CN101914597B - 一种制备魔芋葡甘露寡糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备魔芋葡甘露寡糖的方法。1)将魔芋与水混匀剪切乳化后，依次在压力为160-250MPa和450-650MPa的条件下均质，干燥后得到魔芋粗粉；2)将魔芋粗粉的浆液与内切型甘露聚糖酶进行酶水解反应，得到魔芋葡甘露寡糖的生成液，并不断将所述魔芋葡甘露寡糖的生成液取出，每反应3-6小时补充所述魔芋粗粉的浆液一次，补料9-20次后，再反应3-6小时后停止反应，收集合并所述魔芋葡甘露寡糖的生成液，干燥得到所述魔芋葡甘露寡糖。该方法能够提高甘露聚糖酶的功效和利用效率，最大程度的获得目标葡甘露寡糖产物，纯度达90％以上。
Description
技术领域
本发明涉及食品饲料添加剂领域，特别是涉及一种制备魔芋葡甘露寡糖的方法。
背景技术
我国是魔芋种植大国，鲜魔芋年产量已达100万吨以上，成为农民尤其是贫困地区农民的一个主要经济来源。魔芋中含有90％葡甘露聚糖，是制备功能性葡甘露寡糖的最佳原料。但是我国对于魔芋的加工，仅仅停留在魔芋粗粉、精粉和魔芋胶的制备和生产阶段，其潜在的巨大经济效益没有展现出来。
葡甘露寡糖是指由2-10个葡萄糖和甘露糖通过糖苷键连接而成的寡聚体，对于机体的新陈代谢具有特殊的功效，主要体现在：①促进机体肠道有益菌生长与繁殖；②直接吸附病原菌，排除肠道毒素；③增强机体的免疫功能和抗病能力；④具有降脂效应，能改善脂质代谢，增进矿物元素的吸收，降低血氨浓度。由于独特的生理功能功效，葡甘露寡糖作为重要的功能性添加剂被人们所认知，并将被广泛应用于食品、保健品和饲料等多个领域。
葡甘露寡糖主要是通过葡聚糖酶降解魔芋精粉，通过除杂、精制得到葡甘露寡糖。目前普遍采用的是间歇釜式反应的制备方法，但该方法耗能、耗时且酶的利用效率不高。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备魔芋葡甘露寡糖的方法。
本发明提供的制备魔芋葡甘露寡糖的方法，包括如下步骤：
1)将魔芋与水混匀剪切乳化后，依次在压力为160-250MPa和450-650MPa的条件下均质，干燥后得到魔芋粗粉；
2)将所述魔芋粗粉与水混匀得到魔芋粗粉的浆液，将所述魔芋粗粉的浆液与内切型甘露聚糖酶进行酶水解反应，得到魔芋葡甘露寡糖的生成液，并不断将所述魔芋葡甘露寡糖的生成液取出，每反应3-6小时补充所述魔芋粗粉的浆液一次，所述补充的所述魔芋粗粉的浆液的体积数与所述取出的所述魔芋葡甘露寡糖的生成液的体积数相同，补料9-20次后，再反应3-6小时后停止反应，收集合并所述魔芋葡甘露寡糖的生成液，干燥得到所述魔芋葡甘露寡糖。
上述方法的步骤1)中，所述魔芋与水的用量比为1kg∶600kg-1kg∶1200kg，优选1kg∶1000kg；所述魔芋粗粉的目数为40-80目，优选60目。所述剪切乳化步骤中，剪切乳化速率为6000rpm-10000rpm，优选8000rpm，所述剪切乳化的次数为2-5次，优选3次，所述每次剪切乳化的时间为5-15分钟，优选10分钟；所述在160-250Mpa的条件下均质步骤中，优选均质的压力为200MPa，均质的次数为1次，所述在450-650MPa的条件下均质的步骤中，优选均质的压力为500MPa，均质的次数为2-3次；所述干燥步骤中，温度为80-110℃，优选95℃，时间为10-24小时，优选20小时。
所述步骤2)中，所述内切型甘露聚糖酶为中性β-甘露聚糖酶，各种公开商业途径出售的上述内切型甘露聚糖酶均适用于该方法，如可购自北京博仕奥生物技术有限公司。所述魔芋粗粉的浆液的质量百分比浓度为1.5％-3.5％，优选2％，所述内切型甘露聚糖酶的酶活为18-20万U/g，优选19万U/g；所述中性β-甘露聚糖酶酶活定义如下：在40℃、pH值为6.0的测定条件下，1min催化浓度为5mg/mL的LBG底物(洋槐豆粉)水溶液生成1μg还原糖(以甘露糖表示)所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)，单位计为U/g。
所述酶水解反应中，温度为35℃-45℃，优选40℃，时间为3-6小时，优选4小时，压力为0.16MPa-0.25MPa，优选0.2MPa；所述内切型甘露聚糖酶与所述魔芋粗粉的质量比为0.1-0.6∶1，具体为0.4-0.5∶1，优选0.4∶1。由于该酶水解反应进行过程中，魔芋粉中的葡甘露聚糖量逐渐减少，因此需要补充魔芋粗粉，以维持反应体系的相对平衡。补料次数优选为每反应4小时补料一次。
在所述收集合并所述魔芋葡甘露寡糖的生成液步骤之后，所述干燥步骤之前，还对所述魔芋葡甘露寡糖的生成液进行如下处理：将所述步骤2)得到的所述魔芋葡甘露寡糖的生成液依次进行脱色、除杂和浓缩。
所述脱色步骤中，所用脱色剂为活性炭，所述活性炭为所述魔芋葡甘露寡糖的生成液的总体积的0.1-1％，优选0.6％，温度为90℃-110℃，具体为90-100℃、95-100℃或90-95℃，优选95℃，时间为30-40分钟，优选35分钟。
所述除杂步骤是为了脱除所含有的离子和具有苦涩味的成分，除杂方式为依次用酸性阳离子交换树脂和碱性阴离子交换树脂进行除杂，所述酸性阳离子交换树脂为D72型酸性阳离子交换树脂，所述碱性阴离子交换树脂为D201×7型碱性阴离子交换树脂。各种从公开商业途径购买的上述型号的酸性阳离子交换树脂和碱性阴离子交换树脂均适用于该方法；该除杂步骤中，洗脱液均为蒸馏水。
所述浓缩步骤中，温度为50-60℃，所述浓缩后魔芋葡甘露寡糖溶液中所述魔芋葡甘露寡糖的质量百分浓度为50％-70％，优选65％。
所述步骤2)干燥步骤中，干燥方式为喷雾干燥，温度为120-160℃，具体为140-150℃、120-150℃或150-160℃，优选140℃，时间为10-30分钟，优选15分钟。
本发明提供了一种物理预处理和酶水解反应相结合制备葡甘露寡糖的方法。该方法采用高速剪切乳化耦合超高压均质方式处理鲜魔芋，选择内切甘露聚糖酶制备葡甘露寡糖粗糖液，并进行脱色、除杂、浓缩及干燥，得到了纯度高达90％以上的魔芋葡甘露寡糖。本发明提供的制备魔芋葡甘露寡糖的方法，具有如下优点：
(1)采用高剪切乳化耦合超高压均质处理对魔芋的物理结构具有较大的破坏作用，所得魔芋粗粉的颗粒最小，因而使底物魔芋粗粉暴露出了更多的酶结合位点，同时在酶解反应时也可以增加底物与酶的接触面积和接触几率，从而有利于酶解反应的进行。
(2)该方法能够适时移走生成产物可促进正反应进行，对于提高甘露聚糖酶的功效和利用效率，最大程度的获得目标葡甘露寡糖产物，具有极大的优越性。
附图说明
图1为实施例1制备所得产物的荧光辅助糖电泳图谱。
图2为实施例1制备所得产物的HPLC谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中所述浓度，如无特别说明，均为质量百分浓度。下述实施例中所述检测方法，如无特别说明，均为常规检测方法。下述实施例中所用内切型甘露聚糖酶均购自北京博仕奥生物技术有限公司，产品规格为中性β-甘露聚糖酶，酶活为18-20万U/g。其中，中性β-甘露聚糖酶酶活定义如下：在40℃、pH值为6.0的测定条件下，1min催化浓度为5mg/mL的LBG底物(洋槐豆粉)水溶液生成1μg还原糖(以甘露糖表示)所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)，单位计为U/g。
实施例1
1)将鲜魔芋洗净，去皮，切块，用榨汁机初步破碎，按魔芋与水的用量比为1kg∶1000kg的比例加入蒸馏水，用高剪切混合乳化机于8000r/min下剪切乳化3次，每次10min，再用超高压均质机先于200Mpa下均质一次，再于500Mpa下均质两次，静置，用滤布滤去上层清液，将滤渣在80℃干燥24小时，得到魔芋粗粉，目数为60目。
2)称取步骤1)制得的60目的魔芋粗粉100g，用水调制成浓度为2％的魔芋粗粉的浆液，将该魔芋粗粉的浆液与酶活为19万U/g的内切型甘露聚糖酶40g进行酶水解反应，得到魔芋葡甘露寡糖的生成液，并不断将所述魔芋葡甘露寡糖的生成液取出，该酶水解反应中，温度为40℃，工作压力为0.2MPa，反应4h后，进行第一次补料，补充的物料为所用浓度为2％的魔芋粗粉的浆液，体积为此时收集的魔芋葡甘露寡糖的生成液的体积量。此后每隔4h补料一次，待补料10次后，继续反应4小时，停止反应，收集合并魔芋葡甘露寡糖的生成液；
3)将步骤2)收集到的魔芋葡甘露寡糖的生成液合并，加入该魔芋葡甘露寡糖的生成液体积量0.6％的活性炭粉末，95℃下脱色35min，过滤后，将糖液依次过D72型酸性阳离子交换树脂和D201×7型碱性阴离子交换树脂后，水洗脱液合并在50℃进行浓缩，得到质量百分浓度为70％的葡甘露寡糖溶液，再在140℃喷雾干燥15分钟，得到58g产物。
该荧光辅助糖电泳的具体检测条件如下：
取100μg样品(步骤2)所得产物)，置于2ml离心管中，在旋转真空离心浓缩仪中于40℃下旋干，加入5μL 0.2M ANTS水溶液及5μL 1.0M NaBH3CN水溶液，混匀，于12000r/min下离心2min，置于37℃数控超级恒温槽中反应16h，再于旋转真空离心浓缩仪中40℃旋干，将旋干后的样品溶于50μL由体积比为1∶4的甘油和水组成的样品处理液中，以备使用。所述ANTS为8-氨基-1，3，6-三磺酸萘(8-aminonaphthalene-1，3，6-trisulfonic acid，亦称为8-氨基萘-1，3，6三磺酸或氨基卞三磺酸)。
按照下述条件进行该样品处理液的电泳检测：先在300V电压下电泳1h，然后将电压提高至1000V继续电泳，直至荧光前沿到达分离胶底部。整个电泳过程始终保持电泳槽的温度为5～7℃(采用循环水冷却)。
该电泳条件中，所用浓缩胶为质量百分浓度为3.8％的浓缩胶，所用分离胶为质量百分浓度为30％的分离胶。所用正极缓冲液为pH值为8.2的0.1M Tris-HCl。所用负极缓冲液为pH值为8.5的0.15M Tris-glycine。
所用30％分离胶是按照如下方法制备而得：将60％凝胶储液A34mL，凝胶缓冲液B17mL、重蒸水17mL和10％过硫酸铵水溶液116μL混合搅拌3min，再加入74μLTEMED(N，N，N′，N′-四甲基乙二胺)，搅拌3min后而得。
所用3.8％浓缩胶是按照如下方法制备而得：将60％凝胶储液A 1.26mL、凝胶缓冲液B5.00mL、重蒸水13.6mL和10％过硫酸铵水溶液200μL混合搅拌3min，再加入32μLTEMED，搅拌3min后而得。
其中，制备30％分离胶和3.8％浓缩胶中所用60％凝胶储液A是按照如下方法制备而得：
称取丙烯酰胺300.00g加入到80ml的蒸馏水中，蒸馏水事先加热至70-80℃，继续加热并不断搅拌直至丙烯酰胺全部溶解。加入8.00g甲叉丙烯酰胺(甲叉丙烯酰胺与水的比例为1.6g∶100ml)水溶液直至其全部溶解，冷却至室温后定容至500ml容量瓶中，转移到棕色瓶中4℃冰箱中储存备用。
所用凝胶缓冲液B是按照如下方法制备而得：用1.5M Tris与1.5M Tris-HCl混合用pH计检测pH值至8.5为止。
该步骤2)所得产物的荧光辅助糖电泳如图1所示。其中，1为甘露糖标准样品(DP1)，2为甘露糖(DP1)及甘露寡糖(DP2～5)标准样品(其中，DP2～5依次为葡甘露二糖、葡甘露三糖、葡甘露四糖和葡甘露五糖)，3为步骤2)所得产物。
由图1可知，该步骤2)所得产物是以葡甘露二糖、葡甘露三糖、葡甘露四糖和葡甘露五糖为主的葡甘露寡糖。
此外，对步骤2)所得产物进行HPLC检测，色谱检测条件如下所示：
色谱系统：Waters 2695，色谱柱：Waters Sugar-D(4.6I.D.×250mm)色谱柱，检测器：Waters 2414示差折光检测器，流动相：由乙腈和水以体积比70∶30混合而得的混合液，流速为0.75mL/min，检测温度：30.0℃，进样量：10μL。
所得HPLC检测结果如图2所示，其中，峰1-5依次为甘露糖、葡甘露二糖、葡甘露三糖、葡甘露四糖和葡甘露五糖。由图2可知，该步骤2)所得产物是以葡甘露二糖、葡甘露三糖、葡甘露四糖和葡甘露五糖为主的葡甘露寡糖。
按照滴定法测定步骤2)所得产物中的总糖含量，并按照图2所示HPLC谱图测定该产物中甘露糖的含量，可知，步骤2)所得产物中，寡糖的总含量≥91％。
实施例2
1)鲜魔芋洗净，去皮，切块，用榨汁机初步破碎，按魔芋与水的用量比为1kg∶600kg的比例加入蒸馏水，用高剪切混合乳化机于10000r/min下剪切乳化2次，每次5min，再用超高压均质机先于160MPa下均质一次，再于650MPa下均质三次，静置，用滤布滤去上层清液，将滤渣在110℃干燥10小时，得到魔芋粗粉，目数为80目。
2)称取步骤1)制得的80目的魔芋粗粉100g，用水调制成浓度为3.5％的魔芋粗粉的浆液，将该魔芋粗粉的浆液与酶活为20万U/g的内切型甘露聚糖酶40g进行酶水解反应，得到魔芋葡甘露寡糖的生成液，并不断将所述魔芋葡甘露寡糖的生成液取出，该酶水解反应中，温度为40℃，工作压力为0.16MPa，反应3h后，进行第一次补料，补充的物料为所用浓度为3.5％的魔芋粗粉的浆液，体积为此时收集的魔芋葡甘露寡糖的生成液的体积量。此后每隔3h补料一次，待补料15次后，继续反应3小时，停止反应，收集合并魔芋葡甘露寡糖的生成液；
3)将步骤2)收集到的魔芋葡甘露寡糖的生成液合并，加入该魔芋葡甘露寡糖的生成液体积量0.1％的活性炭粉末，90℃下脱色40min，过滤后，将糖液依次过D72型酸性阳离子交换树脂和D201×7型碱性阴离子交换树脂后，水洗脱液合并在60℃进行浓缩，得到质量百分浓度为70％的葡甘露寡糖水溶液，再在160℃喷雾干燥10分钟，得到54g产物。
将该产物用与实施例1完全相同的检测条件进行荧光辅助糖电泳检测，所得结果与实施例1相同，该产物是以葡甘露二糖、葡甘露三糖、葡甘露四糖和葡甘露五糖为主的葡甘露寡糖产品，寡糖的总含量≥90％。
实施例3
1)鲜魔芋洗净，去皮，切块，用榨汁机初步破碎，按魔芋与水的用量比为1kg∶1200kg的比例加入蒸馏水，用高剪切混合乳化机于6000r/min下剪切乳化5次，每次15min，再用超高压均质机先于250MPa下均质一次，再于450MPa下均质三次，静置，用滤布滤去上层清液，将滤渣在95℃干燥20小时，得到魔芋粗粉，目数为40目。
2)称取步骤1)制得的40目的魔芋粗粉100g，用水调制成浓度为1.5％的魔芋粗粉的浆液，将该魔芋粗粉的浆液与酶活为20万U/g的内切型甘露聚糖酶40g进行酶水解反应，得到魔芋葡甘露寡糖的生成液，并不断将所述魔芋葡甘露寡糖的生成液取出，该酶水解反应中，温度为35℃，工作压力为0.25MPa，反应6h后，进行第一次补料，补充的物料为所用浓度为1.5％的魔芋粗粉的浆液，体积为此时膜外收集的魔芋葡甘露寡糖的生成液的体积量。此后每隔6h补料一次，待补料9次后，继续反应6小时，停止反应，收集合并魔芋葡甘露寡糖的生成液；
3)将步骤2)收集到的魔芋葡甘露寡糖的生成液合并，加入该魔芋葡甘露寡糖的生成液体积量0.1％的活性炭粉末，110℃下脱色40min，过滤后，将糖液依次过D72型酸性阳离子交换树脂和D201×7型碱性阴离子交换树脂后，水洗脱液合并在55℃进行浓缩，得到质量百分浓度为65％的葡甘露寡糖水溶液，再在120℃喷雾干燥30分钟，得到50g产物。
将该产物用与实施例1完全相同的检测条件进行荧光辅助糖电泳检测，所得结果与实施例1相同，该产物是以葡甘露二糖、葡甘露三糖、葡甘露四糖和葡甘露五糖为主的葡甘露寡糖产品，寡糖的总含量≥92％。
实施例4
1)鲜魔芋洗净，去皮，切块，用榨汁机初步破碎，按魔芋与水的用量比为1kg∶600kg的比例加入蒸馏水，用高剪切混合乳化机于10000r/min下剪切乳化3次，每次5min，再用超高压均质机先于200Mpa下均质一次，再于500Mpa下均质两次，静置，用滤布滤去上层清液，将滤渣在95℃干燥20小时，得到魔芋粗粉，目数为60目。
2)称取步骤1)制得的60目的魔芋粗粉100g，用水调制成浓度为3.5％的魔芋粗粉的浆液，将该魔芋粗粉的浆液与酶活为18万U/g的内切型甘露聚糖酶50g进行酶水解反应，得到魔芋葡甘露寡糖的生成液，并不断将所述魔芋葡甘露寡糖的生成液取出，该酶水解反应中，温度为45℃，工作压力为0.2MPa，反应4h后，进行第一次补料，补充的物料为所用浓度为3.5％的魔芋粗粉的浆液，体积为此时膜外收集的魔芋葡甘露寡糖的生成液的体积量。此后每隔4h补料一次，待补料10次后，继续反应4小时，停止反应，收集合并魔芋葡甘露寡糖的生成液；
3)将步骤2)收集到的魔芋葡甘露寡糖的生成液合并，加入该魔芋葡甘露寡糖的生成液体积量1％的活性炭粉末，100℃下脱色30min，过滤后，将糖液依次过D72型酸性阳离子交换树脂和D201×7型碱性阴离子交换树脂后，水洗脱液合并在60℃进行浓缩，得到质量百分浓度为50％的葡甘露寡糖水溶液，再在150℃喷雾干燥15分钟，得到61g产物。
将该产物用与实施例1完全相同的检测条件进行荧光辅助糖电泳检测，所得结果与实施例1相同，该产物是以葡甘露二糖、葡甘露三糖、葡甘露四糖和葡甘露五糖为主的葡甘露寡糖产品，寡糖的总含量≥90％。
Claims (4)
1.一种制备魔芋葡甘露寡糖的方法，包括如下步骤：
1)将魔芋与水按照1kg∶600kg的比例混匀剪切乳化后，依次在压力为200MPa的条件下均质一次和500MPa的条件下均质两次，干燥后得到魔芋粗粉；所述魔芋粗粉的目数为60目；所述剪切乳化中，剪切乳化速率为10000rpm，所述剪切乳化的次数为3次，每次剪切乳化的时间为5分钟；
2)将所述魔芋粗粉与水混匀得到质量百分浓度为3.5％的魔芋粗粉浆液，将所述魔芋粗粉浆液与酶活为18万U/g的中性β-甘露聚糖酶进行酶水解反应，得到魔芋葡甘露寡糖的生成液，并不断将所述魔芋葡甘露寡糖的生成液取出，每反应4小时补充所述魔芋粗粉的浆液一次，所述补充的所述魔芋粗粉的浆液的体积数与所述取出的所述魔芋葡甘露寡糖的生成液的体积数相同，补料10次后，再反应4小时后停止反应，收集合并所述魔芋葡甘露寡糖的生成液，干燥得到所述魔芋葡甘露寡糖；
所述步骤2)所述酶水解反应中，温度为45℃，时间为4小时，压力为0.2MPa；所述中性β-甘露聚糖酶与所述魔芋粗粉的质量比为0.5∶1；
在所述收集合并所述魔芋葡甘露寡糖的生成液步骤之后，所述干燥步骤之前，还将所述魔芋葡甘露寡糖的生成液依次进行脱色、除杂和浓缩；
所述脱色步骤中，所用脱色剂为活性炭，所述活性炭为所述魔芋葡甘露寡糖的生成液的总体积的1％，温度为100℃，时间为30分钟；
所述除杂步骤中，除杂方式为依次用酸性阳离子交换树脂和碱性阴离子交换树脂进行除杂，所述酸性阳离子交换树脂为D72型酸性阳离子交换树脂，所述碱性阴离子交换树脂为D201×7型碱性阴离子交换树脂，洗脱液均为蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)的干燥温度为95℃，干燥时间为20小时。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述浓缩步骤中，温度为60℃，所述浓缩后魔芋葡甘露寡糖溶液中所述魔芋葡甘露寡糖的质量百分浓度为50％。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)干燥步骤中，干燥方式为喷雾干燥，温度为150℃，时间为15分钟。
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