF-1分子的这个部分在下文中将被称为“7聚体”。

E.11-聚体

在另一个优选实施方案中，提供了具有对应SEQIDNO：1的氨基酸残基17-27的下述氨基酸序列的肽：

FSRYARCLAEG[SEQIDNO；5]

Phe-Ser-Arg-Tyr-Ala-Arg-Cys-Leu-Ala-Glu-Gly。

MNTF111-聚体包含FSRYAR结构域，并且也发现足以增强干细胞衍生的运动神经元的存活(参见图4)。MNTF-1分子的这个部分在下文中将被称为“11聚体”。

F.21-聚体

在另一个优选实施方案中，提供了具有对应SEQIDNO：1的氨基酸残基13-33的下述氨基酸序列的肽：

MLSAFSRYARCLAEGHDGPTQ[SEQIDNO：6]

MetLeuSerAlaPheSerArgTyrAlaArgCys，LeuAlaGluGlyHisAspGlyProThrGln

MNTF121-聚体包含大部分“WMLSAFS”结构域以及整个FSRYAR结构域，并且也发现足以增强干细胞衍生的运动神经元的存活(参见图4)。MNTF-1分子的这个部分在下文中将被称为“21聚体”。

VIII.MNTF肽类似物

应当理解其中一个或多个氨基酸替换为其他氨基酸的如本文所述和鉴定的肽类似物在本发明的范围内。在一个优选的备选方案中，运动神经元营养因子肽类似物包含针对SEQIDNO：1的7-32个连续氨基酸残基的片段的一个或多个保守氨基酸置换。

在本发明的范围内的MNTF肽类似物可以是MNTF1肽的改变形式，条件当然一般是该肽的必需活性基本上保持不变。如本文所使用的，术语“改变的形式”指已进行处理以改变其天然存在的结构的肽。改变的形式可以通过下述进行制备，例如通过MNTF1肽片段的共价修饰，通过使MNTF1肽片段与不溶性支持基质交联，或通过使MNTF1肽片段与载体蛋白交联。

在本发明的范围内的MNTF1肽类似物可以是在抗原上与MNTF1肽片段相关的肽片段。在抗原上相关的2种肽显示免疫交叉反应性。例如，针对第一种肽的抗体同样识别第二种肽。

在本发明的范围内的MNTF1肽类似物可以是包含与异源蛋白附着的MNTF1肽片段的融合蛋白。异源蛋白具有与MNTF1肽片段基本上不相似的氨基酸序列。异源蛋白可以与MNTF1肽片段的N末端或C末端融合。融合蛋白可以包括但不限于，聚-His融合物、MYC-标记的融合物、Ig融合物和酶促融合蛋白例如β-半乳糖苷酶融合物。此类融合蛋白，特别地聚-His融合物可以促进重组MNTF1肽片段的纯化。

本发明还提供了MNTF肽的拟肽，并且可以充当药物用于调节神经元细胞的生存力和生长，通过例如阻断包含WMLSAFS和/或FSRYAR结构域的蛋白质的功能。拟肽在制药工业中通常理解为包括具有与模拟的肽的那些类似性质的非肽药物。拟肽设计的原则和实践是本领域已知的，并且在例如FauchereJ.，Adv.DrugRes.15：29(1986)；和Evans等人，J.Med.Chem.30：1229(1987)中得到描述。

具有对于治疗上有用的肽的结构相似性的拟肽可以用于产生等价的治疗或预防效果。一般地，此类拟肽具有任选地被键替换的一个或多个肽键，这可以改变所需性质例如对体内化学破坏的抵抗力。此类键可以包括CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、--CH＝CH--、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和--CH2SO--。拟肽可以显示出增强的药理性质(生物半衰期、吸收率等)，不同的特异性，增加的稳定性，生产经济，减少抗原性等，这使得它们能够作为特别需要的治疗剂使用。

基于建模(例如在实验上测定的)肽结构，使用推理性药物设计的已知方法，可以由技术人员进行WMLSAFS和/或FSRYAR结构域模拟物或结合分子的推理性设计。推理性药物设计的目的是生产生物活性多肽或靶化合物的结构类似物。通过制备此类类似物，可以形成药物，所述药物比天然分子更有活性或稳定，具有针对改变的不同敏感性，或可以影响各种其他分子的功能。在一种方法中，将产生关于靶分子或其片段的三维结构。这可以通过x射线晶体学，计算机建模或通过2种方法的组合来完成。

IX.制备方法

应当理解本发明的MNTF肽组合物可以通过本领域众所周知的方法来制备，包括但不限于，通过固相合成的化学合成和通过HPLC纯化使其不合化学反应的其他产物，或通过在体外翻译系统或在活细胞中表达编码包含本发明的MNTF肽的肽或多肽的核酸序列(例如，DNA序列)生产。优选地组合物的MNTF肽得到分离并进行广泛透析，以去除一种或多种不希望有的小分子量分子，和/或进行冻干以更容易配制到所需媒介物内。应进一步理解在MNTF肽组分中制备的存在的任何另外的氨基酸、突变、化学修饰等，将优选地基本上不干扰MNTF停泊序列的受体识别。

对应本发明的MNTF1的一种或多种片段的肽或多肽长度一般应为至少5-6个氨基酸残基，并且可以包含高达约7个、约8个、约9个、约10个、约11个、约12个、约13个、约15个、约20个或约30个残基左右。肽序列可以通过本领域普通技术人员已知的方法进行合成，例如，使用自动化肽合成机器的肽合成，例如可从AppliedBiosystems(FosterCity，CA)获得的那些。本发明进一步提供了环状肽的合成和使用，例如如下表1中所示衍生自(SEQIDNO：1)和(SEQIDNO：6)的那些。

通过使靶向氨基酸残基与有机衍生剂反应可以将共价修饰引入肽内，所述有机衍生剂能够与选择的侧链或末端残基反应。使用有机衍生剂的多肽共价修饰是本领域技术人员众所周知的。例如，可以使半胱氨酰残基与α-卤乙酸盐(haloacetates)(和相应的胺)，例如氯乙酸或氯乙酰胺反应，以产生羧甲基或羧氨基甲基(carboxyamidomethyl)衍生物。组氨酰残基可以通过在pH5.5-7.0下与焦碳酸二乙酯反应，或在pH6下在1M二甲基胂酸钠中与对溴苯酰甲基溴反应进行衍生。赖氨酰和氨基末端残基可以与琥珀酸或其他羧酸酐进行反应。精氨酰残基可以通过与一种或几种常规试剂反应进行修饰，在所述常规试剂中有苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己胺二酮和茚三酮。通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反应可以将光谱标记引入酪氨酰残基内；最常见地，使用N-乙酰咪唑(原文为acetylimidizol，疑为acetylimidazol)和四硝基甲烷以分别形成0-乙酰酪氨酰种类和3-硝基衍生物。羧基侧基(天冬氨酰或谷氨酰)可以通过与碳化二亚胺(R’-N-C-N-R’)反应进行选择性修饰，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳化二亚胺或1-乙基-3(4氮鎓4，4-二甲基戊基)碳化二亚胺。此外，通过与铵离子反应将天冬氨酰和谷氨酰残基转变成天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基可以脱去酰胺基为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。其他修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，1983，Proteins：Structure和MoleculeProperties，W.H.Freeman&Co.，SanFrancisco，第79-86页)，N末端胺的乙酰化，和在某些情况下C末端羧基的酰胺化。

本发明进一步提供了用于在测定法和关于测定法的试剂盒中使用的MNTF肽类似物，其为游离形式或与载体分子例如蛋白质或固体颗粒连接，以及与标记或示踪物例如生物素或异硫氰酸荧光素连接的经修饰的肽。

使MNTF1肽片段与水不溶性支持基质交联可以用本领域众所周知的双功能剂来进行，包括1，1二(重氮乙酰基)2苯乙烷，戊二醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如，与4-叠氮水杨酸的酯，同双功能酰亚胺酯，包括二琥珀酰亚胺酯例如3，3’-二巯基二(琥珀酰亚胺基丙酸酯)，和双功能马来酰亚胺例如二-N-马来酰亚胺-1，8-辛烷。双功能剂例如甲基-3-[(对叠氮苯基)二硫代]亚胺丙酯产生在光的存在下能够形成交联的光可激活的中间产物。备选地，可以使用反应性水不溶性基质例如溴化氰活化的碳水化合物用于蛋白质固定化。

MNTF1肽片段与第二种蛋白质包括第二种MNTF1肽片段的交联可以使用本文描述的双功能试剂来进行。在另一种备选方案中，插入间隔物，例如二巯基或二氨基或多个氨基酸残基，例如甘氨酸。间隔物也可以是同或异双功能交联剂，例如异双功能交联剂N-(4-羧基-环己基-甲基)-马来酰亚胺。

较长的肽或多肽例如融合蛋白可以通过标准重组DNA技术来生产。例如，编码MNTF1肽片段的DNA片段可以在已包含异源蛋白的商购可得的表达载体中进行克隆，而结果是在框内与异源蛋白融合的MNTF1肽片段。

在某些实施方案中，编码本文描述的MNTF1肽和/或组分的核酸可以例如，用于在体外或体内生产肽用于本发明的各种组合物和方法。例如，在某些实施方案中，编码MNTF1肽的核酸是例如重组细胞中的载体的组分。可以表达核酸以生产包含MNTF1肽序列的肽或多肽。肽或多肽可以从细胞中分泌出来，或作为细胞的部分，或在细胞内。

X.化合物筛选

在另一个实施方案中，鉴定了改变MNTF肽或涉及MNTF肽细胞内信号转导途径的蛋白质的表达水平的化合物。在某些实施方案中，这些化合物被靶向用于治疗本文描述的各种神经病症。

通过本文描述和本领域已知的使用神经元细胞的后续测试，可以区别神经保护的激动剂和拮抗剂，并且可以评估化合物的功效。

基于其在领域公认的动物细胞培养疾病和病症模型系统中治疗神经元病症的能力，所述模型系统包括在整体引入本文作为参考的共同未决的申请U.S.S.N.(待指定)中描述的，所述共同未决的申请于2006年11月10日提交，名称为“MethodsofTreatingNeuronalDisordersusingMNTFpeptidesandanaloguesthereof”，可以进一步区别通过本文描述的筛选操作鉴定的化合物，并且可以评估化合物的功效。

在测试化合物和天然提取物文库的许多药物筛选测定法中，高流通量测定法是希望的，以便使给定时间段内检查的化合物数目达到最大。在无细胞系统中进行，例如可以用纯化或部分纯化的蛋白质获得的测定法，作为“初步”筛选通常是优选的，因为它们可以被产生以允许快速发展和相对容易的检测由测试化合物介导的分子靶中的改变。此外，测试化合物的细胞毒性和/或生物利用度的效应在体外系统中一般是可以被忽略的，相反该测定法主要集中于药物对分子靶的影响，如可以在与受体蛋白质的结合亲和力的改变中表现的。

因此在另一个方面，提供了鉴定用于促进运动神经元的生长或存活的化合物的方法。在一个实施方案中，该方法包括下述步骤：i)制备包含候选化合物的样品，ii)使细胞与所述样品接触，iii)测定涉及信号转导途径的化合物的表达或活性是否得到调节，和iv)测定样品是否能够促进运动神经元的生长或存活。在某些实施方案中，该方法进一步包括测定包含后续化合物的样品是否在体外或体内刺激胰岛素受体的Tyr972和Tyr1162/1163的自磷酸化。在其他实施方案中，该方法进一步包括测定包含候选化合物的样品是否调节MNTF信号转导途径。在其他实施方案中，该方法进一步包括测定包含候选化合物的样品是否调节选自下述的一种或多种蛋白质的表达或活性：胰岛素受体、IGF-1受体、IGF-2受体、Shh、Akt、Bad(bcl-2的细胞死亡拮抗剂)、PI(3，4，5)P3依赖性激酶1(PDK1)、Bax、p53基因产物、pp60-Src、JAK2、一氧化氮合酶(NOS)、糖原合酶激酶3(GSK)、半胱天冬酶、PI3激酶(磷脂酰肌醇3-激酶)和Ras。在其他实施方案中，该方法进一步包括测定包含候选化合物的样品是否受MNTF类似物调节，或备选地调节MNTF类似物(例如活性、表达等)。在另一个方面，本发明提供了通过施用由本文描述的筛选操作鉴定的化合物促进运动神经元生长或存活或用于治疗神经元病症的方法。

在示例性筛选测定法中，目的化合物在其中一般能够结合MNTF肽的条件下与包括MNTF结合蛋白质(例如，表达MNTF肽受体的细胞)和MNTF肽的混合物接触。随后向混合物中加入包含测试化合物的组合物。受体/MNTF肽复合物的检测和量化提供了用于测定测试化合物在抑制(或加强)受体蛋白质和MNTF肽之间的复合物形成方面的功效的方法。还可以执行对照测定法以提供用于比较的基线，其中向受体蛋白质中添加分离的和纯化的MNTF肽，并且在不存在测试化合物的情况下定量受体/MNTF肽复合物的形成。

MNTF肽和MNTF肽之间的复合物形成可以通过各种技术进行检测。例如，复合物形成的调节可以使用例如可检测标记的蛋白质例如放射性标记、荧光标记或酶促标记的MNTF肽，通过免疫测定法或通过色谱检测进行定量。对于无细胞测定法，一般将希望使MNTF肽或MNTF肽结合蛋白固定，以促进受体/MNTF肽复合物与未复合形式的蛋白质之一的分离，以及调节测定法的自动化。例如可以提供添加允许蛋白质与基质结合的结构域的融合蛋白。例如，谷胱甘肽-S-转移酶/受体(GST/受体)融合蛋白可以吸附在谷胱甘肽琼脂糖珠(SigmaChemical，St.Louis，Mo.)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，其随后与MNTF肽例如³⁵S标记的MNTF肽和测试化合物组合，并且在有助于复合物形成的条件下进行温育，例如在关于盐和pH的生理条件下，尽管略微更严格的条件可以是希望的。温育后，洗涤珠以去除任何未结合的MNTF肽，并且直接地或在受体/猬复合物解离后的上清液中测定基质珠结合的放射性标记(例如，置于闪烁体中的珠)。备选地，复合物可以与珠解离，通过SDS-PAGE凝胶分开，并且使用标准电泳技术定量来自凝胶的在珠中发现的MNTF肽水平。

用于使蛋白质固定在基质上的其他技术也可用于在受试测定法中使用。例如，MNTF肽的可溶性部分可以使用生物素和链霉亲和素的缀合进行固定。例如，使用本领域众所周知的技术(例如，生物素化试剂盒，PierceChemicals，Rockford，Ill.)生物素化的受体可以从生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)进行制备，并且固定在链霉亲和素包被的96孔板(PierceChemical)的孔中。备选地，与MNTF肽反应但不干扰猬结合的抗体可以衍生至平板的孔，并且受体通过抗体缀合捕获在孔中。如上所述，MNTF肽和测试化合物的制剂在平板的受体呈递孔中进行温育，并且可以定量孔中捕获的受体/猬复合物的量。用于检测此类复合物的示例性方法，除了上文描述的关于GST-固定复合物的那些外，包括使用与MNTF肽反应，或与受体蛋白质反应并且竞争结合MNTF肽的抗体的复合物的免疫检测；以及依赖于与MNTF肽相关的酶促活性检测的酶联测定法。在后者的情况下，酶可以与MNTF肽进行化学缀合或作为含MNTF肽的融合蛋白提供。为了举例说明，MNTF肽可以与碱性磷酸酶进行化学交联或遗传融合，并且复合物中捕获的MNTF肽的量可以使用酶的生色底物例如对硝基磷酸苯酯进行评估。同样地，可以提供包含MNTF肽和谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白，并且通过使用1-氯-2，4二硝基苯检测GST活性定量复合物形成(Habig等人，JBiolChem，249：7130(1974))。对于用于定量复合物中捕获的抗体之一的免疫检测，可以使用针对蛋白质的抗体，例如抗MNTF肽抗体。备选地，复合物中待检测的蛋白质可以以融合蛋白的形式“附加表位”，除了MNTF肽或MNTF肽序列外，所述融合蛋白还包括对于其可容易获得抗体的第二种多肽(例如，来自商业来源)。例如，使用针对GST部分的抗体，上文描述的GST融合蛋白也可以用于结合的定量。其他有用的附加表位包括myc-表位(例如，参见Ellison等人，JBiolChem266：21150-21157(1991))，其包括来自c-myc的10残基序列，以及pFLAG系统(InternationalBiotechnologies，Inc.)或pEZZ-蛋白A系统(Pharamacia，N.J.)。

XI.组合物

用于依照本发明使用的药物组合物优选包含本发明的一种或多种MNTF肽类似物，连同药学上可接受的稀释剂和/或载体。合适的载体/稀释剂是本领域众所周知的，并且包括盐水或其他无菌水介质，任选地包括另外组分例如缓冲盐和防腐剂、或糖、淀粉、盐或其混合物。

可以提供包含依照本发明的MNTF肽的组合物，用于以适合于施用方案和/或患者需要的任何合适的形式使用。例如，就本发明而言，一种或多种活性成分可以在移植前在体外应用，或在体内移植的干细胞或其衍生物部位处或附近内部应用。

本发明进一步提供了对于建立和繁殖干细胞、神经祖细胞、分化的神经细胞和干细胞衍生的运动神经元有用的培养基。该培养基特别适合于干细胞的分化和干细胞衍生的运动神经元的长期培养。

本发明的细胞培养基理想地补充有成形素和/或生长因子，并且根据需要培养的个别细胞类型进行优化。此类补充和优化在本领域的普通技术内。在某些优选实施方案中，本发明是可以补充有下述近似水平(或在1个有效数字内)的任何或所有下述成形素和/或生长因子的细胞培养基：0.001-1μMRA，0.001-1μMShh或Shh激动剂，和/或0.01-250μg/ml的一种或多种MNTF肽类似物。

作为任选成分，本发明的药物制剂可以包括药学上可接受的载体、稀释剂、稳定或乳化剂、和本领域可获得的类型的盐。此类物质的例子包括标准盐水溶液例如生理学缓冲盐水溶液和水。在本发明的药物制剂中有用的载体和/或稀释剂的具体非限制性例子包括水和生理学可接受的缓冲盐水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水溶液pH7.0-8.0。合适的药学载体包括但不限于，无菌水，盐溶液(例如林格氏溶液)，醇，聚乙烯二醇，明胶，碳水化合物例如乳糖、直链淀粉或淀粉，硬脂酸镁，滑石，硅酸，粘性石蜡，脂肪酸酯，羟甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮等。药物制剂可以进行灭菌并且需要时和不与活性化合物有害地反应的助剂混合，所述助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂和/或芳香族物质等。需要时它们还可以与其他活性物质例如酶抑制剂组合，以减少代谢性降解。

本文提供的化合物可以在药物组合物中进行配制，除了肽外所述药物组合物还可以包括药学上可接受的载体、增稠剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、中性或阳离子脂质、脂质复合物、脂质体、渗透增强剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂等。

药物组合物一般配制用于治疗用途施用。药物组合物还可以包括一种或多种活性成分例如干扰素、抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂等。用于肠胃外施用的制剂可以包括无菌水溶液，所述无菌水溶液还可以包含缓冲剂、脂质体、稀释剂和其他合适的添加剂。包含本文提供的肽的药物组合物可以包括渗透增强剂，以便增强肽的消化递送。穿透增强剂可以分类为属于5个广泛类别之一，即，脂肪酸、胆汁盐、螯合剂、表面活性剂和非表面活性剂(Lee等人，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems8，91-192(1991)；Muranishi，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems7，1-33(1990))。可以包括来自这些广泛类别中的一个或多个的一种或多种渗透增强剂。

充当渗透增强剂的各种脂肪酸及其衍生物包括例如，油酸、月桂酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、蓖麻油酸酯(recinleate)、甘油单油酸酯(ak.a.1-单油酰基-rac-甘油)、甘油二月桂酸酯、辛酸、花生四烯酸、甘油基1-单癸酸酯、1-十二烷基环庚烷-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱、单和双甘油酯及其生理学可接受的盐(即油酸盐、月桂酸盐、癸酸盐、肉豆蔻酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、亚油酸盐等)。Lee等人，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems第92页(1991)；Muranishi，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems7，1(1990)；El-Hariri等人，J.Pharm.Pharmacol.44，651-654(1992))

胆汁的生理学作用包括促进脂质和脂溶性维生素的分散和吸收(Brunton，Chapter38In：Goodman&Gilman’sThePharmacologicalBasisofTherapeutics，第9版，Hardman等人McGraw-Hill，NewYork，N.Y.，第934-935页(1996))。各种天然胆汁盐及其合成衍生物充当渗透增强剂。因此，术语“胆汁盐”包括胆汁的任何天然存在的组分及其任何合成衍生物。

可以使用包含一种或多种渗透增强剂的复合制剂。例如，胆汁盐可以与脂肪酸组合使用以制备复合制剂。螯合剂包括但不限于，乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(例如，水杨酸钠、5-甲氧基水杨酸盐和同香兰草盐)、胶原的N-酰基衍生物、月桂醇聚醚和β-二酮的N氨基酰基衍生物(烯胺)表面活性剂包括例如月桂硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂醚和聚氧乙烯-20-鲸蜡醚(Lee等人，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems第92页(1991))；和全氟化合物乳状液，例如FC-43(Takahashi等人，J.Pharm.Phamacol.40，252-257(1988))。非表面活性剂包括例如，未饱和的环状脲、1-烷基-和1-烯基氮杂环-烷酮衍生物(Lee等人，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems第92页(1991))；和非甾体抗炎剂例如双氯芬酸钠、吲哚美辛和保泰松(Yamashita等人，J.Pharm.Pharmacol.39，621-626(1987))。

一般的药学上可接受的载体包括但不限于，结合剂(例如，预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填充剂(例如，乳糖和其他糖、微晶纤维素、胶质、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石、硅石、二氧化硅胶体、硬脂酸、硬脂酸金属盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙烯二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(例如，淀粉、淀粉羟乙酸拿等)；或湿润剂(例如，月桂磷酸钠等)。

本文提供的组合物可以另外包含以其领域确定的使用水平的，在药物组合物中通常发现的其他附属组分。因此，例如，组合物可以包含另外的相容性药学活性材料，例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或可以包含在本发明的组合物的各种剂型物理学配制中有用的另外材料，例如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当添加时此类材料不应不适当地干扰本文提供的组合物组分的生物活性。

不管化合物通过其引入患者内的方法，胶态分散系统可以用作递送媒介物，以增强肽的体内稳定性和/或使肽靶向特定器官、组织或细胞类型。胶态分散系统包括但不限于，大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠和基于脂质的系统包括水包油乳状液、微胶粒、混合微胶粒、脂质体和未表征结构的脂质：肽复合物。优选的胶态分散系统是多个脂质体。脂质体是由脂质构成以双层构型排列的，具有由一个或多个外层围绕的水核心的微观球体(一般参见，Chonn等人，CurrentOp.Biotech.6，698-708(1995))。

在某些实施方案中，MNTF肽和MNTF类似物可以掺入生物分布导向部分内，或与生物分布导向部分结合使用，所述生物分布导向部分包括一种或多种聚合物，以指导MNTF肽或MNTF类似物或本文提供的其他化合物的生物分布至所需靶的附近，或允许其持续释放。活性剂包括例如，用于增加治疗功效、用于优化生物分布和生物利用度、用于减少组织损伤、用于促进愈合、或用于增加患者舒适的化合物；示例性活性剂包括血管活性剂、麻醉剂、用于缺血的治疗剂、生长因子和细胞因子。备选地，微颗粒或纳米颗粒聚合珠剂型可以在本文提供的组合物中使用。本文提供的化合物可以与活性剂组合使用，或连同与其附着的许多配体或抗配体分子一起包裹在颗粒剂型中。

以这种方式，单独地或与其他活性剂组合的MNTF肽和MNTF类似物以及本文提供的其他化合物随着时间过去在那个位点处释放，以提供持续的治疗利益。相对于本发明实践中有用的其他活性剂，例如生长因子、细胞因子等，持续释放剂型也是有用的。活性剂从本发明的颗粒剂型中的释放可以由于扩散和颗粒基质腐蚀而发生。生物降解率直接影响活性剂释放动力学。

在某些实施方案中，本发明的MNTF肽、MNTF类似物和化合物的控制释放肠胃外制剂可以制备为植入剂、油性注射剂或作为颗粒系统。颗粒系统包括微球体、微粒、微胶囊、纳米胶囊、纳米球和纳米微粒。微胶囊包含治疗蛋白质作为中央核心。在微球体中，治疗剂分散在颗粒各处。脂质体可以用于控制释放以及诱陷药物的药物靶向。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物，包括MNTF肽和MNTF类似物可以地方性地、局部地、经鼻、经口、胃肠道、支气管内、膀胱内、阴道内施用到子宫内，皮下、肌内、关节周、关节内施用到脑脊髓液(ICSF)内、脑组织内(例如颅内施用)、脊髓内、创伤内、腹膜内或胸膜内，或全身地，例如静脉内、动脉内、肝门内或直接施用到器官内。

如本领域已知的，各种导管和递送途径可以用于达到冠状动脉内递送。例如，适合于在本发明中使用的各种通用导管以及改良导管可从商业供应商例如AdvancedCardiovascularSystems(ACS)、TargetTherapeutics和Cordis获得。同样地，当给心肌的递送通过直接注射到冠状动脉内(这是目前最优选的)来达到时，如本领域已知的，许多方法可用于将导管引入冠状动脉内。作为举例说明，导管可以方便地引入股动脉内并且向后穿过髂动脉和腹主动脉并且进入冠状动脉内。备选地，导管可以首先引入臂或颈动脉内并且向后穿过至冠状动脉。这些和其他技术的详细描述可以在本领域中找到(参见，例如，Topol，EJ(编辑)，TheTextbookofInterventionalCardiology，第2版(W.B.SaundersCo.1994)；Rutherford，RB，VascularSurgery，第3版(W.B.SaundersCo.1989)；WyngaardenJB等人(编辑)，TheCecilTextbookofMedicine，第19版(W.B.Saunders，1992)；和Sabiston，D，TheTextbookofSurgery，第14版(W.B.SaundersCo.1991))。

本文提供的化合物可以肠胃外(parentally)施用。有时优选某些化合物与药学上可接受的载体或赋形剂组合，以产生药物组合物。合适的载体和稀释剂包括等渗盐水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。组合物可以配制用于肠胃外、肌内、大脑内、静脉内、皮下或经皮施用。施用的制剂可以包含此类试剂。这些试剂的例子包括阳离子试剂(例如磷酸钙和DEAE-葡聚糖)和lipofectants(例如lipofectamTM和transfectamTM)。

用于局部施用的制剂可以包括经皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。常规药学载体，水、粉末或油基，增稠剂等可能是必需或希望的。包被手套、避孕套等也可能是有用的。用于口部施用的组合物包括粉剂或颗粒剂、在水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、囊剂或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是希望的。用于肠胃外施用的组合物可以包括无菌水溶液，其还可以包含缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂。在某些情况下，用肽与其他常规治疗形式结合治疗患者可能是更有效的，以便增加治疗方案的功效。如本文所使用的，术语“治疗方案”意欲包含治疗、姑息和预防形式。

给药剂量可以取决于许多因素，包括待治疗疾病状态的严重度和应答性，并且疗程从数天持续至数月，或直至实现治愈或达到疾病状态减少。本文提供的化合物的毒性和治疗功效可以通过标准药学操作在细胞培养或实验动物中进行确定。例如，为了确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗上有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，并且它可以表示为比LD50/ED50。显示出大治疗指数的化合物是优选的。尽管可以使用显示出有毒副作用的化合物，但应慎重设计使此类化合物靶向受累组织位点的递送系统，以便使对未感染细胞的潜在损害降到最低，并且从而减少副作用。

得自细胞培养测定法和动物研究的数据可以在用于在人中使用的剂量范围配制中使用。此类化合物的剂量优选地位于循环浓度范围内，所述循环浓度范围包括具有很少毒性或没有毒性的ED50。取决于使用的剂型和利用的施用途径，剂量可以在这个范围内变化。对于在本发明的方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以最初由细胞培养测定法进行评估。剂量可以在动物模型中进行配制，以达到包括如在细胞培养中确定的IC50(即，达到症状的半最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息可以用于更精确地确定在人中的有用剂量。在血浆中的水平可以例如通过高效液相层析进行测量。给药方案可以由患者体内的药物蓄积测量进行计算。剂量可以依单个化合物包括MNTF肽和MNTF类似物的相对功效而变，并且一般可以基于发现在体外和体内动物模型中有效的EC50进行评估。本领域技术人员将认识到，优选剂量将以MNTF肽如何和何处施用(例如体外、体内、局部地、全身地等)而变。

例如，在一个方面，可以施用MNTF肽和MNTF类似物，以在靶位点处(例如在ES干细胞的细胞培养中)达到终浓度约0.01微克/ml(μg/ml)-约1mg/ml、约0.1μg/mL-约50μg/mL、约0.1μg/mL-约150μg/mL、约1μg/mL-约200μg/mL、和约0.1μg/mL-约500μg/mL，包括在这些范围内的任何范围。

取决于施用途径，备选的合适剂量可以例如从约0.1ug到高达约1克的总剂量不同。关于具体剂量和递送方法的指导在文献中提供并且对于本领域从业者一般是可用的。本领域技术人员将利用对于核苷酸与对于蛋白质或其抑制剂不同的制剂。类似地，本文提供的多核苷酸、多肽和化合物的递送将对具体细胞、条件和位置特异。一般而言，剂量一般为0.01mg/kg-1000mg/kg体重，和更一般地，例如，约0.1mg/kg-300mg/kg体重，并且可以每天、每周、每月或每年给予一次或多次，或甚至在2-20年的时间间隔期间给予一次或多次。在某些实施方案中，剂量可以从手术后紧接着到24小时给予，在另一个实施方案中；剂量从2小时到高达24小时给予。取决于具体制剂的半衰期和清除率，长效组合物可以每3-4天、每周或每2周进行施用。基于在体液或组织中测量的药物停留时间和浓度，本领域普通技术人员可以容易地估计用于给药的重复率。成功治疗后，可能希望使患者经历维持疗法以预防疾病状态的复发，其中所选化合物以0.01mg/kg-100mg/kg体重的维持剂量施用，每天一次或多次至每20年一次。在某些病状的治疗或预防中，合适的剂量水平一般为约0.001-100mg/kg患者体重/天，其可以以单次或多次剂量施用。合适的剂量水平可以为约1-约40mg/kg/天。在某些实施方案中，本文提供的化合物，包括MNTF肽和MNTF肽类似物以这样的量施用以达到下述体内浓度：在损害位点上约1微摩尔-约1毫摩尔、约10微摩尔-约500微摩尔、或约30微摩尔-约300微摩尔、和约25微摩尔-约300微摩尔终浓度，并且包括在损害位点上约25微摩尔、或约160微摩尔、或约300微摩尔终浓度，并且更一般地约1微摩尔-约100微摩尔。

本文描述的化合物可以在诊断、治疗、预防中、以及作为研究试剂和在试剂盒中使用。用于检测目的化合物(例如MNTF肽和MNTF类似物)的方法供应可以常规地完成。此类供应可以包括酶缀合物、放射性标记或任何其他合适的检测系统。还可以制备用于检测目的化合物存在或不存在的试剂盒。

本发明的化合物还可以用于研究目的。因此，由肽显示出的特异性杂交可以用于测定法、纯化、细胞产物制备和通过本领域普通技术人员可以理解的其他方法中。

除非另有说明，本文使用的技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。本文参考本领域技术人员已知的各种方法。可以参考的阐述此类已知方法的出版物和其他材料整体引入本文作为参考，如详细阐述一样。阐述重组DNA技术的一般原理的标准参考著作包括Sambrook，J.，等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，Planyiew，N.Y.(1989)和MolecularCloning：ALaboratoryManual，第3版(Sambrook和Russel，2001)，在本文中共同和单独地称为“Sambrook”；McPherson，M.J.，Ed.，DirectedMutagenesis：APracticalApproach，IRLPress，Oxford(1991)；Jones，J.，AminoAcidandPeptideSynthesis，OxfordSciencePublications，Oxford(1992)；Austen，B.M.和Westwood，O.M.R.，ProteinTargetingandSecretion，IRLPress，Oxford(1991)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait，编辑，1984)；AnimalCellCulture(R.I.Freshney，编辑，1987)；HandbookofExperimentalImmunology(D.M.Weir&C.C.Blackwell，编辑)；GeneTransferVectorsforMammalianCells(J.M.Miller&M.P.Calos，编辑，1987)；CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel等人，编辑，1987包括直到2001年的补充)；PCR：ThePolymeraseChainReaction，(Mullis等人，编辑，1994)；CurrentProtocolsinImmunology(J.E.Coligan等人，编辑，1991)；TheImmunoassayHandbook(D.Wild，编辑，StocktonPressNY，1994)；BioconjugateTechniques(GregT.Hermanson，编辑，AcademicPress，1996)；MethodsofImmunologicalAnalysis(R.Masseyeff，W.H.Albert和N.A.Staines，编辑，Weinheim：VCHVerlagsgesellschaftmbH，1993)，Harlow和Lane(1988)Antibodies，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborPublications，NewYork和Harlow和Lane(1999)UsingAntibodies：ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY(在本文中共同和单独地称为Harlow和Lane)，Beaucage等人编辑，CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistryJohnWiley&Sons，Inc.，NewYork，2000)；和Agrawal，编辑，ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs，SynthesisandPropertiesHumanaPressInc.，NewJersey，1993)；Teratocarcinomasandembryonicstemcells：Apracticalapproach(E.J.Robertson，编辑，IRLPressLtd.(1987)；GuidetoTechniquesinMouseDevelopment(P.M.Wasserman等人编辑，AcademicPress(1993)；EmbryonicStemCellDifferentiationinvitro(M.V.Wiles，Meth.Enzymol.225：900(1993)；PropertiesandusesofEmbryonicStemCells：ProspectsforApplicationtoHumanBiologyandGeneTherapy(P.D.Rathjen等人，Reprod.Fertil.Dev.，10：31(1998))；CNSRegeneration：BasicScienceandClinicalAdvances，M.H.Tuszynski&J.H.Kordower，编辑，AcademicPress，(1999)。在本发明实践中可能有用的某些技术在各种专利和专利申请中得到描述，包括报道了从脑组织获得多潜能神经干细胞的美国专利号5,851,832，报道了由新生大脑半球生产成神经细胞的美国专利号5,766,948，报道了哺乳动物神经嵴干细胞的使用的美国专利号5,654,183和5,849,553，报道了从哺乳动物多潜能CNS干细胞在体外产生分化的神经元的美国专利号6,040,180，报道了神经上皮干细胞、少突胶质细胞-星形胶质细胞前体、和谱系受限的神经元前体的产生和分离的WO98/50526和WO99/01159，和报道了从胚胎前脑获得并用培养基进行培养的神经干细胞的美国专利号5,968,829，所述培养基包含葡萄糖、转铁蛋白、胰岛素、硒、孕酮和几种其他的生长因子。

尽管在本发明的执行中可以利用技术人员已知的任何合适的材料和/或方法；然而，本文还是描述了非限制性优选的材料和/或方法。

本发明在某些方面可以参考下述实施例进行理解，所述实施例为了举例说明而不是为了限制而提供。除非另有说明，下述实施例中参考的材料、试剂等可从商业来源获得。

实施例1

ES细胞分化成运动神经元

A.材料与方法

1.胚胎干(ES)细胞培养

ES细胞从HB9-GFP转基因小鼠中获得，并且在采取运动神经元表型后发绿色荧光[Wichterle，H.等人(2000)Cell110，385-397，引入本文作为参考]。在鼠类LIF(Chemicon)的存在下使小鼠ES细胞维持在增殖和未分化的状态中。ES细胞在丝裂霉素处理的原代小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层上进行培养。

2.材料

视黄酸(RA)得自Sigma(R-2625)。音猬(Shh)激动剂Hh-Ag1.3得自Curis，Inc.(Cambridge，Mass.)。MNTF6-聚体、7-聚体、10-聚体、11-聚体、21-聚体和33-聚体肽得自CSBioCompany(MenloPark，CA)，所述CSBioCompany依照由GenervonBiopharmaceuticalsLLC(Montebello，CA)提供的氨基酸序列信息通过固相合成生产肽。

3.分化方案

使小鼠ES细胞与成纤维细胞的饲养层分离。这通过受胰蛋白酶作用和将细胞混合物铺板在包被有0.1％明胶的细胞培养瓶上完成。成纤维细胞特异地附着在明胶上，留下漂浮的ES细胞的纯群体。收集漂浮的ES细胞并重悬浮于分化培养基中。这个阶段被称为“d-1”。ES细胞形成胚状体(EBs)并且在24小时后(“d0”)暴露于RA(1μM)+MNTF或RA(1μM)+Shh激动剂(1μM)。MNTF肽(所有6种形式)以0.1μg/ml-150μg/ml的终浓度范围进行测试。

分化测定法从“d-1”阶段起进行6天。

B.结果

图2中的显微照片显示了在HB9启动子控制下的eGFP表达。HB9表达是完全分化的运动神经元的标记。如图2中所示，用RA和MNTF10-聚体或33-聚体处理的EBs表达eGFP并且发绿色荧光，其程度与用RA和Shh激动剂处理的EBs相同或更大。数据显示本文提供的MNTF10-聚体或33聚体肽在分化过程中是成功的。升高的荧光在MNTF10-聚体或33聚体低至0.1μg/ml的浓度下是可检测的，并且在这个实验中，在约10μg/ml下看起来是最佳的。

C.结论

在低浓度RA的存在下，MNTF10-聚体和33-聚体能够诱导ES细胞分化成分化的运动神经元。这些发现意味着在体外或体内用MNTF10-聚体或33-聚体处理ES、神经前体或部分分化的神经细胞，可以引导干细胞或干细胞衍生的移植物朝向运动神经元表型分化。

实施例2

在Shh抑制剂的存在下MNTF诱导的分化

下述实施例证实MNTF诱导的分化与Shh途径独立。

A.材料和方法

1.材料

环杷明-KAAD在smoothened受体处抑制Shh途径的[3-酮-N-(氨乙基(aminoethy)-氨己酰基-二苯丙酰基)环杷明]得自Calbiochem。

2.实验方案

ES细胞如上所述进行分化并且在第0天时它们用下述进行处理：RA+Shh-激动剂；RA+Shh激动剂+环杷明-KAAD(5μM)；RA+MNTF(33聚体10μg/ul)；和RA+环杷明-KAAD(5μM)+MNTF(33聚体10μg/ul)。在添加其他组分前抑制剂进行1小时预处理。

3.测定法

在分化第5天时，就GFP荧光检查胚状体，所述GFP荧光指示ES细胞分化成运动神经元表型。

B.结果

环杷明-KAAD(5μM)阻断Shh-激动剂对小鼠ES细胞的GFP荧光影响，但不阻断MNTF诱导的ES细胞分化。

C.结论

这些结果显示MNTF1通过与音猬信号转导途径独立的途径诱导ES细胞分化成运动神经元。

实施例3

响应MNTF的胰岛素受体自磷酸化

A.材料和方法

1.材料

胰岛素受体(IR)的非特异性抑制剂HNMPA-(AM)3(羟基-2-萘甲基磷酸(naphthalenylmethylphosponicacid)三乙酰氧基甲酯)得自AlexisBiochemicals。兔(多克隆)抗-胰岛素/胰岛素生长因子-1受体(IR/IGF1R)2.实验方案

使胚状体(EBs)暴露于RA(1μM)+MNTF33聚体(10μg/ml)或RA(1μM)+MNTF33聚体(10μg/ml)+/-HNMPA-(AM)3(50nM)。在0、15分钟、30分钟、1小时、2小时和4小时的时间点上收获细胞。

3.蛋白质印迹

如前所述收获细胞[Barber，A.J.等人，(2001)J.Biol.Chem.276，32814-32821]。用PierceBCA试剂测量蛋白质浓度，并且在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳前针对相等蛋白质调整所有样品。

细胞裂解物用针对磷酸酪氨酸1162-1163IR/IGFR1的的多克隆抗体根据制造商的指导或标准技术进行免疫印迹。蛋白质条带通过增强的化学荧光进行检测。增强的化学荧光免疫印迹的密度计分析用ImageQuant(MolecularDynamics，Sunnyvale，CA)来进行。

B.结果

图3显示了在用MNTF33聚体处理并且在IR抑制剂处理的15分钟内减少自磷酸化的细胞中的IR/IGF-R自磷酸化。

C.结论

MNTF1处理起始IR/IGF-R介导的信号转导途径的活化。

实施例4

MNTF类似物增强干细胞衍生的运动神经元的存活

ES衍生的运动神经元的存活已通过其他人显示依赖于神经营养因子，例如NT3、BDNF、CNTF和GDNF。例如，参见引入本文作为参考的美国专利申请号10/196,882。下述实施例公开了MNTF肽如何可以用于增强干细胞衍生的运动神经元的存活。

A.材料和方法

1.材料

视黄酸(RA)得自Sigma(R-2625)。音猬(Shh)激动剂Hh-Ag1.3得自Curis，Inc.(Cambridge，Mass.)。MNTF6-聚体、7-聚体、10-聚体、11-聚体、21-聚体和33-聚体肽得自CSBioCompany(MenloPark，CA)，所述CSBioCompany依照由GenervonBiopharmaceuticalsLLC(Montebello，CA)提供的氨基酸序列信息通过固相合成生产肽。GDNF和NT3可以得自R&DSystems(Minneapolis，Minnesota)，并且dbcAMP可从RocheMolecularBiochemicals(Indianapolis，IN)获得。

GDNF，dbcAMP，NT3。

2.实验方案

小鼠胚胎干(ES)细胞在RA和Hg-激动剂(Curis，Inc.)的存在下进行分化。在第4天时，分化的胚状体用0.05％胰蛋白酶或胶原酶和分散酶(在PBS中1mg/ml)进行部分解离，并且在包被有PLL-层粘连蛋白和基质胶的盖玻片上进行铺板。

解离的培养物随后在第5天时用GDNF(10ng/ml)，不同剂量的(0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml和50μg/ml)MNTF(所有7种形式)、和dbcAMP(1μM)，NT3(10pg/ml)进行处理。

3.测定法

通过使用由来自HB9启动子表达的GFP产生的荧光鉴定神经元及其轴突。在第6、8和10天时可以如前所述[Harper，J.M.等人(2004)PNAS101，7123-7128，引入本文作为参考]定量神经突长出。在第10天时通过计数具有现有轴突的细胞总数目计算生存性百分比。

B.结果

MNTF10和33聚体在使解离培养物维持培养高达10天方面是有效的。如在图4中所见，MNTF1肽可与有效的运动神经元营养因子如GDNF比较，并且当与NT3和dbcAMP比较时在增强存活方面可能甚至更佳。

C.结论

MNTF肽类似物提供了用于ES细胞衍生的运动神经元细胞培养的另外生长补充物，并且可以增强移植的ES细胞在体内的存活。

实施例5

干细胞制备和维持

本实施例中所用pPS细胞是非人来源的。

C.未分化状态的pPS细胞的繁殖

在促进增殖而不促进分化的条件下，pPS细胞可以在培养中连续繁殖。示例性含血清ES培养基含有80％DMEM(例如Knock-OutDMEM，Gibco)，20％限定的胎牛血清(FBS，Hyclone)或血清替代物(WO98/30679)，1％非必需氨基酸，1mML-谷氨酰胺，和0.1mMβ-巯基乙醇。紧在使用前，加入人bFGF至4ng/mL(WO99/20741，GeronCorp.)。

一般地，ES细胞在饲养细胞层上进行培养。在妊娠13天后从CF1小鼠中收获胚胎，转移至2mL胰蛋白酶/EDTA，切碎，并于37℃温育5分钟。加入10％FBS，允许碎片沉降，并且使细胞在90％DMEM、10％FBS和2mM谷氨酰胺中进行繁殖。为了制备饲养细胞层，照射细胞以抑制增殖但允许合成支持ES细胞的因子(约4000拉德γ-照射)。培养平板用0.5％明胶包被过夜，用375,000受照射的mEFs/孔进行铺板，并且在铺板后5小时-4天之间使用。紧在种植pPS细胞前将培养基替换为新鲜的hES培养基。

无饲养者的培养物在营养培养基中得到支持，并且一般通过培养受照射的原代小鼠胚胎成纤维细胞、端粒化的(telomerized)小鼠成纤维细胞、或衍生自pPS细胞的成纤维细胞样细胞进行适应。培养基可以通过使饲养者以约5-6×10⁴cm²的密度在无血清培养基例如KODMEM中铺板进行适应，所述KODMEM补充有20％血清替代物和4ng/mLbFGF。已适应1-2天的培养基补充有进一步的bFGF，并且用于支持pPS细胞培养物1-2天。

ES细胞出现高核/质比，明显核仁，和具有弱可辨别细胞连接的紧密集落形成。灵长类动物ES细胞表达阶段特异性的胚胎抗原(SSEA3和SSEA4)，和使用命名为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体可检测的标记(Thomson等人，Science282：1145，1998)。小鼠ES细胞可以用作关于SSEA-1的阳性对照，和关于SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的阴性对照。SSEA-4始终存在于人胚胎性癌(hEC)细胞上。pPS细胞的体外分化导致SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81表达的丧失，以及SSEA-1表达的增加。SSEA-1也在hEG细胞上发现。

D.制备神经前体和终末分化细胞

本文提供的某些神经前体细胞通过在特定的培养环境中使干细胞培养、分化或编程来获得，所述培养环境富集具有所需表型的细胞。这些方法可应用于许多类型的干细胞，包括本文描述的灵长类动物多能干(pPS)细胞。神经元细胞分化一般在包含合适底物的培养环境中发生，并且添加包含分化试剂的营养培养基。合适的基质包括用正电荷包被的固体表面，例如碱性氨基酸，由聚-L-赖氨酸和多鸟氨酸示例。底物可以用细胞外基质组分包被，由纤连蛋白示例。其他允许的细胞外基质包括Matrigel.RTM(来自Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞的细胞外基质)、层粘连蛋白和组合底物，例如与纤连蛋白、层粘连蛋白或两者组合的聚-L-赖氨酸。

分化细胞可以基于表型特征进行分选以富集某些群体。细胞分选可以通过下述进行：使群体中的细胞和与神经细胞特有的标记结合的抗体或配体接触，随后分离特异性识别的细胞与群体中的其他细胞。一种方法是其中特异性抗体与固体表面偶联的免疫淘选。使细胞与表面接触，并且洗掉不表达标记的细胞。结合细胞随后通过更剧烈的洗脱进行回收。这种的变体是亲和层析和抗体介导的磁性细胞分选。在一般的分选操作中，使细胞与特异性初级抗体接触，并且随后用与磁珠接触的次级抗免疫球蛋白试剂捕获，可以对所述磁珠实施磁场以回收粘着细胞。

另一种合适的分离方法是荧光激活细胞分选，其中表达标记的细胞用特异性抗体(例如经由荧光标记的次级抗免疫球蛋白)进行标记，并且使用合适的分选仪器根据结合标记的量进行分离。这些方法中的任何一种都是合适的，以允许分化和回收具有目的标记的阳性选择的细胞群，和没有被阳性选择的足够密度或易接近性的特定标记的阴性选择的细胞群。阴性选择还可以通过下述来进行：使细胞顺次与特异性抗体温育以产生群体细胞，当抗体在补体制剂的存在下已结合时，所述群体细胞将裂解。分化细胞群的分选可以在任何时候发生，但优选地在分化过程起始后不久。

细胞可以根据许多表型标准进行表征。该标准包括但不限于，形态特征的显微镜观察，表达的细胞标记的检测或定量，酶促活性，或神经递质及其受体，和电生理功能。

本发明中包含的某些细胞具有神经元细胞或胶质细胞特有的形态特征。在此类细胞存在的评估中该特征由技术人员容易地理解。例如，神经元的特征是小细胞体，和暗示轴突和树突的多个突起。本发明的细胞还可以根据其是否表达各种种类的神经细胞特有的表型标记进行表征。

合适的标记包括但不限于，神经元特有的β-微管蛋白III，微管相关蛋白2(MAP-2)或神经纤丝；星形胶质细胞中存在的神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)；少突神经胶质细胞特有的半乳糖脑苷酯(GaIC)或髓磷脂碱蛋白(MBP)；未分化的hES细胞特有的Oct-4；神经群体及其他细胞特有的巢蛋白；以及A2B5和聚唾液酸化的NCAM(这些标记有时可以显示在其他细胞类型上，例如肝或肌细胞)。β-微管蛋白Ill先前被认为对神经细胞特异，但已发现hES细胞的亚群也是β-微管蛋白III阳性的。MAP-2是关于各种类型的完全分化的神经元更严格的标记。

本文描述的或本领域已知的组织特异性标记可以使用已知的免疫学技术进行检测，包括例如用于细胞表面标记的流式免疫细胞化学，用于细胞内或细胞表面标记的免疫组织化学(例如，固定细胞或组织切片的)，细胞提取物的蛋白质印迹分析，和用于细胞提取物或分泌到培养基内的产物的酶联免疫测定法(例如酶联免疫吸附测定法(ELISA))。由细胞表达的抗原被说成是“抗体-可检测的”，如果显著可检测量的抗体在标准免疫细胞化学或流式细胞计量测定法中将与抗原结合，包括在细胞固定后，并且任选地使用标记的次级抗体或其他缀合物(例如生物素-抗生物素蛋白缀合物)以扩增标记。

组织特异性基因产物表达也可以在mRNA水平上进行检测，例如通过RNA印迹分析、斑点印迹杂交分析、或通过逆转录酶起始的聚合酶链式反应(RT-PCR)(参见美国专利号5,843,780)。本发明的特定神经前体细胞群的分化(例如使用运动神经元营养因子(MNTF)或MNTF类似物)可以产生至少20％、30％、40％或超过50％MAP-2阳性的细胞群。大比例，如5％、10％、25％、或更多的NCAM或MAP-2阳性细胞将能够合成神经递质，例如乙酰胆碱、甘氨酸、谷氨酸盐、去甲肾上腺素、血清素或GABA。某些细胞群包含0.1％和可能1％、3％、或5％或更多(在细胞计数基础上)的NCAM或MAP-2阳性细胞，通过免疫细胞化学或mRNA表达测量的，所述阳性细胞对于酪氨酸羟化酶(TH)是阳性的。这一般在本领域中被视为关于多巴胺合成细胞的标记。

实施例6

鼠类胚胎干细胞通过MNTF分化成运动神经元

在这个实施例中，此处显示在视黄酸的存在下，在鼠类ES细胞体外分化成运动神经元方面，合成的33聚体MNTF肽(SEQIDNO：1)和10聚体MNTF肽(SEQIDNO：4)有效替代音猬。

受体激酶研究用于测量MNTF对于胰岛素受体(IR)的亲和力。结果显示MNTF具有对于胰岛素受体(IR)和胰岛素样生长因子受体(IGF-1R)的亲和力。随后测试通过这些途径中任一的信号在运动神经元产生中是否是可能的。图5显示smoothened受体信号的特异性抑制剂环杷明-KAAD(5uM)阻断Shh对小鼠ES细胞的影响，但不阻断MNTF诱导ES细胞分化的活性。因此，MNTF仍能够产生有丝分裂后的成熟运动神经元。

图5举例说明在分化第5天时在运动神经元特异性HB9启动子的控制下，响应对照(A)，RA(B)；RA/Shh(C)；环杷明-KAAD，RA/Shh(D)；RA和MNTF33聚体(E)；环杷明-KAAD，RA和MNTF33聚体(F)的GFP荧光表达比较。这个数据指出MNTFi)通过与Shh完全不同的途径发信号，或ii)2种途径会聚于smoothened的下游。

图6显示胰岛素受体特异性酪氨酸激酶抑制剂HNMPA(AM)3阻断MNTF对小鼠ES细胞的影响，但不阻断Shh诱导ES细胞分化的活性。如通过第5天胚状体响应下述的GFP荧光表达指示的，IGF1-R抑制剂picrodophyllin不能有效阻断MNTF诱导分化的活性：RA/Shh(A)；RA/MNTF33(B)；RA/MNTF10(C)；HNMPA(AM)3(15μM)/Shh(D)；HNMPA(AM)3/MNTF33(E)；HNMPA(AM)3/MNTF10(F)；PPP(1μM)，RA/Shh(G)；PPP(1μM)，RA/MNTF33(H)；PPP(1μM)，RA/MNTF10(I)。ES细胞的MNTF处理导致Tyr972和Tyr1162/1163的自磷酸化，这是IR活化的标记。

免疫沉淀：

还执行免疫共沉淀研究。来自胰岛素刺激的、IGF-I刺激的、或MNTF-33聚体(10ug/ml)第0天ES细胞的核后上清液对于总蛋白质的量(8mg)进行标准化。使裂解物与5-μg抗IRS-1抗体一起于4℃温育4小时，并且通过添加30μl50％蛋白A琼脂糖浆捕获免疫复合物。用冷裂解缓冲液洗涤4次后，将团块重悬浮于SDS-PAGE样品缓冲液中并煮沸5分钟。蛋白质通过SDS-PAGE(10％)进行分离并且通过电印迹转移到PVDF膜上。使膜在阻断溶液(TBST，3％奶粉)中在室温下温育1小时，随后与下述抗体之一温育：抗PI-3激酶p85亚单位(在TBST中1μg/ml，3％乳，于4℃过夜)。将蛋白质转移至在20％甲醇转移缓冲液中的Immobilon-P转移膜(Millipore，Bedford，MA)。蛋白质印迹用SuperSignalWestFemtoMaximumSensitivitySubstrate(Pierce，Rockford，IL)显色，并且用FuiiLuminescentImageAnalyzer(LAS-1000pluscamera；Fuji，Tokyo，Japan)显现。每个条带的强度通过ImageGauge软件(版本3.4)进行测定。

免疫共沉淀研究显示特异性SH2结构域与IR(关于PI3激酶的p85亚单位)的结合起因于对ES细胞的MNTF处理。

本文呈现的数据进一步显示阻断IGF-1R对MNTF产生运动神经元的能力没有影响，但阻断IR消除了这种能力。这些结果支持下述想法：MNTF是能够通过Shh非依赖性、IR依赖性途径产生并支持运动神经元的新因子。

MNTF的信号转导-生物化学方法：

这个实验的目的是证实MNTF通过胰岛素受体发信号。图7显示其中ES细胞用IGF-1(10nM)(泳道1)、胰岛素(100nM)(泳道2)、MNTF6(泳道3)、MNTF10(泳道4)和MNTF33(泳道5)处理5分钟的实验结果。随后使裂解物与蛋白A珠和抗IRS-1抗体一起温育。免疫复合物通过SDS-PAGE(10％)进行分离，转移至膜，并且通过蛋白质印迹使用针对PI3激酶的p85亚单位的抗体进行分析。随后使裂解物与蛋白A珠和抗IRS-1抗体一起温育。免疫复合物通过SDS-PAGE(10％)进行分离，转移至膜，并且通过蛋白质印迹使用针对PI3激酶的p85亚单位的抗体进行分析。

就召募至IRS-1的含SH2蛋白质的补充而言，在IR和IGF-IR受体之间存在差异。特别地，IGF-IR看起来偶联IRS-1优先于Grb2，而相比之下，IR看起来偶联IRS-1优先于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3激酶)的p85亚单位和Nck。2种受体偶联IRS-1与酪氨酸激酶SHP2相等。在IRS-1上存在3个重要的酪氨酸磷酸化位点(pY608、pY895和pY1172)。在pY608的情况下，Amoui等人显示关于IRS-1通过2种受体差异磷酸化的证据，即Y608在IGF1-R刺激的细胞中更多磷酸化。Amoui等人，J.Endocrinology.，171(1)：153-62(2001)。

这些结果支持下述想法：IR和IGF-IR的胞浆结构域在其固有信号潜能方面具有差异。记住这点，ES细胞在无血清环境中用MNTF进行诱导，并且使裂解物与抗IRS-1及其相应的SH2结构域，例如分别地PI3K和Grb2的p85亚单位一起进行免疫共沉淀。

A.Shh和MNTF途径的共同会聚。

这个实验的目的是确定Shh和MNTF信号的共同下游效应子。近来注意到在鸡神经外植体、10T1_2细胞的软骨形成分化、和NIH3T3细胞中的Gli活化中神经元命运的指定中，磷酸肌醇3-激酶(PI3激酶)依赖性Akt活化对于音猬(Shh)信号是必需的。RioboNA，等人，P.N.A.S.USA.103(12)：4505-10(2006)。通过胰岛素样生长因子I刺激PI3激酶_Akt使得能够通过低水平的Shh诱导Gli活化；然而，胰岛素样生长因子I单独不足以诱导Gli依赖性转录。通过突变鉴定的，蛋白激酶A(PKA)和糖原合酶激酶3_在多个位点上顺次使Gli2磷酸化，因此导致其转录活性降低。其中主要的PKA和糖原合酶激酶3_磷酸化位点被突变为丙氨酸的Gli2突变蛋白保持完全转录活性；然而，PKA-突变体Gli2不依赖于Akt信号起作用，指出Akt通过控制PKA介导的Gli灭活正向调节Shh信号。图8举例说明关于MNTF诱导的ES细胞分化的可能途径。

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本发明已在本文中得到广泛和一般地描述。属于一般公开内容的更窄的种类和亚一般分类中的每一种也可形成本发明的部分。这包括本发明的一般描述，条件或负面限制是从种类中去除任何主题，不管删除的材料是否在本文中具体引用。

其他实施方案在下述权利要求内。此外，当本发明的特征或方面按照Markush组进行描述时，本领域技术人员将认识到本发明因此也按照Markush组的任何个别成员或成员亚组进行描述。

序列表

<110>GenervonBiopharmaceuticals

<120>干细胞的MNTF分化和生长

<130>E5106-00008

<140>PCT/US2006/00008

<141>2006-11-10

<150>US60/735,702

<151>2005-11-10

<150>US60/841,766

<151>2006-09-01

<160>7

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<220>

<221>33-聚体的MNTF

<222>(1)..(33)

<223>合成肽

<400>1

LeuGlyThrPheTrpGlyAspThrLeuAsnCysTrpMetLeuSerAla

151015

PheSerArgTyrAlaArgCysLeuAlaGluGlyHisAspGlyProThr

202530

Gln

<210>2

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成性MNTF肽的类似物

<220>

<221>6-聚体的肽类似物

<222>(1)..(6)

<400>2

PheSerArgTyrAlaArg

15

<210>3

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成性MNTF肽的类似物

<220>

<221>7-聚体

<222>(1)..(7)

<223>肽类似物

<400>3

TrpMetLeuSerAlaPheSer

15

<210>4

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成性MNTF肽的类似物

<220>

<221>10-聚体的肽类似物

<222>(1)..(10)

<223>合成肽

<400>4

MetLeuSerAlaPheSerArgTyrAlaArg

1510

<210>5

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成性MNTF肽的类似物

<220>

<221>11-聚体的肽类似物

<222>(1)..(11)

<400>5

PheSerArgTyrAlaArgCysLeuAlaGluGly

1510

<210>6

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成性MNTF肽的序列

<220>

<221>13-聚体

<222>(1)..(13)

<223>合成肽

<400>6

CysTrpMetLeuSerAlaPheSerArgTyrAlaArgCys

1510

<210>7

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成性MNTF肽的类似物

<220>

<221>21-聚体

<222>(1)..(21)

<223>合成肽

<400>7

MetLeuSerAlaPheSerArgTyrAlaArgCysLeuAlaGluGlyHis

151015

AspGlyProThrGln

20

Claims (15)

1.运动神经元营养因子肽类似物制备在分化胚胎干细胞并将后代移植给宿主的方法中使用的试剂的用途，其中所述胚胎干细胞来自已建立的胚胎干细胞系，所述方法包括：

i)获得所述胚胎干细胞；

ii)在包含运动神经元营养因子肽类似物的培养基中培养所述干细胞群，以诱导所述干细胞分化成分化的运动神经元；

iii)诱导分化以产生分化的运动神经元；和

iv)将所述分化的运动神经元移植给所述宿主，

其中所述运动神经元营养因子类似物调节不依赖于音猬途径的信号转导途径，所述神经元营养因子肽类似物选自：a)具有根据SEQIDNO：1的序列的长度为33个氨基酸的MNTF肽；和b)具有根据SEQIDNO：4的序列的长度为10个氨基酸的MNTF肽。

2.权利要求1的用途，其中所述培养基中包含有效产生神经元后代细胞的量的视黄酸和有效产生运动神经元的量的所述神经元营养因子肽类似物。

3.运动神经元营养因子肽类似物用于制备药物中的用途，所述药物体内应用在移植的干细胞或其衍生物部位处或附近内部用于分化所述移植的干细胞或其衍生物，其中所述运动神经元营养因子类似物调节不依赖于音猬途径的信号转导途径，所述神经元营养因子肽类似物选自：a)具有根据SEQIDNO：1的序列的长度为33个氨基酸的MNTF肽；和b)具有根据SEQIDNO：4的序列的长度为10个氨基酸的MNTF肽，其中所述移植的干细胞来自已建立的胚胎干细胞系。

4.权利要求3的用途，其中所述药物包含有效产生神经元后代细胞的量的视黄酸和有效产生运动神经元的量的所述神经元营养因子肽类似物。

5.运动神经元营养因子肽类似物制备在用于诱导培养中的胚胎干细胞的方法中使用的试剂的用途，其中所述胚胎干细胞来自已建立的胚胎干细胞系，所述方法通过以足以诱导所述细胞分化成分化的运动神经元的量提供运动神经元营养因子肽类似物，其中所述运动神经元营养因子类似物调节不依赖于音猬途径的信号转导途径，所述神经元营养因子肽类似物选自：a)具有根据sEQIDNO：1的序列的长度为33个氨基酸的MNTF肽；和b)具有根据SEQIDNO：4的序列的长度为10个氨基酸的MNTF肽。

6.权利要求5的用途，其中所述方法用于从已建立的人胚胎干细胞系(hES)生产分化的运动神经元，并且其中所述方法包括在包含所述神经元营养因子肽类似物的培养基中培养hES细胞，从而产生其中至少50％的所述细胞表达神经元细胞标记的群体。

7.权利要求5的用途，其中所述方法用于从已建立的人胚胎干细胞系(hES)生产分化的运动神经元，并且其中所述方法包括在包含所述神经元营养因子肽类似物的培养基中培养hES细胞，从而产生其中至少55％的所述细胞表达神经元细胞标记的群体。

8.权利要求5的用途，其中所述方法用于从已建立的人胚胎干细胞系(hES)生产分化的运动神经元，并且其中所述方法包括在包含所述神经元营养因子肽类似物的培养基中培养hES细胞，从而产生其中至少60％的所述细胞表达神经元细胞标记的群体。

9.权利要求5的用途，其中所述方法用于从已建立的人胚胎干细胞系(hES)生产分化的运动神经元，并且其中所述方法包括在包含所述神经元营养因子肽类似物的培养基中培养hES细胞，从而产生其中至少65％的所述细胞表达神经元细胞标记的群体。

10.权利要求5的用途，其中所述方法用于从已建立的人胚胎干细胞系(hES)生产分化的运动神经元，并且其中所述方法包括在包含所述神经元营养因子肽类似物的培养基中培养hES细胞，从而产生其中至少70％的所述细胞表达神经元细胞标记的群体。

11.权利要求5的用途，其中所述方法用于从已建立的人胚胎干细胞系(hES)生产分化的运动神经元，并且其中所述方法包括在包含所述神经元营养因子肽类似物的培养基中培养hES细胞，从而产生其中至少80％的所述细胞表达神经元细胞标记的群体。

12.权利要求5的用途，其中所述方法用于从已建立的人胚胎干细胞系(hES)生产分化的运动神经元，并且其中所述方法包括在包含所述神经元营养因子肽类似物的培养基中培养hES细胞，从而产生其中至少90％的所述细胞表达神经元细胞标记的群体。

13.权利要求5的用途，其中所述方法包括：

i)获得所述胚胎干细胞的培养物；

ii)使所述干细胞的培养物与有效产生神经元后代细胞的量的视黄酸和有效产生运动神经元的量的所述神经元营养因子肽类似物接触。

14.杈利要求1的用途，其中所述宿主具有神经元病症，所述方法进一步包括以有效治疗所述神经元病症的量，移植所述通过运动神经元营养因子肽类似物分化的运动神经元。

15.权利要求1的用途，其中促进哺乳动物神经元的存活、生长、增殖或维持。