CN101896195A

CN101896195A - 鸡毒支原体减毒株

Info

Publication number: CN101896195A
Application number: CN200880115552XA
Authority: CN
Inventors: 马赫什·库马; 穆罕麦德·A·卡恩
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Zoetis Services LLC
Priority date: 2007-09-11
Filing date: 2008-09-10
Publication date: 2010-11-24
Anticipated expiration: 2028-09-10
Also published as: ME00982B; TW200918666A; CA2699410A1; JP2014027950A; WO2009035644A1; UA98506C2; JP2010538646A; CN101896195B; US20110189099A1; NZ583829A; ES2437593T3; CA2699410C; MX2010002866A; CL2008002675A1; ZA201001740B; KR101176717B1; HK1145627A1; PL2200640T3; BRPI0817334A8; US20090068232A1

Abstract

本发明提供了鸡毒支原体减毒活细菌，所述细菌表现出被鉴定为MGA_0621的蛋白质的表达降低。在某些实施方案中，减毒细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体细菌，选自下组的一种或多种蛋白质的表达降低：丙酮酸脱氢酶、磷酸丙酮酸水合酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白质L35。本发明还提供疫苗和使用鸡毒支原体减毒活细菌的疫苗接种方法，和生产鸡毒支原体减毒活细菌的方法。本发明提供示例性的减毒鸡毒支原体活菌株，命名为MGx+47，通过蛋白质组分析，所述菌株表现出MGA_0621的表达显著降低，并且在作为疫苗防治鸡中鸡毒支原体感染而使用时安全有效。

Description

鸡毒支原体减毒株

技术领域

本发明涉及微生物学和免疫学领域。更具体地，本发明涉及针对细菌病原体的新疫苗。

背景技术

支原体(Mycoplasmas)是属于柔膜菌纲(Mollicutes)的小型原核生物(0.2至0.3μm)，柔膜菌纲的成员都缺少细胞壁，并且基因组较小。柔膜菌包括至少100种支原体。支原体是人类和非人类动物以及植物中几种疾病的病原体。例如，鸡毒支原体引起家禽的严重病症。鸡毒支原体与鸡和火鸡的急性呼吸疾病有关，还能引起猎鸟的上呼吸道疾病。此外，鸡毒支原体被鉴定为北美家朱雀结膜炎的病因。

预防并处理由鸡毒支原体感染而引起的疾病的有效策略是用减毒的鸡毒支原体细菌的活菌株免疫。通常地，减毒活疫苗的优势包括使致病原的所有相关免疫原决定簇都以天然形式面对宿主的免疫系统，并且由于致病原能在已接种疫苗的宿主体内扩增而使需要免疫剂的量相对较少。

减毒活疫苗菌株经常通过在培养基中将有毒菌株连续传代几次而产生。尽管已经通过连续传代获得了针对鸡毒支原体的减毒活疫苗菌株，但是这些菌株通常未在分子水平充分地鉴定。人们假定通过连续传代产生的减毒株已经积累了突变，这些突变使微生物具有较小的毒力，但是仍然能复制。然而对于鸡毒支原体减毒株，导致毒力减弱的突变的结果(例如，鉴别减毒株中表达模式改变的蛋白质)通常未知。

因此，本领域中需要新的鸡毒支原体减毒活细菌，其已在蛋白质组水平进行表征，并且在疫苗制剂中安全有效。

发明内容

本发明部分基于令人惊讶的发现，即在用作针对鸟类鸡毒支原体感染的疫苗时，表现出具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽的表达降低的鸡毒支原体细菌是安全有效。SEQ ID NO：1的多肽也称作“MGA_062l”，NCBI登录号为NP_852784。

因此，本发明涉及鸡毒支原体减毒活细菌，其表现出相对于野生型鸡毒支原体，MGA_0621的表达降低。在特定的、非限定性、示例性实施方案中，本发明提供鸡毒支原体减毒活菌株，其表现出相对于野生型鸡毒支原体细菌，选自下组的一种或多种蛋白质的表达降低：丙酮酸脱氢酶、磷酸丙酮酸水合酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白质L35。根据本发明的某些实施方案，通过蛋白质组分析将本发明的鸡毒支原体减毒活细菌表征为一种或多种前述蛋白质的表达降低。根据本发明的一个示例性实施方案，鸡毒支原体减毒活菌株是相对于野生型鸡毒支原体细菌表现出MGA_0621、丙酮酸脱氢酶、磷酸丙酮酸水合酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白质L35的表达降低的菌株，所述菌株于2007年6月19日在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108保藏，并且分配登录号PTA-8485。这个菌株在本文中也称作“鸡毒支原体菌株MGx+47”或“MG-P48”。

本发明还提供包含本发明的鸡毒支原体减毒活细菌的疫苗组合物，以及为动物接种疫苗防止鸡毒支原体感染的方法。此外，本发明提供产生和/或鉴定鸡毒支原体减毒克隆的方法。根据本发明的这个方面，方法包括使鸡毒支原体细菌的初始群落经受减毒条件，分析个体克隆中MGA_0621的表达相对于野生型鸡毒支原体是否降低，并且测试克隆的毒力。根据本发明这个方面产生的鸡毒支原体克隆表现出MGA_0621的表达降低，并且可以可选地表现出选自下组的一种或多种其它蛋白质的表达降低：丙酮酸脱氢酶、磷酸丙酮酸水合酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白质L35。优选地，表现出至少一种前述蛋白质表达降低的菌株还表现出相对于野生型鸡毒支原体细菌的毒力降低。

附图说明

图1是表示鸡毒支原体减毒株MGx+47的蛋白质点的二维(2-D)聚丙烯酰胺凝胶照片。编号为19、49、74、108、114、127、147、166、175和225的圈起的点对应于相对于野生型菌株R-980而在MGx+47中上调的蛋白质。编号为40、68、98、99、130、136和217的圈起的点对应于相对于野生型菌株R-980而在MGx+47中下调的蛋白质。

具体实施方式

本发明涉及适用于疫苗制剂中的鸡毒支原体减毒活细菌。本发明的鸡毒支原体表现出称作MGA_0621的蛋白质的表达降低。在某些实施方案中，本发明的鸡毒支原体细菌还表现出相对于相同种类的野生型鸡毒支原体细菌中以下蛋白质的表达，选自下组的一种或多种其它蛋白质的表达降低：丙酮酸脱氢酶、磷酸丙酮酸水合酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白质L35。

MGA_0621的NCBI登录号为NP_852784，包含下述162个氨基酸序列：MTRTMKNKKAKKKERRFTDLSADLDEEVEKIDPEYEDFKEIKIEKNKDNQVIDKNDPFFYSESFEEARIQLIKDKKVEVKKEEEKVQETTVKNKISEAKKEEAKDVYIDSSLEIASQEPLTKGMHFYTNSRIIRKVRECAKNKGLSISRLITMILDKSIKEE(SEQ ID NO：1)。

鸡毒支原体蛋白质的表达降低

本领域的普通技术人员将能使用常规分子生物学技术，确定鸡毒支原体减毒细菌是否表现出一种或多种蛋白质的表达降低，所述蛋白质在野生型鸡毒支原体细菌细胞中正常表达。可以通过本领域已知的几种方法确定相对于野生型细菌，减毒细菌是否表现出特定蛋白质(例如，MGA_0621、丙酮酸脱氢酶、磷酸丙酮酸水合酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶、核糖体蛋白质L35等)的表达降低。示例性方法包括，例如，定量的基于抗体的方法，比如Western印迹、放射免疫分析(RIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)，其中使用检测目的蛋白(protein of interest)并与目的蛋白连接的抗体。此外，因为信使RNA(mRNA)水平通常反应其编码的蛋白质的量，所以定量的基于核酸的方法也可以用来确定鸡毒支原体减毒细菌中一种或多种蛋白质的表达是否降低。例如，定量反转录/聚合酶链式反应(RT-PCR)方法可以用于测定对应于特定的目的蛋白质的mRNA的量。本领域中公知很多基于核酸的定量方法。

下文为非限定性的示例性方法，可用于确定鸡毒支原体减毒细菌是否表现出蛋白质诸如MGA_0621的表达降低。

首先，使减毒的鸡毒支原体细胞的群落和野生型鸡毒支原体细胞的群落在基本相同的条件下，在基本相同的培养基中生长。接着，使两个细胞群落经受细胞破坏条件。破坏后的细胞(或其包含蛋白质的部分)平行地进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后使用可以与鸡毒支原体MGA_0621蛋白质结合的抗体(比如能使用本领域公知的标准方法获得的抗体)进行Western印迹。然后使用标记的二抗，提供与来自细胞的蛋白质量成比例的可测量的信号。如果鸡毒支原体减毒株显示的信号量小于野生型鸡毒支原体菌株显示的信号量，那么可以推断相对于野生型菌株，减毒株中MGA_0621的表达降低。对这个示例性方法的修改，以及其替代方法，对于本领域的普通技术人员显而易见。

本发明包括鸡毒支原体减毒细菌，其与野生型菌株中观察到的蛋白质表达相比，表现出蛋白质(例如，MGA_0621、丙酮酸脱氢酶、磷酸丙酮酸水合酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶、核糖体蛋白质L35等)的表达任何程度的降低。在某些实施方案中，减毒细菌表现出相对于野生型细菌，蛋白质的表达至少降低5％。例如，如果给定量的野生型鸡毒支原体菌株表现出100单位的特定蛋白质表达，而等量的候选鸡毒支原体减毒株表现出95单位的蛋白质表达，那么可以得出结论，减毒株相对于野生型细菌，蛋白质的表达少5％(其它计算“表达减少百分比”的实例见本文其它部分)。在某些其它实施方案中，减毒细菌表现出相对于野生型鸡毒支原体细菌，蛋白质的表达至少降低10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在其它实施方案中，鸡毒支原体减毒株表现出相对于野生型细菌，蛋白质不表达(即，表达降低100％)。

在本发明的某些示例性实施方案中，相对于野生型鸡毒支原体细菌，减毒细菌表现出MGA_0621的表达降低至少5％，并且可选地选自下组的一种或多种蛋白质的表达降低至少5％：丙酮酸脱氢酶、磷酸丙酮酸水合酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白质L35。

如本文所使用的，通过下式计算鸡毒支原体减毒株相对于野生型菌株所表现出的特定蛋白质的“表达降低百分比”：(A-B)/A×100；其中A＝野生型鸡毒支原体菌株中蛋白质表达的相对水平；并且B＝减毒株中蛋白质表达的相对水平。仅为说明，如果野生型鸡毒支原体菌株表现出表达0.2500单位的蛋白质“Y”，并且鸡毒支原体减毒株表现出表达0.1850单位的蛋白质“Y”，那么可以说减毒株相对于野生型菌株表现出蛋白质“Y”的表达降低[(0.2500-0.1850)/0.2500×100]＝26％。本文实施例3中的表5提供其它示例，计算相对于野生型鸡毒支原体菌株，示例性鸡毒支原体减毒株的表达降低百分比。

疫苗组合物

本发明还包括包含本发明的鸡毒支原体减毒活细菌和可药用的载体的疫苗组合物。如本文所使用的，表达方式“本发明的鸡毒支原体减毒活细菌”包括本文各处描述和/或要求权利的任何鸡毒支原体减毒活细菌。可药用的载体可以是，例如，水、稳定剂、防腐剂、培养基或缓冲液。包含本发明的鸡毒支原体减毒细菌的疫苗制剂可以以悬浮形式或冻干形式或可选地冷冻形式制备。如果冷冻，可以加入甘油或其它相似的试剂以增强冷冻时的稳定性。

为动物接种疫苗的方法

本发明还包括为动物接种疫苗防止鸡毒支原体感染的方法。根据本发明这个方面的方法包括对动物施用免疫有效量的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含本发明的鸡毒支原体减毒活细菌。如本文所使用的，表达方式“本发明的鸡毒支原体减毒活细菌”包括本文各处描述和/或要求权利的任何鸡毒支原体减毒活细菌。表达方式“免疫有效量”表示接种疫苗后在动物体内激发产生防护水平的抗体所需的疫苗组合物的量。疫苗组合物可以以本领域已知的任何方式对动物施用，包括口服、鼻内、粘膜、局部外用、经皮和肠胃外(例如，静脉、腹膜内、皮肤内、皮下或肌肉内)途径。还可以使用无针输送设备施用。可以采用途径的组合进行施用，例如，首先使用肠胃外途径施用，然后使用粘膜途径等施用。

施用鸡毒支原体减毒株的动物优选为鸟，例如，鸡或火鸡。当动物是鸟时，可以施用本发明的疫苗制剂，使制剂立即或最终接触鸟的呼吸道粘膜。因此，疫苗制剂可以对鸟，例如，鼻内、口服和/或眼内施用。用于禽类施用的疫苗组合物可以如上述配制和/或以适合通过喷雾施用的形式配制，包括喷雾器(用于鼻内施用)或在饮用水中施用(用于口服)。

本发明通过喷雾或喷雾器施用的疫苗组合物可以通过将鸡毒支原体减毒活细菌掺入小液体颗粒中而配制。颗粒的初始粒度可以在约10μm至约100μm之间。这些颗粒可以通过例如常规喷雾设备和喷雾产生器产生，包括商业提供的用于背负式喷雾、孵化室喷雾和消毒喷雾的喷雾产生器。

用于产生鸡毒支原体减毒克隆的方法

在本发明的另一个方面，本发明提供用于鉴定和/或产生鸡毒支原体减毒克隆的方法。根据本发明这个方面的方法包括使鸡毒支原体细菌的初始菌群经受减毒条件，从而产生假定的的减毒菌群。接着，分析假定的的减毒菌群的个体克隆，分析相对于野生型鸡毒支原体细菌，MGA_0621的表达是否降低。然后对鉴定为MGA_0621的表达降低的克隆测试毒力。相对于野生型鸡毒支原体细菌，将表现出MGA_0621的表达降低并且毒力降低的克隆鉴定为鸡毒支原体减毒克隆。

根据本发明的这个方面，“鸡毒支原体细菌的初始菌群”可以是任何数量的鸡毒支原体细菌。在某些实施方案中细菌是野生型细菌。或者，细菌可以包含一个或多个突变。但是，优选地，初始群落中的细菌为同种细胞或基本为同种细胞；即，细菌优选全部源自单一亲本鸡毒支原体细菌细胞和/或具有相同或基本相同的基因型和/或表型特征的细胞。

如本文所使用的，术语“减毒条件”表示任何条件或条件的组合，所述条件可能向鸡毒支原体细菌的基因组中引入一个或多个基因改变(例如，核苷酸突变)。示例性、非限定性的减毒条件包括，例如，在培养基中将细菌传代，用可插入基因组的遗传元件如转座子(例如，可随机插入鸡毒支原体基因组中的转座子)转化细菌，对细菌施加接触一种或多种诱变剂(例如，化学诱变剂或紫外线等)。当细胞通过体外传代而减毒时，细胞可以传代任何次，例如，在体外传代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更多次。

在施加减毒条件后，鸡毒支原体细胞的初始群落在本文称作假定的的减毒菌群。通过标准的微生物技术可以获得假定的的减毒菌群的个体克隆，所述技术包括，例如，连续稀释细胞并在合适的培养基上涂布单个细胞。一旦获得个体克隆，可以分析假定的的减毒菌群的个体克隆中MGA_0621和/或一种或多种其它特定蛋白质的表达是否降低。确定鸡毒支原体减毒细菌是否表现出一种或多种蛋白质的表达降低的方法如本文所述，所述蛋白质在野生型鸡毒支原体细菌细胞中正常表达。示例性的方法包括，例如，基于RT-PCR的方法、Western印迹等。

可以通过对易于受到野生型(未减毒)细菌感染的动物施用鉴定为MGA_0621表达降低的个体克隆从而测试其毒力。如本文所使用的，“易于受到野生型鸡毒支原体细菌感染的动物”是在用野生型鸡毒支原体细菌侵染后出现至少一种临床症状的动物。本领域中普通技术人员已知这些症状。例如，对于表现出例如MGA_0621的表达降低的假定的的鸡毒支原体减毒株，菌株可以施用于例如火鸡或鸡(通常易于感染野生型鸡毒支原体)。禽类动物鸡毒支原体感染的临床症状包括，例如，急性呼吸道症状，心包炎，肝周炎，气囊炎，气管变厚，体重增长缓慢，线毛消失，杯状细胞异常，毛细管扩张，淋巴细胞、血浆细胞和/或嗜异细胞增加，并且有时产蛋量减少。因此，如果将假定的的鸡毒支原体减毒株施用于鸡或火鸡，与由野生型鸡毒支原体菌株感染的火鸡或鸡相比，产生的症状较少和/或较轻，则认为假定的的鸡毒支原体减毒株“毒力降低”。任何程度的症状减轻都会将假定的的减毒株鉴定为毒力降低。在某些实施方案中，假定的的减毒株无毒。

根据本发明，相对于野生型鸡毒支原体细菌，表现出MGA_0621(和/或一种或多种其它特定的蛋白质)的表达降低和毒力降低的鸡毒支原体克隆是鸡毒支原体减毒克隆。本发明的一个示例性减毒鸡毒支原体活克隆是命名为MGx+47的菌株，其表现出MGA_0621的表达降低(伴有丙酮酸脱氢酶、磷酸丙酮酸水合酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白质L35的表达降低)。已于2007年6月19日在美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108)保藏MGx+47，并指定登录号为PTA-8485。

下述实施例为说明而非限定本发明的方法和组合物。就本公开而言，对于本领域的技术人员显而易见的、分子生物学和化学中常见的对于各种条件和参数的适当修改和改变落入本发明的精神和范畴中。

实施例

实施例1

鸡毒支原体减毒活菌株的产生

通过将野生型鸡毒支原体菌株R980在体外多次传代而产生新的鸡毒支原体减毒活菌株。具体地，将0.1mL野生型鸡毒支原体菌株R-980的种子材料接种于20mL改进的Frey培养基中(Frey等人，Am.J.Vet.Res.29：2163-2171(1968)(在本文也称作“MG培养基”)。野生型细胞生长至培养基颜色变为浅黄色。然后使用浅黄色培养物如上所述再次接种于新鲜的MG培养基中。以这种方式将培养物传代共47次。为鸟群接种，然后使用野生型鸡毒支原体感染，由此测试产生的菌株是否减毒。感染两周后将所有鸟类解剖并观察与支原体有关的病理。多次传代的菌株(x+47)提供了针对与鸡毒支原体感染有关的临床迹象的保护。这株命名为MGx+47的鸡毒支原体减毒株于2007年6月19日保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108)，并指定登录号为PTA-8485。

实施例2

鸡毒支原体减毒活疫苗在鸡中的安全和有效性评估

在这个实施例中，评价了实施例1中获得的新鸡毒支原体疫苗菌株MGx+47在鸡中的安全和有效性。

将七十一只SPF白色来亨鸡如下分成七组：

表1：实验设计

组	鸡数目	是否接种疫苗	是否感染
				1	11	否	是
2	10	是	否
				3	11	是	是
4a	10	是	否
				4b	11	是	否
4c	9	是	否
				5	9	否	否

在四周龄时，通过粗喷雾的方式，用减毒株MGx+47，以3.72×10⁷CCU/mL/鸟为第2、3、4a、4b和4c组的鸡接种疫苗。在七周龄时，用0.5mL鸡毒支原体菌株R，以7.74×10⁵CCU/mL通过气管感染第1和3组中的鸡。在九周龄时，解剖第1、2、3和5组的鸡，并且分别在接种疫苗后(DPV)第7、14和21天解剖第4a、4b和4c组的鸡。评估鸡的平均体重增长、心包炎、肝周炎、气囊炎和气管炎。结果示于表2中。

表2：安全和有效性概要

接种疫苗＝3.62×10⁷CCU/mL/鸟

侵染＝7.74×10⁵CCU/mL，0.5mL

组

是否接种疫苗

是否感染

平均体重增加(kg/天)

心包炎

肝周炎

气囊炎

气囊炎分值(阳性平均值)

气管(组织学)

1

否

是

0.016

0/11

9/11

3.56

严重气

管炎

2

是

否

0.018

0/10

0

正常

3

是

0.017

0/11

2/11

2.5

混合气管炎

4a

是

否

0.016

0/9

0

正常

4b

是

否

0.017

0/11

0

正常

4c

是

否

0.017

0/10

0

正常

5

否

0.015

0/9

0

正常

表3：安全表：来自每个接种疫苗/未受侵染的鸡、用福尔马林固定的鸡气管的组织学报告(第4a、4b和4c组)

表4：有效性表：来自每只鸡、用福尔马林固定的鸡气管的组织学报告

安全和有效性表(表3和4)的关键点：

●所有“已接种”鸟通过粗喷雾，用疫苗菌株MGx+47，以3.62×10⁷CCU/mL/鸟接种疫苗；

●所有“已侵染”鸟在气管内(IT)用0.5mL鸡毒支原体菌株以7.74×105CCU/mL感染

●时间点(表3：安全表中)＝检查鸡时接种后的天数，以接种后天数(DPV)表示。

●纤毛：“N”＝正常纤毛；“-”＝脱落；

●杯状细胞/M(“-”＝正常杯状细胞；“+”＝呼吸道表面上有粘液)；

●毛细管扩张(“-”＝无扩张或发炎；“+”＝适度毛细管扩张或发炎；“++”＝严重毛细管扩张或发炎)；

●LC/PC＝淋巴细胞和浆细胞(“-”＝无；“+”＝很少；“++++”＝很多)；

●PMN＝嗜异细胞(“-”＝无；“+”＝很少；“++++”＝很多)；

第2组鸡(接种但未受侵染)的组织学分析与第5组鸡(未接种，未受侵染)基本相似，证明新产生的MGx+47疫苗菌株的安全性。(参见，例如，上面的表2)。

关于有效性，第3组鸡(接种并受侵染)与第1组鸡(未接种，侵染)相比，表现出气囊炎显著降低。(参见，例如，表2和4)。此外，如表4所示，第3组鸡表现出的纤毛、杯状细胞、毛细管扩张、淋巴细胞和血浆细胞(LC/PC)、嗜异细胞和气管厚度的鸡毒支原体感染组织学征兆较少。(见表4)。

因此，本实施例证明MGx+47是安全、有效的鸡毒支原体减毒活疫苗菌株。

实施例3

MGx+47疫苗菌株的蛋白质组学鉴定

为了在分子水平更精确地鉴定MGx+47疫苗菌株(参见实施例1和2)，进行了该菌株的蛋白质组学分析。

在这个实施例中，从野生型鸡毒支原体菌株R-980和新鉴定的疫苗菌株MGx+47中分离总蛋白质。将每株菌的蛋白质用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳解析，然后进行凝胶成像的计算机分析(参见图1)。鉴别在疫苗菌株中差异表达的蛋白质点。将与野生型菌株相比，在疫苗菌株中没有表达或表达水平明显降低的蛋白质点从凝胶上切除。

鉴别了五个点，其在MGx+47疫苗菌株中的表达水平与野生型鸡毒支原体相比显著降低。将每个蛋白质点从凝胶上切除并用酶消化。然后使用基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行肽质量指纹分析。将每个蛋白质点鉴定的质谱图谱与肽质量数据库比较，鉴别蛋白质和编码它们的相应基因。这个分析的结果总结于下表中：

表5：MGx+47的蛋白质组学分析结果概要

基因	产物	功能	在野生型MG中的表达水平	在MGx+47中的表达水平	表达降低的百分比
						acoA	丙酮酸脱氢酶	能量产生和转化(Kreb循环)所需	0.1872	0.0858	54.2％
eno	磷酸丙酮酸水合酶	催化磷酸烯醇丙酮酸的形成	0.0683	0.0173	74.7％
						deoC	2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶	核苷酸代谢所需	0.0525	0.0309	41.1％

rpml	核糖体蛋白质L35	翻译、核糖体结构和生物起源	0.1171	0.0259	77.9％
						MGA_0621	假定蛋白	未知	0.4534	0.0835	81.6％

基因产物表达的降低也用“表达降低倍数”表示。例如，在表5中，可以说菌株MGx+47表现出相对于野生型MG，acoA、eno、deoC、rpml和MGA_0621的表达分别降低2.2、3.9、1.7、4.5和5.4倍。

如表5中所示，在减毒MGx+47活疫苗菌株中鉴定了五个与野生型R-980菌株相比表达显著降低的基因产物：AcoA、Eno、DeoC、Rmpl和MGA_0621(NCBI登录号为NP_852784，鉴定为假定蛋白)。观察到表达降低最多的是MGA_0621。因此，引起MGA_0621表达降低的突变或生长条件可能导致鸡毒支原体毒性减弱。因此，MGA_0621的下调可能是产生鸡毒支原体减毒株的有效策略。

尽管上文为便于清楚理解而通过阐述和实施例详细描述了前述发明，但是本发明不限于公开的具体实施例，而是意欲涵盖所有如所附权利要求确定的本发明的精神和范畴内的变化和修改。

本说明中提及的所有文献和专利都说明本发明所述领域技术人员的技术水平。所有文献和专利通过引用并入本文，其程度如同具体和单独陈述每个文献或专利申请通过引用并入。

序列表

<110>惠氏有限责任公司

马赫什.库马

穆罕麦德.A.卡恩

<120>鸡毒支原体减毒株

<130>AM102888

<150>60/993447

<151>2007-09-11

<160>1

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>162

<212>PRT

<213>鸡毒支原体

<400>1

Met Thr Arg Thr Met Lys Asn Lys Lys Ala Lys Lys Lys Glu Arg Arg

1 5 10 15

Phe Thr Asp Leu Ser Ala Asp Leu Asp Glu Glu Val Glu Lys Ile Asp

20 25 30

Pro Glu Tyr Glu Asp Phe Lys Glu Ile Lys Ile Glu Lys Asn Lys Asp

35 40 45

Asn Gln Val Ile Asp Lys Asn Asp Pro Phe Phe Tyr Ser Glu Ser Phe

50 55 60

Glu Glu Ala Arg Ile Gln Leu Ile Lys Asp Lys Lys Val Glu Val Lys

65 70 75 80

Lys Glu Glu Glu Lys Val Gln Glu Thr Thr Val Lys Asn Lys Ile Ser

85 90 95

Glu Ala Lys Lys Glu Glu Ala Lys Asp Val TyrIle Asp Ser Ser Leu

100 105 110

Glu Ile Ala Ser Gln Glu Pro Leu Thr Lys Gly Met His Phe Tyr Thr

115 120 125

Asn Ser Arg Ile Ile Arg Lys Val Arg Glu Cys Ala Lys Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Ser Ile Ser Arg Leu Ile Thr Met Ile Leu Asp Lys Ser Ile Lys

145 150 155 160

Glu Glu

Claims

1.鸡毒支原体减毒活细菌，其表现出相对于野生型鸡毒支原体，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质的表达降低。

2.权利要求1的细菌，其中所述细菌表现出相对于野生型鸡毒支原体，所述蛋白质的表达降低至少25％。

3.权利要求2的细菌，其中所述细菌表现出相对于野生型鸡毒支原体，所述蛋白质的表达降低至少50％。

4.权利要求3的细菌，其中所述细菌表现出相对于野生型鸡毒支原体，所述蛋白质的表达降低至少75％。

5.权利要求1的细菌，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，丙酮酸脱氢酶的表达降低。

6.权利要求1的细菌，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，磷酸丙酮酸水合酶的表达降低。

7.权利要求1的细菌，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶的表达降低。

8.权利要求1的细菌，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，核糖体蛋白质L35的表达降低。

9.权利要求1的细菌，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，丙酮酸脱氢酶、磷酸丙酮酸水合酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体L35的表达降低。

10.疫苗组合物，其包含：

(a)鸡毒支原体减毒活细菌，其表现出相对于野生型鸡毒支原体，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质的表达降低；和

(b)可药用的载体。

11.权利要求10的疫苗组合物，其中所述细菌表现出相对于野生型鸡毒支原体，所述蛋白质的表达降低至少25％。

12.权利要求11的疫苗组合物，其中所述细菌表现出相对于野生型鸡毒支原体，所述蛋白质的表达降低至少50％。

13.权利要求12的疫苗组合物，其中所述细菌表现出相对于野生型鸡毒支原体，所述蛋白质的表达降低至少75％。

14.权利要求10的疫苗组合物，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，丙酮酸脱氢酶的表达降低。

15.权利要求10的疫苗组合物，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，磷酸丙酮酸水合酶的表达降低。

16.权利要求10的疫苗组合物，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶的表达降低。

17.权利要求10的疫苗组合物，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，核糖体蛋白质L35的表达降低。

18.权利要求10的疫苗组合物，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，丙酮酸脱氢酶、磷酸丙酮酸水合酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白质L35的表达降低。

19.使动物对鸡毒支原体免疫的方法，所述方法包括对动物施用免疫有效量的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含鸡毒支原体减毒活细菌，其相对于野生型鸡毒支原体，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质的表达降低。

20.权利要求19的方法，其中所述细菌表现出相对于野生型鸡毒支原体，所述蛋白质的表达降低至少25％。

21.权利要求20的方法，其中所述细菌表现出相对于野生型鸡毒支原体，所述蛋白质的表达降低至少50％。

22.权利要求21的方法，其中所述细菌表现出相对于野生型鸡毒支原体，所述蛋白质的表达降低至少75％。

23.权利要求19的方法，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，丙酮酸脱氢酶的表达降低。

24.权利要求19的方法，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，磷酸丙酮酸水合酶的表达降低。

25.权利要求19的方法，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶的表达降低。

26.权利要求19的方法，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，核糖体蛋白质L35的表达降低。

27.权利要求19的方法，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，丙酮酸脱氢酶、磷酸丙酮酸水合酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白质L35的表达降低。

28.鉴定鸡毒支原体减毒克隆的方法，所述方法包括：

(a)使鸡毒支原体细菌的初始群落经受减毒条件，从而产生假定的减毒菌群；和

(b)分析所述假定的减毒菌群的个体克隆，确定相对于野生型鸡毒支原体，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质的表达是否降低；和

(c)测试(b)中鉴定的所述蛋白质表达降低的克隆的毒力；

其中相对于野生型鸡毒支原体表现出所述蛋白质的表达降低和毒力降低的鸡毒支原体克隆为鸡毒支原体减毒克隆。

29.权利要求28的方法，其中(a)的所述减毒条件包括在体外将鸡毒支原体细菌的所述初始群落传代至少2次。

30.权利要求29的方法，其中(a)的所述减毒条件包括在体外将鸡毒支原体细菌的所述初始群落传代至少5次。

31.权利要求30的方法，其中(a)的所述减毒条件包括在体外将鸡毒支原体细菌的所述初始群落传代至少10次。

32.权利要求28的方法，其中(a)的所述减毒条件包括用转座子转化鸡毒支原体细菌的所述初始群落，所述转座子随机地插入鸡毒支原体基因组中。

33.权利要求28的方法，其中(a)的所述减毒条件包括将鸡毒支原体细菌的所述初始群落暴露于化学诱变剂或紫外光。

34.权利要求28的方法，其中所述假定的减毒菌群的所述个体克隆在(b)中通过反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)分析所述蛋白质的表达是否降低。

35.权利要求28的方法，其中所述假定的减毒菌群的所述个体克隆在(b)中通过Western印迹分析所述蛋白质的表达是否降低。

36.权利要求28的方法，其中(b)中鉴定的所述克隆在(c)中如下测试毒力：对易感染鸡毒支原体的动物施用一个或多个所述克隆，并将在施用所述一个或多个克隆后的所述动物中观察到的临床症状与未施用所述克隆的对照动物的临床症状进行比较。

37.在ATCC以登录号PTA-8485保藏的鸡毒支原体减毒活细菌。

38.权利要求19的方法，其中所述疫苗组合物通过直接注射、喷雾施用或饮用水施用对所述动物进行施用。