CN101942468A

CN101942468A - 提高转基因生物耐盐性的基因LcGST及其制备以及利用其编码的蛋白

Info

Publication number: CN101942468A
Application number: CN 201010197002
Authority: CN
Inventors: 孙艳香; 冯雪; 王彬
Original assignee: Langfang Normal University
Current assignee: Langfang Normal University
Priority date: 2010-05-28
Filing date: 2010-05-28
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2030-05-28
Also published as: CN101942468B

Abstract

本发明属于新基因的制备，特别是指一种提高转基因生物耐盐性的基因LcGST以及利用其编码的蛋白。外侧上游引物为5’-GTTCTTCCTCAAACTTCAACC-3’，外侧下游引物为5’-TTTCAAACCCTGTACAATCG-3’；内侧上游引物为5’-ATAGGTACCGAGCTCACCATGGCTGACGAGGTG-3’，内侧下游引物为5’-CTGGGATCCCTCGAGCTACTCGATGCCTAACTTG-3’，以百脉根培养21天后的叶片组织cDNA为模板，采用巢式PCR扩增方法首次在百脉根中获得谷胱甘肽S-转移酶基因LcGST，并应用其编码了可提高转基因生物耐盐性的蛋白。本发明为耐盐基因工程提供了新的候选基因，利用本发明获得的谷胱甘肽S-转移酶基因LcGST基因可为进一步转化到重要作物提高转基因植物耐盐性奠定基础，具有较大的经济效益和应用价值。

Description

提高转基因生物耐盐性的基因LcGST及其制备以及利用其编码的蛋白

所属技术领域

本发明属于新基因的制备，特别是指一种能提高转基因生物耐盐性的基因LcGST的制备以及利用其编码的蛋白。

背景技术

在我国，干旱、半干旱地区及盐碱地占国土面积的1/2左右，严重制约了农业的发展；在河北省，近几年来连续干旱的严峻形势以及黑龙岗地区和中西部地区土壤盐渍化和次生盐渍化程度的增加，不仅造成了一些重要农作物的大量减产，也减少了地表的植被覆盖，恶化了生态环境。随着科技的进步，利用基因工程手段改良、提高植物的抗旱、耐盐能力已经成为植物抗逆性改良的重要手段，而抗旱、耐盐基因的筛选和鉴定则是植物抗逆基因工程育种的首要基础性工作。

谷胱甘肽(glutathione，GSH)普遍存在于生物体内，含量丰富，其作为生物体内主要的还原态硫之一，在还原态硫的储存和转运、蛋白质和核酸的合成、清除自由基以及维持细胞膜的完整性等方面具有重要作用。谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferases，GSTs)是由一个大的多基因家族编码的多功能蛋白酶，能催化GSH和亲电子的异源物质发生接合反应，并在细胞各部分内源代谢中作为多种化学物质的结合蛋白和转运蛋白催化依赖于GSH的生物转化。其表达受多种环境因子的诱导，在植物的生长发育、次生代谢和抗逆中有重要作用。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种能提高转基因生物耐盐能力的谷胱甘肽S-转移酶LcGST基因。

本发明的目的之二在于提供该基因的制备方法。

本发明的目的之三在于提供利用该基因编码的蛋白。

本发明的整体技术构思是：

提高转基因生物耐盐性的基因LcGST，其序列如下：

ATGGCTGACG AGGTGGTTCT TCTTGATTTC TGGGCAAGTC CATTTGGCAT GAGAGTCAGA

ATCGCACTTG CTGAAAAGGG TATCAACTAT GAGTACAAAG AAGAGGATTT GAGGAACAAG

AGTCCTCTAC TTCTCCAATC GAACCCTGTT CACAAGAAGA TTCCAGTTCT CATCCACAAT

GGAAAACCCA TTGCTGAATC TCTGATTGCT GTTCAGTATA TTGATGAGGT GTGGAATGAT

GCATCTCCCT TGTTGCCTTC TGATCCTTAC CAGAGAGCTC AAGCTAGATT CTGGGCTGAT

TATGTTGATA AGAAGATATA TGAAATTGGT AGGAACATAA TTTGGAAGAA AAATGAAGAA

AGAGAAGCTG CCAAGAAGGA ATTCATAGAT TGCCTCAAGT TGCTGGAGGA ACAGCTCGGA

GACAAGACTT ACTTCGGAGG AGACAAGCTT GGGTATGTTG ATATAGCACT TGTTCCATTC

TACACTTGGT TTAAAGGCTA TGAGACCCTT GGCAACTTCA ACATAGAGAG TGAGTGCCCC

AAGCTCATTG CTTGGGCCAA GAGATGCCTG CAGAAAGAGA GCGTTTCAAA GTCTCTCCAT

GACCAAGACA AGATCTATGA GTTCATTGTG GAAATCAGAA AGAAGTTAGG CATCGAGTAG。

百脉根是一种建设生态农业的优质草种，在保持水土，防止土壤荒漠化等方面起到了巨大作用。百脉根具有基因组小、再生容易以及易于遗传转化等特点，近几年已被作为豆科植物中的模式植物而用于分子生物学的研究。本发明申请人利用美国国立生物技术信息中心(NCBI)中已知的大豆谷胱甘肽S-转移酶基因作为探针，在百脉根EST数据库中检索，利用DNAMAN软件对检索到的EST序列进行电子拼接，获得了含有完整开放阅读框的拼接序列，并对该基因进行了克隆。具体方法如下：

提高转基因生物耐盐性的基因LcGST的制备，制备方法包括：

(1)首先以已知的大豆谷胱甘肽S-转移酶基因的编码序列在美国国立生物技术信息中心百脉根的表达序列标签数据库中为LcGST基因寻找证据，获得同源性很高3条EST序列，序列号分别为BW597792.1、BW599863.1和BW594579.1，利用DNAMAN软件对检索获得的EST序列进行电子拼接，获得了相应的含有完整开放阅读框的拼接序列；

(2)依拼接序列设计特异性引物，LcGST基因的外侧上游引物为5’-GTTCTTCCTCAAACTTCAACC-3’，外侧下游引物为5’-TTTCAAACCCTGTACAATCG-3’；内侧上游引物为5’-ATAGGTACCGAGCTCACCATGGCTGACGAGGTG-3’，内侧下游引物为5’-CTGGGATCCCTCGAGCTACTCGATGCCTAACTTG-3’，将内侧上、下游引物分别引入Kpn I和BamH I酶切位点；

(3)利用设计的特异性引物以百脉根培养21天后的叶片组织cDNA为模板进行巢式PCR扩增，获得目的条带；

(4)PCR终产物回收后与pMD18-T连接，连接产物采用热激转化法转入大肠杆菌DH5α的感受态细胞，并筛选阳性克隆，进行测序，测序与预期结果一致。

利用可提高转基因生物耐盐性的基因LcGST编码的蛋白，其序列如下：

Met Ala Asp Glu Val Val Leu Leu Asp Phe Trp Ala Ser Pro Phe Gly

Met Arg Val Arg Ile Ala Leu Ala Glu Lys Gly Ile Asn Tyr Glu Tyr

Lys Glu Glu Asp Leu Arg Asn Lys Ser Pro Leu Leu Leu Gln Ser Asn

Pro Val His Lys Lys Ile Pro Val Leu Ile His Asn Gly Lys Pro Ile

Ala Glu Ser Leu Ile Ala Val Gln Tyr Ile Asp Glu Val Trp Asn Asp

Ala Ser Pro Leu Leu Pro Ser Asp Pro Tyr Gln Arg Ala Gln Ala Arg

Phe Trp Ala Asp Tyr Val Asp Lys Lys Ile Tyr Glu Ile Gly Arg Asn

Ile Ile Trp Lys Lys Asn Glu Glu Arg Glu Ala Ala Lys Lys Glu Phe

Ile Asp Cys Leu Lys Leu Leu Glu Glu Gln Leu Gly Asp Lys Thr Tyr

Phe Gly Gly Asp Lys Leu Gly Tyr Val Asp Ile Ala Leu Val Pro Phe

Tyr Thr Trp Phe Lys Gly Tyr Glu Thr Leu Gly Asn Phe Asn Ile Glu

Ser Glu Cys Pro Lys Leu Ile Ala Trp Ala Lys Arg Cys Leu Gln Lys

Glu Ser Val Ser Lys Ser Leu His Asp Gln Asp Lys Ile Tyr Glu Phe

Ile Val Glu Ile Arg Lys Lys Leu Gly Ile Glu。

本发明的基因制备中具体的工艺步骤和工艺条件是：

步骤(3)是利用设计的特异性引物，以百脉根培养21天后叶片组织的cDNA为模板在扩增仪上按照94℃预变性5分钟；30个PCR循环：94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸1分钟；72℃延伸10分钟的程序进行PCR扩增；以此PCR产物稀释100倍后取1μl作模板进行PCR扩增，按照94℃预变性5分钟；30个PCR循环：94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟；72℃延伸10分钟的条件进行，两次PCR反应均按如下成份及用量进行：

ddH₂O 10.5μl

10x PCR Buffer 2μl

dNTP(2.5mmol/L) 2μl

10umol/L的上游引物 2μl

10umol/L下游引物 2μl

模板 1μl

Taq plus DNA polymerase(5U/μl) 0.5μl

所述的步骤(4)是将内侧引物扩增的PCR产物从琼脂糖凝胶上切下，按上海生物工程有限公司的EZ Spin Column DNA Gel Extraction KitUN1Q-10柱式DNA胶回收试剂盒说明书进行胶回收，在16℃下经T4DNA连接酶连接12小时，10μl连接反应体系如下：

10×Ligation Buffer 1μl

pMD18-T载体(50ng/μl) 1μl

胶回收产物 7μl

T4DNA连接酶(350U/μl) 1μl

将连接产物转化DH5α感受态细胞，并筛选阳性克隆，送往上海生工进行测序，测序与预期结果一致，将其命名为LcGST。

本发明所具备的实质性特点和取得的显著技术进步在于：

其一、目前百脉根被认为是豆科模式植物，通常被用来研究豆科植物和根瘤菌的共生关系，由其基因组中进行抗旱、耐盐相关基因的克隆研究报道较少，本发明所克隆的LcGST基因在此种植物中为首次报道。

其二、利用本发明所克隆的LcGST获得的转基因生物的耐盐性显著提高。这不仅有助于揭示豆科植物抗旱、耐盐的机理，为生物的抗旱耐盐代谢途径的研究提供重要理论基础，也为植物基因工程领域提供了更多的候选功能基因，对利用基因工程手段进行植物遗传性状的改良具有重要参考价值。

附图说明

本发明的附图有：

图1是本发明中两次PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，分别获得约700bp左右的一条特异带图。

图中M是DL 2000Marker，1是内侧引物PCR扩增产物，2是外侧引物PCR扩增产物。

图2是LcGST编码氨基酸的同源比对结果。

图中GmGST、VvGST、RcGST分别来源于大豆、葡萄和蓖麻，GenBank注册号分别为ACL80571、ABL84692、XP_002532823。

将LcGST基因推断的编码氨基酸序列在NCBI数据库中进行blast对比分析，发现它与多种植物体内的谷胱甘肽S-转移酶均有一定相似度，经DNAMAN软件对其与大豆GmGST、葡萄VvGST、蓖麻RcGST进行相似性分析显示，相似性分别为80.6％、76.3％和73.5％(图2)，证明所克隆基因的编码产物为谷胱甘肽S-转移酶。

图3是质粒pET-32a(+)-LcGST双酶切检测结果。

图中1是pET-32a(+)-LcGST的酶切产物，2是DL 2000Marker，3是DL 15000Marker，4是pET-32a(+)的酶切产物。

图4是E.coli BL21(DE3)中诱导前和诱导后目的融合蛋白表达的SDS-PAGE检测结果。

图中1、3、5分别为含重组质粒pET-32a(+)-LcGST、空质粒pET-32a(+)和不含外源质粒的大肠杆菌BL21(DE3)未经IPTG诱导取得的总蛋白；2、4、6分别为含重组质粒pET-32a(+)-LcGST、空质粒pET-32a(+)和不含外源质粒的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导2小时后取得的总蛋白；7为标准蛋白。其中箭头a表示融合蛋白；箭头b表示标签蛋白。

图5是NaCl处理条件下含重组质粒pET-32a(+)-LcGST、空质粒pET-32a(+)的大肠杆菌生长情况分析。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例做进一步的描述，但不应理解为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准。

本实施例中的基因序列以及由其编码的蛋白质序列如前述，其中基因的制备方法及功能鉴定包括：

1、提高转基因生物耐盐性的基因LcGST的制备

(1)首先通过电子拼接获得基因序列

以已知的大豆的谷胱甘肽S-转移酶基因的编码序列在美国国立生物技术信息中心(NCBI)百脉根表达序列标签数据库中为LcGST基因寻找证据，获得同源性很高的3条EST序列，序列号分别为BW597792.1、BW599863.1和BW594579.1。利用DNAMAN软件对检索获得的EST序列进行电子拼接，获得了相应的含有完整开放阅读框的拼接序列。

(2)以拼接序列设计特异性引物，LcGST基因的外侧上游引物为5’-GTTCTTCCTCAAACTTCAACC-3’，外侧下游引物为5’-TTTCAAACCCTGTACAATCG-3’；内侧上游引物为5’-ATAGGTACCGAGCTCACCATGGCTGACGAGGTG-3’，内侧下游引物为5’-CTGGGATCCCTCGAGCTACTCGATGCCTAACTTG-3’，将内侧上、下游引物分别引入Kpn I和BamH I酶切位点；

(3)利用设计的特异性引物以百脉根培养21天后的叶片组织的cDNA为模板进行巢式PCR扩增，获得目的条带；

(4)PCR终产物回收后与pMD18-T连接，并转化感受态细胞DH5α，热激转化后，筛选阳性克隆，进行测序，测序与预期结果一致。

步骤(3)是利用设计的特异性引物，以百脉根培养21天后叶片组织的cDNA为模板在扩增仪上按照94℃预变性5分钟；30个PCR循环：94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸1分钟；72℃延伸10分钟的程序进行PCR扩增；以此PCR产物稀释100倍后取1μl作模板进行PGR扩增，按照94℃预变性5分钟；30个PCR循环：94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟；72℃延伸10分钟的条件进行，两次PCR反应均按如下成份及用量进行：

ddH₂O 10.5μl

10xPCR Buffer 2μl

dNTP(2.5mmol/L) 2μl

10umol/L的上游引物 2μl

10umol/L下游引物 2μl

模板 1μl

Taq plus DNA polymerase(5U/μl) 0.5μl

步骤(4)是将内侧引物扩增的PCR产物从琼脂糖凝胶上切下，按上海生物工程有限公司的EZ Spin Column DNA Gel Extraction Kit UN1Q-10柱式DNA胶回收试剂盒说明书进行胶回收，在16℃下经T4 DNA连接酶连接12小时，10μl连接反应体系如下：

10×Ligation Buffer 1μl

pMD18-T载体(50ng/μl) 1μl

胶回收产物 7μl

T4DNA连接酶(350U/μl) 1μl

将连接产物转化DH5α感受态细胞，热激转化后筛选阳性克隆，对获得的阳性克隆送往上海生工进行测序，测序与预期结果一致，将其命名为LcGST。

2、LcGST推断氨基酸序列的同源性分析

将LcGST基因推断的编码氨基酸序列在NCBI数据库中进行blast对比分析，发现它与多种植物体内的谷胱甘肽S-转移酶均有一定相似度，经DNAMAN软件对其与大豆GmGST、葡萄VvGST、蓖麻RcGST进行相似性分析显示，相似性分别为80.6％、76.3％和73.5％(如图2所示)，证明所克隆基因的编码产物为谷胱甘肽S-转移酶。

3、百脉根谷胱甘肽S-转移酶基因可提高转基因生物耐盐性的实验分析

(1)原核表达载体的构建与转化子获得

将pET-32a(+)空质粒与含有目的片段的克隆载体分别用限制性内切酶Kpn I和BamH I进行37℃、3小时的双酶切反应，25μl双酶切反应体系成份及用量如下：

ddH₂O 3.5μl

10×K Buffer 2.5μl

质粒 17μl

BamHI(8-20U/μl) 1μl

KpnI(4-12U/μl) 1μl

酶切产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测后回收目的条带并利用T4 DNA连接酶连接目的条带，将连接产物转化大肠杆菌，筛选含重组质粒的阳性克隆，并用Kpn I和BamH I双酶切分析所筛选的阳性克隆。结果如图3所示，质粒pET-32a(+)的大小约为5900bp，经双酶切后出现pET-32a(+)线性片段；目的基因LcGST是一段全长约为680bp的DNA，质粒pET-32a(+)-LcGST经双酶切后电泳检测，出现合适条带，说明原核表达载体质粒pET-32a(+)-LcGST构建成功。将构建的pET-32a(+)-LcGST原核表达载体利用热激法转入BL21(DE3)菌株中，获得含有重组质粒的大肠杆菌工程菌株。

(2)重组蛋白的诱导表达与鉴定

分别将含有重组质粒和含有空质粒(对照)的BL21(DE3)菌株在37℃、IPTG的终浓度为1.0mmol/L的条件下诱导2小时，取菌液煮沸裂解，5000转/分钟离心5分钟，取15μl上清液进行SDS-PAGE垂直式凝胶电泳，其中分离胶为12％，浓缩胶为5％。

分离胶(12％)的配制成份如下：

30％储备胶 4.0ml

1.5mol/L Tris-HCl(pH＝8.8) 2.5ml

ddH₂O 3.3ml

10％SDS 0.1ml

10％AP 0.1ml

TEMED 8μl

浓缩胶(5％)的配制成份：

30％储备胶 0.67ml

0.5mol/LTris-HCl(pH＝6.8) 0.5ml

ddH₂O 2.75ml

10％SDS 40μl

10％AP 40μl

TEMED 8μl

电泳时，浓缩胶电流10mA，分离胶电流15mA，电泳至溴酚蓝行至电泳

槽前沿时停止(需约4小时)，用考马斯亮兰染色液室温染色1-2小时。将胶从染色液中取出，在脱色摇床慢摇脱色至条带清晰，将脱色好的胶板拍照。照片如图4所示，经IPTG诱导的含有重组质粒pET-32a(+)-LcGST的大肠杆菌BL21(DE3)与含空质粒对照相比，在45KDa以下出现一条差异带，且表达量明显增强。预测目的融合蛋白包括GST蛋白(约24.1KDa)和pET-32a标签蛋白(约20.7KDa)，分子量大约为44.8KDa，因此分析此差异带为pET-32a(+)-LcGST在大肠杆菌BL21中表达的目的融合蛋白。

(3)转化子的耐盐性鉴定

分别挑取含重组质粒pET-32a(+)-LcGST和含空质粒对照的大肠杆菌BL21(DE3)单菌落37℃、200转/分钟振荡培养过夜后用液体LB培养基调整至相同菌液浓度，分别取100μl菌液转入含有0、100、200、300、400、500mmolNaCl的液体LB培养基(含1.0mmol/L IPTG)中进行胁迫处理，37℃、200转/分钟振荡培养2小时后752型紫外分光光度计检测600nm下OD值，每个处理进行三次重复，将平均值进行对比分析(见图5)，显示相同盐处理条件下转基因重组菌株的细胞数量与对照菌株相比均增加，其中300mmol/L NaCl胁迫处理时增加最高，达到53.1％，表明LcGST在大肠杆菌中的表达提高了宿主菌的耐盐性。

大肠杆菌菌株DH5α和BL21(DE3)均为公知公用菌株，热激转化方法为常规方法。产物回收均按按照上海生工生物工程有限公司的EZ Spin ColumnDNA Gel Extraction Kit UN1Q-10柱式DNA胶回收试剂盒进行。

rganization Applicant

----------------------

Street：爱民西道100号

City：廊坊市

State：河北省

Country：中国

PostalCode：065000

PhoneNumber：0316-2197385

FaxNumber：0316-2197385

EmailAddress：yx_sun70@163.com

<110>OrganizationName：廊坊师范学院

Application Project

-------------------

<120>Title：提高转基因生物耐盐性的基因LcGST及其制备以及利用其编码的蛋白

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<140>CurrentAppNumber：201010197002.6

<141>CurrentFilingDate：2010-05-28

Sequence

--------

<213>OrganismName：Aritfical Sequence

<400>PreSequenceString：

atggctgacg aggtggttct tcttgatttc tgggcaagtc catttggcat gagagtcaga

60

atcgcacttg ctgaaaaggg tatcaactat gagtacaaag aagaggattt gaggaacaag

120

agtcctctac ttctccaatc gaaccctgtt cacaagaaga ttccagttct catccacaat

180

ggaaaaccca ttgctgaatc tctgattgct gttcagtata ttgatgaggt gtggaatgat

240

gcatctccct tgttgccttc tgatccttac cagagagctc aagctagatt ctgggctgat

300

tatgttgata agaagatata tgaaattggt aggaacataa tttggaagaa aaatgaagaa

360

agagaagctg ccaagaagga attcatagat tgcctcaagt tgctggagga acagctcgga

420

gacaagactt acttcggagg agacaagctt gggtatgttg atatagcact tgttccattc

480

tacacttggt ttaaaggcta tgagaccctt ggcaacttca acatagagag tgagtgcccc

540

aagctcattg cttgggccaa gagatgcctg cagaaagaga gcgtttcaaa gtctctccat

600

gaccaagaca agatctatga gttcattgtg gaaatcagaa agaagttagg catcgagtag

660

<212>Type：DNA

<211>Length：660

SequenceName：百脉根谷胱甘肽S-转移酶LcGST编码cDNA序列

SequenceDescription：

Organization Applicant

----------------------

Street：爱民西道100号

City：廊坊市

State：河北省

Country：中国

PostalCode：065000

PhoneNumber：0316-2197385

FaxNumber：0316-2197385

EmailAddress：yx_sun70@163.com

<110>OrganizationName：廊坊师范学院

Application Project

-------------------

<120>Title：提高转基因生物耐盐性的基因LcGST及其制备以及利用其编

码的蛋白

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<141>CurrentFilingDate：2010-05-28

Sequence

--------

<213>OrganismName：Aritfical Sequence

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MADEVVLLDF WASPFGMRVR IALAEKGINY EYKEEDLRNK SPLLLQSNPV HKKIPVLIHN

60

GKPIAESLIA VQYIDEVWND ASPLLPSDPY QRAQARFWAD YVDKKIYEIG RNIIWKKNEE

120

REAAKKEFID CLKLLEEQLG DKTYFGGDKL GYVDIALVPF YTWFKGYETL GNFNIESECP

180

KLIAWAKRCL QKESVSKSLH DQDKIYEFIV EIRKKLGIE

219

<212>Type：PRT

<211>Length：219

SequenceName：百脉根谷胱甘肽S-转移酶LcGST氨基酸序列

SequenceDescription：

Claims

1.提高转基因生物耐盐性的基因LcGST，其特征在于其序列如下：ATGGCTGACG AGGTGGTTCT TCTTGATTTC TGGGCAAGTC CATTTGGCAT GAGAGTCAGAATCGCACTTG CTGAAAAGGG TATCAACTAT GAGTACAAAG AAGAGGATTT GAGGAACAAGAGTCCTCTAC TTCTCCAATC GAACCCTGTT CACAAGAAGA TTCCAGTTCT CATCCACAATGGAAAACCCA TTGCTGAATC TCTGATTGCT GTTCAGTATA TTGATGAGGT GTGGAATGATGCATCTCCCT TGTTGCCTTC TGATCCTTAC CAGAGAGCTC AAGCTAGATT CTGGGCTGATTATGTTGATA AGAAGATATA TGAAATTGGT AGGAACATAA TTTGGAAGAA AAATGAAGAAAGAGAAGCTG CCAAGAAGGA ATTCATAGAT TGCCTCAAGT TGCTGGAGGA ACAGCTCGGAGACAAGACTT ACTTCGGAGG AGACAAGCTT GGGTATGTTG ATATAGCACT TGTTCCATTCTACACTTGGT TTAAAGGCTA TGAGACCCTT GGCAACTTCA ACATAGAGAG TGAGTGCCCCAAGCTCATTG CTTGGGCCAA GAGATGCCTG CAGAAAGAGA GCGTTTCAAA GTCTCTCCATGACCAAGACA AGATCTATGA GTTCATTGTG GAAATCAGAA AGAAGTTAGG CATCGAGTAG。

2.根据权利要求1所述的可提高转基因生物耐盐性的基因LcGST的制备，其特征在于所述的制备方法包括如下步骤：

(4)PCR终产物回收后与pMD1-T连接，连接产物采用热激转化法转入大肠杆菌DH5α的感受态细胞，并筛选阳性克隆，进行测序，测序与预期结果一致。

3.根据权利要求2所述的可提高转基因生物耐盐性的基因LcGST的制备，其特征在于所述的步骤(3)是利用设计的特异性引物，以百脉根培养21天后叶片组织的cDNA为模板在扩增仪上按照94℃预变性5分钟；30个PCR循环：94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸1分钟；72℃延伸10分钟的程序进行PCR扩增；以此PCR产物稀释100倍后取1μl作模板进行PCR扩增，按照94℃预变性5分钟；30个PCR循环：94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟；72℃延伸10分钟的条件进行，两次PCR反应均按如下成份及用量进行：

ddH₂0 10.5μl

10x PCR Buffer 2μl

dNTP(2.5mmo l/L) 2μl

10umol/L的上游引物 2μl

10umol/L下游引物 2μl

模板 1μl

Taq plus DNA polymerase(5U/μl) 0.5μl

4.根据权利要求2所述的提高转基因生物耐盐性的基因LcGST的制备，其特征在于所述的步骤(4)是将内侧引物扩增的PCR产物从琼脂糖凝胶上切下，按上海生物工程有限公司的EZ Spin Column DNA Gel Extract ion KitUN1Q-10柱式DNA胶回收试剂盒说明书进行胶回收，在16℃下经T4DNA连接酶连接12小时，10μl连接反应体系如下：

10×Li gat ion Buffer 1μl

pMD18-T载体(50ng/μl) 1μl

胶回收产物 7μl

T4DNA连接酶(350U/μl) 1μl

5.利用如权利要求1所述的基因LcGST编码的蛋白，其特征在于其序列如下：

Met Ala Asp Glu Val Val Leu Leu Asp Phe Trp Ala Ser Pro Phe Gly

Met Arg Val Arg Ile Ala Leu Ala Glu Lys Gly Ile Asn Tyr Glu Tyr

Lys Glu Glu Asp Leu Arg Asn Lys Ser Pro Leu Leu Leu Gln Ser Asn

Pro Val His Lys Lys Ile Pro Val Leu Ile His Asn Gly Lys Pro Ile

Ala Glu Ser Leu Ile Ala Val Gln Tyr Ile Asp Glu Val Trp Asn Asp

Ala Ser Pro Leu Leu Pro Ser Asp Pro Tyr Gln Arg Ala Gln Ala Arg

Phe Trp Ala Asp Tyr Val Asp Lys Lys Ile Tyr Glu Ile Gly Arg Asn

Ile Ile Trp Lys Lys Asn Glu Glu Arg Glu Ala Ala Lys Lys Glu Phe

Ile Asp Cys Leu Lys Leu Leu Glu Glu Gln Leu Gly Asp Lys Thr Tyr

Phe Gly Gly Asp Lys Leu Gly Tyr Val Asp Ile Ala Leu Val Pro Phe

Tyr Thr Trp Phe Lys Gly Tyr Glu Thr Leu Gly Asn Phe Asn Ile Glu

Ser Glu Cys Pro Lys Leu Ile Ala Trp Ala Lys Arg Cys Leu Gln Lys

Glu Ser Val Ser Lys Ser Leu His Asp Gln Asp Lys Ile Tyr Glu Phe

Ile Val Glu Ile Arg Lys Lys Leu Gly Ile Glu。