ES2437593T3

ES2437593T3 - Cepas de Mycoplasma gallisepticum atenuadas

Info

Publication number: ES2437593T3
Application number: ES08830621.2T
Authority: ES
Inventors: Mahesh Kumar; Muhammad Ayub Khan
Original assignee: Zoetis W LLC
Current assignee: Zoetis Services LLC
Priority date: 2007-09-11
Filing date: 2008-09-10
Publication date: 2014-01-13
Anticipated expiration: 2028-09-10
Also published as: AU2008299913B2; EP2200640B1; AU2008299913A1; US7935356B2; WO2009035644A1; CN101896195B; MX2010002866A; RU2010108641A; ME00982B; HK1145627A1; CA2699410A1; US20130302373A1; CL2008002675A1; US20130022547A1; BRPI0817334A8; UA98506C2; KR101176717B1; PL2200640T3; JP2010538646A; EP2200640A1

Abstract

La bacteria Mycoplasma gallisepticum viva atenuada depositada en la ATCC bajo el número de acceso PTA-8485.

Description

Cepas de Mycoplasma gallisepticum atenuadas

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

5 La presente invención se refiere a los campos de la microbiología e inmunología. Más específicamente, la invención se refiere a novedosas vacunas contra patógenos bacterianos.

Técnica anterior

Los Mycoplasmas son pequeños organismos procariotas (0,2 a 0,3 pm) que pertenecen a la clase Mollicutes, cuyos miembros carecen de pared celular y tienen un pequeño tamaño de genoma. Los mollicutes incluyen al menos 100

10 especies de Mycoplasma. Las especies de Mycoplasma son los agentes causantes de varias enfermedades en animales humanos y no humanos, además de en plantas. M. gallisepticum, por ejemplo, es responsable de significativas condiciones de enfermedad en aves de corral. M. gallisepticum está asociado a enfermedad respiratoria aguda en pollos y pavos y también puede producir enfermedad de las vías respiratorias superiores en aves de caza. Además, se ha reconocido M. gallisepticum como una causa de conjuntivitis en gorriones en América del Norte.

15 Una estrategia eficaz para prevenir y gestionar enfermedades producidas por infección por M. gallisepticum es por vacunación con cepas atenuadas vivas de la bacteria M. gallisepticum. Las ventajas de vacunas atenuadas vivas, en general, incluyen la presentación de todos los determinantes inmunogénicos relevantes de un agente infeccioso en su forma natural para el sistema inmunitario del huésped, y la necesidad de cantidades relativamente pequeñas del agente inmunizante debido a la capacidad del agente para multiplicarse en el huésped vacunado.

20 Las cepas de vacunas atenuadas vivas se crean frecuentemente sometiendo múltiples veces a pases sucesivos una cepa virulenta en medios. Aunque las cepas de vacunas atenuadas vivas contra M. gallisepticum han sido obtenidas por pases sucesivos, tales cepas están generalmente poco caracterizadas al nivel molecular. Se supone que las cepas atenuadas hechas por pases sucesivos tienen mutaciones acumuladas que hacen que los microorganismos sean menos virulentos, pero que todavía puedan replicarse. Sin embargo, con respecto a cepas de M. gallisepticum

25 atenuadas, las consecuencias de las mutaciones que producen la atenuación (por ejemplo, la identidad de proteínas cuyo patrón de expresión ha sido alterado en la cepa atenuada) son normalmente desconocidas.

El documento US 2002/0187162 A1 se refiere a M. gallisepticum deficiente en citoadherencia que no expresa al menos dos de las tres proteínas, la molécula Gap-A, proteína cmA y la proteína de 45 Kd que se describe. La cepa de M. gallisepticum que se reivindica en el documento US 2002/0187162 A1 contiene mutaciones y características que se

30 diferencian de la presente invención.

Adler y col. (“Immunological response to Mycoplasma gallisepticum”; Adler HE, Therlogenology, vol 6 (nº 2-3), 1 de agosto de 1976, páginas 87-91) describe inmunidad de infección por M. gallisepticum que es solo en parte de origen humoral. La inmunidad humoral sola no protegerá al ave contra la exposición en el alvéolo. Esta referencia muestra que los linfocitos T son de importancia en la defensa contra la infección. La inmunización descrita en aquel documento

35 muestra inmunización en las fosas nasales usando M. gallisepticum que se sometió múltiples veces a pases. Se estableció que hay una posible función de IgA y linfocinas generales en prevenir lesiones del alvéolo. No se ha facilitado caracterización adicional.

Hudson y col. (“Identification of a virulence-associated determinant, dihydrolipoamine dehydrogenase (lpd) in a Mycoplasma gallisepticum through in vivo screening of trans pons mutants”. Infection and Immunity, vol 74 (nº 2),

40 febrero de 2006) describe la atenuación de M. gallisepticum por alteración mediada por transposón de dihidrolipoamida deshidrogenasa, que es un componente de piruvato deshidrogenasa. Esta referencia no describe la cepa de M. gallisepticum de la presente invención ni los niveles particulares de proteína que se alteran.

La base de datos UniProt, 15 de diciembre de 2003, número de acceso Q7NC76, es un número de acceso de UniProtKB/Swiss-Prot que describe una proteína hipotética derivada de M. gallisepticum. No se describe información

45 adicional referente a la función, rutas, etc. Esto es parte de la secuencia del genoma completo del patógeno aviar M. gallisepticum y referencias a Papazisi y col. (Microbiology, vol. 149, páginas 2307-2316 (2003)).

Por consiguiente, existe la necesidad en la materia de nuevas bacterias M. gallisepticum atenuadas vivas que se hayan caracterizado al nivel proteómico y que sean seguras y eficaces en formulaciones de vacuna.

Breve resumen de la invención

50 La presente invención se basa, en parte, en el sorprendente descubrimiento de que bacterias M. gallisepticum que

presentan expresión reducida de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1 son tanto seguras como eficaces cuando se usan como una vacuna contra infección por M. gallisepticum en aves. El polipéptido de SEC ID Nº: 1 también denomina “MGA_0621” y tiene el nº de acceso de NCBI NP_852784.

Por consiguiente, la presente solicitud describe bacterias M. gallisepticum atenuadas vivas que presentan expresión

5 reducida de MGA_0621, con respecto a M. gallisepticum natural. En una realización a modo de ejemplo no limitante específica, la solicitud describe una cepa de M. gallisepticum atenuada viva que presenta expresión reducida de MGA_0621, y adicionalmente presenta expresión reducida de una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en piruvato deshidrogenasa, fosfopiruvato hidratasa, 2-desoxirribosa-5-fosfato aldolasa y proteína ribosómica L35, con respecto a bacterias M. gallisepticum naturales. Según ciertas realizaciones de la presente solicitud, las

10 bacterias M. gallisepticum atenuadas vivas descritas se caracterizan por análisis proteómico por tener expresión reducida de una o más de las proteínas anteriormente mencionadas. Según una realización a modo de ejemplo de la presente solicitud, la cepa de M. gallisepticum atenuada viva es una cepa que presenta expresión reducida de MGA_0621, piruvato deshidrogenasa, fosfopiruvato hidratasa, 2-desoxirribosa-5-fosfato aldolasa y proteína ribosómica L35, con respecto a bacterias M. gallisepticum naturales, cepa que se depositó en la Colección americana de cultivos

15 tipo (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, el 19 de junio de 2007, y a la que se le ha asignado el nº de acceso PTA-8485. Esta cepa se denomina alternativamente en el presente documento “cepa MGx+47 de M. gallisepticum” o “MG-P48”.

Así, según una primera realización, la presente invención proporciona la bacteria Mycoplasma gallisepticum atenuada viva depositada en la ATCC bajo el número de acceso PTA-8485.

20 La presente solicitud también describe composiciones de vacuna que comprenden las bacterias M. gallisepticum atenuadas vivas de la invención, además de procedimientos de vacunación de un animal contra infección por M. gallisepticum.

Así, según una segunda realización, la presente invención también proporciona una composición de vacuna que comprende: (a) la bacteria Mycoplasma gallisepticum atenuada viva según la primera realización; y (b) un vehículo

25 farmacéuticamente aceptable.

Según una tercera realización, la presente invención también proporciona la composición de vacunas según la segunda realización para su uso en vacunar un animal contra infección por Mycoplasma gallisepticum.

Según una cuarta realización, la presente invención también proporciona la composición de vacuna según la tercera realización, en la que dicha composición de vacuna es para administración a dicho animal por inyección directa,

30 administración por pulverización o administración en el agua potable.

Además, la presente solicitud describe procedimientos para preparar y/o identificar clones de M. gallisepticum atenuados. Según este aspecto de la solicitud, los procedimientos comprenden someter una población inicial de bacterias M. gallisepticum a condiciones atenuantes, ensayar los clones individuales para la expresión reducida de MGA_0621, con respecto a M. gallisepticum natural, y probar los clones para virulencia. Los clones de M. gallisepticum

35 producidos según los procedimientos de este aspecto de la solicitud presentarán expresión reducida de MGA_0621 y opcionalmente pueden presentar expresión reducida de una o más proteínas adicionales seleccionadas del grupo que consiste en piruvato deshidrogenasa, fosfopiruvato hidratasa, 2-desoxirribosa-5-fosfato aldolasa y proteína ribosómica L35. Preferentemente, las cepas que presentan expresión reducida de al menos una de las proteínas anteriormente mencionadas también presentan virulencia reducida con respecto a la bacteria M. gallisepticum natural.

40 Breve descripción del dibujo

La Figura 1 es una fotografía de un gel de poliacrilamida bidimensional (2-D) que representa puntos de proteínas de la cepa MGx+47 de M. gallisepticum atenuada. Los puntos redondeados numerados 19, 49, 74, 108, 114, 127, 147, 166, 175 y 225 se corresponden con proteínas que están reguladas por incremento en MGx+47 con respecto a la cepa R980 natural. Los puntos redondeados numerados 40, 68, 98, 99, 130, 136 y 217 se corresponden con proteínas que se

45 regulan por disminución en MGx+47 con respecto a la cepa R-980 natural.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a bacterias M. gallisepticum atenuadas vivas que son adecuadas para su uso en formulaciones de vacuna. Las bacterias M. gallisepticum de la presente invención presentan expresión reducida de una proteína denominada MGA_0621. En ciertas realizaciones, las bacterias M. gallisepticum de la invención presentan

50 adicionalmente expresión reducida de una o más proteínas adicionales seleccionadas del grupo que consiste en piruvato deshidrogenasa, fosfopiruvato hidratasa, 2-desoxirribosa-5-fosfato aldolasa y proteína ribosómica L35, con respecto a la expresión de estas proteínas en una bacteria M. gallisepticum natural de la misma especie.

MGA_0621 se identifica bajo el nº de acceso de NCBI NP_852784, tiene la siguiente secuencia de 162 aminoácidos:

MTRTMKNKKAKKKERRFTDLSADLDEEVEKIDPEYEDFKEIKIEKNKDNQVIDKNDP FFYSESFEEARIQLIKIDKKVEVKKEEEKVQETTVKNKISEAKKEEAKDVYIDSSLEIAS QEPLTKGMHFYTNSRIIRKVRECAKNKGLSISRLITMILDKSIKEE (SEC ID Nº: 1).

Expresión reducida de proteínas de mycoplasma gallisepticum

5 Un experto en la materia podrá determinar, usando técnicas de biología molecular rutinarias, si una bacteria M. gallisepticum atenuada presenta o no expresión reducida de una o más proteínas que normalmente se expresan en células bacterianas de M. gallisepticum naturales. La determinación de si una bacteria atenuada presenta o no expresión reducida de una proteína particular (por ejemplo, MGA_0621, piruvato deshidrogenasa, fosfopiruvato hidratasa, 2-desoxirribosa-5-fosfato aldolasa, proteína ribosómica L35, etc.) con respecto a una bacteria natural puede

10 llevarse a cabo por varios procedimientos conocidos en la técnica. Procedimientos a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, procedimientos cuantitativos basados en anticuerpos tales como transferencia Western, radioinmunoensayos (RI) y enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), en los que se usa un anticuerpo que detecta y se une a la proteína de interés. Además, como los niveles de ARN mensajero (ARNm) generalmente reflejan la cantidad de proteína codificada del mismo, también pueden usarse procedimientos cuantitativos basados en ácidos nucleicos para

15 determinar si una bacteria M. gallisepticum atenuada presenta o no expresión reducida de una o más proteínas. Por ejemplo, pueden usarse los procedimientos de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (RT-PCR) para medir la cantidad de ARNm correspondiente a una proteína particular de interés. Numerosos procedimientos cuantitativos basados en ácidos nucleicos son muy conocidos en la técnica.

Lo siguiente es un procedimiento a modo de ejemplo no limitante que puede usarse para determinar si una bacteria M. 20 gallisepticum atenuada presenta o no expresión reducida de una proteína tal como, por ejemplo, MGA_0621,

Primero, una población de células de M. gallisepticum atenuadas y una población de células de M. gallisepticum naturales se cultivan bajo condiciones sustancialmente idénticas en sustancialmente el mismo medio de cultivo. A continuación, las dos poblaciones de células se someten a condiciones de rotura de las células. Las células rotas (o las fracciones que contienen proteína de las mismas) se someten, en paralelo, a electroforesis en gel de SDS25 poliacrilamida (SDS-PAGE) y luego a transferencia Western usando un anticuerpo que se une a la proteína MGA_0621 de M. gallisepticum (tales anticuerpos pueden obtenerse usando procedimientos convencionales que son muy conocidos en la técnica). Un anticuerpo secundario marcado se aplica entonces con el fin de proporcionar una señal medible que sea proporcional a la cantidad de proteína derivada de las células. Si la cantidad de señal mostrada por la cepa de M. gallisepticum atenuada es inferior a la cantidad de señal mostrada por la cepa de M. gallisepticum natural,

30 entonces puede llegarse a la conclusión de que la cepa atenuada presenta expresión reducida de MGA_0621 con respecto a la cepa natural. Variaciones en este procedimiento a modo de ejemplo, además de alternativas al mismo, serán inmediatamente evidentes para expertos en la materia.

La presente solicitud describe bacterias M. gallisepticum atenuadas que presentan cualquier grado de reducción en la expresión de una proteína (por ejemplo, MGA_0621, piruvato deshidrogenasa, fosfopiruvato hidratasa, 2-desoxirribosa35 5-fosfato aldolasa, proteína ribosómica L35, etc.) en comparación con la expresión de esa proteína observada en una cepa natural. En ciertas realizaciones de la solicitud, la bacteria atenuada presenta al menos aproximadamente el 5% menos de expresión de la proteína con respecto a una bacteria natural. Como ejemplo, si una cantidad dada de una cepa de M. gallisepticum natural presenta 100 unidades de expresión de una proteína particular y la misma cantidad de una cepa de M. gallisepticum atenuada candidata presenta 95 unidades de expresión de la proteína, entonces se 40 concluye que la cepa atenuada presenta el 5% menos de expresión de la proteína con respecto a la bacteria natural (ejemplos adicionales para calcular “porcentaje de menos expresión” se exponen en cualquier parte en el presente documento). En ciertas otras realizaciones, la bacteria atenuada presenta al menos aproximadamente el 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 36%, 40%. 45%, 50%, 55%, 60%, 85%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% menos de expresión de la proteína con respecto a una bacteria M. gallisepticum natural. En

45 todavía otras realizaciones, la cepa de M. gallisepticum atenuada no presenta expresión (es decir, 100% menos de expresión) de la proteína con respecto a una bacteria M. gallisepticum natural.

En ciertas realizaciones a modo de ejemplo de la presente solicitud, la bacterias atenuadas presentan al menos 5% menos de expresión de MGA_0621, y opcionalmente al menos 5% menos de expresión de una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en piruvato deshidrogenasa, fosfopiruvato hidratasa, 2-desoxirribosa-5-fosfato

50 aldolasa y proteína ribosómica L35 con respecto a una bacteria M. gallisepticum natural.

Como se usa en el presente documento, el “porcentaje menos de expresión” de una proteína particular mostrada por una cepa de M. gallisepticum atenuada con respecto a una cepa natural se calcula por la siguiente fórmula: (A - B) / A x 100; en la que A = el nivel de expresión relativo de la proteína en una cepa de M. gallisepticum natural; y B = el nivel de expresión relativo de la proteína en la cepa atenuada. Únicamente con el fin de ilustración, si una cepa de M. 55 gallisepticum natural mostró 0,2500 unidades de expresión de proteína “Y” y una cepa de M. gallisepticum atenuada mostró 0,1850 unidades de expresión de proteína “Y”, entonces se dice que la cepa atenuada presenta [(0,2500 - 0,1850) / 0,2500 x 100] = 26% menos de expresión de proteína “Y” con respecto a la cepa natural. La Tabla 5 en el

Ejemplo 3 en el presente documento proporciona ejemplos ilustrativos adicionales del porcentaje menos de expresión calculado para una cepa de M. gallisepticum atenuada a modo de ejemplo con respecto a una cepa de M. gallisepticum natural.

Composiciones de vacuna

5 La presente solicitud también describe composiciones de vacuna que comprenden una bacteria M. gallisepticum atenuada viva de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, la expresión “bacteria M. gallisepticum atenuada viva de la invención” engloba cualquier bacteria M. gallisepticum atenuada viva que se describe y/o reivindica en cualquier parte en el presente documento. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser, por ejemplo, agua, un estabilizador, un conservante, medio de cultivo o un

10 tampón. Las formulaciones de vacuna que comprenden las bacterias M. gallisepticum atenuadas de la invención pueden prepararse en forma de una suspensión o en una forma liofilizada o, alternativamente, en una forma congelada. Si está congelada, puede añadirse glicerol u otros agentes similares para potenciar la estabilidad cuando se congelan.

Procedimientos de vacunación de un animal

15 La presente solicitud también describe procedimientos de vacunación de un animal contra infección por M. gallisepticum. Los procedimientos según este aspecto de la solicitud comprenden administrar a un animal una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición de vacuna que comprende una bacteria M. gallisepticum atenuada viva de la invención. Como se usa en el presente documento, la expresión “bacteria M. gallisepticum atenuada viva de la invención” engloba cualquier bacteria M. gallisepticum atenuada viva que se describe y/o reivindica en cualquier parte

20 en el presente documento. La expresión “cantidad inmunológicamente eficaz” significa la cantidad de composición de vacuna requerida para provocar la producción de niveles protectores de anticuerpos en un animal tras la vacunación. La composición de vacuna puede administrarse al animal en cualquier modo conocido en la técnica que incluye vías orales, intranasales, mucosas, tópicas, transdérmicas y parenterales (por ejemplo, intravenosas, intraperitoneales, intradérmicas, subcutáneas o intramusculares). La administración también puede lograrse usando dispositivos de

25 administración sin aguja. La administración puede lograrse usando una combinación de vías, por ejemplo, primero administración usando una vía parenteral y posterior administración usando una vía mucosa, etc.

El animal al que se administra la cepa de M. gallisepticum atenuada es preferentemente un ave, por ejemplo, un pollo o un pavo. Si el animal es un ave, las formulaciones de vacuna de la invención pueden administrarse de forma que las formulaciones se pongan inmediatamente o eventualmente en contacto con las membranas mucosas respiratorias del

30 ave. Así, las formulaciones de vacuna pueden administrarse a aves, por ejemplo, intranasalmente, por vía oral y/o intraocularmente. La composiciones de vacuna para administración aviar pueden formularse como se ha descrito anteriormente y/o en una forma adecuada para administración por pulverización, que incluye aerosol (para administración intranasal) o en agua potable (para administración por vía oral).

Las composiciones de vacuna de la presente invención que se administran por pulverización o aerosol pueden

35 formularse incorporando las bacterias M. gallisepticum atenuadas vivas en pequeñas partículas de líquido. Las partículas pueden tener un tamaño de gotita inicial de entre aproximadamente 10 μm y aproximadamente 100 μm. Tales partículas pueden generarse, por ejemplo, por aparato de pulverización convencional y generadores de aerosol, que incluyen generadores de pulverización comercialmente disponibles para pulverización en mochila, pulverización en criadero y pulverización con Atomist.

40 Procedimientos para la preparación de clones de m. gallisepticum atenuados

En otro aspecto de la presente solicitud se describen procedimientos para identificar y/o preparar clones de M. gallisepticum atenuados. Los procedimientos según este aspecto de la solicitud comprenden someter una población inicial de bacterias M. gallisepticum a condiciones atenuantes, produciendo así una población bacteriana putativamente atenuada. A continuación, los clones individuales de la población bacteriana putativamente atenuada se ensayan para

45 expresión reducida de MGA_0621 con respecto a una bacteria M. gallisepticum natural. Los clones que se identifica que tienen expresión reducida de MGA_0621 se prueban entonces para virulencia. Los clones que presentan tanto expresión reducida de MGA_0621 como virulencia reducida con respecto a una bacteria M. gallisepticum natural se identifican como clones de M. gallisepticum atenuados.

Según este aspecto de la solicitud, la “población inicial de bacterias M. gallisepticum” puede ser cualquier cantidad de

50 bacterias M. gallisepticum. Las bacterias, en ciertas realizaciones, son bacterias naturales. Alternativamente, las bacterias pueden contener una o más mutaciones. Preferentemente, sin embargo, las bacterias en la población inicial son clónicamente idénticas o sustancialmente clónicamente idénticas; es decir, las bacterias se derivan todas preferentemente de una única célula bacteriana de M. gallisepticum parental y/o tienen características genotípicas y/o fenotípicas idénticas o sustancialmente idénticas.

Como se usa en el presente documento, el término “condiciones atenuantes” significa cualquier condición o combinación de condiciones que tenga el potencial para introducir uno o más cambios genéticos (por ejemplo, mutaciones de nucleótidos) en el genoma de una bacteria M. gallisepticum. Condiciones atenuantes no limitantes a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, someter a pases las bacterias en cultivo, transformar las bacterias con un

5 elemento genético insertable en el genoma tal como un transposón (por ejemplo, un transposón que se inserta aleatoriamente en el genoma de M. gallisepticum), exponer las bacterias a uno o más mutágenos (por ejemplo, mutágenos químicos o luz ultravioleta), etc. Si las células bacterianas se atenúan sometiéndolas a pases in vitro, las células pueden someterse a pases cualquier número de veces, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o más veces in vitro.

10 La población inicial de células de M. gallisepticum, después de haberse sometido a condiciones atenuantes, se denomina en el presente documento una población bacteriana putativamente atenuada. Los clones individuales de la población bacteriana putativamente atenuada pueden obtenerse por técnicas de microbiológica convencional que incluyen, por ejemplo, diluir sucesivamente las células y sembrar las células individuales sobre medios apropiados. Una vez obtenidos, los clones individuales de la población bacteriana putativamente atenuada se ensayan para expresión

15 reducida de MGA_0621 y/o una o más proteínas especificadas adicionales. Los procedimientos para determinar si una bacteria M. gallisepticum atenuada presenta o no expresión reducida de una o más proteínas que normalmente se expresan en células bacterianas de M. gallisepticum naturales se describen en cualquier parte en el presente documento. Procedimientos a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, procedimientos basados en RT-PCR, transferencia Western, etc.

20 Los clones individuales que se identifican por tener expresión reducida de MGA_0621 pueden probarse para virulencia por la administración de los clones a un animal que es susceptible a infección por la versión natural (sin atenuar) de la bacteria. Como se usa en el presente documento, “un animal que es susceptible a infección por una bacteria M. gallisepticum natural” es un animal que muestra al menos un síntoma clínico después de exponerse a una bacteria M. gallisepticum natural. Tales síntomas son conocidos para los expertos en la materia. Por ejemplo, en el caso de una

25 cepa de M. gallisepticum putativamente atenuada que presenta expresión reducida de, por ejemplo, MGA_0621, la cepa puede administrarse a, por ejemplo, pavos o pollos (que son normalmente susceptibles a infección por M. gallisepticum natural). Los síntomas clínicos de infección por M. gallisepticum de aves de corral incluyen, por ejemplo, síntomas respiratorios agudos, pericarditis, perihepatitis, aerosaculitis, engrosamiento de la tráquea, aumento de peso reducido, deciliación, células caliciformes anormales, distensión capilar, números elevados de linfocitos, células

30 plasmáticas y/o heterófilos, y en algunos casos producción reducida de huevos. Así, si la cepa de M. gallisepticum putativamente atenuada, cuando se administra a un pollo o pavo, produce menos síntomas y/o síntomas menos graves con respecto a un pavo o pollo que se ha infectado por una cepa de M. gallisepticum natural, entonces se considera que la cepa de M. gallisepticum putativamente atenuada tiene “virulencia reducida”. Cualquier grado de reducción en síntomas identificará la cepa putativamente atenuada como que tiene virulencia reducida. En ciertas realizaciones, la

35 cepa putativamente atenuada será avirulenta.

Según la presente invención, un clon de M. gallisepticum que presenta expresión reducida de MGA_0621 (y/o una o más proteínas especificadas adicionales) y que presenta virulencia reducida con respecto a una bacteria M. gallisepticum natural es un clon de M. gallisepticum atenuado. Un clon de M. gallisepticum atenuado vivo a modo de ejemplo de la presente invención, que presenta expresión reducida de MGA_0621 (junto con expresión reducida de

40 piruvato deshidrogenasa, fosfopiruvato hidratasa, 2-desoxirribosa-5-fosfato aldolasa y proteína ribosómica L35) es la cepa designada MGx+47. MGx+47 se ha depositado en la Colección americana de cultivos tipo, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, el 19 de junio de 2007, y a la que se le asignó el número de acceso PTA-8485.

Los siguientes ejemplos son ilustrativos, pero no limitantes, del procedimiento y composiciones de la presente invención.

45 Ejemplos

Ejemplo 1

Generación de una cepa de m. gallisepticum atenuada viva

Se generó una nueva cepa de Mycoplasma gallisepticum atenuada viva pasando una cepa de M. gallisepticum natural R980 múltiples veces in vitro. En particular, 0,1 ml de material de semilla de la cepa de M. gallisepticum natural R-980 50 se inoculó en 20 ml de medio de Frey modificado (Frey y col., Am. J. Vet. Res. 29:2163-2171 (1968) (también denominado en el presente documento “medio de cultivo MG”). Las células naturales se cultivaron hasta que el medio cambió de color a amarillo brillante. Los cultivos amarillos brillantes se usaron posteriormente para re-inocular el medio de cultivo MG fresco como se ha descrito anteriormente. El cultivo se sometió a pases un total de 47 veces de este modo. La cepa resultante se probó para atenuación vacunando grupos de aves, seguido de exposición usando M. 55 gallisepticum natural. A todas las aves se les hizo la autopsia dos semanas después de la exposición y se observaron las patologías relacionadas con Mycoplasma. La cepa de alto pase (x+47) proporcionó protección contra los signos

clínicos asociados a infección por Mycoplasma gallisepticum. Esta cepa de M. gallisepticum atenuada designada MGx+47 se depositó en la Colección americana de cultivos tipo, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, el 19 de junio de 2007, y se le asignó el número de acceso PTA-8485.

Ejemplo 2 Evaluación de seguridad y eficacia de una vacuna de m. gallisepticum atenuada viva en pollos

En este ejemplo se evaluó la seguridad y eficacia de la nueva cepa de la vacuna de M. gallisepticum MGx+47 obtenida en el Ejemplo 1 en pollos.

Setenta y un pollos Leghorn blancos SPF se dividieron en siete grupos del siguiente modo:

Tabla 1: Diseño del estudio

Grupo: Nº de pollos Vacunados Expuestos

1: 11 No Yes

2: 10 Sí No

3: 11 Sí Sí

4a: 10 Sí No

4b: 11 Sí No

4c: 9 Sí No

5: 9 No No

Los pollos en los grupos 2, 3, 4a, 4b y 4c se vacunaron con la cepa MGx+47 atenuada a 3,62 x 107 UCC/ml/ave, administrada por pulverización densa a las 4 semanas de edad. Los pollos en los grupos 1 y 3 se expusieron intratraquealmente (IT) a las 7 semanas de edad a 0,5 ml de cepa de Mycoplasma gallisepticum R a 7,74 x 105 UCC/ml. La autopsia se realizó en los pollos de los grupos 1, 2, 3 y 5 a las 9 semanas de edad, y la autopsia se realizó

15 en los pollos de los grupos 4a, 4b y 4c 7, 14 y 21 días después de la vacunación (DDV), respectivamente. Los pollos se evaluaron para aumento de peso promedio, pericarditis, perihepatitis, aerosaculitis y traqueítis. Los resultados se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2: Resumen de seguridad y eficacia Vacunación = 3,62 x 107 UFC/ml/ave Exposición = 0,5 ml a 7,74 x 105 UFC/ml

Grupo: Vacunado Expuesto Aumento de peso promedio (kg/día) Pericarditis Perihepatitis Aerosaculitis Puntuación de aerosaculitis(promedio de positivos) Tráquea (histología)

1: No Sí 0,016 0/11 0/11 9/11 3,56 Traqueítis grave

2: Sí No 0,018 0/10 0/10 0/10 0 Normal

3: Sí Sí 0,017 0/11 0/11 2/11 2,5 Traqueítis mixta

4a: Sí No 0,016 0/9 0/9 0/9 0 Normal

4b: Sí No 0,017 0/11 0/11 0/11 0 Normal

4c: Sí No 0,017 0/10 0/10 0/10 0 Normal

5: No No 0,015 0/9 0/9 0/9 0 Normal

Tabla 3: Tabla de seguridad: Informe de histología de tráqueas de pollo fijadas en formalina de pollos vacunados/sin exponer individuales (grupo 4a, 4b y 4c)

Momento de tiempo: Pollo Cilios Células caliciformes/M Distensión capilar LC/PC PMN Espesor (micrómetros)

7 DDV: 1 N - - - - 30

2: N - - - - 30

3: N - - - - 30

4: N - - + - 30

5: N - - - - 30

6: N - - + - 30

7: N - - + - 30

8: N - - - - 30

9: N + - - - 30

14 DDV: 1 N - - - - 50

2: N + - - - 50

3: N - - + - 50

4: N - - - - 50

5: N - - - - 50

6: N - - - - 50

7: N - - - - 50

8: N - - - - 50

9: N - - + - 50

10: N - - - - 50

11: N - - + - 50

21 DDV: 1 N - - - - 50

2: N - - ++ - 110

3: N - - - - 50

4: N - - - - 50

5: N - - - - 50

6: N - - + - 50

7: N - - - - 50

8: N - - - - 50

9: N - - - - 50

10: N - - - - 50

Tabla 4: Tabla de eficacia: Informe de histología de tráqueas de pollo fijadas en formalina de pollos individuales

Grupo: Pollo Cilios Células caliciformes/M Distensión capilar LC/PC PMN Espesor (micrómetros)

1: Sin vacunar; expuestos

1: - + ++ ++++ ++ 410

2: +/- - - + - 90

3: N + - - - 50

4: - - ++++ ++++ - 420

5: N + + + - 60

6: - + ++++ ++++ +++ 400

7: - - ++++ ++++ - 440

8: - - ++++ ++++ ++++ 280

9: - + - - - 40

10: - - ++++ ++++ - 260

11: - + ++++ ++++ +++ 450

3: Vacunados y expuestos

1: - - ++ ++++ - 380

2: N - + + - 40

3: N - + + - 50

4: - - + +++ ++ 220

5: N - + + - 60

6: N - + + - 60

7: N - - - - 50

8: N - - - - 50

9: N - + + - 50

10: +/- - + ++ - 140

5: Sin vacunar; sin exponer

1: N - - + - 50

2: N - - + - 50

3: N - - - - 50

4: N - - + - 50

5: N - - - - 50

6: N - - + - 50

7: N - - - - 50

10 (continuación)

8: N - - + - 50

9: N - - - - 50

Clave para las tablas de seguridad y eficacia (tablas 3 y 4):

• Todas las aves “vacunadas” se vacunaron por pulverización densa con la cepa de vacuna MGx+47 a 3,62 x 107 5 UCC/ml/ave;

•: Todas las aves “expuestas” se expusieron intratraquealmente (IT) a 0,5 ml de cepa de Mycoplasma gallisepticum R a 7,74 x 105 UCC/ml

•: Momento de tiempo (en la Tabla 3: Tabla de seguridad) = número de días después de la vacunación cuando los pollos se examinaron, expresado como nº de días después de la vacunación (DDV).

10 • Cilios: “N” = cilios normales; “-” = deciliación;

•: Células caliciformes/M (“-” = células caliciformes normales; “+” = moco que se encuentra sobre la superficie respiratoria);

•: Distensión capilar (“-” = sin distensión o inflamación; “+” = distensión capilar o inflamación moderada; “++” = distensión capilar o inflamación grave);

15 • LC/PC = Linfocitos y células plasmáticas (“-” = ninguna; “+” = pocas; “++++” = numerosas);

• PMN = Heterófilos (“-” = ninguno; “+” = pocos; “++++” = numerosos);

El análisis de histología de los pollos del grupo 2 (vacunados pero no expuestos) fue sustancialmente similar al de los pollos del grupo 5 (sin vacunar, sin exponer), demostrando la seguridad de la cepa de vacuna MGx+47 recientemente generada (véase, por ejemplo, la Tabla 2 anterior).

20 Con respecto a la eficacia, los pollos del grupo 3 (vacunados y expuestos) mostraron aerosaculitis significativamente reducida en comparación con los pollos del grupo 1 (sin vacunar y expuestos) (véanse, por ejemplo, las Tablas 2 y 4). Además, como se ilustra en la Tabla 4, los pollos del grupo 3 presentaron menores signos histológicos de infección por

M. gallisepticum con respecto a cilios, células caliciformes, distensión capilar, linfocitos y células plasmáticas (LC/PC), heterófilos (PMN) y espesor de la tráquea (véase la Tabla 4).

25 Así, este ejemplo demuestra que MGx+47 es una cepa de vacuna de M. gallisepticum atenuada viva segura y eficaz.

Ejemplo 3

Caracterización proteómica de la cepa de vacuna mgx+47

En un esfuerzo por definir más precisamente la cepa de la vacuna MGx+47 (véanse los Ejemplos 1 y 2) al nivel molecular, se realizó un análisis proteómico de esta cepa.

30 En este ejemplo, proteína total se aisló de la cepa de M. gallisepticum natural R-980 y de la cepa de vacuna recientemente identificada MGx+47. Las proteínas de cada cepa se resolvieron por electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional, seguido de análisis computerizado de las imágenes del gel (véase la Figura 1). Se identificaron manchas de proteína que se expresaron diferencialmente en la cepa de vacuna. Las manchas de proteína que estuvieron ausentes, o se expresaron a niveles significativamente reducidos, en la cepa de vacuna en comparación

35 con la cepa natural se escindieron del gel.

Se identificaron cinco manchas que se expresaron a niveles significativamente menores en la cepa de vacuna MGx+47 con respecto a M. gallisepticum natural. Cada una de estas manchas de proteína se escindió del gel y se digirió enzimáticamente. Seguido de huella peptídica usando espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción/ionización láser asistida por matriz (EM MALDI-TOF). Los espectros de masas identificados para cada

40 mancha de proteína se compararon con una base de datos de masas de péptidos para identificar las proteínas y los genes correspondientes que las codifican. Los resultados de este análisis se resumen en la siguiente tabla:

Tabla 5: Resumen del análisis proteómico de MGx+47

Gen: Producto Función Nivel de expresión en MG natural Nivel de expresión en MGx+47 Disminución del porcentaje en la expresión

acoA: Piruvato deshidrogenasa Requerida para la producción y conversión de energía (ciclo de Krebs) 0,1872 0,0858 54,2%

eno: Fosfo-piruvato hidratasa Cataliza la formación de fosfoenol-piruvato 0,0683 0,0173 74,7%

deoC: 2-Desoxirribosa-5fosfato aldolasa Requerida para el metabolismo de nucleótidos 0,0525 0,0309 41,1%

rpml: Proteína ribosómica L35 Traducción, estructura ribosómica y biogénesis 0,1171 0,0259 77,9%

MGA_0621: Proteína hipotética Desconocida 0,4534 0,0835 81,6%

La disminución en la expresión de los productos génicos también puede expresarse en términos de “veces de disminución en la expresión”. Por ejemplo, en la Tabla 5, puede decirse que la cepa MGx+47 presenta una disminución 5 de 2,2, 3,9, 1,7, 4,5 y 5,4 veces en la expresión de acoA, eno, deoC, rpml y MGA_0621, respectivamente, con respecto a MG natural.

Como se indica en la Tabla 5, se identificaron cinco productos génicos que tenían expresión significativamente reducida en la cepa de vacuna MGx+47 atenuada viva con respecto a la cepa R-980 natural: AcoA, Eno, DeoC, Rmpl, y MGA_0621 (una proteína hipotética identificada bajo el número de acceso de NCBI NP_852784). La mayor

10 disminución en la expresión se observó para MGA_0621. Así, es probable que mutaciones o condiciones de crecimiento que producen una disminución en la expresión de MGA_0621 produzcan la atenuación de M. gallisepticum. Por tanto, parece que la regulación por disminución de MGA_0621 es una estrategia eficaz para producir cepas de M. gallisepticum atenuadas.

Listado de secuencias

15 <110> Wyeth

Kumar, Mahesh

Khan, Muhammad Ayub

<120> Cepas de Mycoplasma gallisepticum atenuadas

<130> AM102888

<150> 60/993447

<151> 11/09/2007

<160> 1

<170> PatentIn versión 3.4

<210> 1

<211> 162

<212> PRT

<213> Mycoplasma gallisepticum

<400> 1

Claims

REIVINDICACIONES

1.

La bacteria Mycoplasma gallisepticum viva atenuada depositada en la ATCC bajo el número de acceso PTA-8485.
2.

Una composición de vacuna que comprende:

(a) la bacteria Mycoplasma gallisepticum viva atenuada según la reivindicación 1; y 5 (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
3.

La composición de vacuna según la reivindicación 2 para su uso en vacunar un animal contra infección por Mycoplasma gallisepticum.
4.

La composición de vacuna para su uso según la reivindicación 3, en la que dicha composición de vacuna es para

administración a dicho animal por inyección directa, administración por pulverización o administración en el agua 10 potable.

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