CN101934081A - 磁性纳米层片状羟基磷灰石与dna复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种磁性纳米层片状羟基磷灰石与DNA复合物及其制备方法，它是以磁性纳米层片状羟基磷灰石和鲑鱼精DNA为原料，按照DNA与磁性层片状羟基磷灰石的质量比1∶5～200进行配料，其制备方法是将磁性层片状羟基磷灰石的悬浮液与DNA溶液于37℃下摇动反应0.5-3.5h，高速离心后常温下干燥；本发明提供的复合物具有插层和剥离型结构，实现了超螺旋结构DNA的大量存储和有效保护。本发明提供的复合物制备方法相对容易、成本低、具有超顺磁性。对于磁性层片状羟基磷灰石在多基因药物治疗和蛋白质/基因复合药物治疗方面具有重要意义。

Description

磁性纳米层片状羟基磷灰石与DNA复合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学材料领域，涉及一种磁性纳米层片状羟基磷灰石与DNA复合物及其制备方法和应用，具体涉及一种磁性层片状羟基磷灰石与DNA纳米基因药物载体材料的制备。

背景技术

基因治疗是将人正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的一种新的治疗技术。适宜的基因载体可将目的基因安全、高效、可控、简便易行地导入目标细胞，实现其表达，从而达到基因转染或治疗疾病的目的。目前基因治疗临床试验中约2/3以上以病毒为载体。但是病毒载体因免疫原性高，毒性大，目的基因容量小，靶向特异性差，制备较复杂，存在潜在的诱发突变和致癌的危险等缺点限制了其在基因治疗中的应用。非病毒载体具有相对低毒、无免疫原性和致瘤性等优点，已成为基因载体领域的研究热点。目前，这一领域的研究多集中于载体材料的选择与优化方面，所涉及的材料主要包括裸DNA、壳聚糖、聚乙烯亚胺、多聚阳离子聚合物和脂质体的衍生物、多肽等有机材料，磷酸钙、二氧化硅等无机材料，以及脂质体与磁性粒子的复合体、脂质体与磷酸钙的复合体等有机/无机复合载体材料。在众多非病毒基因载体当中，层状无机材料载体因其成本低、制备工艺简单、有效保护DNA不受分解等优势得到广泛关注和研究。但是诸如蒙脱土和水滑石等层状无机载体缺乏靶向性，不具有生物降解性。与之相比，磁性层片状羟基磷灰石具有优异的生物相容性和超顺磁性能，使该材料有望应用在非病毒基因载体方面。但是目前为止，还没有对磁性层片状羟基磷灰石在DNA的吸附、插层和抗酶解性能方面进行研究。基于以上技术空白，本发明在制备磁性层片状羟基磷灰石(公开号CN 101759170A)基础上，首次采用自组装方法制备了磁性层片状羟基磷灰石和DNA的复合物。该复合物制备方法简单，成本低，可实现对DNA的良好保护，在未来的基因治疗中将发挥重要作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种磁性纳米层片状羟基磷灰石与DNA复合物及其制备方法和应用。将磁性层片状羟基磷灰石和DNA层层组装，实现DNA的有效存储和保护。本发明复合物具有优良的超顺磁性能，可实现靶向基因治疗。制备方法相对容易，成本低，制备的复合物可有效保护DNA不受DNA酶的分解，在多基因药物治疗和蛋白质/基因复合药物治疗方面具有重要意义。

本发明提供的磁性纳米层片状羟基磷灰石与DNA复合物是以鲑鱼精DNA和磁性层片状羟基磷灰石为原料，按照DNA和羟基磷灰石的质量比1∶5～200进行配料，其制备方法包括如下步骤：

将磁性层片状羟基磷灰石的悬浮液与DNA透明溶液混合后在恒温摇床中进行振荡，静置吸附后将反应产物清洗并离心，干燥，所得复合物具有层状有序结构。

本发明提供的磁性层片状羟基磷灰石/DNA复合物的制备方法包括如下步骤：

1)将5～200份的磁性层状羟基磷灰石粉体加灭菌的高纯水分散，超声得到分散均匀的悬浮液。间歇超声2～4次，每次1min，超声功率：100W，超声频率：40kHz。

2)用灭菌的高纯水配置质量浓度为1mg/ml的鲑鱼精DNA溶液，将1份DNA溶液加入到步骤1)的悬浊液中，震荡，超声分散，然后加入灭菌高纯水定容，得到混合液。

3)将混合液放入37℃恒温摇床，转速150rpm，平衡吸附0.5～3.5h。

4)反应产物水洗，然后超速离心(10000rpm)，去除未结合的游离DNA，产物室温干燥。

本发明提供的磁性层片状羟基磷灰石/DNA复合物用于基因药物治疗。

本发明提供的磁性层片状羟基磷灰石/DNA复合物具有插层和剥离结构。实现了超螺旋结构DNA的大量存储和有效保护。本发明提供的复合物制备方法相对容易，成本低。制备的复合物可有效保护DNA不受DNA酶的分解。同时制备的复合物具有优良的超顺磁性能，可实现靶向基因治疗。对于磁性层片状羟基磷灰石在基因药物载体中的应用，尤其是在多基因药物治疗和蛋白质/基因复合药物治疗方面具有重要意义。

附图说明

图1是X射线衍射图谱。

图2是不同酶浓度下材料的电泳照片。

图3是不同材料质量比下DNA的吸附插层率柱状图。

具体实施方式

实施例1

将5mg的磁性层片状羟基磷灰石粉体加入锥形瓶中(制备方法见CN 101759170A)，加少量灭菌的高纯水。间歇超声3次，每次1min，超声功率100W，超声频率：40kHz，最终得到分散均匀的磁性层片状羟基磷灰石悬浮液。用灭菌的高纯水配制成浓度为1mg/mL的溶液。将1mg DNA溶液逐滴加入锥形瓶中，振荡。最后定容至20mL。将锥形瓶放入恒温摇床振荡，温度：37℃，转速：150rpm，平衡吸附0.5h。将得到的产物清洗并超速离心，离心速率10000rpm，室温干燥。进行XRD测试、电泳测试和紫外分光测试，图1是X射线小角度衍射图谱，图2是电泳测试照片，图3是不同材料质量比下DNA的吸附插层率柱状图。

实施例2

将200mg的磁性层片状羟基磷灰石粉体加入锥形瓶中(制备方法见CN101759170)，加少量灭菌的高纯水。间歇超声3次，每次1min，超声功率100W，超声频率：40kHz，最终得到分散均匀的磁性层片状羟基磷灰石悬浮液。用灭菌的高纯水配制成浓度为1mg/mL的溶液。将1mg DNA溶液逐滴加入锥形瓶中，振荡。最后定容至20mL。将锥形瓶放入恒温摇床振荡，温度：37℃，转速：150rpm，平衡吸附3.5h。将得到的产物清洗并超速离心，离心速率10000rpm，室温干燥。进行XRD测试、电泳测试和紫外分光测试，图1是X射线小角度衍射图谱，图2是电泳测试照片，图3是材料质量比下DNA的吸附插层率柱状图。

测试结果：与纯的磁性层片状羟基磷灰石相比，复合物的XRD衍射峰左移，对应的层间距随着DNA含量的增加而增大。表明DNA分子已经进入磁性层片状羟基磷灰石的层间，同时由小角度X射线衍射峰还可以看出随着DNA含量的变化，复合物具有插层和剥离型两种结构。凝胶电泳结果表明，磁性层片状羟基磷灰石对DNA有良好的抗酶解作用。紫外分光测试结果表明磁性层片状羟基磷灰石可实现大量DNA的吸附插层，吸附插层率随着羟基磷灰石的含量增加而增大。

Claims (6)

1.一种磁性纳米层片状羟基磷灰石与DNA复合物，其特征在于它是以磁性层片状羟基磷灰石和鲑鱼精DNA为原料，按照DNA和羟基磷灰石的质量比1∶5～200进行配料，其制备方法包括如下步骤：

将磁性层片状羟基磷灰石的悬浮液与DNA溶液在摇动下反应，反应产物水洗，常温干燥。

2.按权利要求1所述的磁性层片状羟基磷灰石与DNA复合物，其特征在于所述的磁性层片状羟基磷灰石与DNA复合物具有插层和剥离状结构。

3.按权利要求1所述的DNA/层状羟基磷灰石复合物的制备方法，其特征在于它是包括如下步骤：

1)将层状羟基磷灰石粉体加水溶解，超声得到分散均匀的悬浮液；

2)用灭菌的高纯水配置质量浓度为1mg/ml的鲑鱼精DNA溶液，将DNA溶液加入到步骤1)的悬浊液中，震荡，超声分散，然后加入灭菌高纯水定容，得到混合液；

3)将混合液放入37℃恒温摇床，转速150rpm，平衡吸附0.5-3.5h；

4)反应产物水洗，然后超速离心，去除未插层的游离DNA，产物室温干燥。

4.按照权利要求3所述的DNA/纳米层状羟基磷灰石复合物的制备方法，其特征在于步骤1)所述的超声条件：间歇超声2～4次，每次1min，超声功率100W，超声频率40kHz。

5.按照权利要求3所述的DNA/纳米层状羟基磷灰石复合物的制备方法，其特征在于所述的超速离心速率为10000rpm。

6.权利要求1所述的磁性纳米层片状羟基磷灰石与DNA复合物的应用，其特征在于该材料用于基因药物载体。 

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