CN101942022A

CN101942022A - 抗人表皮生长因子受体单链抗体-铁蛋白重链亚基蛋白、构建方法及其用途

Info

Publication number: CN101942022A
Application number: CN2010102394993A
Authority: CN
Inventors: 曹旭妮; 李旭; 朱培; 叶邦策
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2010-07-29
Filing date: 2010-07-29
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2030-07-29
Also published as: CN101942022B

Abstract

本发明提供一类新的可用于肿瘤早期诊断和药物传输系统的载体蛋白——抗人表皮生长因子受体单链抗体-铁蛋白重链亚基蛋白、构建方法及其用途。该融合蛋白是将抗人表皮生长因子受体通过基因工程的方法外接于铁蛋白重链亚基蛋白的表面上。本发明的目标蛋白具有很好的人表皮生长因子受体介导的肿瘤细胞靶向性，可以用于靶向成像试剂和靶向给药载体。

Description

抗人表皮生长因子受体单链抗体-铁蛋白重链亚基蛋白、构建方法及其用途

技术领域

本发明属于生物医学领域靶向成像和给药的制备技术，具体涉及抗人表皮生长因子受体单链抗体-铁蛋白重链亚基蛋白、制备方法及其用途。

技术背景

纳米材料因其具有独特的性质使其在癌症诊断分析中展示了许多优势。将纳米技术与生物医学领域相结合(纳米生物医学)已成为纳米技术领域中发展最为迅速的研究领域之一。生物笼状蛋白材料(Protein cages)，本身就是天然生物大分子，因而具有良好的生物兼容性。它们通常是由多个多肽亚基结合而形成中空的结构，外部直径与中间空穴直径均在纳米尺度范围内。近来随着基因工程、蛋白化学修饰技术与纳米技术的融合，这类生物纳米材料在蛋白的表面、内部以及各蛋白亚基界面易于修饰的特性决定了它们能有效地组装各种功能分子以构建多功能纳米器件，因此引起了的普遍关注和兴趣。因为人们可以根据需要赋予这类生物纳米材料各种各样新的功能。

表皮生长因子受体(以下简称：EGFR)信号转导通路中在细胞的增殖分化过程中起着很重要的作用，同时也在癌症的发生发展起着十分重要的促进作用。大量的研究表明，肿瘤细胞中的EGFR表达量过高，这使得EGFR成为治疗肿瘤或者是肿瘤成像非常好的一个靶点。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种新的可用于肿瘤早期诊断和药物传输系统的载体蛋白——抗人表皮生长因子单链抗体-铁蛋白重链亚基蛋白、构建方法及其用途。为实现以上技术目的及成本考虑，本发明采用基于PET原核表达制备活性蛋白的方法。

本发明的抗人表皮生长因子受体单链抗体-铁蛋白重链亚基蛋白，即anti EGFRscFv::FTH1目标融合蛋白具有序列如下：

MGEVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAIGWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGIANYAQKFQGRVTITADESTSSAYMELSSLRSEDTAVYYCAREEGPYCSSTSCYAAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQDPAVSVALGQTVKITCQGDSLRSYFASWYQQKPGQAPTLVMYARNDRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQPEDEADYYCAAWDDSLNGYLFGAGTKLTVLEFMTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNES。

本发明以铁蛋白重链亚基为载体构建以EGFR为靶点的功能化铁蛋白纳米粒子，方法涉及采用原核表达PET系统制备抗人表皮生长因子受体单链抗体-铁蛋白重链亚基蛋白(antiEGFR scFv::FTH1或者anti EGFR scFv::FTH1/FTH1)。单链抗体是一种新型基因工程抗体。通常它是将抗体重链和轻链可变区(Fv)基因之间，用一段约25个氨基酸的短肽基因将其连接成的，其表达产物可折叠成具有抗原结合能力的，由单一肽链组成的小分子抗体。它具有比完整抗体更小的特点，因而也更易于实现肿瘤细胞的内化。从而使得其在肿瘤导向治疗和体内显像，以及其他免疫诊断和防治中，具有有广泛的应用前景。本发明是以J.D.Marks构建的抗EGFR单链抗体为基础(J.Mol.Biol，2007，371：934-947)，构建新的蛋白纳米粒子——抗人表皮生长因子受体单链抗体-铁蛋白重链亚基纳米粒子，使得该纳米粒子具有EGFR靶向性。所采用的方法包括以Ecoil.BL21(DE3)构建工程菌株，表达FTH1蛋白及anti EGFRscFv::FTH1融合蛋白包涵体、包涵体分离与纯化、包涵体的变复性制备活性融合蛋白等步骤。此外，发明中所构建的蛋白可以应用于表皮生长因子受体表达过量的肿瘤，如乳腺癌的早期诊断和药物的传输系统。

本发明的制备方法，包括两大阶段，即表达工程菌的构建和目标融合蛋白的制备。本发明的第一部分为工程菌的构建。该工程菌的构建的核心是pET28a(+)/anti EGFR scFv::FTH1的构建。其中融合方式不影响活性蛋白的制备，两种方式均可实现肿瘤细胞的靶向结合，但是考虑到蛋白折叠的效率问题，在本发明中优先选择N端融合方式，即将anti EGFR scFv融合于FTH1的N端。

本发明的第二部分目标蛋白的制备与纯化。出于成本的考虑，本发明优先采用原核表达系统中的常规包涵体变复性法制备活性anti EGFR scFv::FTH1融合蛋白或者是anti EGFRscFv::FTH1/FTH1。本部分的发明的典型特性之一是通过铁蛋白重链亚基之间可以相互自组装的特性，将更多的铁蛋白重链亚基掺杂于蛋白内，以实现目标蛋白表面的anti EGFR scFv可调性。本发明还通过蛋白的电镜和细胞的活性实验证明了该目标蛋白的活性，可以实现EGFR受体介导的乳腺癌MCF-7等多种细胞的靶向，可以用于生物医学领域的靶向成像和靶向给药。

本发明制备方法包括以下(1)～(4)步骤，或者(1)～(3)和(5)～(8)的步骤：

(1)构建pET28a(+)/anti EGFR scFv::FTH 1表达工程菌：

采用重叠PCR技术扩增anti EGFR scFv::FTH1的基因，并将片段插于pET28a(+)载体上。片段和载体连接后，转化入DH5α感受态细胞内之后，将序列正确的表达载体转化入Ecoil.BL21(DE3)表达菌株，以获得目标表达工程菌；

(2)诱导pET28a(+)/anti EGFR scFv::FTH 1表达菌表达anti EGFR scFv::FTH 1目标蛋白：

将表达工程菌以1∶100的接种比例接种于LB培养基中，加入IPTG培养，离心洗涤，收集菌体；

(3)分离与纯化包涵体：破碎菌体，离心后回收沉淀；

(4)变复性制备活性anti EGFR scFv::FTH1目标蛋白：

以8M尿素溶液溶解以上步骤获得的包涵体。之后透析复性制备anti EGFRscFv::FTH1目标蛋白：

(5)构建pET28a(+)/FTH1表达工程菌：

采用PCR技术扩增FTH 1的基因插于pET28a(+)载体上，转化入DH5α感受态细胞内之后，将序列正确的表达载体转化入Ecoil.BL21(DE3)表达菌株，以获得目标表达工程菌；

(6)诱导pET28a(+)/FTH1表达菌表达FTH1目标蛋白：

将表达工程菌以1∶100的接种比例接种于LB培养基，IPTG诱导，离心收集菌体；

(7)分离FTH1目标蛋白：

破碎菌体，收集上清溶液，采用凝胶色谱法分离FTH1目标蛋白；

(8)变复性制备活性anti EGFR scFv::FTH1/FTH1目标蛋白：

以8M尿素尿素溶液溶解以上步骤获得的anti EGFR scFv::FTH1包涵体及FTH1目标蛋白，之后透析复性制备anti EGFR scFv::FTH1/FTH1目标蛋白。

附图说明：

图1anti EGFR scFv::FTH1融合蛋白序列；

图2实施例1中所制备的anti EGFR scFv::FTH1/FTH1目标蛋白的透射电镜图；

图3用流式细胞术研究实施例2中所制备的anti EGFR scFv::FTH1/FTH1目标蛋白对乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞EGFR受体的靶向效果图。

其中，(A)FTH1-F5M与细胞MCF-7的结合(阴性对照)，geo.mean 3.73；(B)FTH1-F5M与细胞MDA-MB-231的结合(阴性对照)，geo.mean 7.06；(C)anti EGFRscFv::FTH1/FTH1-F5M与细胞MCF-7的结合，geo.mean 18.98；(D)anti EGFRscFv::FTH1/FTH1-F5M与细胞MDA-MB-231的结合，geo.mean 31.08

具体实施方式：

通过下述实施例将有助于理解本发明，但不能限制本发明的内容。

实施例1

步骤1)构建pET28a(+)/a ntiEGFR scFv::FTH1表达工程菌：

采用重叠PCR技术扩增anti EGFR scFv::FTH1的基因，使片断在5’端带有Nco I酶切位点，在3’端带有Not I酶切位点。酶切后并将片段插于pET28a(+)载体的NcoI和NotI之间。片段和载体连接后，转化入DH5α感受态细胞内，以菌落PCR、酶切鉴定法筛选阳性克隆。之后，通过测序将序列正确的表达载体转化入Ecoil.BL21(DE3)表达菌株，以获得目标工程表达菌。anti EGFR scFv::FTH1目标融合蛋白序列如下：

MGEVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAIGWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGIANYAQKFQGRVTITADESTSSAYMELSSLRSEDTAVYYCAREEGPYCSSTSCYAAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQDPAVSVALGQTVKITCQGDSLRSYFASWYQQKPGQAPTLVMYARNDRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQPEDEADYYCAAWDDSLNGYLFGAGTKLTVLEFMTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNES

步骤2)anti EGFR scFv::FTH1目标蛋白的制备

(1)诱导pET28a(+)/anti EGFR scFv::FTH1表达菌表达anti EGFR scFv::FTH1目标蛋白：从平板上挑取单克隆工程表达菌落，至于25ml LB液体培养基中(40％NaCl，40％Tryptone，20％Yeast Extract，kanamycin 50μg/ml)，置于37℃恒温摇床内，200rpm，过夜培养。于次日按接种量1％接种至200ml LB液体培养基中(成分及抗生素浓度同上)。置于37℃恒温摇床内，培养至OD为0.5-0.6时，加入终浓度为1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃，诱导过夜。最后在4℃、5000rpm条件下经30min离心收集菌体，菌体存放于-20℃。

实施例2

构建pET28a(+)/FTH1表达工程菌，并诱导表达FTH1蛋白，步骤如实施例1。

实施例3

anti EGFR scFv::FTH1目标蛋白的制备

(1)诱导pET28a(+)/anti EGFR scFv::FTH 1表达菌表达anti EGFR scFv::FTH 1目标蛋白：从平板上挑取单克隆工程表达菌落，至于25ml LB液体培养基中(40％NaCl，40％Tryptone，20％Yeast Extract，kanamycin 50μg/ml)，置于37℃恒温摇床内，200rpm，过夜培养。于次日按接种量1％接种至200ml LB液体培养基中(成分及抗生素浓度同上)。置于37℃恒温摇床内，培养至OD为0.5-0.6时，加入终浓度为1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃，诱导过夜。最后在4℃、5000rpm条件下经30min离心收集菌体，菌体存放于-20℃。

(2)分离与纯化anti EGFR scFv::FTH1包涵体：

取出经过反复冻融的菌体，加入10ml的重悬液重悬菌体[50mM tris(三羟甲基氨基甲烷)，pH7.9]。在功率为300W的超声破碎仪中破碎菌体150个周期(每个周期工作3s，间隙7s)。在4℃，5000rpm条件下30min离心，除去上清，收集沉淀。加入洗涤液[50mM Tris，50mM NaCl，1mM EDTA(乙二胺四乙酸)，1％tritonX-100(C₃₄H₆₂O₁₁)，pH7.9]，洗涤所得的沉淀4次，得到较纯的包涵体。

(3)变复性制备活性anti EGFR scFv::FTH1目标蛋白：

向洗涤液中加入25ml变性液[50mM Tris-HCl，8M Urea(尿素)，1mM EDTA，10mM DTT(二硫苏糖醇)，pH7.9]重悬洗涤后的包涵体。置于28℃的恒温摇床中过夜，使包涵体溶解。次日，用变性液对溶解的包涵体进行稀释，使蛋白最终的浓度为0.1mg/ml，体积为50ml。随后置于透析带中，在4℃下浸没于复性液中透析，每隔6h，更换一次复性液(每次更换的复性液见下表)。待透析复性结束后，过滤收集复性后的蛋白溶液，用50KD的超滤管超滤浓缩目标蛋白。

复性液的配方如下：

实施例4

anti EGFR scFv::FTH1/FTH1目标蛋白的制备：

(1)分离与纯化FTH1蛋白

取出经过反复冻融的菌体，加入10ml的重悬液重悬菌体[50mM PBS(磷酸盐缓冲液)，150mMNaCl，pH 7.0]。在功率为300W的超声破碎仪中破碎菌体150个周期(每个周期工作3s，间隙7s)。在4℃，5000rpm条件下30min离心，收集上清。采用Superose 6为填料的凝胶色谱柱分离目标蛋白，洗脱液为50mM PBS，150Mm NaCl，pH 7.0，收集蛋白流出液。最后，超滤浓缩目标蛋白。

(2)分离与纯化anti EGFR scFv::FTH1包涵体

实施步骤见实施例3(2)。

(3)变复性制备活性anti EGFR scFv::FTH1/FTH1目标蛋白

将变性好的anti EGFR scFv::FTH1溶液和FTH1蛋白按物质的量1∶1混合，用变性液(50mMTris-Hcl，8M Urea，1mM EDTA，10mM DTT，pH7.9)调整体积和浓度，使总蛋白最终的浓度为0.1mg/ml，体积为50ml，随后置于透析带中。其余复性步骤见实施例3(3)，目标蛋白电镜结果见图2

实施例5

anti EGFR scFv::FTH1目标蛋白靶向性研究

将F5M(荧光素-5-马来酰亚胺)和anti EGFR scFv::FTH1目标蛋白按物质的量之比为20∶1比例混合，并控制pH在6.5-7.5。室温下反应半小时，之后置于4℃反应过夜。次日，用SephadexG25分子筛分离F5M标记后的目标蛋白，用于以下EGFR受体靶向性研究。

将培养好的乳腺癌细胞MCF-7用胰蛋白酶消化下来，取1×10⁶个细胞分装到无菌的EP管中。用含0.5％BSA(牛血清白蛋白)的PBS缓冲液洗涤两遍，加入F5M标记的anti EGFRscFv::FTH1目标蛋白溶液，混匀后冰上孵育1-2h。用0.5％BSA PBS溶液洗涤细胞3次，重悬后用FACS分析。由于MDA-MB-231细胞表面上的EGFR受体的表达较MCF-7的高，而目标蛋白与两种细胞的结合具有明显的差异。说明该目标蛋白与EGFR受体的结合具有很好的特异性。

实施例6

anti EGFR scFv::FTH1/FTH1目标蛋白靶向性研究，见实施例5，结果如图3所示。由于MDA-MB-231细胞表面上的EGFR受体的表达较MCF-7的高，而结果中目标蛋白与两种细胞的结合也具有较为明显的差异(两种细胞的几何平均荧光值分别为MDA-MB-231：31.08，MCF-7：18.98)，说明该目标蛋白与EGFR受体的结合具有很好的特异性。

Claims

1.一种抗人表皮生长因子受体单链抗体-铁蛋白重链亚基蛋白，其特征在于，所述的抗人表皮生长因子受体单链抗体-铁蛋白重链亚基融合蛋白具有如下的的序列：

2.一种构建如权利要求1所述的抗人表皮生长因子受体单链抗体-铁蛋白重链亚基蛋白的方法，其特征在于，包括(1)～(4)步骤，或者(1)～(3)和(5)～(8)的步骤：

(1)构建pET28a(+)/a ntiEGFR scFv::FTH1表达工程菌：

采用重叠PCR技术扩增anti EGFR scFv::FTH1的基因，并将片段插于pET28a(+)载体上，片段和载体连接后，转化入DH5α感受态细胞内之后，将序列正确的表达载体转化入Ecoil.BL21(DE3)表达菌株，以获得目标表达工程菌；

(2)诱导pET28a(+)/anti EGFR scFv::FTH1表达菌表达anti EGFR scFv::FTH1目标蛋白：

(3)分离与纯化包涵体：破碎菌体，离心后回收沉淀；

(4)变复性制备活性a ntiEGFR scFv::FTH1目标蛋白：

(5)构建pET28a(+)/FTH1表达工程菌：

采用PCR技术扩增FTH1的基因插于pET28a(+)载体上，转化入DH5α感受态细胞内之后，将序列正确的表达载体转化入Ecoil.BL21(DE3)表达菌株，以获得目标表达工程菌；

(6)诱导pET28a(+)/FTH1表达菌表达FTH1目标蛋白：

(7)分离FTH1目标蛋白：

(8)变复性制备活性anti EGFR scFv::FTH1/FTH1目标蛋白：

以8M尿素尿素溶液溶解以上步骤获得的anti EGFR scFv::FTH1包涵体及FTH1目

标蛋白，之后透析复性制备anti EGFR scFv::FTH1/FTH1目标蛋白。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的洗涤，以含有tritonX-100溶液进行洗涤沉淀。

4.一种如权利要求1所述抗人表皮生长因子受体单链抗体-铁蛋白重链亚基蛋白的用途，其特征在于，作为靶向成像试剂或靶向药物载体。