CN101932938A - 作为标记物用于化学疗法的tle3 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用TLE3作为标记物来预测患者所患癌症将对化学疗法起反应的可能性的方法。本发明涉及使用TLE3作为标记物来选择化学疗法以治疗癌症的方法。

Description

作为标记物用于化学疗法的TLE3
技术领域
无
背景技术
癌症治疗的主要困难在于为给定患者选择具有最大效能和最小毒性的化学疗法。使用(例如)免疫组织化学(IHC)对细胞表面标记物进行分析已提供了将某些癌症分为多个亚类的方法。例如，在乳癌的预后和治疗决策中考虑的一个因素是是否存在雌激素受体(ER)。ER-阳性乳癌通常比ER-阴性癌症显著更易于对激素疗法(例如他莫昔芬(tamoxifen)，其在乳腺组织中用作抗雌激素)起反应。尽管这些分析有用，但其仅部分地预测乳癌的临床特征。不同癌症中存在表型差异，但当前诊断工具却无法检测。因此，业内对如何将患者按照可能的治疗来分类从而使疗效最大化仍然有很大争议(例如，乳癌参见“NIH共识发展会议声明：乳癌的辅助疗法(NIH Consensus Development Conference Statement：Adjuvant Therapy for Breast Cancer)，2000年11月1-3日”，国立癌症研究所杂志专题论文(J.Nat.Cancer Inst.Monographs)，30：5-15，2001和迪莱奥(Di Leo)等人，国际临床肿瘤学杂志(Int.J.Clin.Oncol.)7：245-253，2002)。具体来说，当前没有工具可预测患者对紫杉醇治疗的可能反应，紫杉醇是具有特别不利的副作用的化学治疗药物。业内非常需要改良的方法和试剂来将癌症分类并由此为给定患者选择具有最大效能和最小毒性的治疗方案。
发明内容
业内已确定TLE3(转导素样分裂增强子3，英特斯(Entrez)基因库编号7090)的表达与癌症对化学疗法的反应之间的关联。此关联已使用TLE3抗体和来自乳癌队列(包括经治疗和未经治疗两类患者，疗效已知)的样品来证实。本发明者也已观察到，TLE3抗体在经治疗卵巢癌患者样品中的结合与改良预后有关。因此，在一方面中，本发明提供使用TLE3作为标记物来预测患者所患癌症对化学疗法起反应的可能性的方法。在另一方面中，本发明提供使用TLE3作为标记物来决定是否对癌症患者施用化学疗法的方法。在又一方面中，本发明提供使用TLE3作为标记物来为癌症患者选择化学疗法的方法。
可使用任何已知方法来检测TLE3的表达。因此，尽管已例示说明本发明方法可通过使用抗体来检测TLE3多肽，但在某些实施例中可使用一或多种业内熟知的引物来检测TLE3多核苷酸。
一般来说，TLE3可结合其它标记物或临床因素(例如，癌症阶段、肿瘤大小、神经节特征、年龄等)来使用以进一步改良本发明方法的预测能力。
附录简单说明
本专利申请案涉及包含附录A中所呈现的表格和数据的材料。具体来说，附录A是列举多种标记物的表格，这些标记物可结合TLE3标记物联合用于本发明方法中。所述表格包括抗体编号、母本基因名称、英特斯基因库编号、母本基因的已知别名、可用于制备抗体的肽、和用于染色的实例性抗体效价。所属领域技术人员可使用母本基因名称、英特斯基因库编号和/或母本基因的已知别名容易地获得附录A中所列来自公开数据库(例如，基因库(GenBank)、国际蛋白质数据库(Swiss-Prot)或这些数据库未来的任何衍生数据库)的每一个母本基因的核苷酸(和相应氨基酸)序列。附录A中所列每一个母本基因的核苷酸序列和相应氨基酸序列是以引用方式自这些公开数据库并入本文中。可自指定商业来源获得编号开头为S5或S6的抗体。
附图说明
图1比较乳癌患者TLE3-阴性(S0643-)和TLE3-阳性(S0643+)样品的IHC图像。
图2展示卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)复发曲线，其是使用亨兹维尔医院(Huntsville Hospital)(HH)乳癌队列中的所有患者在基于用针对TLE3标记物产生的抗体染色进行分类后获得。分别使用TLE3-阳性和TLE3-阴性患者的复发数据来获得顶部及底部曲线。如图中所示，结合TLE3标记物的抗体与此乳癌队列中的改良预后相关(HR＝0.573，p＜0.004)。
图3展示卡普兰-迈耶复发曲线，其是使用罗斯维尔公园癌症研究所(Roswell Park Cancer Institute)(RP)乳癌队列中的所有患者在基于用针对TLE3标记物产生的抗体染色进行分类后获得。RP队列中的所选患者全部都是ER(雌激素受体，英特斯基因库编号2099)、PR(孕激素受体，英特斯基因库编号5241)和HER-2标记物(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物2，英特斯基因库编号2064)三阴性患者。分别使用TLE3-阳性和TLE3-阴性患者的复发数据来获得顶部及底部曲线。如图中所示，结合TLE3标记物的抗体与此乳癌队列中的改良预后相关(HR＝0.24，p＜0.011)。
图4展示使用图1HH乳癌队列中未接受化学疗法的患者获得的卡普兰-迈耶复发曲线。分别使用此亚类中TLE3-阳性和TLE3-阴性患者的复发数据来获得顶部及底部曲线。如图中所示，结合TLE3标记物的抗体与未接受化学疗法的乳癌患者的预后无关(HR＝0.788，p＝0.49)。
图5展示使用图1HH乳癌队列中接受化学疗法的患者获得的卡普兰-迈耶复发曲线。分别使用此亚类中TLE3-阳性和TLE3-阴性患者的复发数据来获得顶部及底部曲线。如图中所示，结合TLE3标记物的抗体与预后在接受化学疗法的患者中恢复关联(HR＝0.539，p＜0.013)。
图6展示使用图2RP乳癌队列中接受化学疗法的患者获得的卡普兰-迈耶复发曲线。分别使用此亚类中TLE3-阳性和TLE3-阴性患者的复发数据来获得顶部及底部曲线。如图中所示，结合TLE3标记物的抗体与此亚类乳癌患者的改良预后有关(HR＝0.194，p＝0.010)。这些结果与图5中用HH队列获得的结果类似。
图7展示使用图5HH乳癌队列中接受CMF(环磷酰胺、甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶)化学疗法的患者获得的卡普兰-迈耶复发曲线。分别使用此亚类中TLE3-阳性和TLE3-阴性患者的复发数据来获得顶部及底部曲线。如图中所示，结合TLE3标记物的抗体与此亚类经治疗患者的改良预后有关(HR＝0.398，p＜0.019)。
图8展示使用图5HH乳癌队列中接受CA(环磷酰胺和亚德里亚霉素)或CAF(环磷酰胺、亚德里亚霉素和5-氟尿嘧啶)化学疗法(使用或不使用紫杉烷)的患者获得的卡普兰-迈耶复发曲线。分别使用此亚类中TLE3-阳性和TLE3-阴性患者的复发数据来获得顶部及底部曲线。如图中所示，结合TLE3标记物的抗体与预后之间的关联在此亚类经治疗患者中丧失显著性(HR＝0.666，p＝0.22)。
图9展示使用图8HH乳癌队列中仅接受CA或CAF化学疗法(即不使用紫杉烷)的患者获得的卡普兰-迈耶复发曲线。分别使用此亚类中TLE3-阳性和TLE3-阴性患者的复发数据来获得顶部及底部曲线。如图中所示，结合TLE3标记物的抗体与此亚类经治疗患者的预后无关(HR＝1.03，p＝0.95)。
图10展示使用图8HH乳癌队列中接受CA或CAF以及紫杉烷的患者获得的卡普兰-迈耶复发曲线。分别使用此亚类中TLE3-阳性和TLE3-阴性患者的复发数据来获得顶部及底部曲线。如图中所示，结合TLE3标记物的抗体与预后在此亚类经治疗患者中恢复关联(HR＝0.114，p＝0.038)。
图11展示使用图6RP乳癌队列中仅接受CA化学疗法(即不使用紫杉烷)的患者获得的卡普兰-迈耶复发曲线。分别使用此亚类中TLE3-阳性和TLE3-阴性患者的复发数据来获得顶部及底部曲线。如图中所示，结合TLE3标记物的抗体与此亚类经治疗患者的预后无关(HR＝0.759，p＝0.81)。
图12展示使用图6RP乳癌队列中接受CA以及紫杉烷的患者获得的卡普兰-迈耶复发曲线。分别使用此亚类中TLE3-阳性和TLE3-阴性患者的复发数据来获得顶部及底部曲线。如图中所示，结合TLE3标记物的抗体与此亚类经治疗患者的改良预后有关(HR＝0.142，p＝0.011)。
图13展示使用图6RP乳癌队列中接受紫杉烷或CMF的患者获得的卡普兰-迈耶复发曲线。某些接受紫杉烷的患者也接受了CA。分别使用此亚类中TLE3-阳性和TLE3-阴性患者的复发数据来获得顶部及底部曲线。如图中所示，结合TLE3标记物的抗体与此亚类经治疗患者的改良预后有关(HR＝0.137，p＝0.011)。
图14展示使用图6RP乳癌队列中接受新辅助化学疗法的患者获得的卡普兰-迈耶复发曲线。分别使用此亚类中TLE3-阳性和TLE3-阴性患者的复发数据来获得顶部及底部曲线。样品量较小(N＝12)；然而，如图中所示，在使用费氏确切检验(Fisher Exact Test)来测量时，结合TLE3标记物的抗体显示与此亚类经治疗患者的改良预后显著相关(p＝0.005)。
图15-17展示使用图6RP乳癌队列中接受化学疗法的患者获得的卡普兰-迈耶复发曲线。分别使用患有II+期(图15)、IIb+期(图16)和III+期(图17)癌症的TLE3-阳性和TLE3-阴性患者的复发数据来获得顶部及底部曲线。在每种情形下，结合TLE3标记物的抗体都与这些亚类经治疗患者的改良预后有关。在图17亚类中样品量较小(N＝19)；然而在使用费氏确切检验来测量时此关联具有显著性(p＝0.020)。
图18展示使用阿拉巴马大学伯明翰分校(University of Alabama at Birmingham)(UAB)卵巢癌队列中的患者获得的卡普兰-迈耶复发曲线。所有患者都接受紫杉醇。大多数患者也接受铂类化学疗法(卡铂或顺铂)。分别使用此亚类中TLE3-阳性和TLE3-阴性患者的复发数据来获得顶部及底部曲线。如图中所示，结合TLE3标记物的抗体与这些经治疗患者的预后有关(HR＝0.64，p＜0.049)。
具体实施方式
定义
结合-在相互作用配偶体“结合”标记物时，其通过非共价直接相互作用相连。
癌症标记物-“癌症标记物”或“标记物”是癌症样品中可检测到的分子实体。一般来说，标记物可为多肽(例如，TLE3蛋白)或多核苷酸(例如，TLE3mRNA)，其可指示基因(例如，TLE3基因)表达并且存于癌症样品中，例如存于癌细胞的细胞质或膜内和/或自所述细胞分泌。
癌症样品-本文所用术语“癌症样品”或“样品”在广义上包括取自癌症患者的细胞或组织样品(例如，取自肿瘤、取自血流等)、可能位于体内其它位置的肿瘤源细胞(例如，血流或转移位点中的细胞)、或衍生自所述样品的任何材料。衍生材料可包括(例如)自样品提取的核酸或蛋白质、子代细胞等。在一个实施例中，癌症样品可为肿瘤样品。
关联-“关联”是指可根据一个变量预测另一变量的程度，例如可根据标记物在癌症样品中的表达来预测癌症对疗法的反应的程度。可使用多种统计方法来测量两个变量之间的关联，例如(但不限于)司徒登氏(student)t-检验、费氏确切检验、皮尔逊(Pearson)相关系数、斯皮尔曼(Spearman)相关系数、卡方检验(Chi squared test)等。结果以传统方式表示为所测量相关系数，其中p值提供对因偶然而产生关联的可能性的测量。一般认为p值小于0.05的关联在统计学上具有显著性。优选关联的p值小于0.01，特别优选地小于0.001。
杂交-在引物与标记物如本文所述以物理方式彼此“杂交”时，其通过非共价碱基对相互作用相连。
相互作用配偶体-“相互作用配偶体”是结合多肽标记物的实体。例如(但不限于)，相互作用配偶体可为结合标记物的抗体或其片段。一般来说，若相互作用配偶体以可检测程度结合标记物并且在类似条件下不以可检测程度结合无关分子实体(例如，其它标记物)，则认为相互作用配偶体可“特异性结合”标记物。标记物与相互作用配偶体之间是否特异性结合通常取决于靶标记物是否存在相互作用配偶体可识别的特定结构特征，例如抗原决定簇或表位。一般来说，应理解特异性并不一定具有绝对性。例如，业内熟知，除了靶表位以外，多种抗体通常也可与其它表位交叉反应。所述交叉反应性是否可接受取决于相互作用配偶体用于何种应用。因此，相互作用配偶体的特异性程度取决于其应用背景。一般来说，若相互作用配偶体与特定标记物结合的倾向超过与其它潜在配偶体(例如其它标记物)的结合，则其表现对所述配偶体具有特异性。所属领域技术人员能够选择出具有足够特异性程度而可在任何给定应用中(例如，用于检测靶标记物，用于治疗目的等)发挥适当作用的相互作用配偶体。也应了解，可在其它因素背景下评估特异性，例如相互作用配偶体与靶标记物的亲和性对相互作用配偶体与其它潜在配偶体(例如其它标记物)的亲和性。若相互作用配偶体对靶标记物表现高亲和性并且对非靶分子表现低亲和性，则相互作用配偶体即使缺少特异性也可为可接受的诊断用试剂。
引物-“引物”是以物理方式与多核苷酸标记物杂交的寡核苷酸实体。一般来说，若引物以可检测程度与标记物杂交并且在类似条件下不以可检测程度与无关分子实体(例如，其它标记物)杂交，则认为所述引物“特异性杂交”所述标记物。标记物与引物之间是否特异性杂交取决于靶标记物中是否存在与引物核苷酸序列互补的特定核苷酸序列。一般来说，应理解特异性并不一定具有绝对性。引物的特异性程度取决于其应用背景。一般来说，若引物与特定标记物杂交的倾向超过与其它潜在配偶体(例如其它标记物)的杂交，则其表现对所述配偶体具有特异性。所属领域技术人员能选择出具有足够特异性程度而在任何给定应用中发挥适当作用的引物。也应了解，可在其它因素背景下评估特异性，例如引物与靶标记物的亲和性对引物与其它潜在配偶体(例如其它标记物)的亲和性。若引物对靶标记物表现高亲和性并且对非靶分子表现低亲和性，则引物即使缺少特异性也可为可接受的诊断用试剂。
反应-癌症对疗法的“反应”可表示任何可检测的变化，例如在分子、细胞、器官、或生物体水平上的变化。例如，肿瘤大小、患者预期寿命、复发、或患者存活时间长度等都是反应。可以多种方式中的任一种来测量反应，包括(例如)肿瘤大小的非侵入性测量(例如，CT扫描、影像增强可视化等)、肿瘤大小的侵入性测量(例如，残余肿瘤切除术等)、替代标记物测量(例如，血清PSA等)、临床病程差异(例如，测量患者生活质量、复发时间、存活时间等)。
小分子-“小分子”是非聚合分子。小分子可在实验室中合成(例如，通过组合合成方法)或得自自然界(例如，天然产物)。小分子的特征通常在于其含有若干个碳-碳键并且分子量小于1500Da，但出于本发明目的不欲使此特征具有限制性。
本发明某些优选实施例的详细说明
如上所述，业内已确定TLE3(转导素样分裂增强子3，英特斯基因库编号7090)在癌症样品中的表达与癌症对化学疗法的反应有关。如各实例中所述，此关联已使用TLE3抗体和来自两个乳癌队列(包括经治疗和未经治疗两类患者，疗效已知)的样品来证实。也已显示此预测模型在用于经治疗卵巢癌患者队列的多个样品时具有一致性。也已证实TLE3可用于预测对特定类型的化学疗法的反应，所述化学疗法包括涉及投与细胞周期特异性化学治疗药物(例如甲氨蝶呤和紫杉烷)的治疗。由于已知这些化学治疗药物可用于不同癌症类型，因此这些结果表明，本发明方法也可用于预测所述化学治疗药物在不同癌症类型中的效能。
预测对化学疗法的反应并选择化学疗法
在一方面中，本发明提供使用TLE3作为标记物来预测患者所患癌症对化学疗法起反应的可能性的方法。一般来说，这些方法涉及提供来自癌症患者的癌症样品，测定TLE3是否在所述癌症样品中表达，和根据所述测定步骤的结果来预测患者所患癌症对化学疗法起反应的可能性。在一个实施例中，预测步骤包含根据癌症样品中存在TLE3的表达预测患者所患癌症可能对化学疗法起反应。在一个实施例中，预测步骤包含根据癌症样品中不存在TLE3的表达预测患者所患癌症不可能对化学疗法起反应。
在某些实施例中，提供阴性对照样品，并且测定步骤包含检测TLE3在癌症样品和阴性对照样品中的表达水平和比较TLE3在癌症样品和阴性对照样品中的表达水平。一般来说，阴性对照样品可为不以可复现方式表达TLE3的任何样品。在一个实施例中，阴性对照样品可为不以可复现方式结合TLE3抗体的样品。在一个实施例中，阴性对照样品可为不以可复现方式产生可检测水平的TLE3 mRNA的样品。在一个实施例中，阴性对照样品可得自患有TLE3-阴性癌症的患者。在一个实施例中，阴性对照样品可得自未患癌症的患者。在某些实施例中，阴性对照样品可源自与所述癌症具有相同类型的组织(例如，在提及乳癌时其源自乳腺组织)。在其它实施例中，阴性对照样品可源自不同类型的组织或甚至不同生物体或细胞系。
或者或另外，在某些实施例中，提供阳性对照样品，并且测定步骤包含检测TLE3在癌症样品和阳性对照样品中的表达水平和比较TLE3在癌症样品与阳性对照样品中的表达水平。一般来说，阳性对照样品可为以可复现方式表达TLE3的任何样品。在一个实施例中，阴性对照样品可为以可复现方式结合TLE3抗体的样品。在一个实施例中，阴性对照样品可为以可复现方式产生可检测水平的TLE3 mRNA的样品。在一个实施例中，阳性对照样品可得自患有TLE3-阳性癌症的患者。在某些实施例中，阳性对照样品可源自与所述癌症具有相同类型的组织(例如，在提及乳癌时其源自乳腺组织)。在其它实施例中，阳性对照样品可源自不同类型的组织或甚至不同生物体或细胞系。
可使用任何已知方法来测定TLE3的表达。
在一个实施例中，可使用结合TLE3多肽(例如，TLE3蛋白或其抗原片段)的相互作用配偶体来检测TLE3多肽。例如，如下文所述，可使用TLE3抗体作为相互作用配偶体并通过使癌症样品与所述TLE3抗体接触来检测TLE3表达。在所述实施例中，本发明方法可涉及提供来自癌症患者的癌症样品，使癌症样品与针对TLE3的抗体接触，和根据抗体与癌症样品的结合来预测患者所患癌症对化学疗法起反应的可能性。在一个实施例中，预测步骤可包含根据抗体可结合癌症样品来预测患者所患癌症可对化学疗法起反应。在另一个实施例中，预测步骤可包含根据抗体不能与癌症样品结合来预测患者所患癌症不能对化学疗法起反应。
在另一个实施例中，可使用一或多种与TLE3多核苷酸(例如，TLE3mRNA、cDNA或RNA)杂交的引物来检测TLE3多核苷酸。在所述实施例中，本发明方法可涉及提供来自癌症患者的癌症样品，使癌症样品与一或多种与TLE3杂交的引物接触，和根据一或多种引物与癌症样品的杂交来预测患者所患癌症对化学疗法起反应的可能性。在一个实施例中，预测步骤可包含根据一或多种引物可与癌症样品杂交来预测患者所患癌症可对化学疗法起反应。在另一个实施例中，预测步骤可包含根据一或多种引物不能与癌症样品杂交来预测患者所患癌症不能对化学疗法起反应。
在另一方面中，本发明提供根据患者所患癌症对化学疗法起反应的可能性来决定是否对癌症患者施用化学疗法的方法。在一个实施例中，决定步骤包含根据癌症样品中存在TLE3的表达来决定对癌症患者施用化学疗法。在一个实施例中，决定步骤包含根据癌症样品中不存在TLE3的表达决定不对癌症患者施用化学疗法。
在又一方面中，本发明提供为癌症患者选择化学疗法的方法。一般来说，这些方法包含提供来自癌症患者的癌症样品，测定癌症样品中是否表达TLE3，和根据测定步骤的结果来为癌症患者选择化学疗法。在一个实施例中，选择步骤包含根据癌症样品中存在TLE3的表达来选择化学疗法。
如各实例中所述，已证实TLE3表达与对使用甲氨蝶呤(参见图7)和紫杉烷(参见图10、12和13)的化学疗法的反应有关。业内认为甲氨蝶呤和紫杉烷是细胞周期特异性化学治疗药物(例如，参见古德曼(Goodman)和吉尔曼(Gilman)，治疗学的药理基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics)，IX.肿瘤性疾病的化学疗法(Chemotherapy of Neoplastic Diseases)，第51章，抗肿瘤药(Antineoplastic Agents)，第11版，主编劳伦斯L.布朗顿(Laurence L. Brunton)，副编辑约翰S.拉佐(John S.Lazo)和基思L.帕克(Keith L. Parker))。细胞周期特异性化学治疗药物在细胞周期的特定阶段中表现其作用机制，与之相反，非细胞周期特异性化学治疗药物在包括静止期(G0)在内的所有阶段中发挥同等作用。如同除甲氨蝶呤以外还有许多其它抗代谢物一样，文献中也已将除紫杉烷以外的其它植物生物碱归类为细胞周期特异性化学治疗药物。相反，业内已将诸如顺铂和环磷酰胺等多种烷化剂归类为非细胞周期特异性化学治疗药物。本发明结果表明，TLE3的预测能力可扩展至除甲氨蝶呤和紫杉烷以外的其它细胞周期特异性化学治疗药物。
在某些实施例中，本发明方法因此可用于选择细胞周期特异性化学治疗药物或决定是否投与细胞周期特异性化学治疗药物。在一个实施例中，本发明方法可用于选择抗代谢物或决定是否投与抗代谢物，在一个实施例中，本发明方法可用于选择植物生物碱或决定是否投与植物生物碱。在一个实施例中，本发明方法可用于选择甲氨蝶呤或决定是否投与甲氨蝶呤。在另一个实施例中，本发明方法可用于选择紫杉烷或决定是否投与紫杉烷。在一个实施例中，紫杉烷是紫杉醇。在一个实施例中，紫杉烷是多西他赛(docetaxel)。
在每种情形下都应了解，这些化学治疗药物可单独投与或与业内已知和下文所述的其它化学治疗药物组合投与。还应了解，本发明涵盖所选择化学治疗药物为甲氨蝶呤或紫杉烷衍生物(即结构衍生自甲氨蝶呤或紫杉烷的化合物)的方法。各衍生物通常可共享母体化合物的大部分结构，但可在母体化合物内的一或多个位置处包括不同取代基、杂原子、环稠合、饱和水平、异构性、立体异构性等。以下美国专利以非限制性方式阐述可用于本发明方法中的实例性甲氨蝶呤衍生物的制备：美国专利第6,559,149号和第4,374,987号。以下美国专利以非限制性方式阐述可用于本发明方法中的实例性紫杉烷衍生物的制备：美国专利第7,074,945号；第7,063,977号；第6,906,101号；第6,649,778号；第6,596,880号；第6,552,205号；第6,531,611号；第6,482,963号；第6,482,850号；第6,462,208号；第6,455,575号；第6,441,026号；第6,433,180号；第6,392,063号；第6,369,244号；第6,339,164号；第6,291,690号；第6,268,381号；第6,239,167号；第6,218,553号；第6,214,863号；第6,201,140号；第6,191,290号；第6,187,916号；第6,162,920号；第6,147,234号；第6,136,808号；第6,114,550号；第6,107,332号；第6,051,600号；第6,025,385号；第6,011,056号；第5,955,489号；第5,939,567号；第5,912,263号；第5,908,835号；第5,869,680号；第5,861,515号；第5,821,263号；第5,763,477号；第5,750,561号；第5,728,687号；第5,726,346号；第5,726,318号；第5,721,268：5,719,177号；第5,714,513号；第5,714,512号；第5,703,117号；第5,698,582号；第5,686,623号；第5,677,462号；第5,646,176号；第5,637,723号；第5,621,121号；第5,616,739号；第5,606,083号；第5,580,899号；第5,476,954号；第5,403,858号；第5,380,916号；第5,254,703号；和第5,250,722号。上述专利和本文所引用任何其他参考文献中每一者的全部内容都是以引用方式并入本文中。
甲氨蝶呤通过抑制叶酸代谢来发挥作用并且已被批准用于治疗膀胱癌、乳癌、胃癌、绒毛膜癌、头颈癌、脑脊膜癌、白血病(急性脑膜白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病)、淋巴瘤(伯基特(Burkitt′s)淋巴瘤、儿童淋巴瘤、非霍奇金氏(non-Hodgkin′s)淋巴瘤)、蕈样肉芽肿病、未知原发性癌和淋巴肉瘤(BC癌症中心癌症药物手册中的甲氨蝶呤(Methotrexate in B C Cancer Agency Cancer Drug Manual)，2007)。也已显示甲氨蝶呤可用于治疗食管癌、肺癌和睾丸癌(最新甲氨蝶呤(Methotrexate in UpToDate)，2007)。在某些实施例中，本发明方法包含选择甲氨蝶呤以及一或多种其它化学治疗药物或决定是否投与甲氨蝶呤以及一或多种其它化学治疗药物的步骤。例如，甲氨蝶呤通常以称作CMF的组合投与癌症患者，CMF也包括环磷酰胺和5-氟尿嘧啶。
紫杉烷是紫杉(Taxus)属植物产生的二萜。紫杉烷可得自天然来源或以合成方式产生。紫杉烷包括紫杉醇(TAXOLTM)和多西他赛(TAXOTERETM)。紫杉烷通过在细胞分裂期间干扰正常微管生长来发挥作用。在某些实施例中，本发明方法包含选择紫杉烷(例如，紫杉醇或多西他赛)以及一或多种其它化学治疗药物或决定是否投与紫杉烷以及一或多种其它化学治疗药物的步骤，例如，紫杉烷通常与环磷酰胺和亚德里亚霉素(多柔比星(doxorubicin))和任选地5-氟尿嘧啶组合投与癌症患者(即与CA或CAF一起投与)。
紫杉醇已被批准用于治疗乳癌、卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、肺癌和卵巢癌(BC癌症中心癌症药物手册中的紫杉醇(Paclitaxel in BC Cancer Agency Cancer Drug Manual)，2007；和巴赫金(Mekhail)和马克曼(Markman)，药理治疗专家意见杂志(Expert Opin.Pharmacother.)3：755-66，2002)。也已显示紫杉醇可用于治疗宫颈癌(第1124-34页，AHFS 2005药物资讯(Drug Information)，贝塞斯达(Bethesda)，马里兰：美国卫生系统药师协会(American Society of Health-System Pharmacists)，2005)、子宫内膜癌(BC癌症中心癌症药物手册中的紫杉醇，2007)、膀胱癌(最新紫杉醇(Paclitaxel in UpToDate)，2007)、头颈癌(最新紫杉醇，2007)、白血病(最新紫杉醇，2007)和恶性黑色素瘤(最新紫杉醇，2007)。紫杉醇的副作用包括超敏反应，例如面部潮红、皮疹、或呼吸短促。患者通常在使用紫杉醇之前接受药物来预防超敏反应。紫杉醇也可对骨髓产生临时性损伤。骨髓损伤可使人更易于感染、贫血和撞伤或容易流血。其它副作用可包括手臂和腿的关节或肌肉疼痛；腹泻；恶心呕吐；手或足出现麻木、灼热或麻刺感；以及脱发。
多西他赛已被批准用于治疗乳癌(阿普罗(Aapro)，肿瘤学研讨会(Seminars in Oncology)25(5增刊12)：7-11，1998；纳伯郝兹(Nabholtz)等人，临床肿瘤学杂志(Journal of Clinical Oncology)17(5)：1413-24，1999；肖斯特罗姆(Sjostrom)等人，欧洲癌症杂志(European Journal of Cancer)35(8)：1194-201，1999；和博斯坦(Burstein)等人，临床肿瘤学杂志18(6)：1212-9，2000)、非小细胞肺癌(福塞拉(Fossella)等人，临床肿瘤学杂志18(12)：2354-62，2000；和汉斯沃斯(Hainsworth)等人，癌症(Cancer)89(2)：328-33，2000)和卵巢癌(凯耶(Kaye)等人，欧洲癌症杂志33(13)：2167-70，1997)。也已显示多西他赛可用于治疗间皮瘤(沃罗比奥夫(Vorobiof)等人，美国临床肿瘤学会会报(Proc Am Soc Clin Oncol)19：578a，2000)、前列腺癌(皮库斯(Picus)等人，肿瘤学研讨会26(5增刊17)：14-8，1999；和帕瑞莱克(Petrylak)等人，临床肿瘤学杂志17(3)：958-67，1999)、泌尿道上皮移行细胞癌(迪莫普洛斯(Dimopoulos)等人，肿瘤学年报(Annals of Oncology)10(11)：1385-8，1999和帕克苔丝(Pectasides)等人，欧洲癌症杂志36(I)：74-9，2000)、头颈癌(USP DI中的多西他赛(Docetaxel in USP DI)，2000和高科多(Couteau)等人，英国癌症杂志(British Journal of Cancer)81(3)：457-62，1999)和小细胞肺癌(史密斯(Smyth)等人，欧洲癌症杂志30A(8)：1058-60，1994)。
在TLE3-阳性乳癌和卵巢癌患者中观察到对化学疗法的改良反应，此观察结果表明，本发明方法可用于不同癌症类型中。我们观察到TLE3表达与对用甲氨蝶呤和紫杉烷治疗的改良反应有关，此结果进一步表明，本发明方法可应用于对这些化学治疗药物起反应的多种癌症中。如上所述，此类癌症包括(但不限于)乳癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、头颈癌、和白血病。
在一个实施例中，本发明方法可用于患有乳癌的癌症患者。在一个实施例中，本发明方法可用于患有卵巢癌的癌症患者。在一个实施例中，本发明方法可用于患有肺癌的癌症患者。在一个实施例中，本发明方法可用于患有膀胱癌的癌症患者。在一个实施例中，本发明方法可用于患有胃癌的癌症患者。在一个实施例中，本发明方法可用于患有头颈癌的癌症患者。在一个实施例中，本发明方法可用于患有白血病的癌症患者。
如实例中所述，在一个实施例中，在ER(雌激素受体，英特斯基因库编号2099)、PR(孕激素受体，英特斯基因库编号5241)和HER-2标记物(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物2，英特斯基因库编号2064)三阴性乳癌患者中观察到TLE3表达与对化学疗法的反应有关。因此，在某些实施例中，本发明方法可用于属于此类别的乳癌患者。
如实例中所述，在新辅助疗法情形下实施治疗时，发现在TLE3表达与对化学疗法的反应之间也存在关联。因此，在某些实施例中，本发明方法可用于在新辅助疗法情形下接受化学疗法的患者。在其它实施例中，化学疗法可在辅助疗法情形下施用。
如实例中所述，也发现TLE3表达与对化学疗法的反应之间的关联与癌症阶段无关。因此，在某些实施例中，本发明方法可用于患有II+期(即II期或更晚期)癌症的患者。在某些实施例中，本发明方法可用于患有IIb+期或III+期癌症的患者。
检测TLE3表达
如上所述，可使用任何已知方法来测定TLE3的表达。在一个实施例中，可通过使用相互作用配偶体(例如，抗体)检测TLE3多肽标记物来测定TLE3表达；在另一个实施例中，可通过使用引物检测TLE3多核苷酸标记物来测定TLE3表达。
检测TLE3多肽标记物
可使用结合TLE3多肽标记物(其可为TLE3蛋白或其抗原片段)的任何相互作用配偶体来检测TLE3多肽标记物。因此，可采用以可检测程度结合TLE3标记物的任何实体作为本发明相互作用配偶体，只要其以亲和性与特异性的适宜组合结合标记物即可。
特别优选的相互作用配偶体是抗体或片段(例如，F(ab)片段、F(ab’)2片段、Fv片段、或sFv片段等；例如，参见瑛宝(Inbar)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)69：2659，1972；霍克曼(Hochman)等人，生物化学(Biochem.)15：2706，1976；以及欧利希(Ehrlich)等人，生物化学19：4091，1980；休斯顿(Huston)等人，美国国家科学院院刊85：5879，1998；颁予休斯顿等人的美国专利第5,091,513号和第5,132,405号；和颁予拉德那(Ladner)等人的美国专利第4,946,778号，所述文献各自以引用方式并入本文中)。在某些实施例中，相互作用配偶体可选自突变抗体(或其片段)文库。例如，可在各自包括不同点突变的抗体集合中针对其与目标标记物的结合进行筛选。另外，可使用嵌合抗体作为相互作用配偶体，例如下文更详细阐述的“人类化”或“镶面”抗体。
在使用抗体作为相互作用配偶体时，这些抗体可通过所属领域技术人员已知的多种技术中的任一种来制备(例如，参见哈洛(Harlow)和莱恩(Lane)，抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，1988，还可参见各实例)。例如，可通过细胞培养技术来产生抗体，包括生成单克隆抗体，或可通过将抗体基因转染至适宜的细菌或哺乳动物细胞宿主中以使得可产生重组抗体。在一种技术中，首先将包含目标标记物的抗原部分(或标记物自身)的“免疫原”注入众多种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、绵羊或山羊)中的任一种中。在此步骤中，标记物(或其抗原部分)可不经修饰即用作免疫原。或者，尤其对于相对较短的标记物来说，若标记物连接至载体蛋白(例如牛血清白蛋白或钥孔帽贝血蓝蛋白(KLH))，则可诱发优良的免疫反应。将免疫原注入动物宿主中，优选地根据预定方案纳入一或多次加强免疫并周期性对动物进行取血。然后可通过(例如)亲和色谱使用与适宜固体载体偶合的标记物(或其抗原部分)自所述抗血清纯化对标记物具有特异性的多克隆抗体。实例性方法阐述于各实例中。
若期望用于诊断性或治疗性目的，则可使用(例如)科勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)，欧洲免疫杂志(Eur.J.Immunol.)6：511，1976中的技术和其改良形式来制备TLE3特异性单克隆抗体。简单来说，这些方法涉及制备能产生具有期望特异性(即与目标标记物的反应性)的抗体的永生细胞系。所述细胞系可用(例如)得自上述经免疫动物的脾细胞来产生。然后通过(例如)与骨髓瘤细胞融合配偶体(优选地与经免疫动物同源)融合来使脾细胞永生化。可采用多种融合技术。例如，可将脾细胞和骨髓瘤细胞与非离子型洗涤剂合并数分钟，随后以低密度将其平铺于支持杂交细胞生长但不支持骨髓瘤细胞生长的选择培养基上。优选的选择技术使用HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)选择。在足够时间(通常为约1至2周)后，观察杂交细胞集落。选择单一集落并测试其培养上清液对标记物的结合活性。优选者为具有高反应性和特异性的杂交瘤。
可自生长杂交瘤集落的上清液分离单克隆抗体。此外，可采用各种技术来提高产率，例如将杂交瘤细胞系注入适宜脊椎动物(例如小鼠)的腹腔中。然后可自腹水液或血液中收获单克隆抗体。可通过习用技术自抗体移除污染物，例如色谱、凝胶过滤、沉淀和萃取。可在纯化过程中的(例如)亲和色谱步骤中使用TLE3。
应理解，本发明并不限于使用抗体或抗体片段作为相互作用配偶体。具体来说，本发明也涵盖使用可模拟抗体功能的合成相互作用配偶体。业内已提出并论证了若干种设计和/或鉴别抗体模拟物的方法(例如，参见谢威尔逊(Hsieh-Wilson)等人的综述，化学研究述评(Acc.Chem.Res.)29：164，2000；和帕克祖(Peczuh)和汉密尔顿(Hamilton)，化学研究(Chem，Rev.)100：2479，2000)。例如，业内已通过筛选小分子或天然产物分离物的合成文库鉴别出以与天然蛋白质类似的方式结合蛋白质表面的小分子(例如，参见盖勒普(Gallop)等人，医疗化学杂志(J.Med.Chem.)37：1233，1994；戈登(Gordon)等人，医疗化学杂志37：1385，1994；德维特(DeWitt)等人，美国国家科学院院刊90：6909，1993；布宁(Bunin)等人，美国国家科学院院刊91：4708，1994；比尔希略(Virgilio)和艾尔曼(Ellman)，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)116：11580，1994；王(Wang)等人，医疗化学杂志38：2995，1995；以及凯克(Kick)和艾尔曼，医疗化学杂志38：1427，1995)。类似地，业内已成功地将组合型方法应用于针对结合多种蛋白质的能力来筛选肽和蛋白质文库(例如，参见卡尔(Cull)等人，美国国家科学院院刊89：1865，1992；马太(Mattheakis)等人，美国国家科学院院刊91：9022，1994；斯考特(Scott)和史密斯(Smith)，科学(Science)249：386，1990；戴福林(Devlin)等人，科学249：404，1990；科里(Corey)等人，基因(Gene)128：129，1993；布雷(Bray)等人，四面体通讯(Tetrahedron Lett.)31：5811，1990；福多(Fodor)等人，科学251：767，1991；霍顿(Houghten)等人，自然(Nature)354：84，1991；莱姆(Lam)等人，自然354：82，1991；布雷克(Blake)和利兹戴维斯(Litzi-Davis)，生物共轭化学(Bioconjugate Chem.)3：510，1992；尼道(Needels)等人，美国国家科学院院刊90：10700，1993；和奥尔迈耶(Ohlmeyer)等人，美国国家科学院院刊90：10922，1993)。业内也已使用类似方法来研究碳水化合物-蛋白质相互作用(例如，参见奥尔登堡(Oldenburg)等人，美国国家科学院院刊89：5393，1992)和多核苷酸-蛋白质相互作用(例如，参见埃灵顿(Ellington)和肖斯泰克(Szostak)，自然346：818，1990；以及蒂尔克(Tuerk)和高德(Gold)，科学249：505，1990)。这些方法也已扩展至研究蛋白质与非天然生物聚合物(例如寡聚氨基甲酸酯、寡聚脲、寡聚砜等)之间的相互作用(例如，参见祖凯曼(Zuckermann)等人，美国化学协会杂志114：10646，1992；西蒙(Simon)等人，美国国家科学院院刊89：9367，1992；祖凯曼等人，医疗化学杂志37：2678，1994；伯吉斯(Burgess)等人，德国应用化学杂志(Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.)34：907，1995；和晁(Cho)等人，科学261：1303，1993)。另外，已提出大致基于抗体分子的基本折叠的替代性蛋白质骨架，并且其可用于制备本发明相互作用配偶体(例如，参见古(Ku)和舒尔特(Schultz)美国国家科学院院刊92：6552，1995)。也已构造出包含诸如3-氨甲基苯甲酸等小分子骨架和由单一肽环组成的取代基的抗体模拟物。肽环在这些模拟物中发挥结合功能(例如，参见史密斯等人，美国化学协会杂志116：2725，1994)。业内也已阐述包含多个基于杯芳烃单元构造的合成肽环的抗体模拟物(例如，参见颁予汉密尔顿等人的美国专利第5,770,380号)。
可采用任何可用策略或系统来检测相互作用配偶体与TLE3标记物之间的结合。在某些实施例中，可通过将可检测标记添加至相互作用配偶体来检测结合。在其它实施例中，可通过使用特异性结合第一相互作用配偶体的经标记第二相互作用配偶体来检测结合，例如如抗原/抗体检测领域熟知的配偶体。可检测标记可直接检测或可间接检测，例如通过信号产生系统中一或多个其它成员的组合作用来检测。可直接检测的标记的实例包括放射性标记、顺磁性标记、荧光标记、光散射标记、吸收性标记和比色标记。可间接检测的标记的实例包括化学发光标记，例如能将底物转化为发色产物的酶，例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和诸如此类。
一旦经标记相互作用配偶体结合TLE3标记物，可以多种方式使复合体可视化或检测复合体，其中根据具体可检测标记来选择具体检测方式，其中代表性检测方法包括(例如)闪烁计数法、放射自显影术、顺磁性测量、荧光测量、光吸收测量、光散射测量和诸如此类。
一般来说，可通过使相互作用配偶体与包括标记物的癌症样品接触来分析相互作用配偶体与TLE3标记物之间的结合。根据样品性质，适宜方法包括(但不限于)免疫组织化学(IHC)、放射免疫分析、ELISA、免疫印迹法和荧光活化细胞分选(FACS)。倘若要在组织样品(例如生检样品)中检测蛋白质，则IHC是尤其适合的检测方法。获取组织和细胞样品并实施IHC和FACS的技术为业内所熟知。
在处理大量样品时(例如，在同时处理来自相同患者的若干样品或来自不同患者的多个样品时)，期望采用阵列化和/或自动化模式。在某些实施例中，可使用实例中所述组织阵列。可根据多种技术来构造组织阵列。根据一程序，使用市售机械装置(例如，手动组织阵列仪MTA1，购自比彻仪器公司(Beecher Instruments)，阳光草原(Sun Prairie)，WI)来从自各患者制备的石蜡块(供体块)移出0.6微米直径的全厚度“核心”，并将所述核心插入网格上指定位置的单独石蜡块(受体块)中。在优选实施例中，可将来自多达约400个患者的核心(或来自相同患者的多个核心)插入单一受体块中；优选地，核心间间隔为约1mm。根据适用于石蜡包埋材料的标准方法，可将所得组织阵列加工为薄切片以供用相互作用配偶体进行染色。
不论采用何种模式，并且不论采用何种检测策略，辨别效价(discriminating titer)的鉴定可简化结合研究以评价使用相互作用配偶体的合意性。在所述研究中，使相互作用配偶体与多个不同样品接触，所述样品优选地具有至少一个共同性状(例如，组织来源)并且通常具有多个共同性状(例如，组织来源、阶段、显微特征等)。在某些情形下，期望选择一组具有至少一个共同性状和至少一个不同性状的样品，从而使得可测定能区分不同性状的效价。在其它情形下，期望选择一组不具有可检测的不同性状的样品，从而使得可测定能区分先前不能区分的样品的效价。然而，所属领域技术人员应理解，即使在具有不同相似性和差异程度的样品集合的研究中，本发明通常也会容许实现这两个目标。
如上文和实例中所论述，本发明者已将这些技术应用于来自乳癌和卵巢癌患者的样品。本发明也涵盖确认自产生标记物的细胞分泌的标记物可能存于血清中，从而使得能通过血液测试来检测标记物而不需要生检试样。结合所述标记物的相互作用配偶体代表本发明的特别优选的实施例。
一般来说，此一分析的结果可以多种模式中的任一种来表示。所述结果可以定性方式来表示。例如，测试报告可能仅指明是否检测到TLE3标记物，可能也指明了检测限制。另外，测试报告可指明结合的亚细胞位置(例如细胞核对细胞质)和/或在这些不同亚细胞位置处的相对结合水平。所述结果可以半定量方式来表示。例如，可界定不同范围并且可向所述范围指定分值(例如，0至5)，从而提供一定程度的定量信息。此一分值可反映各种因素，例如检测到标记物的细胞数、信号强度(其可指明标记物的表达水平)等。所述结果可以定量方式来表示，例如，表示为检测到标记物的细胞的百分比、表示为浓度等。所属领域技术人员应了解，测试所提供的结果类型可根据测试的技术限制和与标记物检测相关的生物显著性而变化。例如，在某些情形中，纯定性结果(例如，是否以一定检测水平检测到标记物)提供大量信息。在其它情形下，需要量化程度更高的结果(例如，标记物在两个样品中的表达水平之比)。
检测TLE3多核苷酸标记物
尽管在多种情形下使用诸如抗体等相互作用配偶体来检测多肽标记物可代表确定具体样品中是否表达TLE3的最便捷方式，但本发明方法还涵盖使用引物来检测多核苷酸标记物。检测特定多核苷酸标记物的存在的多种方法为业内已知并且可用于本发明方法中。一般来说，这些方法依赖于一或多种引物与多核苷酸标记物的杂交。
可采用任何可用策略或系统来检测引物与TLE3多核苷酸(其可为TLE3 mRNA、通过RT-PCR自mRNA产生的cDNA、自所述cDNA产生的RNA等)之间的杂交。在某些实施例中，可通过简单地将可检测标记添加至引物来检测杂交。在其它实施例中，可通过使用可与第一引物特异性杂交的经标记第二引物(例如，第一引物中不与TLE3标记物杂交的区域)来检测杂交。在其它实施例中，有利地，可使用一组经设计用于扩增TLE3基因中某区域的引物通过PCR来扩增癌症样品内的TLE3标记物。然后可使用(例如)可与扩增产物杂交的经标记第二引物来检测所得产物。所属领域技术人员应了解这些实施例的变化形式。
关于引物设计的考虑因素为业内所熟知并阐述于(例如)以下文献中：牛顿(Newton)等人(编辑)，PCR：常用数据序列(PCR：Essential data Series)，约翰威利国际出版公司(John Wiley & Sons)；PCR引物：实验室手册(PCRPrimer：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY，1995；怀特(White)等人(编辑)，PCR方案：当前方法和应用(PCR Protocols：Current methods and Applications)，分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)，胡马纳出版社(The Humana Press)，托托华，NJ，1993。此外，可使用业内已知的多种电脑程序来选择适宜引物。
一般来说，可检测标记可直接检测或可间接检测，例如通过信号产生系统中一或多个其它成员的组合作用来检测。可直接检测的标记的实例包括放射性标记、顺磁性标记、荧光标记、光散射标记、吸收性标记和比色标记。可间接检测的标记的实例包括化学发光标记，例如能将底物转化为发色产物的酶，例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和诸如此类。
一旦经标记引物与TLE3标记物杂交，可以多种方式使复合体可视化或检测复合体，其中根据具体可检测标记来选择具体检测方式，其中代表性检测方法包括(例如)闪烁计数法、放射自显影术、顺磁性测量、荧光测量、光吸收测量、光散射测量和诸如此类。
一般来说，可通过使引物与包括标记物的癌症样品接触来分析引物与TLE3标记物之间的杂交。根据癌症样品的性质，适宜方法包括(但不限于)微阵列分析、原位杂交、RNA印迹法(Northern blot)、和各种核酸扩增技术，例如PCR、RT-PCR、定量PCR、连接酶链式反应等。
新颖疗法的鉴定
根据本发明，TLE3的预测能力不仅可用于根据癌症对已知疗法的可能的反应性将癌症分类，也可用于鉴定可用于治疗癌症的潜在新疗法或治疗药剂。
实际上，TLE3代表鉴定新治疗药剂的有吸引力的候选者(例如，通过筛选来检测优选地至少以指定亲和性和/或特异性与标记物结合或杂交的化合物或实体，和/或通过筛选来检测调节(即提高或降低)标记物的表达、定位、修饰、或活性的化合物或实体)。因此，在一个实施例中，本发明提供包含以下步骤的方法：使测试化合物与表达TLE3标记物的细胞(例如，个别经改造细胞或在组织背景下等)接触；和确定测试化合物是否可调节TLE3标记物的表达、定位、修饰或活性。在许多情形下，可证实相互作用配偶体或引物(例如，反义或RNAi引物)自身就是可用治疗药物。
因此，本发明提供自身是可用治疗药剂的相互作用配偶体和引物。例如，针对TLE3产生的抗体与癌细胞的结合可抑制所述细胞的生长。或者或另外，可使用根据本发明定义或制备的相互作用配偶体来将治疗药剂递送至癌细胞。具体来说，可使相互作用配偶体(例如，针对TLE3产生的抗体)与一或多种治疗药剂偶合。就此来说适宜药剂包括放射性核素或药物。优选的放射性核素包括90Y、123I、125I、13II、186Re、188Re、211At和212Bi。优选药物包括苯丁酸氮芥(chlorambucil)、异环磷酰胺(ifosphamide)、氮芥(mechlorethamine)、环磷酰胺、卡铂、顺铂、丙卡巴肼(procarbazine)、氨烯咪胺(decarbazine)、卡莫司汀(carmustine)、阿糖胞苷(cytarabine)、羟基脲、巯嘌呤、甲氨蝶呤、紫杉醇、多西他赛、硫鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、放线菌素D(actinomycin D)、博来霉素(bleomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星、依托泊苷(etoposide)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、L-天冬酰胺酶、肾上腺皮质类固醇、更昔洛韦三磷酸盐(canciclovir triphosphate)、腺嘌呤阿拉伯糖核苷三磷酸、5-吖丙啶基-4-羟基氨基-2-硝基苯甲酰胺、丙烯醛(acrolein)、磷酰胺芥子气、6-甲基嘌呤、依托泊苷、苯甲酸芥子气、氰化物和氮芥。
根据所述实施例，治疗药剂可通过直接或间接共价或非共价相互作用与相互作用配偶体偶合。在治疗药剂和相互作用配偶体各自具有能彼此反应的取代基时，所述治疗药剂与相互作用配偶体之间可能存在直接相互作用。例如，一者上的亲核基团(例如氨基或巯基)可能能与另一者上的含羰基基团(例如酸酐或酰卤)或含有良好离去基团(例如，卤化物)的烷基反应。间接相互作用可涉及自身非共价结合治疗药剂和相互作用配偶体二者的连接体基团。连接体基团可用作间隔物来间隔相互作用配偶体与药剂以避免结合能力的干扰。连接体基团也可用于提高药剂或相互作用配偶体上的取代基的化学反应性并由此提高偶合效率。化学反应性的提高也可促进原本不可能使用的药剂或药剂上的官能团的使用。
所属领域技术人员应了解，可采用多种双官能或多官能试剂(二者都具有同官能性和异官能性，例如皮尔斯化学(Pierce Chemical)公司，罗克福德，I11.的目录中所述的试剂)作为连接体基团。例如，可通过氨基、羧基、巯基或氧化碳水化合物残基来实现偶合。有多个参考文献阐述所述方法，例如颁予罗德威尔(Rodwell)等人的美国专利第4,671,958号。另外应了解，治疗药剂和相互作用配偶体可通过非共价相互作用(例如配体/受体型相互作用)来偶合。可采用稳定性和特异性足以在本发明背景下作用的任何配体/受体对来偶合治疗药剂和相互作用配偶体。举例来说，可使治疗药剂与生物素共价连接，并且使相互作用配偶体与抗生物素蛋白共价连接。然后，生物素与抗生物素蛋白的强非共价结合使得可偶合治疗药剂与相互作用配偶体。典型配体/受体对包括蛋白质/辅因子对和酶/底物对。除了常用的生物素/抗生物素蛋白对以外，这些配体/受体对包括(但不限于)生物素/抗生蛋白链菌素对、地高辛配基(digoxigenin)/抗地高辛配基对、FK506/FK506结合蛋白(FKBP)对、雷帕霉素(rapamycin)/FKBP对、环孢素受体(cyclophilin)/环孢素对和谷胱甘肽/谷胱甘肽转移酶对。其它适宜配体/受体对可由所属领域技术人员来识别，例如与表位标记(例如(但不限于)谷胱甘肽转移酶(GST)、c-myc、
Figure BPA00001188368000191
和麦芽糖结合蛋白(MBP))成对的单克隆抗体以及以下文献中所述的其它表位标记：凯斯勒(Kessler)，第105-152页，诱变技术进展(Advances in Mutagenesis)，凯斯勒编辑，施普林格出版公司(Springer-Verlag)，1990；“亲和色谱：方法和方案(分子生物学方法)(Affinity Chromatography：Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology))”，帕斯卡贝雷恩(Pascal Baillon)编辑，胡马纳出版社，2000；和“固定化亲和配体技术(Immobilized Affinity Ligand Techniques)”，赫尔墨斯(Hermanson)等人，学术出版社(Academic Press)，1992。
倘若治疗药剂在与相互作用配偶体分离时更有效，则期望使用在内化至细胞期间或内化后可裂解的连接体基团。文献中已阐述多种不同的可裂解连接体基团。在细胞内自这些连接体基团释放药剂的机制包括通过以下方式来裂解：还原二硫键(例如，颁予斯皮特勒(Spitler)的美国专利第4,489,710号)、辐照光不稳定键(例如，颁予森特(Senter)等人的美国专利第4,625,014号)、水解衍生的氨基酸侧链(例如，颁予科恩(Kohn)等人的美国专利第4,638,045号)、血清补体介导的水解(例如，颁予罗德威尔等人的美国专利第4,671,958号)和酸催化水解(例如，颁予布拉特勒(Blattler)等人的美国专利第4,569,789号)。
在某些实施例中，可期望使不止一种治疗药剂与相互作用配偶体偶合。在一个实施例中，使多个药剂分子与一个相互作用配偶体分子偶合。在另一个实施例中，可使不止一种类型的治疗药剂与一个相互作用配偶体分子偶合。不论具体实施例如何，可以多种方式来制备具有不止一种药剂的制剂。例如，可使不止一种药剂与相互作用配偶体分子直接偶合，或可使用提供多个附接位点的连接体。
或者，可使用载剂。载剂可以多种方式携载药剂，包括直接共价键结或通过连接体基团共价键结。适宜载剂包括蛋白质(例如白蛋白)(例如，颁予加藤(Kato)等人的美国专利第4,507,234)、肽、和多糖(例如氨基葡聚糖(例如，颁予史(Shih)等人的美国专利第4,699,784)。载剂也可通过非共价结合或通过囊封在(例如)脂质体囊泡中来携载药剂(例如，颁予马丁(Martin)等人的美国专利第4,429,008号和颁予梅休(Mayhew)等人的第4,873,088号)。对放射性核素药剂具有特异性的载剂包括放射性卤化小分子和螯合化合物。例如，颁予斯里瓦斯塔瓦(Srivastava)的美国专利第4,735,792号揭示代表性放射性卤化小分子和其合成。放射性核素螯合物可自螯合化合物形成，所述螯合化合物包括那些含有氮和硫原子作为供体原子来结合金属或金属氧化物、放射性核素的化合物。例如，颁予戴维森(Davison)等人的美国专利第4,673,562号揭示代表性螯合化合物和其合成。
在相互作用配偶体自身为治疗药物时，应理解，在多种情形下，可如此使用结合相同标记物的任何相互作用配偶体。
在本发明一优选实施例中，治疗药剂(无论是还是不是相互作用配偶体)是抗体，例如针对TLE3标记物的抗体。如业内所熟知，在出于治疗性目的使用抗体或其片段时，可证实使用目标抗体的“人类化”或“镶面”形式有利于降低任何潜在的免疫原性反应。一般来说，“人类化”或“镶面”抗体分子和其片段可使针对抗人类抗体分子的不期望免疫反应最小化，所述抗人类抗体分子可限制这些部分在人类接受者中的治疗应用的持续时间和效率。
业内已阐述多种包含源自非人类免疫球蛋白的抗原结合部分的“人类化”抗体分子，包括嵌合抗体，其具有与人类恒定结构域融合的啮齿动物可变区和其相关互补决定区(CDR)(例如，参见温特(Winter)等人，自然349：293，1991；劳伯里欧(Lobuglio)等人，美国国家科学院院刊86：4220，1989；肖(Shaw)等人，免疫杂志(J.Immunol.)138：4534，1987；和布朗(Brown)等人，癌症研究(Cancer Res.)47：3577，1987)、在与适宜人类抗体恒定结构域融合之前移植至人类支撑框架区(FR)中的啮齿动物CDR(例如，参见雷彻曼(Riechmann)等人，自然332：323，1988；范霍温(Verhoeyen)等人，科学239：1534，1988；和琼斯(Jones)等人，自然321：522，1986)、和由重组镶面啮齿动物FR支撑的啮齿动物CDR(例如，参见于1992年12月23日公开的欧洲专利公开案第519,596号)。应理解，本发明也涵盖根据美国专利第6,075,181号中所述的技术使用XenoMouseTM技术(安根尼克斯(AbGenix)公司，弗里蒙特，CA)产生的“全人”抗体。
另外，可使用所谓“镶面”抗体，其包括“镶面FR”。镶面方法涉及用人类FR残基选择性替代(例如)鼠类重链或轻链可变区中的FR残基，以提供包含基本上保留所有天然FR蛋白折叠结构的抗原结合部分的异种分子。镶面技术基于以下理解：抗原结合部分的抗原结合特征主要取决于抗原结合表面内重链和轻链CDR组的结构和相对布局(例如，参见戴维斯(Davies)等人，生物化学年鉴(Ann.Rev，Biochem)，59：439，1990)。因此，仅在小心地维持CDR结构、其彼此之间的相互作用、和其与可变区结构域其余部分的相互作用时，在人类化抗体中可保留抗原结合特异性。通过使用镶面技术，用人类残基来替代易于遇到免疫系统的外部(例如，溶剂可及)FR残基，以提供包含弱免疫原性或实质上无免疫原性镶面表面的杂交分子。
优选地，适于用作治疗药物(或治疗药剂载剂)的相互作用配偶体对靶标记物(例如，TLE3)表现高特异性并对其它标记物表现低背景结合。在某些实施例中，单克隆抗体优选地用于治疗性目的。
医药组合物
如上所述，本发明提供新疗法和鉴定这些新疗法的方法。在某些实施例中，相互作用配偶体或引物可为可用治疗药剂。或者或另外，根据本发明定义或制备的相互作用配偶体结合用作治疗药剂的靶的标记物(例如，TLE3)。同样，可使用本发明相互作用配偶体来向癌症细胞递送治疗药剂。例如，可使根据本发明提供的相互作用配偶体与一或多种治疗药剂偶合。
本发明包括包含这些本发明治疗药剂的医药组合物。一般来说，医药组合物可包括治疗药剂以及一或多种非活性药剂，例如生物相容性无菌载剂，包括(但不限于)无菌水、盐水、缓冲盐水、或右旋糖溶液。医药组合物可单独投与或与其它治疗药剂组合投与，所述其它治疗药剂包括其它化学治疗药剂、激素、疫苗和/或放射性疗法。在此处和说明书中的其它位置，“与……组合”并不欲表示多种药剂必须同时投与或经调配以一起递送，但这些递送方法都在本发明的范围内。一般来说，各药剂可以一定剂量按照所述药剂的预定时间方案来投与。或者，本发明涵盖递送本发明医药组合物以及可改良其生物利用度、降低或改变其代谢、抑制其排泄、或改变其在体内的分布的药剂。尽管本发明医药组合物可用于治疗有需要的任何个体(例如，任何动物)，但其最优选地用于治疗人类。
可通过多种途径将本发明医药组合物投与人类和其它动物，包括经口、静脉内、肌内、动脉内、皮下、心室内、经皮、经直肠、阴道内、腹膜内、经局部(使用粉剂、软膏剂、或滴剂)、经颊、或作为经口或经鼻喷雾剂或气溶胶。一般来说，最适宜投与途径可取决于多种因素，包括药剂性质(例如，其在胃肠道环境中的稳定性)、患者情况(例如，患者是否能耐受经口投与)等。目前静脉内途径最常用于递送治疗性抗体。然而，本发明涵盖通过考虑到药物递送科学中的可能进步的任何适宜途径递送本发明医药组合物。
调配和制造医药试剂的一般考虑因素可参见(例如)雷明顿氏制药科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第19版，麦克出版(Mack Publishing)公司，东方省，PA，1995。
范例
实例1：产生抗体
此实例阐述用于生成这些实例中所用TLE3抗体的方法。可使用类似方法来生成结合任何目标标记物(例如，结合附录A中所列蛋白质或源自附录A中所列其它标记物的蛋白质)的抗体。在某些情形下，抗体可得自市售来源(例如，华瑞康(Chemicon)、达科(Dako)、癌基因研究产品(Oncogene Research Products)、尼奥马克(NeoMarkers)等)或其它可公开获得的来源(例如，帝国癌症研究技术公司(Imperial Cancer Research Technology)等)。
材料和溶液
●茴香醚(目录号A4405，西格玛(Sigma)，圣路易，MO)
●2，2’-连氮基-二-(3-乙基-苯并噻唑啉-磺酸)(ABTS)(目录号A6499，分子探针(Molecular Probes)，尤金(Eugene)，OR)
●活化马来酰亚胺钥孔帽贝血蓝蛋白(目录号77106，皮尔斯，罗克福德，IL)
●钥孔帽贝血蓝蛋白(目录号77600，皮尔斯，罗克福德，EL)
●磷酸(H3PO4)(目录号P6560，西格玛)
●冰乙酸(目录号BP1185-500，菲舍尔(Fisher))
●EDC(EDAC)(目录号341006，凯尔贝尔(Calbiochem))
●25％戊二醛(目录号G-5882，西格玛)
●甘氨酸(目录号G-8898，西格玛)
●生物素(目录号B2643，西格玛)
●硼酸(目录号B0252，西格玛)
●琼脂糖4B(目录号17-0120-01，LKB/法玛西亚(Pharmacia)，乌普萨拉，瑞典)
●牛血清白蛋白(LP)(目录号100350，宝灵曼(Boehringer Mannheim)，印第安纳波利斯，IN)
●溴化氰(目录号C6388，西格玛)
●透析袋Spectra/Por膜MWCO：6-8000(目录号132665，波谱工业(Spectrum Industries)，拉古娜希尔斯，CA)
●二甲基甲酰胺(DMF)(目录号22705-6，奥德里奇(Aldrich)，密尔沃基，WI)
●DIC(目录号BP 592-500，菲舍尔)
●乙二硫醇(目录号39，802-0，奥德里奇)
●醚(目录号TX 1275-3，EM科学(EM Sciences))
●乙二胺四乙酸(EDTA)(目录号BP 120-1，菲舍尔，斯普林菲尔德，NJ)
●1-乙基-3-(3’二甲基氨基丙基)-碳二亚胺，HCL(EDC)(目录号341-006，凯尔贝尔，圣地亚哥，CA)
●弗氏完全佐剂(Freund’s Adjuvant，complete)(目录号M-0638-50B，李氏实验室(Lee Laboratories)，格雷森(Grayson)，GA)
●弗氏不完全佐剂(Freund’s Adjuvant，incomplete)(目录号M-0639-50B，李氏实验室)
●熔融石英色谱管柱(管柱品号12131011；熔融石英品号12131029，瓦里安制样产品(Varian Sample Preparation Products)，港口城，CA)
●得自牛皮的明胶(目录号G9382，西格玛)
●生物素化山羊抗兔IgG(目录号A 0418，西格玛)
●HOBt(目录号01-62-0008，凯尔贝尔)
●辣根过氧化物酶(HRP)(目录号814393，宝灵曼)
●HRP-抗生蛋白链菌素(目录号S 5512，西格玛)
●盐酸(目录号71445-500，菲舍尔)
●过氧化氢30％w/w(目录号H1009，西格玛)
●甲醇(目录号A412-20，菲舍尔)
●96孔微量滴定板(目录号2595，康宁(Corning-Costar)，普林斯顿，CA)
●N-α-Fmoc保护的氨基酸，购自凯尔贝尔.参见’97-’98目录第1-45页。
●附接至王氏(Wang)树脂的N-α-Fmoc保护的氨基酸，购自凯尔贝尔.参见’97-’98目录第161-164页。
●NMP(目录号CAS 872-50-4，波迪克和杰克逊(Burdick and Jackson)，马斯基根，MI)
●肽(由遗传研究公司(Research Genetics)合成，细节阐述于下文中)
●哌啶(目录号80640，弗路卡(Flulca)，可通过西格玛购得)
●碳酸氢钠(目录号BP328-1，菲舍尔)
●硼酸钠(目录号B9876，西格玛)
●碳酸钠(目录号BP357-1，菲舍尔)
●氯化钠(目录号BP 358-10，菲舍尔)
●氢氧化钠(目录号SS 255-1，菲舍尔)
●抗生蛋白链菌素(目录号1520，宝灵曼)
●茴香硫醚(目录号T-2765，西格玛)
●三氟乙酸(目录号TX 1275-3，EM科学)
●Tween-20(目录号BP 337-500，菲舍尔)
●水槽(Rectangular Servin’SaverTM品号3862，乐柏美(Rubbermaid)，伍斯特，OH)
●BBS-硼酸盐缓冲盐水，含有溶于蒸馏水中的EDTA(用HCl或NaOH调节至pH 8.2至8.4)、25mM硼酸钠(硼砂(Borax))、100mM硼酸、75mM NaCl和5mM EDTA。
●存于盐水中的0.1N HCl，如下所述：浓HCl(8.3ml/0.917升蒸馏水)和0.154M NaCl
●甘氨酸(pH 2.0和pH 3.0)溶于蒸馏水中并调节至期望pH，即0.1M甘氨酸和0.154M NaCl。
●溶于蒸馏水中的5X硼酸盐和1X氯化钠，即0.11M NaCl、60mM硼酸钠和250mM硼酸。
●用氢氧化钠、50至100mM柠檬酸调节至pH 4.0的存于蒸馏水中的底物缓冲液。
●AA溶液：使HOBt溶于NMP中(使8.8克HOBt溶于1升NMP中)。浓度为0.53M的Fmoc-N-a-氨基。
●DIC溶液：使1份DIC溶于3份NMP中。
●去保护溶液：使1份哌啶溶于3份DMF中。
●试剂R：2份茴香醚、3份乙二硫醇、5份茴香硫醚和90份三氟乙酸。
设备
●MRX板读取器(达奈科技公司(Dynatech)，尚蒂利，VA)
●汉密尔顿遮蔽器(Hamilton Eclipse)(汉密尔顿仪器公司(Hamilton Instruments)，里诺，NV)
●贝克曼(Beckman)TJ-6离心机(型号TJ-6，贝克曼仪器公司(Beckman Instruments)，富勒顿，CA)
●图表记录器(记录器1品号18-1001-40，法玛西亚LKB生物科技公司)
●UV监测器(紫外线吸收计(Uvicord)SII品号18-1004-50，法玛西亚LKB生物科技公司)
●亚米康(Amicon)搅拌细胞浓缩器(8400型，亚米康，贝弗利，MA)
●30kD MW截止滤光片(目录号YM-30膜，目录号13742，亚米康)
●多通道自动化移液器(目录号4880，康宁，剑桥，MA)
●pH计康宁240(康宁科学产品(Corning Science Products)，康宁玻璃制品(Corning Glassworks)，康宁，NY)
●ACT396肽合成仪(高级化工公司(Advanced ChemTech)，路易斯维尔，KY)
●真空干燥器(箱体购自来博康(Labconco)，堪萨斯城，MO和泵购自阿尔卡特(Alcatel)，劳雷尔，MD)。
●冻干器(尤尼托普(Unitop)600sl，与冷凝干燥机(Freezemobile)12串联，二者都购自维特斯(Virtis)，加迪纳，NY)
肽选择
使用利用霍普(Hopp)/伍兹(Woods)方法(阐述于霍普和伍兹，分子免疫学(Mol.Immunol.)20：483，1983；以及霍普和伍兹，美国国家科学院学报78：3824，1981中)的程序自目标蛋白质序列内选择可产生相应抗体的肽。所述程序使用鉴定15-20个氨基酸的肽序列的扫描窗，所述肽序列含有若干个通过低溶剂可及性预测的假定抗原表位。此与大多数霍普/伍兹方法的实践相反，所述方法鉴定单一短(约6个氨基酸)推定抗原表位。有时可通过环结构的PHD预测法来进一步评价所预测的溶剂可及性(阐述于罗斯特(Rost)和山德尔(Sander)，蛋白质(Proteins)20：216，1994中)。优选肽序列显示与其它已知人类蛋白具有最小相似性。相似性是通过使用等于2的字长实施BLASTP比对来测定的(阐述于阿尔茨契尔(Altschul)等人，分子生物学杂志(J. Mol.Biol.)215：403，1990中)。检查所赋予期望值(EXPECT value)小于1000的所有比对，并且将在精确的连续无缺口比对中将比对的相似性大于60％或大于四个残基的那些肽强制性排除。在期望靶定蛋白质暴露于细胞膜外的区域时，根据文献或如使用隐马尔科夫模型(hidden Markov model)预测的跨膜结构域所定义来确定目标蛋白的细胞外区域(阐述于克罗赫(Krogh)等人，分子生物学杂志305：567，2001中)。在肽序列位于细胞外结构域中时，若其含有N-连接糖基化位点则排除所述肽。如附录A中所示，对于TLE3抗体的制备来说，使用具有氨基酸序列KNHHELDHRERESSAN(SEQ ID NO.383)的单肽。附录A提供一至三个可用于制备针对其它标记物的抗体的肽序列。
肽合成
向肽合成仪提供期望肽的序列。测定C-末端残基并使适宜王氏树脂附接至反应容器上。使用合成循环通过一次添加一个氨基酸自C-末端至N-末端合成肽。所述氨基酸的添加受肽合成仪控制，其依照进入其数据库的肽序列来控制。如下所述实施合成步骤：
步骤1-树脂溶胀：添加2ml DMF，培育30分钟，排干DMF。
步骤2-合成循环(按照肽长度重复实施)
2a-去保护：将1ml去保护溶液添加至反应容器中并培育20分钟。
2b-洗涤循环
2c-偶合：将750ml氨基酸溶液(随接受指示的肽合成仪中所列的序列而变化)和250ml DIC溶液添加至反应容器中。将反应容器培育30分钟并洗涤一次。将偶合步骤重复实施一次。
2d-洗涤循环
步骤3-最后去保护：最后将步骤2a和2b实施一次。
在甲醇中使树脂消溶胀(在5ml甲醇中冲洗两次，在5ml甲醇中培育5分钟，在5ml甲醇中冲洗)并随后进行真空干燥。
通过在试剂R中培育2小时并随后在醚中沉淀自树脂移出肽。在醚中洗涤肽并随后进行真空干燥。将肽再次溶解于diH2O中，冷冻并冻干过夜。
肽与钥孔帽贝血蓝蛋白的偶联
使肽(6mg)与钥孔帽贝血蓝蛋白(KLH)偶联。若所选肽包括至少一个半胱氨酸，则可将三个等份试样(2mg)溶于PBS(2ml)中并使其通过存于2ml PBS中的戊二醛、EDC或马来酰亚胺活化的KLH(2mg)与KLH偶合，所得总体积为4ml。若肽无半胱氨酸(如TLE3肽)，则可通过戊二醛和EDC方法使两个等份试样(3mg)偶合。
马来酰亚胺偶合可通过混合2mg肽与溶于PBS(4ml)中的2mg马来酰亚胺活化的KLH并培育4hr来达成。
EDC偶合可通过在4ml PBS(通过添加磷酸使pH降低至5)中混合2mg肽、2mg未修饰KLH与20mg EDC并培育4小时来达成。然后通过缓慢添加1.33ml乙酸(pH 4.2)来终止反应。在使用EDC来偶合3mg肽时，使上述数量增加1.5倍。
当在0.9ml PBS中混合2mg肽与2mg KLH时，发生戊二醛偶合。添加0.9ml存于PBS中的0.2％戊二醛并混合1小时。添加0.46ml存于PBS中的1M甘氨酸并混合1小时。在使用戊二醛来偶合3mg肽时，使上述数量增加1.5倍。
随后再次汇集经偶联等份试样，混合2小时，在1升PBS中透析并冻干。
兔的免疫
向两只纽西兰白兔中注射250μg(总量)存于总体积为1ml的等体积弗氏完全佐剂(complete Freund’s adjuvant)和盐水中的KLH偶联肽，之后在第一次免疫后第2、6、8和12周以1ml总体积将100μg存于等体积弗氏不完全佐剂(incomplete Freund’s Adjuvant)和盐水中的KLH偶联肽注射至三至四个背侧皮下位点中。免疫方案如下所述：
第0天          免疫前取血，初次免疫
第15天         第1次加强免疫
第27天         第1次取血
第44天         第2次加强免疫
第57天         第2次取血和第3次加强免疫
第69天         第3次取血
第84天         第4次加强免疫
第98天         第4次取血
收集兔血清
自耳动脉对兔进行取血(30至50ml)。在室温下经15分钟使血液凝成块并使用IEC DPR-6000以5000g离心自凝块分离血清。将无细胞血清小心地倾析至清洁试管中并储存在-20℃以供亲和纯化。
抗体效价的测定
除洗涤溶液外所有溶液都是通过汉密尔顿遮蔽器(液体处理分配器)来添加。在兔中使用ELISA分析以固相肽测定抗体效价。以被动方式用稀释于BBS(100μl，1μg/孔)中的肽来涂布柔性高结合ELISA板，并在4℃下于水槽(具有润湿棉球的气密性容器)中将板培育过夜。将板排空，随后使用半自动化板洗涤器通过重复填充和排空以含有0.1％Tween-20(BBS-TW)的BBS洗涤三次。通过用含有1％BSA和0.1％明胶的BBS-TW(BBS-TW-BG)填满各孔并在室温下培育2小时来将板封闭。将板排空并将免疫前和免疫后血清二者添加至孔中。第一孔含有以1∶50存于BBS中的血清。然后在板上将血清以1∶1之比再连续滴定11次，使最终(12次)稀释度为1∶204,800。在4℃下将板培育过夜。如上所述将板排空并洗涤三次。
将生物素化山羊抗兔IgG(100μl)添加至微量滴定板的各测试孔中并在室温下培育4小时。将板排空并洗涤三次。将辣根过氧化物酶-偶联的抗生蛋白链菌素(100μl，以1∶10,000稀释于BBS-TW-BG中)添加至各孔中并在室温下培育2小时。将板排空并洗涤三次。通过合并10ml柠檬酸盐缓冲液(0.1M，pH 4.0)、0.2ml原液(15mg/ml水溶液)和10μl 30％过氧化氢自原液制备新鲜ABTS。将ABTS溶液(100μl)添加至各孔中并在室温下培育。在添加底物20分钟后，在414nm下对板进行读取。
肽亲和纯化管柱的制备：
亲和管柱是通过使5mg肽与10ml溴化氰活化琼脂糖4B偶联并使5mg肽与肼-琼脂糖4B偶联来制备。简单来说，将100μl DMF添加至肽(5mg)中并将混合物旋转混合直至内含物完全润湿。然后添加水(900μl)并将内含物旋转混合直至肽溶解。将一半溶解肽(500μl)添加至单独管中，所述管含有10ml存于0.1ml硼酸盐缓冲盐水(pH 8.4)(BBS)中的溴化氰活化的琼脂糖4B和10ml存于0.1M碳酸盐缓冲液(使用存于柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中的过量EDC调节至pH 4.5)中的肼-琼脂糖4B。在室温下使偶联反应进行过夜。汇集偶联琼脂糖并将其装载至熔融石英管柱上，用10ml BBS洗涤，用10ml 1M甘氨酸封闭并用10ml 0.1M甘氨酸(用HCl调节至pH 2.5)洗涤并在BBS中再次中和。洗涤管柱的全部体积以在280nm下使光密度达到基线。
抗体的亲和纯化
使肽亲和管柱附接至UV监测器和图表记录器上。使所滴定兔抗血清解冻并汇集。用一体积BBS稀释血清并使其以10ml/分钟流过管柱。用过量BBS自管柱洗出非肽免疫球蛋白和其它蛋白质直至280nm下的光密度达到基线。使各管柱分离并使用pH 7.0至1.0的分段pH梯度洗脱亲和纯化管柱。在280nm下监测洗脱并将含有抗体的流份(pH 3.0至1.0)直接收集至过量0.5M BBS中。使用存于收集管中的过量缓冲液(0.5M BBS)来中和pH梯度的酸性流份中所收集的抗体。
使用“经特定处理的(depleted)”血清重复实施整个程序以确保抗体的最大回收。使用搅拌细胞装置和截留分子量为30kD的膜来浓缩经洗脱材料。通过在280nm下读取光密度来测定最终制剂的浓度。使用下式来确定浓度：mg/ml＝OD280/1.4。
应了解，在某些实施例中，可使用额外步骤来纯化本发明抗体。具体来说，可证实针对(例如)用于生成所述抗体的多肽中的一者再纯化抗体是有利的。应理解，本发明涵盖已通过所述额外纯化或再纯化步骤制备的抗体。还应了解，纯化过程可能会影响样品与本发明抗体之间的结合。
实例2：制备并染色组织阵列
此实例阐述用于制备用于各实例中的组织阵列的方法。此实例也阐述如何对抗体进行染色。
组织阵列是通过以下方式来制备的：将来自大量石蜡块(供体块)的全厚度核心插入网格模式的网格中指定位置处的空白石蜡块(受体块)中，所述核心含有源自多个不同患者的阻止片段和/或源自单一患者的不同组织或组织片段。然后制造包埋组织的石蜡(供体块)的标准载玻片，其含有适用于H & E染色的试样的薄切片。经过训练的病理学家或可熟练评估肿瘤和正常组织的相当职业者在组织阵列上指定目标采样区域(例如，与间质相对的肿瘤区域)。然后使用购自Beecher Instruments的市售组织阵列仪自供体块移出核心，之后将其插入受体块的指定位置中。重复所述过程直至所有供体块都已插入受体块中。然后将受体块切成薄片以获得50-300个载玻片，其含有源自插入受体块中的所有病例的核心。
然后根据制造商说明书使用具有DAB底物的达科易美逊(Envision)+，过氧化物酶IHC试剂盒(达科公司，卡平特，CA)以所选抗体来实施免疫组织化学染色。图1展示TLE3-阴性(S0643-)和TLE3-阳性(S0643+)样品的实例性IHC染色图像。
实例3：TLE3表达与癌症患者对化学疗法的反应有关。
用实例1中的TLE3抗体对来自两个不同乳癌队列-亨兹维尔医院(HH)和罗斯维尔公园癌症研究所(RP)-的肿瘤样品进行染色。可获得两个队列中所有患者的治疗和复发数据。图2展示在根据对TLE3抗体的染色分类后使用HH队列中的所有患者获得的卡普兰-迈耶复发曲线。分别使用TLE3-阳性和TLE3-阴性患者的复发数据来获得顶部及底部曲线。如图中所示，结合TLE3标记物的抗体与此乳癌队列的改良预后有关(HR＝0.573，p＝0.004)。图3展示使用RP队列中的所有患者以类似方式获得的卡普兰-迈耶复发曲线。对于HH队列，人们发现结合TLE3标记物的抗体与改良预后有关(HR＝0.239，p＝0.011)。
为确定TLE3的表达是否与对化学疗法的反应有关，使用接受或未接受化学疗法的HH队列患者分别获得卡普兰-迈耶复发曲线(分别参见图4和5)。如图4中所示，结合TLE3标记物的抗体与未接受化学疗法的患者的预后无关(HR＝0.788，p＝0.490)。然而，如图5中所示，在接受化学疗法的患者中所述关联恢复(HR＝0.539，p＝0.013)。这些结果证实，TLE3的表达与对化学疗法的改良反应有关(即TLE3-阳性癌症比TLE-3阴性癌症更有可能对化学疗法起反应)。使用RP乳癌队列中接受化学疗法的患者获得的卡普兰-迈耶复发曲线与此预测模型一致(参见图6，HR＝0.194，p＝0.010)。使用UAB卵巢癌队列中接受化学疗法的患者获得的卡普兰-迈耶复发曲线也与此预测模型一致(参见图18，HR＝0.64，p＝0.049)。
实例4：特定化学疗法关联
既然HH和RP队列中的不同患者接受不同类型的化学疗法，因此也能确定TLE3的表达是否与对特定类型的化学疗法的反应有关。
图7展示使用图5HH乳癌队列中接受CMF(环磷酰胺、甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶)化学疗法的患者获得的卡普兰-迈耶复发曲线。分别使用此亚类中TLE3-阳性和TLE3-阴性患者的复发数据来获得顶部及底部曲线。如图7中所示，结合TLE3标记物的抗体与此亚类经治疗患者的改良预后有关(HR＝0.398，p＝0.019)。由于以下结果证实所述抗体与HH队列中经CA(环磷酰胺和亚德里亚霉素，HR＝1.000)或CAF(环磷酰胺、亚德里亚霉素和5-氟尿嘧啶，HR＝1.000)治疗的患者无关，因此能够确认图7中的预测性关联介于TLE3结合与用甲氨蝶呤治疗之间(也可参见图9，其组合经CA和CAF治疗的亚类，HR＝1.030)。
图8展示使用图5HH乳癌队列中接受CA或CAF化学疗法(使用或不使用紫杉烷)的患者获得的卡普兰-迈耶复发曲线。如图中所示，结合TLE3标记物的抗体与预后之间的关联在此亚类经治疗患者中丧失显著性(HR＝0.666，p＝0.22)。在使用仅接受CA或CAF化学疗法(即不使用紫杉烷)的患者获得曲线时，显著性进一步降低(参见图9，HR＝1.030，p＝0.95)。然而，所述关联在接受CA或CAF以及紫杉烷的患者中恢复(参见图10，HR＝0.114，p＝0.038)。这些结果证实，TLE3的结合与用紫杉烷治疗有关。
图11展示使用图6RP乳癌队列中仅接受CA化学疗法(即不使用紫杉烷)的患者获得的卡普兰-迈耶复发曲线。分别使用此亚类中TLE3-阳性和TLE3-阴性患者的复发数据来获得顶部及底部曲线。如图中所示，结合TLE3标记物的抗体与此亚类经治疗患者的预后无关(HR＝0.759，p＝0.81)。在使用接受CA化学疗法以及紫杉烷的患者来获得曲线时所述关联恢复(参见图12，HR＝0.153，p＝0.018)。这些结果证实了图8和9中使用来自HH队列的样品获得的结果。
图13展示使用图6RP乳癌队列中接受紫杉烷或CMF的患者获得的卡普兰-迈耶复发曲线。某些接受紫杉烷的患者也接受了CA。分别使用此亚类中TLE3-阳性和TLE3-阴性患者的复发数据来获得顶部及底部曲线。如图中所示，结合TLE3标记物的抗体与此亚类经治疗患者的改良预后有关(HR＝0.137，p＝0.011)。
图14展示使用图6RP乳癌队列中接受新辅助化学疗法的患者获得的卡普兰-迈耶复发曲线。分别使用此亚类中TLE3-阳性和TLE3-阴性患者的复发数据来获得顶部及底部曲线。样品量较小(N＝12)；然而，如图中所示，在使用费氏确切检验来测量时，结合TLE3标记物的抗体显示与此亚类经治疗患者的改良预后显著相关(p＝0.005)。此外，在12个接受新辅助化学疗法的患者中，两个患者接受CA(两个患者都显示复发)，并且十个患者接受CA和紫杉烷(七个患者显示复发，三个患者未复发)。值得注意的是，三个未显示任何复发的患者只是具有TLE3-阳性样品的患者。这些结果具有重要意义，因为其显示TLE3结合与对化学疗法的反应之间的关联与是在辅助疗法情形下还是在新辅助疗法情形下实施治疗无关。
图15-17展示使用图6RP乳癌队列中接受化学疗法的患者获得的卡普兰-迈耶复发曲线。分别使用患有II+期(图15)、IIb+期(图16)和III+期(图17)癌症的TLE3-阳性和TLE3-阴性患者的复发数据来获得顶部及底部曲线。在每种情形下，结合TLE3标记物的抗体都与这些亚类经治疗患者的改良预后有关。在图17亚类中样品量较小(N＝19)；然而在使用费氏确切检验来测量时此关联具有显著性(p＝0.020)。这些结果在临床上具有重要意义，因为其证实TLE3标记物的预测能力与癌症阶段无关并且甚至在具有最差预后的患者(例如，III+期患者)中也能保持显著性。
实例5：二变量分析
为确认TLE3的预测能力与其它临床因素(例如，年龄、肿瘤大小、神经节状态、坏死等)无关，使用来自RP乳癌队列的结果来实施二变量统计分析。结果汇总于下表1中。如表中所示，使用TLE3进行预测可在所有二变量分析中保持显著性，从而证实其与其它临床因素无关。
表1-二变量分析
Figure BPA00001188368000311
1发现具有转移癌的神经节。
2血管淋巴入侵。
3含有紫杉烷的方案。
其它实施例
在考虑本文所揭示的本发明的说明书和实践后，所属领域技术人员可了解本发明的其它实施例。意欲将说明书和各实例仅视为例示性，并且本发明的真正范围是由随附权利要求书来表明。
Figure BPA00001188368000321
Figure BPA00001188368000331
Figure BPA00001188368000341
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Claims (44)

1.一种预测患者所患癌症将对化学疗法起反应的可能性的方法，其包含以下步骤：
提供来自癌症患者的癌症样品；
测定所述癌症样品中是否表达TLE3；和
根据所述测定步骤的结果来预测所述患者所患癌症将对化学疗法起反应的可能性。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述预测步骤包含根据所述癌症样品中存在TLE3的表达预测所述患者所患癌症可能对化学疗法起反应。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述预测步骤包含根据所述癌症样品中不存在TLE3的表达预测所述患者所患癌症不可能对化学疗法起反应。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述测定步骤包含以下步骤：
提供阴性对照样品；
检测所述阴性对照样品中TLE3的表达水平；
检测所述癌症样品中TLE3的表达水平；和
比较所述癌症样品中TLE3的表达水平与所述阴性对照样品中TLE3的表达水平。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述测定步骤包含以下步骤：
提供阳性对照样品；
检测所述阳性对照样品中TLE3的表达水平；
检测所述癌症样品中TLE3的表达水平；和
比较所述癌症样品中TLE3的表达水平与所述阳性对照样品中TLE3的表达水平。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述测定步骤包含使所述癌症样品与结合TLE3多肽的相互作用配偶体接触。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述相互作用配偶体是抗体。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述测定步骤包含使所述癌症样品与一或多种与TLE3多核苷酸杂交的引物接触。
9.如权利要求1所述的方法，其另外包含：
根据所述患者所患癌症将对化学疗法起反应的可能性来决定是否向所述癌症患者施用化学疗法。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述决定步骤包含根据所述癌症样品中存在TLE3的表达决定向所述癌症患者施用化学疗法。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述决定步骤包含根据所述癌症样品中不存在TLE3的表达决定不向所述癌症患者施用化学疗法。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述化学疗法包含用细胞周期特异性化学治疗药物来治疗。
13.如权利要求9所述的方法，其中所述化学疗法包含用甲氨蝶呤或甲氨蝶呤衍生物来治疗。
14.如权利要求9所述的方法，其中所述化学疗法包含用紫杉烷或紫杉烷衍生物来治疗。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述紫杉烷是紫杉醇。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述紫杉烷是多西他赛(docetaxel)。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症患者患有乳癌。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症患者患有肺癌。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症患者患有卵巢癌。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述化学疗法是在新辅助疗法情形下施用。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述化学疗法是在辅助疗法情形下施用。
22.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症患者患有II+期癌症。
23.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症患者患有IIb+期癌症。
24.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症患者患有III+期癌症。
25.一种为癌症患者选择化学疗法的方法，其包含以下步骤：
提供来自癌症患者的癌症样品；
确定所述癌症样品中是否表达TLE3；和
根据所述测定步骤的结果来为所述癌症患者选择化学疗法。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述选择步骤包含根据所述癌症样品中存在TLE3的表达选择化学疗法。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述测定步骤包含以下步骤：
提供阴性对照样品；
检测所述阴性对照样品中TLE3的表达水平；
检测所述癌症样品中TLE3的表达水平；和
比较所述癌症样品中TLE3的表达水平与所述阴性对照样品中TLE3的表达水平。
28.如权利要求25所述的方法，其中所述测定步骤包含以下步骤：
提供阳性对照样品；
检测所述阳性对照样品中TLE3的表达水平；
检测所述癌症样品中TLE3的表达水平；和
比较所述癌症样品中TLE3的表达水平与所述阳性对照样品中TLE3的表达水平。
29.如权利要求25所述的方法，其中所述测定步骤包含使所述癌症样品与结合TLE3多肽的相互作用配偶体接触。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述相互作用配偶体是抗体。
31.如权利要求25所述的方法，其中所述测定步骤包含使所述癌症样品与一或多种与TLE3多核苷酸杂交的引物接触。
32.如权利要求25所述的方法，其中所述化学疗法包含用细胞周期特异性化学治疗药物来治疗。
33.如权利要求25所述的方法，其中所述化学疗法包含用甲氨蝶呤或甲氨蝶呤衍生物来治疗。
34.如权利要求25所述的方法，其中所述化学疗法包含用紫杉烷或紫杉烷衍生物来治疗。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述紫杉烷是紫杉醇。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述紫杉烷是多西他赛。
37.如权利要求25所述的方法，其中所述癌症患者患有乳癌。
38.如权利要求25所述的方法，其中所述癌症患者患有肺癌。
39.如权利要求25所述的方法，其中所述癌症患者患有卵巢癌。
40.如权利要求25所述的方法，其中所述化学疗法是在新辅助疗法情形下施用。
41.如权利要求25所述的方法，其中所述化学疗法是在辅助疗法情形下施用。
42.如权利要求25所述的方法，其中所述癌症患者患有II+期癌症。
43.如权利要求25所述的方法，其中所述癌症患者忠有IIb+期癌症。
44.如权利要求25所述的方法，其中所述癌症患者患有III+期癌症。
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