CN101893570B - 谷物类农产品中阿维菌素类农药多残留检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了谷物类农产品中阿维菌素类农药多残留检测方法。该方法用乙腈提取残留在谷物类农产品中阿维菌素类农药，利用盐析作用使含有阿维菌素类农药的有机相与水相分离，提取出的阿维菌素类农药在无水状态下用三氟乙酸酐(TFAA)-N-甲基咪唑(NMIM)-乙腈(ACN)法荧光衍生化后，通过高效液相色谱-荧光检测方法(HPLC-FD)实现它们的痕量残留分析。本发明专利的方法可实现对大米、小麦、玉米等多种谷物类农产品中阿维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和伊维菌素的残留量进行痕量分析检测，同时具有简便省时、低成本等优点。

Description

谷物类农产品中阿维菌素类农药多残留检测方法

技术领域

本发明涉及农产品中农药残留检测分析方法，尤其是一种谷物类农产品中阿维菌素类农药多残留检测方法。

背景技术

阿维菌素(Avermectin，简称AVM)是1976年日本北里大学大村智等和美国默沙东公司合作，从阿维链霉菌的发酵产物中分离出基本结构为十六元大环内酯二糖苷类化合物。该类化合物有4个主要组分：A1a，A2a，B1a，B2a；4个次要组分：A1b，A2b，B1b，B2b，其中抗虫活性最强的为B1a。Abamectin即Avermectin B1，含Avermectin B1a≥80％，Avermectin B1b≤20％。1985年阿维菌素作为农药投入市场后，以阿维菌素为母体，通过半合成，进行结构改造，已开发出一系列活性更高，选择性更强，安全性更优的衍生新品种。目前已经成熟商品化阿维菌素衍生化合物有：伊维菌素(ivermectin，简称IVM)、埃玛菌素(emamectin，又称甲氨基阿维菌素)、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、道拉菌素(dormectin)、埃珀利诺菌素(eprinomectin，又称乙酰氨基阿维菌素)和色拉菌素(selamectin)等。由此可以看出，阿维菌素不仅是一个优异的产品，还是一种宝贵的资源。以它为起点，用最短的时间，最少的费用，可开发出更多更好的新产品。因此，业内专家认为，阿维菌素的问世，是继青霉素以来抗生素的又一次革命。

阿维菌素类农药以广谱、高效，并能与多数农药混配使用，扩大了杀虫谱，在农业生产上迅速得到广泛应用，是我国目前用量最大、使用范围最广的杀虫剂之一。阿维菌素类农药对多种农业害虫都有很高的敏感性，包括双翅目的蝇蛆、纳、虹、痰蚊；同翅目的木虱、粉虱、蚜；膜翅目的蚁、蜂、叶蜂；缨翅目的蓟马；鞘翅目的各类甲虫；半翅目的蜻蛛；鳞翅目幼虫(蝶、蛾、潜叶蛾等)。在农业生产上，它的用药量仅为菊酯类农药的1/50-1/200。作为甲胺磷、马拉硫磷等高毒农药的替代品种，2008年国家农业部批准推荐阿维菌素和阿维菌素甲维盐类在水稻上使用，目前在国内水稻、小麦、玉米等谷物类作物生上，阿维菌素类农药早已开始大面积应用。

尽管是通过微生物发酵工艺生产的农药，但本质上而言，阿维菌素类农药是生物合成的有机化学农药。据毒理学试验数据，阿维菌素对大鼠的致死中量值为10mg/kg，与对硫磷的致死中量值(3.5-12.5mg/kg)相仿。按WHO五级分级标准，它属高毒化合物。目前阿维菌素对动物的急性中毒机制仍不明确，可能与它进入中枢系统有关。阿维菌素中毒时动物的主要表现在神经病态症状，乃至最后死亡。此外，有研究发现，阿维菌素对哺乳动物的繁殖生育能力具有潜在毒性作用。因此，人们对农产品中阿维菌素的最高残留限量(MRL值)标准作了严格要求。如我国农业部规定它的MRL值在柑桔中为20μg/kg，叶菜为50μg/kg；欧盟详细规定了它在多种农产品中的MRL值，在果蔬产品、谷物等农产品MRL值多为10μg/kg。

目前关于阿维菌素类农药的检测方法主要有液相色谱-紫外检测方法(HPLC-UV)、液相色谱-荧光检测方法(HPLC-FD)、液相色谱-质谱检测方法(HPLC-MS)和免疫分析方法。由于HPLC-UV检测灵敏度低而HPLC-MS需要昂贵的仪器，液相色谱-荧光检测方法(HPLC-FD)是目前最适用检测农产品中阿维菌素类农药残留的技术方法。然而，由于阿维菌素类农药在近年来才批准应用在水稻上，以前的文献报道大多关于畜产品上和果蔬类农产品上阿维菌素类农药残留分析方法研究，谷物类农产品中阿维菌素类农药残留分析方法研究非常少。通过专利检索发现，目前尚无关于谷物类农产品中阿维菌素类农药多残留分析方法的专利。

谷物类主要是指禾本科植物的种子。它包括稻米、小麦、玉米等及其他杂粮，比如小米、黑米、荞麦、燕麦、薏仁米、高粱等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种适用大米、小麦、玉米等谷物类农产品中阿维菌素类农药多残留分析的高效液相-荧光(HPLC-FD)检测方法。

本发明解决一种谷物类农产品中阿维菌素类农药多残留检测方法，用于对阿维菌素、伊维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐阿维菌素类等多种农药残留物的同时快速检测，包括下述步骤：

第一步：样品前处理：

取谷物类农产品用研磨机粉碎后，再过80～120目筛，称取样品10～30g置于容器中，加入30～100mL乙腈，在10000～15000r/min高速匀质器匀质2～5min后，放置在微波辅助萃取装置中处理15～20min；

静置1～2h后，将乙腈溶液用萃取样品滤纸过滤至装有3～7g氯化钠的带塞量筒中，滤液剧烈震荡5～10min后静置30～60min，利用盐析作用使有机相分层；

从有机层中吸取10～50mL提取液转移至玻璃试管，然后在50～70℃水浴上氮气吹干；在装有蒸干样品的试管中加入0.3～0.5mL无水乙腈，然后在超声波清洗机上超声0.5～1min，使吸附在试管壁上的多种阿维菌素类农药充分溶解在乙腈中，待衍生化；

第二步：柱前衍生化：

衍生试剂A：N-甲基咪唑与乙腈以1∶(0.8～1.2)(v/v)配置而成；

衍生试剂B：三氟乙酸酐与乙腈以1∶(1.8～2.2)(v/v)配置而成；

在避光、室温环境条件下，在装有乙腈溶解的阿维菌素类农药的试管中，先后分别加入0.1～0.3mL衍生试剂A和0.3～0.5mL衍生试剂B，盖上试管塞充分振荡反应至少1h后，再加入1mL甲醇，盖上试管塞混匀溶液，再充分反应至少1h，得衍生化后的样品溶液；

第三步：色谱检测：

将衍生化后的样品溶液过0.45μm滤膜后，在高效液相色谱-荧光检测器上进行测定，色谱条件为：

色谱柱：Kromasil 100-5-C₁₈，250mm×4.6mm，5μm；

流动相：起始为：水/乙腈/甲醇＝5/10/85(v/v/v)；

4～6min后为：乙腈/甲醇＝20/80(v/v)；

流速为：0.8～1.2mL/min；

检测波长：荧光激发波长为365nm，发射波长为475nm；

柱温：20～40℃；

进样量：10～40μl。

本发明利用相似相溶原理，以乙腈为提取剂，提取谷物类农产品中阿维菌素类农药(阿维菌素、伊维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐)残留，然后在无水状态下用三氟乙酸酐(TFAA)-N-甲基咪唑(NMIM)-乙腈(ACN)法进行荧光衍生，合成有荧光的衍生物，最后在高效液相色谱-荧光检测器进行阿维菌素类农药的痕量分析。

在上述方案的基础上，所述的谷物类农产品包括大米、小麦或玉米。

在上述方案的基础上，所述的阿维菌素类农药为阿维菌素、伊维菌素或甲氨基阿维菌素苯甲酸盐。

在上述方案的基础上，第一步中，谷物类农产品经粉碎、过筛之后如不能立即测定，则放在不高于-20℃的冰箱中保存。

在上述方案的基础上，第二步中，所述的振荡反应为在先后衍生试剂A和衍生试剂B后立即盖上试管塞振荡摇匀，反应至少1h后，试管内再加入1mL甲醇，盖上试管塞混匀溶液，再充分反应至少1h。

在上述方案的基础上，第二步中，所述的振荡反应为在先后衍生试剂A和衍生试剂B后立即盖上试管塞振荡摇匀，等衍生化反应产生的温度降下来后，加入1mL甲醇，盖上试管塞，放到55～65℃水浴上继续衍生化反应至少1小时，取出后用甲醇定容至1mL。

本发明的有益效果是：

1、本发明以乙腈为提取溶剂，能有效对残留在谷物类农产品中的阿维菌素类农药提取，前处理中省略了净化过程，前处理操作更为简便省时和节约成本，每个样品前处理所需时间低于4小时，所用溶剂仅约为50～100ml；

2、在低于15min的色谱保留时间内实现对阿维菌素、伊维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐3种农药的检测分析(如图1所示，阿维菌素8.4min、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐10.2min、伊维菌素10.9min)。

3、在0.01～5mg/L浓度范围，本发明对阿维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和依维菌素有保持良好的线性关系(R²可达0.999)，可实现对此浓度范围内这3种农药进行准确定量分析。

4、本发明对谷物类农产品中阿维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和依维菌素的检测添加回收率范围在80～120％，变异系数为1～15％，最小检测浓度在2μg/g以下，完全符合标残留分析要求。

附图说明

图1为阿维菌素类农药(阿维菌素、伊维菌素和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐)的液相色谱(HPLC-FD)图。

具体实施方式

实施例1：大米中阿维菌素类农药多残留量的检测

第一步：样品前处理：

大米样品用研磨机粉碎后，再过100目筛(样品不能立即测定时放在-20℃冰箱中保存)称取粉碎样品20g置于100mL平底玻璃瓶中，加入50mL乙腈，样品在14000r/min高速匀质器匀质2min后，放置在微波辅助萃取装置中处理20min；

静置1h后，萃取样品滤纸过滤至装有5g左右氯化钠的100mL具塞量筒中，滤液在剧烈震荡5min后静置30min，利用盐析作用使有机相分层；

从有机层中吸取10mL提取液转移至玻璃试管，然后在60℃水浴上氮气吹干。在装有蒸干样品的试管中加入0.4mL无水乙腈，然后在超声波清洗机上超声1min，使吸附在试管壁上的阿维菌素农药充分溶液在乙腈中，待衍生化；

第二步：柱前衍生化：

衍生试剂A：N-甲基咪唑(NMIM)与乙腈以(v/v)1∶1配置而成，现配现用；

衍生试剂B：三氟乙酸酐(TFAA)与乙腈以(v/v)1∶2配置而成，现配现用；

具体操作步骤：在避光、室温环境条件下，在装有0.4mL乙腈溶解的阿维菌素类农药的试管中，先后分别加入0.2mL衍生试剂A和0.4mL衍生试剂B，立即盖上试管塞振荡摇匀，反应1h后，试管内再加入1mL甲醇，盖上试管塞混匀溶液，再充分反应1h，反应液过0.45μm滤膜后进行测定；

第三步：色谱检测：

在高效液相色谱-荧光检测器(HPLC-FLD)上进行测定，色谱条件为：

色谱柱：Kromasil 100-5-C₁₈，250mm×4.6mm，5μm；

流动相：起始为：水/乙腈/甲醇(v/v/v)＝5/10/85；

5min后为：乙腈/甲醇(v/v/v)＝20/80；

流速：1.0mL/min；

检测波长：荧光激发波长为365nm，发射波长为475nm；

柱温：40℃；

进样量：20μl。

技术效果

a)大米样品中最小检出浓度：阿维菌素为1μg/g，甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和依维菌素为2μg/g。

b)添加回收：对大米样品进行0.01mg/kg、0.1mg/kg、1mg/kg三个不同浓度水平的添加回收实验。结果表明，阿维菌素类农药的添加回收率为90.5％～106.5％(见表1)，变异系数在0.85％～5.26％，完全达到了残留分析的要求，见表1所示：

表1大米中阿维菌素、甲氨基阿维菌素和伊维菌素的添加回收率

实施例2：小麦中阿维菌素类农药多残留量的检测

第一步：样品前处理：

小麦样品用研磨机粉碎后，再过100目筛(样品不能立即测定时放在-20℃冰箱中保存)，称取粉碎样品30g置于100mL平底玻璃瓶中，加入90mL乙腈，样品在14000r/min高速匀质器匀质2min后，放置在微波辅助萃取装置中处理20min；

静置1h后，萃取样品滤纸过滤至装有5g左右氯化钠的100mL具塞量筒中，滤液在剧烈震荡5min后静置30min，利用盐析作用使有机相分层；

从有机层中吸取20mL提取液转移至玻璃试管，然后在60℃水浴上氮气吹干。在装有蒸干样品的试管中加入0.4mL无水乙腈，然后在超声波清洗机上超声1min，使吸附在试管壁上的阿维菌素农药充分溶液在乙腈中，待衍生化；

第二步：柱前衍生化：

衍生试剂A：N-甲基咪唑(NMIM)与乙腈以(v/v)1∶1配置而成，现配现用；

衍生试剂B：三氟乙酸酐(TFAA)与乙腈以(v/v)1∶2配置而成，现配现用；

具体操作步骤：在避光、室温环境条件下，在装有0.4mL乙腈溶解的阿维菌素类农药的试管中，先后分别加入0.2mL衍生试剂A和0.4mL衍生试剂B，立即盖上试管塞振荡摇匀，反应1h后，试管内再加入1mL甲醇，盖上试管塞混匀溶液，再充分反应1h，反应液过0.45μm滤膜后进行测定；

第三步：色谱检测：

在高效液相色谱-荧光检测器(HPLC-FLD)上进行测定，色谱条件为：

色谱柱：Kromasil 100-5-C₁₈，250mm×4.6mm，5μm；

流动相：起始为：水/乙腈/甲醇(v/v/v)＝5/10/85；

5min后为：乙腈/甲醇(v/v/v)＝20/80；

流速：1.0mL/min；

检测波长：荧光激发波长为365nm，发射波长为475nm；

柱温：40℃；

进样量：20μl。

技术效果

a)小麦样品中最小检出浓度：阿维菌素为1μg/g，甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和依维菌素为2μg/g。

b)添加回收：对小麦样品进行0.01mg/kg、0.1mg/kg、1mg/kg三个不同浓度水平的添加回收实验。结果表明，阿维菌素类农药的添加回收率为90.5％～106.5％(见表1)，变异系数在0.85％～5.26％，完全达到了残留分析的要求，见表2所示：

表2小麦中阿维菌素、甲氨基阿维菌素和伊维菌素的添加回收率

实施例3：玉米中阿维菌素类农药多残留量的检测

第一步：样品前处理：

玉米样品用研磨机粉碎后，再过100目筛(样品不能立即测定时放在-20℃冰箱中保存)，称取粉碎样品10g置于100mL平底玻璃瓶中，加入30mL乙腈，样品在14000r/min高速匀质器匀质2min后，放置在微波辅助萃取装置中处理15～20min；

静置1h后，萃取样品滤纸过滤至装有5g左右氯化钠的100mL具塞量筒中，滤液在剧烈震荡5min后静置30min，利用盐析作用使有机相分层；

从有机层中吸取10mL提取液转移至玻璃试管，然后在60℃水浴上氮气吹干。在装有蒸干样品的试管中加入0.4mL无水乙腈，然后在超声波清洗机上超声1min，使吸附在试管壁上的阿维菌素农药充分溶液在乙腈中，待衍生化。

第二步：柱前衍生化：

衍生试剂A：N-甲基咪唑(NMIM)与乙腈以(v/v)1∶1配置而成，现配现用；

衍生试剂B：三氟乙酸酐(TFAA)与乙腈以(v/v)1∶2配置而成，现配现用；

具体操作步骤：在避光、室温环境条件下，在装有0.4mL乙腈溶解的阿维菌素类农药的试管中，先后分别加入0.2mL衍生试剂A和0.4mL衍生试剂B，立即盖上试管塞振荡摇匀，反应1h后，试管内再加入1mL甲醇，盖上试管塞混匀溶液，再充分反应1h，反应液过0.45μm滤膜后进行测定；

第三步：色谱检测：

在高效液相色谱-荧光检测器(HPLC-FLD)上进行测定，色谱条件为：

色谱柱：Kromasil 100-5-C₁₈，250mm×4.6mm，5μm；

流动相：起始为：水/乙腈/甲醇(v/v/v)＝5/10/85；

5min后为：乙腈/甲醇(v/v/v)＝20/80；

流速：1.0mL/min；

检测波长：荧光激发波长365nm，发射波长475nm；

柱温：40℃；

进样量：20μl。

技术效果

a)玉米样品中最小检出浓度：阿维菌素为1μg/g，甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和依维菌素为2μg/g。

b)添加回收：对玉米样品进行0.01mg/kg、0.1mg/kg、1mg/kg三个不同浓度水平的添加回收实验。结果表明，阿维菌素类农药的添加回收率为90.5％～106.5％(见表1)，变异系数在0.85％～5.26％，完全达到了残留分析的要求，见表3所示：

表3玉米中阿维菌素、甲氨基阿维菌素和伊维菌素的添加回收率

Claims (4)

1.一种谷物类农产品中阿维菌素类农药多残留检测方法，用于对阿维菌素、伊维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐阿维菌素类多种农药残留物的同时快速检测，其特征在于：所述的阿维菌素类农药为阿维菌素、伊维菌素或甲氨基阿维菌素苯甲酸盐，采用乙腈提取谷物类农产品中阿维菌素、伊维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐这3种阿维菌素类农药的残留，包括下述步骤：

第一步：样品前处理：

取谷物类农产品用研磨机粉碎后，再过80～120 目筛，称取样品10～30g 置于容器中，加入30～100mL 乙腈，在10000～15000r/min 高速匀质器匀质2～5min后，放置在微波辅助萃取装置中处理15～20min；

静置1～2h后，将乙腈溶液用萃取样品滤纸过滤至装有3～7g氯化钠的带塞量筒中，滤液剧烈震荡5 ～ 10min 后静置30 ～ 60min，利用盐析作用使有机相分层；

从有机层中吸取10～50mL提取液转移至玻璃试管，然后在50～70℃水浴上氮气吹干；在装有蒸干样品的试管中加入0.3～0.5mL无水乙腈，然后在超声波清洗机上超声0.5～1min，使吸附在试管壁上的多种阿维菌素类农药充分溶解在乙腈中，待衍生化；

第二步：柱前衍生化：

衍生试剂A ：N- 甲基咪唑与乙腈以1 ∶ (0.8 ～ 1.2)(v/v) 配制而成；

衍生试剂B ：三氟乙酸酐与乙腈以1 ∶ (1.8 ～ 2.2)(v/v) 配制而成；

在避光、室温环境条件下，在装有乙腈溶解的阿维菌素类农药的试管中，先后分别加入0.1～0.3mL 衍生试剂A和0.3～0.5mL衍生试剂B，盖上试管塞充分振荡反应至少1h 后，再加入1mL甲醇，盖上试管塞混匀溶液，再充分反应至少1h，得衍生化后的样品溶液；

第三步：色谱检测：

将衍生化后的样品溶液过0.45μm 滤膜后，在高效液相色谱-荧光检测器上进行测定，色谱条件为：

色谱柱：Kromasil 100-5-C18，250mm×4.6mm，5μm；

流动相：起始为：水/ 乙腈/ 甲醇＝ 5/10/85(v/v/v) ；

4～6min后为：乙腈/甲醇＝20/80(v/v)；

流速为：0.8～1.2mL/min；

检测波长：荧光激发波长为365nm，发射波长为475nm；

柱温：20～40℃；

进样量：10～40μl。

2.根据权利要求1所述的谷物类农产品中阿维菌素类农药多残留检测方法，其特征在于：第一步中，谷物类农产品经粉碎、过筛之后如不能立即测定，则放在不高于-20℃的冰箱中保存。

3.根据权利要求1所述的谷物类农产品中阿维菌素类农药多残留检测方法，其特征在于：第二步中，先后加入衍生试剂A 和衍生试剂B 后立即盖上试管塞振荡摇匀的衍生化反应产生热量，待温度降至室温下来后，加入1mL 甲醇，盖上试管塞，放到55～65℃水浴上继续衍生化反应至少1小时，取出后用甲醇定容至1mL。

4.根据权利要求1所述的谷物类农产品中阿维菌素类农药多残留检测方法，其特征在于：利用盐析作用使有机相分层，省略样品净化过程，荧光衍生反应后直接在仪器上检测分析。