CN101899013B - 2-(2-取代芳基-2h-1,2,4-三唑-3-巯基)乙酰胺衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，具体公开了一类如通式I所示的2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺衍生物、其N-氧化物、立体异构体形式、立体异构体混合物和药学上可接受的盐、其水合物和溶剂化物，其多晶和共晶，其同样生物功能的前体和衍生物，其制备方法以及含有一个或多个此类化合物的组合物在治疗和预防人免疫缺陷病毒(HIV)感染药物中的应用。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一类2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺衍生物及其药用盐，其水合物和溶剂化物，其多晶和共晶，其同样生物功能的前体药物和衍生物，其制备方法以及含有一个或多个此类化合物的组合物在治疗和预防人免疫缺陷病毒(HIV)感染药物中的应用。
背景技术
人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)是艾滋病(AIDS)的主要病原体。自1981年发现以来，艾滋病已成为危害人类生命健康的重大传染性疾病。虽然目前高效抗逆转录疗法(HAART)的实施是抗艾滋病治疗的一项重大突破，但是由于耐药性的出现及长期服药的毒性问题极大地限制了该疗法的应用，新型抗艾滋病药物的研发刻不容缓。逆转录酶在病毒整个生命周期中起着关键作用，靶向于HIV-1RT非底物结合位点的非核苷类抑制剂(NNRTIs)具有高效、低毒的优点，成为HAART疗法的重要组成部分。但是由于NNRTIs结合位点的氨基酸易发生突变，导致耐药毒株的蔓延，使该类药物迅速丧失临床效价。因此研发新型、高效抗耐药的NNRTIs是目前抗艾滋病药物研究的重要方向之一。参见《抗艾滋病药物研究》，刘新泳主编，人民卫生出版社，北京，2006，12。
五元杂环化合物具有广泛的抗HIV活性，它们在HIV非核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂、CCR5抑制剂、gp41抑制剂、Rev抑制剂等的研究中发挥重要作用。它们广泛应用于新型抗HIV先导化合物的发现及结构优化，一是作为构成药效团的基本结构母核，以适合药物特殊作用靶点的空间要求，二是作为活性取代基或环系的组成部分而产生相应的生物活性。药物之所以依赖于杂环是因为杂环较脂肪或芳香化合物在体内更不易代谢分解，且具有更好的生物相容性。
1，2，4-三唑巯乙酰胺类化合物是最近通过高通量筛选得到的一类新型、广谱高效的非核苷类HIV-1逆转录酶抑制剂，其中化合物VRX-480773和RDEA-806正处于临床研究(其中RDEA-806正处于IIa期临床试验)，它在极低浓度下就能抑制对EFV及大多数NNRTI产生耐药的病毒株，而且表现出较高的生物利用度及优秀的药代动力学性质，进一步的临床研究正在进行中，有望成为新的抗艾滋病药物。(参见①Wang Z，et al.Bioorg Med Chem Lett.2006，16(16)：4174-7.②De La Rosa M，et al.Bioorg Med Chem Lett.2006，16(17)：4444-9.③ZhangZ，et al.Antimicrob Agents Chemother.2007，5l(2)：429-37.④Rossotti R，et al.HIV Ther.2009，3(1)，66-77.)
因此，以该类骨架化合物为模板，进行广泛的结构修饰，对发现广谱高效、生物利用度好且具有自主知识产权的新型抗HIV药物具有重大意义。
发明内容
本发明提供了2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺衍生物及其制备方法，本发明还提供了2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺衍生物的活性筛选结果及其应用。
本发明的技术方案如下：
1.2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺衍生物
本发明以1，2，4-三唑巯乙酰胺类抗艾滋病临床候选药物为先导化合物，根据生物电子等排体药物设计原理，改变三唑环上氮原子的排布，由此设计合成了一系列全新结构骨架的具有通式I的2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺衍生物，以及其N-氧化物、立体异构体形式、立体异构体混合物或药学上可接受的盐，
其中，
与1，2，4-三唑直接相连芳基Ar1为结构多样性的取代苯环或取代萘环，优选的，Ar1为2，4-二氯苯环、2，4-二溴苯环、2-氯-4-环丙基苯环、2-溴-4-环丙基苯环、2-氯-4-叔丁基苯环、2-溴-4-叔丁基苯环、1-萘环、2-萘环、4-环丙基-1-萘环或4-叔丁基-1-萘环；
与酰胺相连的芳环Ar2为取代苯环或取代六元含氮芳杂环；
X、Y、Z为碳原子或氮原子；
R1为H、F、Cl、Br、I、NO2或Me；
R2为H、F、Cl、Br、I、Me、OCH3、COMe、COOMe、COOEt、COOH或SO2NH2。
2.2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺衍生物的合成路线如下：
其中，
与1，2，4-三唑直接相连芳基Ar1为结构多样性的取代苯环或取代萘环，优选的，Ar1为2，4-二氯苯环、2，4-二溴苯环、2-氯-4-环丙基苯环、2-溴-4-环丙基苯环、2-氯-4-叔丁基苯环、2-溴-4-叔丁基苯环、1-萘环、2-萘环、4-环丙基-1-萘环或4-叔丁基-1-萘环；
与酰胺相连的芳环Ar2为取代苯环或取代六元含氮芳杂环；
X、Y、Z为碳原子或氮原子；
R1为H、F、Cl、Br、I、NO2或Me；
R2为H、F、Cl、Br、I、Me、OCH3、COMe、COOMe、COOEt、COOH或SO2NH2。
试剂及条件：(i)HCOCO2H，H2O；(ii)DPPA，TEA，Tol；(iii)POCl3；(iv)NaH，HSCH2COOEt，THF；(v)NaOH，H2O/DMSO，HCl；(vi)PCl5，芳胺，THF，室温.
3.中间体2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑3-巯基)乙酸(6)的制备方法
在搅拌下，向取代芳基肼1(27.7mmol)的水(15mL)溶液中，加入2-乙醛酸(4.5g，30.5mmol，50％)和水(5mL)的混合溶液，再加入3mL浓盐酸；将生成的沉淀过滤，干燥，得2-(2-芳基肼叉)乙酸2；
在中间体2(12.9mmol)的无水甲苯(80mL)悬浊液中，搅拌下加入1.8mL三乙胺(1.3g，12.9mmol)和2.8mL二苯基磷酰叠氮(3.6g，12.9mmol)；混合物缓慢的加热到回流，到60℃时开始有气体生成，持续1h左右；将反应完毕后澄清的橙色溶液冷却，倾入100mL10％的氢氧化钾溶液中；碱液中的提取物用浓盐酸酸化，析出固体，抽滤，乙酸乙酯-正己烷重结晶得到2-芳基-2H-1，2，4-3(4H)-三唑3；
中间体3(1mmol)和三氯氧磷(5mL)的混合物在搅拌回流10h，薄层层析(TLC)检测反应完毕后，冷却，旋干溶剂，残余物于40mL乙酸乙酯溶解。将有机相用水、饱和NaHCO3溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩滤液得5-氯-1-取代芳基-1H-1，2，4-三唑4粗品，不经纯化直接用于下一步合成中；
将5-氯-1-取代芳基-1H-1，2，4-三唑4(2mmol)加入到2-巯基乙酸乙酯(0.23mL，2.1mmol)和氢化钠(NaH)(0.084g，2.1mmol)的四氢呋喃(THF)(10mL)溶液中。混合物在0℃下搅拌10min，然后加热回流，TLC检测反应完全，旋蒸除去溶剂，加入30mL二氯甲烷稀释，连续用水(2×30mL)、饱和的碳酸氢钠和氯化钠溶液洗涤。有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩滤液得到三唑巯乙酰胺5粗品。
将三唑巯乙酰胺5(1.2mmol)溶解于1mL二甲基亚砜(DMSO)中，加入1N的NaOH水溶液(2.0mL，2.0mmol)。室温搅拌1h，再用1N的HCl酸化，加入100mL乙酸乙酯稀释，连续用水和饱和氯化钠溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩得2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酸6粗品，纯度足以进行下一步反应，不必纯化。
4.2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺衍生物(7)的制备方法
利用上述中间体2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酸6，通过与各种取代芳胺的酰化反应，然后经柱层析分离纯化得到2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺衍生物，具体步骤如下：
冰浴搅拌下将五氯化磷(PCl5)(0.23g，1.1mmol)加入到2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酸6(1mmol)的乙醚(15mL)溶液中。室温下搅拌2h，减压浓缩后，溶解到15mL四氢呋喃(THF)中，依次加入1mmol芳胺和1.2mmol三乙胺。混合物在室温下继续搅拌，TLC检测反应完全，旋干，得到的粗产品，用乙酸乙酯∶石油醚(1∶4)快速柱层析得到目标化合物7。
上述的各种取代芳胺的结构通式II为：
其中，X、Y、Z为碳原子或氮原子；R1为H、F、Cl、Br、I、NO2或Me；R2为H、F、Cl、Br、I、Me、OCH3、COMe、COOMe、COOEt、COOH或SO2NH2。
5.目标化合物的抗HIV-1(IIIB)及耐药毒株活性和毒性实验
对按照上述方法合成的15个化合物进行了抗HIV-1(IIIB)活性筛选，它们的抗HIV-1活性和毒性数据列于表1中，并以奈韦拉平(NVP)和AZT为对照。由表1可以看出新型三唑巯乙酰胺类化合物呈现出显著的抗野生型HIV活性，其中有6个化合物抑制HIV-1复制的EC50值在微摩尔水平，这几个化合物依次是I-7a(EC50＝6.21+0.87μM，SI＝5)、I-7c(EC50＝4.85+0.83μM，SI＝20)、I-7e(EC50＝4.99±0.92μM，SI＝20)、I-7g(EC50＝2.78±0.97μM，SI＝67)、I-7l(EC50＝4.13+0.41μM，SI＝14)和I-7m(EC50＝4.68+0.72μM，SI＝7)。此外化合物I-7d和I-7h也表现出一定程度的抗HIV活性。
同时对部分新型三唑巯乙酰胺类化合物进行了多种抗耐药株活性筛选，结果发现，上述对野生型HIV的EC50处在微摩尔级的6个化合物也对E138K、K103N及L100I耐药株具有显著的抑制活性，EC50大约为7-28μM之间(如表2所示)。而对F227L+V106A、RES056、Y181C及Y188L耐药株无活性。
由于该类化合物仅对HIV-1呈现出抑制活性，而对HIV-2无活性，可认为是经典的非核苷类抑制剂。
2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺衍生物是一系列结构新颖的非核苷类HIV-1抑制剂，具有进一步的研发价值，可作为抗HIV的先导化合物加以利用。
本发明的2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺衍生物可作为HIV-1非核苷类抑制剂应用。具体地说，作为HIV-1抑制剂用于制备抗艾滋病药物。
一种抗HIV-1药物组合物，包括本发明的2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺衍生物。
表1化合物I-7a～I-7o的结构及抗HIV-1(IIIB)的活性和毒性(MT-4细胞)
注：aEC50：保护50％感染HIV-1的MT-4细胞免于细胞病变的化合物浓度；bCC50：使50％未感染HIV-1的细胞发生病变的化合物浓度；c选择性系数：CC50/EC50的比值；dNA：无活性。
表2部分化合物对耐药株的抑制活性
注：aEC50：保护50％感染HIV-1(耐药株)的MT-4细胞免于细胞病变的化合物浓度；bCC50：使50％未感染HIV-1的细胞发生病变的化合物浓度；c选择性系数：CC50/EC50的比值；dNA：无活性。
本发明提供了全新结构的2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺衍生物、其制备方法、抗HIV活性筛选结果及其作为抗HIV抑制剂的首次应用。通过实验证明本发明的2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺衍生物可作为HIV-1非核苷类抑制剂应用。具体地说，作为HIV-1抑制剂用于制备抗艾滋病药物。
具体实施方式
通过下述实例有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容，在下列实例中，所有目标化合物的编号与表1相同。
实施例1.中间体2-(2-(2，4-二氯苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酸I-6的制备
在搅拌下，向2，4-二氯苯肼I-1(4.9g，27.7mmol)的水(15mL)溶液中，加入2-乙醛酸(4.5g，30.5mmol，50％)和水(5mL)的混合溶液，再加入3mL浓盐酸。将生成的沉淀过滤，干燥，得到4.8g 2-(2-(2，4-二氯苯基)肼叉)乙酸I-2为黄色固体，产率：75％。mp：158℃.1HNMR(DMSO-d6，ppm)δ：6.91-7.05(m，3H，Ph)，7.55(s，1H，N＝CH)，10.5(s，1H，CO2H)，11.9(bs，1H，NH).ESI-MS：m/z 233.1(M+1).
在2-(2-(2，4-二氯苯基)肼叉)乙酸I-2(3.0g，12.9mmol)的无水甲苯(80mL)悬浊液中，边搅拌边加入1.8mL三乙胺(1.3g，12.9mmol)和2.8mL二苯基磷酰叠氮(3.6g，12.9mmol)。混合物缓慢的加热到回流，到60℃时开始有气体生成，持续1h左右。将反应完毕后澄清的橙色溶液冷却，倾入100mL 10％的氢氧化钾溶液中。碱液中的提取物用浓盐酸酸化，析出固体，在乙酸乙酯和庚烷中重结晶得到2.55g 2-(2，4-二氯苯基)-2H-1，2，4-3(4H)-三唑I-3，为褐色固体，产率：86％。mp：189-190℃.1H-NMR(DMSO-d6，ppm)δ：12.1(s，1H，NH)，8.11(s，1H，三唑-H)，7.65(d，1H，J＝2.4Hz，PhH)，7.47(dd，1H，J1＝2.4Hz，J2＝8.4Hz，PhH)，7.39(d，1H，J＝8.4Hz，PhH).13C-NMR(DMSO-d6，ppm)δ：153.35，137.76，134.68，133.96，132.81，131.62，130.46，128.89.ESI-MS：m/z 230.4(M+1)，232.3(M+3).
2-(2，4-二氯苯基)-2H-1，2，4-3(4H)-三唑I-3(0.23g，1mmol)和三氯氧磷(5mL)的混合物在搅拌回流10h，TLC检测反应完毕后，冷却，旋干溶剂，残余物于40mL乙酸乙酯溶解。将有机相用水、饱和NaHCO3溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩滤液得到淡黄色固体，为5-氯-1(2，4-二氯苯基)-1H-1，2，4-三唑I-4粗品，直接用于下一步合成中。1H-NMR(DMSO-d6，ppm)δ：8.38(s，1H，三唑-H)，8.04(d，1H，J1＝2.4Hz，PhH)，7.84(dd，1H，J1＝2.4Hz，J2＝8.4Hz，PhH)，7.73(d，1H，J2＝8.4Hz，PhH).
将5-氯-1(2，4-二氯苯基)-1H-1，2，4-三唑I-4(0.5g，2mmol)加入到2-巯基乙酸乙酯(0.23mL，2.1mmol)和NaH(0.084g，2.1mmol)的THF(10mL)溶液中。混合物在0℃下搅拌10min，然后加热回流8h。反应完毕，旋蒸除去溶剂，加入30mL二氯甲烷稀释，连续用水(2×30mL)、饱和的碳酸氢钠和氯化钠溶液洗涤。有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩滤液得到I-5粗品黄色油状物。ESI-MS：m/z 232.3(M+1)，234.4(M+3).C12H11C12N3O2S(Exact Mass：330.99).
将I-5(0.4g，1.2mmol)于1mL二甲基亚砜(DMSO)中溶解，加入1N的NaOH水溶液(2.0mL，2.0mmol)。室温搅拌1h，再用1N的HCl酸化，加入100mL乙酸乙酯稀释，连续用水和饱和氯化钠溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩得到黄色油状物，即2-(2-(2，4-二氯苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酸I-6粗品0.35g，产率97％。
实施例2.N-(2-氯苯基)-2-(2-(2，4-二氯苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺I-7a的制备
将PCl5(0.23g，1.1mmol)加入到冰浴中的I-6(0.30g，1mmol)的乙醚(15mL)溶液中。室温下搅拌2h，减压浓缩后，溶解到15mL THF中，依次加入1mmol 2-氯苯胺和1.2mmol三乙胺。混合物在室温下继续搅拌，TLC检测反应完全，旋干，得到的产物乙酸乙酯∶石油醚(1∶4)快速柱层析得到目标化合物I-7a。白色针晶，产率：45.7％.熔点：118-121℃。
产物光谱分析数据：
1H NMR(CDCl3，ppm)δ：9.76(s，1H，NH)，8.33(d，1H，J＝8.4Hz，PhH)，8.08(s，1H，三唑-H)，7.60(d，1H，J＝2.4Hz，PhH)，7.43-7.26(m，4H，PhH)，7.05(dt，1H，PhH)，4.03(s，2H，S-CH2).ESI-MS：m/z 413.5(M+1)，415.4(M+3)，417.5(M+5)，435.4(M+Na).C16H11Cl3N4OS(411.97).
实施例3.2-(2-(2，4-二氯苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)-N-(2-氟苯基)乙酰胺I-7b的制备
操作同上，所不同的是使用2-氟苯胺。白色粉末，产率：50.4％.mp：108-110℃.
产物光谱分析数据：
1H NMR(CDCl3，ppm)δ：10.17(s，1H，NH)，8.34-8.31(m，1H，PhH)，8.11(s，1H，三唑-H)，7.61(d，1H，J＝2.4Hz，PhH)，7.41(dd，1H，J1＝2.4Hz，J2＝8.4Hz，PhH)，7.37(d，1H，J＝8.4Hz，PhH)，7.14-7.05(m，3H，PhH)，3.96(s，2H，S-CH2).ESI-MS：m/z 397.1(M+1)，399.0(M+3).C16H11Cl2FN4OS(396)。
实施例4.N-(2-溴苯基)-2-(2-(2，4-二氯苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺I-7c的制备
操作同上，所不同的是使用2-溴苯胺。白色方晶，产率：35.2％.mp：115-116℃.
产物光谱分析数据：
1H NMR(CDCl3，ppm)δ：9.55(s，1H，NH)，8.26(d，1H，J＝8.4Hz，PhH)，8.08(s，1H，三唑-H)，7.60(d，1H，J＝2.4Hz，PhH)，7.60(dd，1H，J1＝2.4Hz，J2＝8.4Hz，PhH)，7.54(dd，1H，J1＝2.4Hz，J2＝8.4Hz，PhH)，7.42(dd，1H，J1＝2.4Hz，J2＝8.4Hz，PhH)，7.37(d，1H，J＝8.4Hz，PhH)，7.05(dt，1H，PhH)，4.04(s，2H，S-CH2).
ESI-MS：m/z 457.0(M+1)，459.0(M+3).C16H11BrCl2N4OS(455.92).
实施例5.N-(2，4-二氯苯基)-2-(2-(2，4-二氯苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺I-7d的制备
操作同上，所不同的是使用2，4-二氯苯胺。白色针晶，产率：44.7％.mp：115-118℃.
产物光谱分析数据：
1H NMR(CDCl3，ppm)δ：9.90(s，1H，NH)，8.26(d，1H，J＝9.6Hz，PhH)，8.07(s，1H，三唑-H)，7.43-7.37(m，4H，PhH)，7.25(dd，1H，J1＝2.4Hz，J2＝8.4Hz，PhH)，4.04(s，2H，S-CH2).ESI-MS：m/z 447.1(M+1)，449.1(M+3).C16H10Cl4N4OS(445.93).
实施例6.N-(2-氯吡啶-3-基)-2-(2-(2，4-二氯苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺I-7e的制备
操作同上，所不同的是使用2-氯吡啶-3-胺。白色针晶，产率：65.4％.mp：143-145℃.
产物光谱分析数据：
1H NMR(DMSO，ppm)δ：10.15(s，1H，NH)，8.68(d，1H，J＝7.8Hz，吡啶-H)，8.28(d，1H，J1＝1.8Hz，PhH)，8.20(dd，1H，J＝1.2Hz，J＝4.8Hz，吡啶-H)，8.01(s，1H，三唑-H)，7.61(dd，1H，J1＝1.8Hz，J2＝8.4Hz，PhH)，7.40(d，1H，J2＝8.4Hz，PhH)，7.33-7.29(m，1H，吡啶-H)，4.28(s，2H，S-CH2).
ESI-MS：m/z 414.1(M+1)，416.1(M+3)，418.3(M+3)，436.3(M+Na+)，438.2(M+2+Na+).C15H10Cl3N5OS(412.97)。
实施例7.2-(2-(2，4-二氯苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)-N-(4-甲基-2-硝基苯基)乙酰胺I-7f的制备
操作同上，所不同的是使用4-甲基-2-硝基苯胺。浅黄色粉末，产率：37.4％.mp：185-186℃.
产物光谱分析数据：
1H-NMR(CDCl3，ppm)δ：11.07(s，1H，NH)，8.55(d，1H，J＝8.4Hz，PhH)，8.01(s，1H，三唑-H)，7.97(s，1H，PhH)，7.61(d，1H，J＝1.8Hz，PhH)，7.46-7.42(m，3H，PhH)，4.11(s，2H，S-CH2)，2.40(s，3H，CH3).
MS(ESI)：m/z 438.2(M+1)，540.1(M+3).C17H13Cl2N5O3S(437.01).
实施例8.2-(2-(2，4-二氯苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)-N-(2-硝基苯基)乙酰胺I-7g的制备
操作同上，所不同的是使用2-硝基苯胺。黄色针晶，产率：53.8％.mp：153-154℃.
产物光谱分析数据：
1H-NMR(CDCl3，ppm)δ：11.19(s，1H，NH)，8.68(d，1H，J＝8.4Hz，PhH)，8.18(dd，1H，J＝1.8Hz，J＝8.4Hz，PhH)，8.06(s，1H，三唑-H)，7.65(t，1H，PhH)，7.61(d，1H，J1＝1.8Hz，PhH)，7.46-7.42(m，2H，PhH)，7.22(m，1H，PhH)，4.13(s，2H，S-CH2).
MS(ESI)：m/z 424.1(M+1)，426.3(M+3).C16H11Cl2N5O3S(423).
实施例9.2-(2-(2，4-二氯苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)-N-邻甲苯基乙酰胺I-7h的制备
操作同上，所不同的是使用邻甲苯胺。白色片晶，产率：50.7％.mp：121-122℃.
产物光谱分析数据：
1H-NMR(CDCl3，ppm)δ：9.42(brs，1H，NH)，8.06(s，1H，三唑-H)，7.91(d，1H，J1＝7.8Hz，PhH)，7.61(d，1H，J＝2.4Hz，Ph’H)，7.43(dd，1H，J1＝7.8Hz，J2＝2.4Hz，PhH)，7.37(d，1H，J2＝2.4Hz，PhH)，7.22(t，1H，Ph’H)，7.18(d，1H，J＝7.2Hz，Ph’H)，7.08(t，1H，Ph’H)，3.96(s，2H，S-CH2)，2.27(s，3H，CH3).
MS(ESI)：m/z 393.1(M+1)，395.1(M+3).C17H14Cl2N4OS(392.03).
实施例10.N-(4-乙酰基-2-溴苯基)-2-(2-(2，4-二氯苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺I-7i的制备
操作同上，所不同的是使用4-乙酰基-2-溴苯胺。白色针晶，产率：55.4％.mp：131-133℃.
产物光谱分析数据：
1H-NMR(CDCl3，ppm)δ：9.27(s，1H，NH)，8.36(d，1H，J＝8.4Hz，Ph’H)，8.24(s，1H，Ph’H)，8.09(s，1H，三唑-H)，7.98(d，1H，J1＝1.2Hz，PhH)，7.91(d，1H，J＝8.4Hz，Ph’H)，7.64(dd，1H，J1＝1.2Hz，J2＝8.4Hz，PhH)，7.45(d，1H，J2＝8.4Hz，PhH)，3.85(s，2H，S-CH2)，2.58(s，3H，CH3).
MS(ESI)：m/z 199.1(M+1)，202.1(M+3)，204.1(M+5).C18H13BrCl2N4O2S(497.93)。
实施例11.N-(2-溴-4-甲基苯基)-2-(2-(2，4-二氯苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺I-7j的制备
操作同上，所不同的是使用2-溴-4-甲基苯胺。白色固体，产率：48.6％.mp：125-126℃.
产物光谱分析数据：
1H-NMR(CDCl3，ppm)δ：9.55(s，1H，NH)，8.17(d，1H，J＝8.4Hz，Ph’H)，8.04(s，1H，三唑-H)，7.88(d，1H，J1＝1.8Hz，PhH)，7.59(dd，1H，J1＝1.8Hz，J2＝8.4Hz，PhH)，7.43(s，1H，Ph’H)，7.38(d，1H，J＝8.4Hz，PhH)，7.20(s，1H，J＝8.4Hz，Ph’H)，3.57(s，2H，S-CH2)，2.39(s，3H，CH3).
MS(ESI)：m/z 471.2(M+1)，473.2(M+3).C17H13BrCl2N4OS(469.94)。
实施例12.N-(2-溴-4-氯苯基)-2-(2-(2，4-二氯苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺I-7k的制备
操作同上，所不同的是使用2-溴-4-氯苯胺。白色固体，产率：49.8％.mp：163-165℃。产物光谱分析数据：
1H-NMR(CDCl3，ppm)δ：9.67(s，1H，NH)，8.24(d，1H，J＝8.4Hz，Ph’H)，8.08(s，1H，三唑-H)，7.61(d，1H，J＝1.8Hz，PhH)，7.54(d，1H，J＝2.4Hz，Ph’H)，7.42(dd，1H，J1＝2.4Hz，J2＝8.4Hz，Ph’H)，7.38(d，1H，J＝8.4Hz，PhH)，7.28(dd，1H，J1＝1.8Hz，J2＝8.4Hz，PhH)，4.02(s，2H，S-CH2).
MS(ESI)：m/z 491.1(M+1)，493.1(M+3)，495.0(M+5).C16H10BrCl3N4OS(489.88).
实施例13.3-溴-4-(2-(2-(2，4-二氯苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰氨基)苯甲酸甲酯I-7l的制备
操作同上，所不同的是使用2-溴-4-甲氧羰基苯胺。白色针状晶体，产率：59.3％.mp：164-166℃.
产物光谱分析数据：1H-NMR(CDCl3，ppm)δ：9.84(s，1H，NH)，8.24(d，1H，J＝8.4Hz，Ph’H)，8.23(d，1H，J＝1.8Hz，Ph’H)，8.09(s，1H，三唑-H)，7.97(dd，1H，J1＝1.8Hz，J2＝8.4Hz，Ph’H)，7.61(d，1H，J＝2.4Hz，PhH)，7.41(dd，1H，J1＝2.4Hz，J2＝8.4Hz，PhH)，7.38(d，1H，J＝8.4Hz，PhH)，4.05(s，2H，S-CH2)，3.91(s，3H，OCH3).
MS(ESI)：m/z 515.3(M+1)，517.4(M+3)，537.0(M+Na+).C18H13BrCl2N4O3S(513.93).
实施例14.3-溴-4-(2-(2-(2，4-二氯苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺基)苯甲酸乙酯I-7m的制备
操作同上，所不同的是使用2-溴-4-乙氧羰基苯胺。白色针晶，产率：67.1％.mp：103-105℃。
产物光谱分析数据：
1H-NMR(CDCl3，ppm)δ：9.82(s，1H，NH)，8.45(d，1H，J＝8.4Hz，Ph’H)，8.23(d，1H，J＝1.8Hz，Ph’H)，8.09(s，1H，三唑-H)，7.99(dd，1H，J1＝1.8Hz，J2＝8.4Hz，Ph’H)，7.61(d，1H，J＝2.4Hz，PhH)，7.42(dd，1H，J1＝2.4Hz，J2＝8.4Hz，PhH)，7.38(d，1H，J＝8.4Hz，PhH)，4.36(s，2H，OCH2)，4.05(s，2H，S-CH2)，1.39(s，3H，CH3).
MS(ESI)：m/z 529.2(M+1)，531.1(M+3)，533.2(M+5)，551.2(M+Na+)，551.2(M+2+Na+).C19H15BrCl2N4O3S(527.94).
实施例15.4-(2-(2-(2，4-二氯苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺基)苯甲酸甲酯I-7n的制备
操作同上，所不同的是使用4-甲氧羰基苯胺。白色针晶，产率：68.2％.mp：153-154℃。
产物光谱分析数据：
1H-NMR(CDCl3，ppm)δ：10.43(s，1H，NH)，8.16(s，1H，三唑-H)，8.01(d，2H，J＝8.4Hz，Ph’H)，7.64(d，2H，J＝8.4Hz，Ph’H)，7.61(d，1H，J＝2.4Hz，PhH)，7.43(dd，1H，J1＝2.4Hz，J2＝8.4Hz，PhH)，7.37(d，1H，J＝8.4Hz，PhH)，3.90(s，2H，S-CH2)，3.88(s，3H，OCH3).
MS(ESI)：m/z 437.3(M+1)，439.3(M+3)，441.4(M+5)，559.3(M+Na+)，461.3(M+2+Na+).C18H14Cl2N4O3S(436.02).
实施例16.4-(2-(2-(2，4-二氯苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-巯基)乙酰胺基)苯甲酸乙酯I-7o的制备
操作同上，所不同的是使用4-乙氧羰基苯胺。白色针晶，产率：71.4％.mp：147-149℃.
产物光谱分析数据：
1H-NMR(CDCl3，ppm)δ：10.43(s，1H，NH)，8.16(s，1H，三唑-H)，8.01(d，2H，J＝8.4Hz，Ph’H)，7.63(d，2H，J＝8.4Hz，Ph’H)，7.61(d，1H，J＝2.4Hz，PhH)，7.42(dd，1H，J1＝2.4Hz，J2＝8.4Hz，PhH)，7.37(d，1H，J＝8.4Hz，PhH)，4.35(s，2H，OCH2)，4.04(s，2H，S-CH2)，1.41(s，3H，CH3).
MS(ESI)：m/z 451.2(M+1)，453.2(M+3)，455.1(M+5)，473.3(M+Na+)，475.3(M+2+Na+).C19H16Cl2N4O3S(450.03).
实施例17.目标化合物的体外抗HIV活性测试
(参见①Pauwels R，et al.J.Virol.Methods.1988，20，309.②Pannecouque C，et al.Nat Protocols2008，3，427.)
术语解释：
MT-4细胞：人急性淋巴母细胞白血病细胞。
MTT分析法：MTT即为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
Nevirapine(NVP)：抗艾滋病上市药物奈韦拉平。
AZT.抗艾滋病上市药物齐多夫定。
DMSO：二甲基亚砜。
测试原理
由于HIV感染的MT-4细胞在一定时间内(5-7天)会发生病变，因此向HIV感染的MT-4细胞悬浊液中加入适当浓度的待检测化合物溶液，经过一段时间(5-7天)的培养后，用MTT分析法测定MT-4细胞活力，得到保护50％细胞免于细胞病变的药物浓度(EC50)即可得出目标化合物的抗HIV的活性。同时得到目标化合物使50％未感染HIV的细胞发生病变的浓度(CC50)，计算出选择系数(selectivity index，SI＝CC50/EC50)。
MTT分析法原理：MTT即溴化-3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四唑氮，可与活的细胞内琥珀酸脱氢酶相结合，而不与死亡细胞发生反应。目前MTT法是一种快速、简洁反映细胞活力的酶分析方法。
测试材料和方法
(1)HIV-1(IIIB)、HIV-2(ROD)毒株、各种HIV-1耐药株：由比利时Leuven大学Rega研究院微生物与免疫学研究所提供。
(2)MT-4细胞：由比利时Leuven大学Rega研究院微生物与免疫学研究所提供。
(3)MTT：购自美国Sigma公司。
(4)样品处理：样品临用前溶于DMSO配成适当浓度，并用双蒸水作5倍稀释，各5个稀释度。
(5)阳性对照药：Nevirapine(NVP)、AZT。
(6)测试方法：样品稀释后加入到HIV感染MT-4细胞悬浊液中，经过一段时间后用MTT比色法测定细胞活力，于酶标仪中，在590nm下记录吸光度(A)值，计算出EC50，CC50以及SI。
(7)MTT染色法：加入样品培养一段时间后，再向每孔加入MTT溶液(5mg/ML)20μL，继续培养若干小时，弃染色液，并向每孔加入150μL DMSO，充分混合，于酶标仪中，在590nm下记录吸光度。
具体操作如下：将化合物用DMSO或水溶解后用磷酸盐缓冲液稀释，将3×105MT-4细胞与100μL不同浓度的化合物溶液在37℃共同预孵育1h。然后向该混合物中加入100μL适当浓度的病毒稀释液，将细胞于37℃孵育1h。洗涤三次后，将细胞再次分别悬浮于含有或不含化合物的培养基质中。接着将细胞在5％CO2环境中，于37℃下再孵育7天，并于感染后的第三天用含有或不含化合物的培养基质补充原培养液。每种培养条件都重复操作两次。对病毒的细胞病变作用每天都用反向光学显微镜监控。一般来讲，本实验中所用的病毒稀释液常常会在病毒感染后第五天发生细胞病变。药物抑制浓度以药物对病毒致细胞病变作用产生50％抑制作用而同时对细胞无直接毒性的浓度(EC50)表示。值得强调的是，当化合物水溶性较差，需要用DMSO才能溶解时，DMSO体积比浓度相对于水来讲，一般会低于10％(DMSO在MT-4细胞培养介质中最终浓度小于2％)。因为DMSO能影响测试化合物抗病毒活性，对含有相同浓度DMSO溶液的抗病毒活性对比空白实验也应该平行操作进行。另外，DMSO最终浓度(1/1000)远远低于影响HIV-1在T-细胞中复制所需浓度。
目标化合物的体外抗HIV-1(IIIB)、HIV-2(ROD)及多种耐药株活性筛选数据由比利时Leuven大学Rega研究院微生物与免疫学研究所提供，所有的活性数据都经过至少两次独立、平行的实验测得。
Claims (7)
1.具有通式I的2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-硫基)乙酰胺衍生物，以及其药学上可接受的盐，
其中，
X、Y、Z为碳原子或氮原子；
R1为Cl、Br、NO2、Me；
R2为H、Cl、COMe、COOEt；
与1，2，4-三唑直接相连芳基Ar1为2，4-二氯苯基。
2.如权利要求1所述的2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-硫基)乙酰胺衍生物，以及其药学上可接受的盐，其特征在于所述的药学上可接受的盐是盐酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐。
3.权利要求1所述的2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-硫基)乙酰胺衍生物的制备方法，步骤如下：
利用中间体2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-硫基)乙酸(6)，通过与各种连有R1及R2的芳胺的酰化反应，然后经柱层析分离纯化得到2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-硫基)乙酰胺衍生物，具体步骤如下：
冰浴搅拌下将1.1mmol五氯化磷加入到1mmol中间体(6)的15mL乙醚溶液中；室温下搅拌2h，减压浓缩后，溶解到15mL四氢呋喃中，依次加入1mmol连有R1及R2的芳胺和1.2mmol三乙胺；混合物在室温下继续搅拌，TLC检测反应完全，旋干，得到的粗产品，用质量比为1∶4的乙酸乙酯-石油醚快速柱层析得到目标化合物(7)；
上述的各种连有R1及R2的芳胺以及中间体(6)、目标化合物(7)的结构通式分别为：
其中，X、Y、Z、R1、R2、Ar1如权利要求1所定义。
4.权利要求3所述的2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-硫基)乙酰胺衍生物的制备方法，其中，中间体2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-硫基)乙酸(6)的制备步骤如下：
在搅拌下，向27.7mmol取代芳基肼(1)的15mL水溶液中，加入30.5mmol 50％的2-乙醛酸和5mL水的混合溶液，再加入3mL浓盐酸；将生成的沉淀过滤，干燥，得2-(2-芳基肼叉)乙酸(2)；
在12.9mmol中间体(2)的80mL无水甲苯悬浊液中，搅拌下加入12.9mmol三乙胺和12.9mmol二苯基磷酰叠氮；混合物缓慢的加热到回流，到60℃时开始有气体生成，持续1h；将反应完毕后澄清的橙色溶液冷却，倾入100mL10％的氢氧化钾溶液中；碱液中的提取物用浓盐酸酸化，析出固体，抽滤，乙酸乙酯-正己烷重结晶得到2-芳基-2H-1，2，4-3(4H)-三唑(3)；
将1mmol中间体(3)和5mL三氯氧磷的混合物再搅拌回流10h，薄层层析检测反应完毕后，冷却，旋干溶剂，残余物于40mL乙酸乙酯中溶解；将有机相用水、饱和NaHCO3溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩滤液得5-氯-1-取代芳基-1H-1，2，4-三唑(4)粗品，不经纯化直接用于下一步合成中；
将2mmol 5-氯-1-取代芳基-1H-1，2，4-三唑(4)加入到2.1mmol 2-巯基乙酸乙酯和2.1mmol氢化钠的10mL四氢呋喃溶液中；混合物在0℃下搅拌10min，然后加热回流，TLC检测反应完全，旋蒸除去溶剂，加入30mL二氯甲烷稀释，连续用30mL水洗涤两次、饱和的碳酸氢钠和氯化钠溶液洗涤；有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩滤液得到三唑硫乙酸乙酯(5)粗品；
将1.2mmol三唑硫乙酸乙酯(5)溶解于1mL二甲基亚砜中，加入2.0mmol 1N的NaOH水溶液；室温搅拌1h，再用1N的HCl酸化，加入100mL乙酸乙酯稀释，连续用水和饱和氯化钠溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩得2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-硫基)乙酸(6)粗品，纯度足以进行下一步反应，不必纯化；
上述的化合物(1)-(5)的结构通式分别为：
其中Ar1如权利要求1所定义。
5.权利要求1或2所述的2-(2-取代芳基-2H-1，2，4-三唑-3-硫基)乙酰胺衍生物在制备抗HIV的药物中的应用。
6.一种抗HIV药物组合物，包含权利要求1或2所述化合物和一种或多种药学上可接受的载体。
7.一种抗HIV药物组合物，包含权利要求1或2所述化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120725 Termination date: 20150712 |
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| EXPY | Termination of patent right or utility model |