CN104404093A - 一种生物不对称转化制备r-苯乙醇胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术与生物医药领域，更具体涉及一种生物不对称转化制备R-苯乙醇胺的方法。该方法能够选择性地将底物苯乙酮胺不对称转化为R-苯乙醇胺，所制得的R-苯乙醇胺纯度高，产物无需拆分，并且该制备方法成本低，污染少。该方法利用苯乙醇胺醇脱氢酶催化底物苯乙酮胺中羰基的不对称还原成为R-苯乙醇胺。本发明的R-苯乙醇胺制备方法专一性强、产率高、操作简单、成本低廉、目标产物易分离。本发明所采用的苯乙醇胺醇脱氢酶生物不对称转化R-苯乙醇胺的方法，不仅能获得高纯度的R-苯乙醇胺，而且生产成本比现有的低廉，并且产物无需拆分，是一种具有广泛应用前景的生产方法，可以满足迅速发展的医药工业的需求。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术与生物医药领域，更具体涉及一种生物不对称转化制备R-苯乙醇胺的方法。
背景技术
苯乙醇胺（Phenylethanolamine）,化学名为2-苯基-2-羟基乙胺，是一种重要的药物合成前体，可用于合成β-受体阻滞剂类心血管药物，多巴、儿茶酚胺类神经系统药物和抗哮喘的氨哮素等邻羟基胺类药物。许多在化学结构上属于苯乙醇胺类化合物的药物，羟基连接的手性碳原子构型决定着该类化合物的生物学功能，通常R型对映有效，而S型对映体往往低效、无效甚至有毒副作用。如沙丁醇胺（salbutamol）,其R型对映体具有抗哮喘作用，药效为外消旋体的80倍，而S型对映体则具有使气管收缩的作用。因此，制备光学纯的手性苯乙醇胺类药物具有重要意义。
目前，单一对映体(R)-苯乙醇胺的制备均为其外消旋体的手性拆分，国内对于（R）-苯乙醇胺的生物不对称合成报道甚少，本专利得用生物酶转化方来制备(R)-苯乙醇胺，为手性药物的合成提供了一条新的绿色途径，对光学纯的苯乙醇胺类药物的研究和开发具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物不对称转化制备R-苯乙醇胺的方法，该方法能够选择性地将底物苯乙酮胺不对称转化为R-苯乙醇胺，所制得的R-苯乙醇胺纯度高，产物无需拆分，并且该制备方法成本低，污染少。
本发明的生物不对称转化制备R-苯乙醇胺的方法，是利用苯乙醇胺醇脱氢酶催化底物苯乙酮胺（C6H5COCH2NH2）中羰基的不对称还原成为R-苯乙醇胺。首先将底物苯乙酮胺加入反应瓶中，然后加入辅酶NADH和苯乙醇胺醇脱氢酶，催化底物苯乙酮胺中羰基的不对称还原，反应最终产物经减压干燥得R-苯乙醇胺。
苯乙酮胺的结构式为： 。
所述生物不对称转化的时间为12～25 h。最佳生物不对称转化的时间为16 h。
所述生物不对称转化的温度为25～40℃。所述生物不对称转化的最佳温度为32℃。
所述辅酶NADH的浓度为2～12 mmol/L，苯乙醇胺醇脱氢酶的用量为1～10 ml。当苯乙醇胺醇脱氢酶用量为5 ml 时，辅酶NADH的最佳浓度为5mmol/L。
所述底物苯乙酮胺的浓度为15～110 mmol/L。底物苯乙酮胺的最佳浓度为80 mmol/L。
所述减压干燥的条件为50～85℃，0.05～0.09 Mpa，在五氧化二磷干燥器中减压干燥6 h。
本发明所提反应除了可以在水相中进行，还可以在有机相，双水相，离子液体和固定化体系中进行。
本发明的显著优点是： R-苯乙醇胺制备方法专一性强、产率高、操作简单、成本低廉、目标产物易分离。所采用的苯乙醇胺醇脱氢酶生物不对称转化R-苯乙醇胺的方法，不仅能获得高纯度的R-苯乙醇胺，而且生产成本比现有的低廉，并且产物无需拆分，是一种具有广泛应用前景的生产方法，可以满足迅速发展的医药工业的需求。
附图说明
图1为苯乙醇胺标准品（A）及转化产物（B）毛细管电泳图。
具体实施方式
以下本发明的几个具体实例，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
R-苯乙醇胺醇脱氢酶在离子液体C2OHMIM·NO3中不对称转化R-苯乙醇胺
在250mL锥型瓶中首先加入50 mL由12.5％(V/V) C2OHMIM·NO3和磷酸缓冲液（50 mmol/L, pH 7.2）组成的混合溶剂，然后加入底物苯乙酮胺（50mmol/L），辅酶NADH(5mmol/L）和苯乙醇胺醇脱氢酶（购自福州化玻科教仪器有限公司）（1.5mL），置锥型瓶于恒温振荡培养箱中(32℃, 160 r/min)，保温16 h后，得产物R-苯乙醇胺。R-苯乙醇胺的光学纯度（e.e）采用毛细管电泳分析。电泳条件为：分离电压10 kV；分离柱温25 ℃；进样压力3.0×103 Pa，进样时间10 sec；紫外检测波长220 nm。 标准样品用超纯水配制（Milli.-Qii型超纯水系统）。毛细管预处理为：每次使用前分别用超纯水(13.78×104Pa)淋洗5min、0.1mol/L NaOH（6.89×104Pa）淋洗5min、超纯水淋洗5min。每次进样前用超纯水和缓冲液各淋洗3min。其中R－苯乙醇胺的e.e值为99.8％，转化率为85.41%(如图1所示）。
实施例2
环氧功能化载体固定化苯乙醇胺醇脱氢酶不对称转化R-苯乙醇胺
将2.0g聚氧乙烯醚-聚氧丙烯醚-聚氧乙烯醚在35℃溶解于45.0mL1.3mol/L的HCl溶液中,加入一定量的正硅酸乙酯,搅拌均匀后转入晶化釜,在100℃晶化24h,过滤、洗涤并干燥后,经程序升温至550℃,煅烧6h得到载体原粉.取1.0g载体原粉,置于50mL三颈瓶中,加入0.5mL 3-含氧缩水甘油基丙基三甲氧基硅烷和20mL甲苯,于110℃油浴及氮气气氛下回流24h.样品经过滤、甲苯洗涤和乙醇索氏提取后于60℃干燥,所得环氧基功能化分子筛用JP-01表示.将真空干燥的载体JP-01加入到0.1mol/L，pH=7.8的磷酸盐缓冲溶液中,浸润10min,再加入0.6ml（R）-苯乙醇胺醇脱氢酶溶液,于30℃水浴摇床中振荡72h.得到固定化酶。
称取10 g上述固定化酶，放入250ml 的锥型瓶中，分别加入水50 ml，底物苯乙酮胺50mmol/l，辅酶NADH 1 mmol/L。静置于32 ℃的恒温振荡培养箱中反应16 h，反应完毕后，用棉沙布过滤环氧功能化载体固定化酶，收集过滤液，离心去除从载体中渗漏出来的苯乙醇胺醇脱氢酶后，收集离心上清液，置于五氧化二磷减压干燥箱减压干燥6 h，减压干燥箱的工作条件为60℃，0.08 Mpa。
实施例3
苯乙醇胺醇脱氢酶在氯仿中不对称转化R-苯乙醇胺
以氯仿为有机相，首先在锥型瓶中加入100ml氯仿，然后加入0.6ml磷酸缓冲液，以确保苯乙醇胺醇脱氢酶保持活性三维结构状态所需要的最少含水量。在此基础上，添加底物苯乙酮胺25mmol/L，辅酶NADH 3 mmol/L和苯乙醇胺醇脱氢酶1.5 ml。加入TW-80 0.8ml和DMSO 0.6ml以提高苯乙醇胺醇脱氢酶的反应活性，然后把锥型瓶放置在32 ℃，180r/min的恒温振荡培养箱中反应16 h，离心除去R-苯乙醇胺醇脱氢酶后，放入五氧化二磷减压干燥箱减压干燥6h去除溶剂，减压干燥箱的工作条件为60℃，0.08 Mpa。苯乙醇胺醇脱氢酶在氯仿中不对称转化R-苯乙醇胺的得率为70％，产物纯度为99.5%。
实施例4
苯乙醇胺醇脱氢酶在聚乙二醇/(NH4)2SO4 双水相体系中不对称转化R-苯乙醇胺
在250 ml 的锥型瓶中，先加入 50 ml 溶有浓度为0.004 mol/L的β-环糊精的苯乙酮胺水溶液（苯乙酮胺浓度为 120 mmol/L），再加入20 ml 质量分数为30 %的PEG2000 溶液，磁力搅拌器摇匀后，加入质量分数为 20 %的(NH4)2 SO4 和10 mM辅酶NADH以及2.5 Ml R-苯乙醇胺醇脱氢酶, 加入 5 ml NaH2PO4-H3PO4缓冲液调节体系的pH(6.5～7.0)值后，静置于32 ℃的恒温振荡培养箱中反应28 h, 待溶液分相完全后，分离上下相。R-苯乙醇胺和苯乙醇胺醇脱氢酶主要分布在PEG 相中，利用Sephadex G-100凝胶层析进行R-苯乙醇胺和苯乙醇胺醇脱氢酶，以及PEG2000的分离，具体步骤为：首先称取3 g 葡聚糖凝胶（Sephadex G-25）于沸水中煮沸5 h后冷却，充分溶胀后的凝胶反复倾泻去掉表面悬浮的小颗粒，如此反复洗涤2-3次，最后加入等体积pH 7.0磷酸缓冲液备用。接着取玻璃层析柱垂直固定在铁架台上，将层析柱下端的止水螺丝旋紧，向柱中加入50 mM磷酸缓冲液（约1/3柱床高度），调节流速1滴/10 s。待柱中剩余约0.5 cm磷酸缓冲液时，关掉恒流泵，将溶胀好的凝胶浓浆液缓慢倒入柱中，待凝胶沉积约1～2 cm高度后打开出水口，控制一定流速，使凝胶一直处于溶液中。然后关闭出水口，静置片刻，使凝胶完全沉降。接着用50 mM磷酸缓冲液冲洗洗脱凝胶层析柱，然后平衡20 min。最后将PEG 相中的样品小心加入到柱床表面，然后打开恒流泵，不断向柱内加50 mM磷酸缓冲液进行洗脱，由于R-苯乙醇胺是小分子化合物，最先被洗脱出来，收集R-苯乙醇胺洗脱液，放入五氧化二磷减压干燥箱减压干燥6h，减压干燥箱的工作条件为60℃，0.08 Mpa，产物纯度为99.7%。
Claims (10)
1.一种生物不对称转化制备R-苯乙醇胺的方法，其特征在于：首先将底物苯乙酮胺加入反应瓶中，然后加入辅酶NADH和苯乙醇胺醇脱氢酶，催化底物苯乙酮胺中羰基的不对称还原，反应最终产物经减压干燥得R-苯乙醇胺。
2.根据权利要求1所述的生物不对称转化制备R-苯乙醇胺的方法，其特征在于：生物不对称转化的时间为12～25 h。
3.根据权利要求2所述的生物不对称转化制备R-苯乙醇胺的方法，其特征在于：最佳生物不对称转化的时间为16 h。
4.根据权利要求1所述的生物不对称转化制备R-苯乙醇胺的方法，其特征在于：所述生物不对称转化的温度为25～40℃。
5.根据权利要求4所述的生物不对称转化制备R-苯乙醇胺的方法，其特征在于：所述生物不对称转化的最佳温度为32℃。
6.根据权利要求1所述的生物不对称转化制备R-苯乙醇胺的方法，其特征在于：所述辅酶NADH的浓度为2～12 mmol/L，苯乙醇胺醇脱氢酶的用量为1～10 ml。
7.根据权利要求6所述的生物不对称转化制备R-苯乙醇胺的方法，其特征在于：当苯乙醇胺醇脱氢酶用量为5 ml 时，辅酶NADH的最佳浓度为5mmol/L。
8.根据权利要求1所述的生物不对称转化制备R-苯乙醇胺的方法，其特征在于：所述底物苯乙酮胺的浓度为15～110 mmol/L。
9.根据权利要求8的生物不对称转化制备R-苯乙醇胺的方法，其特征在于：底物苯乙酮胺的浓度为80 mmol/L。
10.根据权利要求1所述的生物不对称转化制备R-苯乙醇胺的方法，其特征在于：所述减压干燥的条件为50～85℃，0.05～0.09 Mpa，在五氧化二磷干燥器中减压干燥6 h。
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 刘振杰: "苯乙醇胺手性合成的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）工程科技辑》 * |
| 叶勇: "《制药工艺学》", 28 February 2014, 华南理工大学出版社 * |
| 王佳亮等: "利用完整细胞不对称合成R－苯乙醇胺的研究", 《生物工程学报》 * |
| 黄量等: "《手性药物的化学与生物学》", 31 December 2002, 化学工业出版社 * |
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