CN101906457B

CN101906457B - 一种生物不对称转化制备r－肾上腺素的方法

Info

Publication number: CN101906457B
Application number: CN 201010245540
Authority: CN
Inventors: 许小平; 李忠琴; 陈秉梅; 侯志国
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2010-08-05
Filing date: 2010-08-05
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2030-08-05
Also published as: CN101906457A

Abstract

本发明提供了一种乙醇脱氢酶生物不对称转化R-肾上腺素的方法，该方法利用乙醇脱氢酶催化底物肾上腺酮中羰基的不对称还原成为R-肾上腺素。本发明的R-肾上腺素制备方法专一性强、产率高、操作简单、成本低廉、目标产物易分离。本发明所采用的乙醇脱氢酶生物不对称转化R-肾上腺素的方法，不仅能获得高纯度的R-肾上腺素，而且生产成本比现有的低廉，并且产物无需拆分，是一种具有广泛应用前景的生产方法，可以满足迅速发展的医药工业的需求。

Description

一种生物不对称转化制备R-肾上腺素的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体涉及乙醇脱氢酶生物不对称转化R-肾上腺素。

技术背景

(R)-肾上腺素是由肾上腺髓质分泌的一种激素，属于儿茶酚胺类手性药物，临床上广泛应用于治疗心脏骤停、支气管哮喘、过敏性休克，也可治疗荨麻疹、枯草热及鼻粘膜或齿龈出血。由于肾上腺素分子中存在一个手性中心，而生命过程中发生的各种生化反应均与手性的识别和应答有关。因而肾上腺素对生物的应答（如在体内的吸收、转运、组织分布、代谢和消除）直接关系到它的药理作用、临床效果和药效发挥。例如在支气管扩张作用中，R-肾上腺素是其S对映体的45倍。因此，探索单一对映体肾上腺素的制备方法，研究R-肾上腺素不对称反应的机制，不仅可以为临床上正在使用的100多种拟肾上腺素能药提供一种制备单一对映体药物的新方法，而且为肾上腺素能药不对称转化的工业化生产开辟了一条新的绿色途径。

目前肾上腺素工业化合成路线主要有两条，一是以相应的α-卤代苯乙酮为原料，经胺化及还原后，然后进行化学拆分得单一对映体产品；二是在制备肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素时，以儿茶酚与氯乙酰氯或氯乙酸为原料，通过缩合、氨化及还原，得相应产物的外消旋体，再用(+)-酒石酸进行化学拆分。但化学合成与拆分方法技术路线复杂，合成步骤多，费用高，并且拆分后的S对映体无法利用，对环境将造成较大的污染。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物不对称转化制备R-肾上腺素的方法，该方法能够选择性地将底物肾上腺酮不对称转化为R-肾上腺素，所制得的R-肾上腺素纯度高，产物无需拆分，并且该制备方法成本低，污染少。

本发明的生物不对称转化制备R-肾上腺素的方法，是利用乙醇脱氢酶催化底物肾上腺酮中羰基的不对称还原成为R-肾上腺素。首先将底物肾上腺酮加入锥型瓶中，然后加入辅酶NADH和乙醇脱氢酶，催化底物肾上腺酮中羰基的不对称还原，反应最终产物经减压干燥得R-肾上腺素。

所述减压干燥条件为45～70℃，0.05～0.08 Mpa；最佳条件为55℃，0.07 Mpa。

生物转化时间为15～24 h。

所述生物不对称转化的温度为32～40℃；最佳温度为35℃。

所述辅酶NADH的浓度为1～10 mmol/L，乙醇脱氢酶的用量为1～5 ml。

所述底物肾上腺酮的浓度为5～120 mmol/L。

本发明以乙醇脱氢酶为生物催化剂，以潜手性化合物肾上腺酮为底物，将底物肾上腺酮加入生物不对称转化体系，然后加入乙醇脱氢酶和辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），催化底物肾上腺酮中羰基的不对称还原，最后从生物不对称转化系统中分离纯化反应产物R-肾上腺素。该反应除了可以在水相中进行，还可以在有机相，双水相，离子液体和固定化体系中进行。

本发明的显著优点是：本发明的R-肾上腺素制备方法专一性强、产率高、操作简单、成本低廉、目标产物易分离。所采用的乙醇脱氢酶生物不对称转化R-肾上腺素的方法，不仅能获得高纯度的R-肾上腺素，而且生产成本比现有的低廉，并且产物无需拆分，是一种具有广泛应用前景的生产方法，可以满足迅速发展的医药工业的需求。

附图说明

图1为转化产物肾上腺素高效液相色谱图；

图2 为转化产物肾上腺素高效毛细管电泳图；

图3 为肾上腺素标准品（A）及转化产物肾上腺素（B）质谱图。

具体实施方式

本发明提供的乙醇脱氢酶生物不对称转化R-肾上腺素的方法主要用于制备R-肾上腺素，所述制备方法步骤为：在100 mL的锥型瓶中，加入5～120 mmol/L的底物肾上腺酮(购自Sigma公司)，1～10 mmol/L的辅酶NADH（购自Roche公司），再加入1～5mL乙醇脱氢酶(购自Sigma公司)启动反应，其余部分用50 mmol/L磷酸缓冲液补足。32～40℃水浴锅保温15～24 h后，离心除去乙醇脱氢酶，得R-肾上腺素水溶液，经减压干燥得R-肾上腺素。

其中，减压干燥条件为45～70℃，0.05～0.08 Mpa ，最佳条件为55℃，0.07 MPa。

转化的温度为32～40℃，最佳温度为35℃。

辅酶NADH浓度为1～10 mmol/L，乙醇脱氢酶用量为1～5mL。

底物肾上腺酮浓度为5～120 mmol/L。

以下本发明的几个具体实例，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

乙醇脱氢酶在离子液体中不对称转化R-肾上腺素

在100mL锥型瓶中首先加入50 mL由12.5％(V/V) C₄MImBF₄和磷酸缓冲液（50 mmol/L, pH 7.0）组成的混合溶剂，然后加入底物肾上腺酮（5mmol/L），辅酶NADH(2mmol/L）和乙醇脱氢酶（1.5mL），置锥型瓶于恒温振荡培养箱中(35℃, 160 r/min)保温15 h后，得产物R-肾上腺素。R-肾上腺素浓度采用反相离子对高效液相色谱法测定，其中流动相为甲醇∶醋酸钠-醋酸缓冲液（15∶85, V/V），庚烷磺酸钠(5mmol/L)为离子对试剂，流速1.0mL/min，检测波长233nm，柱温25℃。其中底物肾上腺酮的转化率为96.74％，R-肾上腺素的得率为55.8％（如图1所示）。产物肾上腺素的光学纯度（e.e）采用毛细管电泳分析。电泳条件为：分离电压10 kV；分离柱温250C；进样压力3.0×103 Pa，进样时间10 sec；紫外检测波长214 nm。标准样品用超纯水配制（Milli.-Qii型超纯水系统）。毛细管预处理为：每次使用前分别用超纯水(13.78×104Pa)淋洗5min、0.1mol/L NaOH（6.89×104Pa）淋洗5min、超纯水淋洗5min。每次进样前用超纯水和缓冲液各淋洗3min。其中R-肾上腺素的e.e值为99.8％（如图2所示）。R-肾上腺素的分子量采用Finnigan MATLCQ^TM 离子阱电喷雾质谱仪测定。质谱检测采用正离子模式，离子阱条件为：喷雾电压 5 KV, 壳气，辅助气为N₂。金属毛细管的温度为270℃，金属毛细管的电压为16 KV。肾上腺素在电喷雾电离条件下容易得到质子而带正电荷，侧链N原子具有吸质子的特性，样品通过静电场以后，得到的质子很容易结合到N原子上，形成准分子离子峰[M＋H]⁺ ，图3为肾上腺素标准品（A）及本实验得到的转化产物R-肾上腺素（B）的质谱图，A图中出现的m/z184.1强离子峰和B图中出现的m/z184.2强离子峰应该都属于准分子离子[M＋H]⁺，肾上腺素的标准分子量为183.2，A和B的保留时间（A为2.16 min，B为2.10 min）也基本一致，表明实验得到的转化产物是R-肾上腺素。

实施例2

乙醇脱氢酶在聚乙二醇/(NH₄)₂SO₄ 双水相体系中不对称转化R-肾上腺素

在250 ml 的锥型瓶中，先加入 50 ml 溶有浓度为0.004 mol/L的β-环糊精的肾上腺酮水溶液（肾上腺酮浓度为 120 mmol/L），再加入20 ml 质量分数为30 %的PEG2000 溶液，磁力搅拌器摇匀后，加入质量分数为 20 %的(NH₄)₂ SO₄ 和10 mM辅酶NADH以及2.5 mL乙醇脱氢酶, 加入 5 ml NaH₂PO₄-H₃PO₄缓冲液调节体系的pH(6.5～7.0)值后，静置于35 ℃的恒温振荡培养箱中反应20 h, 待溶液分相完全后，分离上下相。R-肾上腺素和乙醇脱氢酶主要分布在PEG 相中，利用Sephadex G-100凝胶层析进行肾上腺素和乙醇脱氢酶，以及PEG2000的分离，具体步骤为：首先称取3 g 葡聚糖凝胶（Sephadex G-25）于沸水中煮沸5 h后冷却，充分溶胀后的凝胶反复倾泻去掉表面悬浮的小颗粒，如此反复洗涤2-3次，最后加入等体积pH 7.0磷酸缓冲液备用。接着取玻璃层析柱垂直固定在铁架台上，将层析柱下端的止水螺丝旋紧，向柱中加入50 mM磷酸缓冲液（约1/3柱床高度），调节流速1滴/10 s。待柱中剩余约0.5 cm磷酸缓冲液时，关掉恒流泵，将溶胀好的凝胶浓浆液缓慢倒入柱中，待凝胶沉积约1～2 cm高度后打开出水口，控制一定流速，使凝胶一直处于溶液中。然后关闭出水口，静置片刻，使凝胶完全沉降。接着用50 mM磷酸缓冲液冲洗洗脱凝胶层析柱，然后平衡20 min。最后将PEG 相中的样品小心加入到柱床表面，然后打开恒流泵，不断向柱内加50 mM磷酸缓冲液进行洗脱，由于R-肾上腺素是小分子化合物，最先被洗脱出来，收集R-肾上腺素洗脱液，放入减压干燥箱内减压干燥，减压干燥箱的工作条件为55℃，0.07 Mpa，产物纯度为99.5%。

实施例3

乙醇脱氢酶在有机相中不对称转化R-肾上腺素

以氯仿为有机相，首先在锥型瓶中加入100ml氯仿，然后加入0.6ml磷酸缓冲液，以确保乙醇脱氢酶保持活性三维结构状态所需要的最少含水量。在此基础上，添加底物肾上腺酮25mmol/L，辅酶NADH 3 mmol/L和乙醇脱氢酶1.5 ml。加入TW-80 0.8ml和DMSO 0.6ml以提高乙醇脱氢酶的反应活性，然后把锥型瓶放置在35 ℃，180r/min的恒温振荡培养箱中反应18 h，离心除去乙醇脱氢酶后，放入减压干燥箱内减压干燥去除溶剂，减压干燥箱的工作条件为65℃，0.07 Mpa。乙醇脱氢酶在氯仿中不对称转化R-肾上腺素的得率为65.3％，产物纯度为99.4%。

实施例4

聚N-异丙基丙烯酰胺固定化乙醇脱氢酶不对称转化R-肾上腺素

在100克水中，加入N-异丙基丙烯酰胺10g, 甲基丙烯酸钠0.5克, N,N -亚甲基双丙基丙烯酰胺0.005克，乙醇脱氢酶2.0 ml。然后加入过硫酸铵(0.01克)及偏重硫酸钠(0.02克)启动聚合反应。整个反应始终是在25 ℃下进行，并充以氮气以消除因氧气而引发的链终止。24 h可得含有乙醇脱氢酶的N-异丙基丙烯酰胺与甲基丙烯酸钠共聚的凝胶。将凝胶切成直径约为 10 mm、高约为 5 mm的圆柱体后，放在蒸馏水中浸泡 4h，以去除反应剩余物及杂质。浸泡后的凝胶放入温度为50 ℃的烘箱干燥，干燥1d后备用。然后称取10 g含有乙醇脱氢酶的N-异丙基丙烯酰胺与甲基丙烯酸钠的共聚凝胶，放入250ml 的锥型瓶中，分别加入水50 ml，底物肾上腺酮50mmol/l，辅酶NADH 1 mmol/L。静置于35 ℃的恒温振荡培养箱中反应20 h，反应完毕后，用棉沙布过滤含有乙醇脱氢酶的N-异丙基丙烯酰胺与甲基丙烯酸钠的共聚凝胶，收集过滤液，离心去除从凝胶中渗漏出来的乙醇脱氢酶后，收集离心上清液，置于减压干燥箱内减压干燥，减压干燥箱的工作条件为55℃，0.07 MPa。

Claims

1.一种生物不对称转化制备R-肾上腺素的方法，其特征在于：首先将底物肾上腺酮加入锥型瓶中，然后加入辅酶NADH和乙醇脱氢酶，催化底物肾上腺酮中羰基的不对称还原，反应最终产物经减压干燥得R-肾上腺素；所述减压干燥条件为45～70℃，0.05～0.08 Mpa；所述辅酶NADH的浓度为1～10 mmol/L，乙醇脱氢酶的用量为1～5 ml；所述生物不对称转化的最佳温度为35℃。

2.根据权利要求1所述的生物不对称转化制备R-肾上腺素的方法，其特征在于：所述减压干燥条件为55℃，0.07 Mpa。

3.根据权利要求1所述的生物不对称转化制备R-肾上腺素的方法，其特征在于：生物转化时间为15～24 h。

4.根据权利要求1所述的生物不对称转化制备R-肾上腺素的方法，其特征在于：所述底物肾上腺酮的浓度为5～120 mmol/L。