CN101887016B

CN101887016B - 一种利用表面等离子体共振传感器检测睾酮的方法

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Publication number: CN101887016B
Application number: CN2010101930457A
Authority: CN
Inventors: 韦天新; 魏清泉; 王洋
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Priority date: 2010-06-07
Filing date: 2010-06-07
Publication date: 2012-04-25
Anticipated expiration: 2030-06-07
Also published as: CN101887016A

Abstract

本发明涉及一种利用表面等离子体共振传感器检测睾酮的方法，属于激素检测分析技术领域。将睾酮分子印迹识别敏感芯片固定在表面等离子体共振传感器中，对芯片进行角度扫描，记录表面等离子体共振光谱图，得到共振角度θ¹；记录表面等离子体共振光谱图，得到每种标准溶液对应的共振角度θⁿ；以Δθ＝θⁿ-θ¹为纵坐标，以睾酮标准溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线；将待测样品溶液注入流通池，记录表面等离子体共振光谱图，得到共振角度θ^x，计算Δθ^x＝θ^x-θ¹，根据Δθ^x在标准曲线上得到睾酮的含量。本发明具有响应快速，一般5-10分钟内即可出结果；选择性高，能测定睾酮的超低含量；传感器芯片可重复利用，降低了检测成本。

Description

一种利用表面等离子体共振传感器检测睾酮的方法

技术领域

本发明涉及一种利用表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，简称SPR)传感器检测睾酮的方法，属于激素检测分析技术领域。

背景技术

睾酮是一种类固醇类激素，准确检测其含量在环境监测、食品安全等方面具有重要的意义和作用。

目前应用于睾酮素检测的方法主要有气相色谱/质谱、同位素稀释质谱法、薄层色谱、化学发光、高效液相色谱、酶联免疫分析法、放射免疫分析法等。由于气相、液相色谱与质谱仪器昂贵、操作麻烦，而薄层色谱的灵敏度较低，不适合定量分析。因此，对睾酮的检测多是采用自60年代发展起来的放射免疫分析方法和80年代兴起的酶联免疫分析法。放射免疫分析法必须采用放射性标记物，检测设备复杂，必需用专门的放射性探测器进行测定，对操作人员也有放射性污染与伤害，需要特殊的防护和去污设备，此外，因所使用的放射性标记物的放射性核素时刻都在发生衰变，特别是如常用的碘-125、碘-131和磷-32等半衰期短的核素，其保存时期不长，也给测试带来了不便。酶联免疫分析法虽然避免了放射免疫分析法的污染、繁琐、保存期短等问题，但由于其检测范围窄、灵敏度低等缺点仍不能满足需求。在此背景下，国内外学者积极开发新的检测技术和样品预处理方法，通过不同途径进行努力，以寻求建立灵敏、准确、经济、快速的检测方法。在这方面，表面等离子体共振传感器显示出很大的优势。

表面等离子体共振是一种物理光学现象，它通过测量金属表面物质折射率的变化来研究物质的化学和物理吸附性质。基于该效应的生物传感技术已广泛应用于免疫学、药物筛选等多个生化研究领域。与常规检测技术相比，表面等离子体共振具有高灵敏度、响应快、检测过程快捷、能够获得实时数据、操作方便、无需标记、可保持分子的生物活性等突出优点，因此受到人们的广泛关注。免疫分析方面的研究是表面等离子体共振传感技术应用时间最早、应用范围最广并且发展最为完善的领域之一，然而由于该技术对检测环境要求苛刻、造价昂贵以及芯片重复使用性能较差等难以克服的缺点，限制了表面等离子体共振技术在实际检测中的应用。为了进一步改善表面等离子体共振传感器的性能和应用范围，科研工作者们开始将分子印迹技术与表面等离子体共振技术相结合，制备出新型的表面等离子体共振传感器。这种新型的传感器不仅仅局限于生物样品分子，不再受到生物活性探针分子的限制，而且还提高了传感器芯片的重复使用率。

本发明利用光接枝分子印迹聚合物膜的方法制备了表面等离子体共振传感器芯片，并利用该芯片对睾酮进行了检测。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有的检测睾酮含量的方法存在的不足，提供一种利用表面等离子体共振传感器检测睾酮的方法，可以应用于睾酮超低含量的检测。

本发明的原理是：将一种睾酮分子印迹识别敏感芯片作为表面等离子体共振传感器的传感芯片，当待测样品通过传感芯片表面时，根据表面等离子体共振原理，芯片共振角的变化值与待测样品的浓度成正比，因此根据共振角变化值可以测出样品中睾酮的含量。

一种利用表面等离子体共振传感器检测睾酮的方法，以睾酮分子印迹识别敏感芯片作为表面等离子体共振传感器的传感芯片，睾酮分子印迹识别敏感芯片包括玻璃基片、金膜层、单分子烷基链层和分子印迹聚合物膜；该芯片由下往上依次为玻璃基片、金膜层、单分子烷基链层和分子印迹聚合物膜；

所述的单分子烷基链层的结构式为Au-(CH₂)_nCH₃，其中n＝5-17；

所述分子印迹聚合物膜由目标睾酮模板分子、功能单体、交联剂、制孔剂以及光引发剂经光照聚合反应得到，所述功能单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、亚甲基丁二酸、甲基丙烯酸羟乙酯中的一种或两种；所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-亚甲基二丙烯酰胺、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯中的一种；所述制孔剂为二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的一种；光引发剂为二苯甲酮、安息香双甲醚、安息香叔丁醚中的一种或几种。

一种表面等离子体共振传感器芯片的制备方法，其具体步骤为：

1)采用真空蒸镀或溅射的方法在玻璃基片上镀金膜层；

2)将步骤1)中得到的玻璃基片浸入烷基硫醇溶液中，室温放置5～24h，浸泡完成后在金膜层2上自组装一层单分子烷基链层；

3)将步骤2)中得到的玻璃基片装入表面等离子体共振传感器中，表面等离子体共振传感器中的流通池用透紫外光玻璃片盖住，在透紫外光玻璃片背后安装紫外灯；向表面等离子体共振传感器中的流通池中注入聚合溶液，然后用紫外灯照射聚合溶液，光照时间根据所需分子印迹聚合物膜的厚度决定；

4)在步骤3)得到的玻璃基片用制孔剂与乙酸配制的高极性洗脱剂洗脱睾酮模板分子，在分子印迹聚合物膜上留下具有选择性的空穴和结合位点，得到基于光接枝分子印迹聚合物膜的表面等离子体共振传感器芯片；

步骤2)中所述烷基硫醇溶液的溶剂为乙醇、甲醇或三氯甲烷中的一种，所述烷基硫醇溶液浓度为1～100mmol/L，所述烷基硫醇的化学式为HS(CH₂)_nCH₃，其中n＝5-17；

步骤3)中所述聚合溶液由浓度为0.01-0.05mol/L的睾酮模板分子、功能单体、交联剂、制孔剂、光引发剂及溶剂组成，其中睾酮模板分子与功能单体的浓度比为1∶2～4，睾酮模板分子与交联剂的浓度比为1∶4～10，所述光引发剂的浓度为0.1％～1％g/ml；

所述功能单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、亚甲基丁二酸、甲基丙烯酸羟乙酯中的一种或两种，所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-亚甲基二丙烯酰胺、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯中的一种，所述制孔剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的一种，所述光引发剂为二苯甲酮、安息香双甲醚、安息香叔丁醚中的一种或几种。

本发明的一种利用表面等离子体共振传感器检测睾酮的方法，其具体步骤为：

1)将睾酮分子印迹识别敏感芯片固定在表面等离子体共振传感器中，将有机溶剂注入表面等离子体共振传感器中的流通池，使有机溶剂在流通池和表面等离子体共振传感器中的溶剂瓶中循环，当表面等离子体共振传感器的反射光强稳定不变时，对芯片进行角度扫描，记录表面等离子体共振光谱图，得到芯片在有机溶剂中的共振角度θ¹；

2)利用有机溶剂分别配制不同浓度的睾酮标准溶液，然后按照由低到高的浓度顺序，分别单独注入表面等离子体共振传感器中的流通池，使睾酮标准溶液在流通池和试剂瓶中循环；每注入一种标准溶液后，监测动力学吸附曲线，待反射光强稳定不变时，再次注入有机溶剂直至反射光强再次稳定不变时，对芯片进行角度扫描，记录表面等离子体共振光谱图，得到每种标准溶液对应的共振角度θⁿ；

3)利用表面等离子体共振光谱图计算每种标准溶液相对于有机溶剂的共振角度θ¹的角度位移值Δθ，Δθ＝θⁿ-θ¹，然后以Δθ为纵坐标，以睾酮标准溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线；

4)将待测样品溶液注入流通池，使待测样品溶液在流通池和样品瓶中循环，监测动力学吸附曲线，待反射光强稳定时，再次注入有机溶剂直至反射光强再次稳定不变时，对芯片进行角度扫描，记录表面等离子体共振光谱图，得到待测样品的共振角度θ^x，计算待测样品相对于有机溶剂的共振角度θ¹的角度位移值Δθ^x，Δθ^x＝θ^x-θ¹，根据Δθ^x在标准曲线上得到睾酮的含量；

上述步骤1)、步骤2)及步骤4)中的有机溶剂均相同，为二氯甲烷、正己烷、三氯甲烷、甲醇、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、砜类化合物或杂环类化合物中的一种或两种。

有益效果

本发明利用一种睾酮分子印迹识别敏感芯片作为表面等离子体共振传感器的传感芯片，采用表面等离子体共振检测法测定样品中睾酮的含量；该测试方法具有响应快速，一般5-10分钟内即可出结果；选择性高，能够有效测定样品中睾酮的超低含量；相对于免疫学的方法而言，本方法对于检测环境要求不是特别苛刻，扩大了应用范围，传感器芯片可以重复利用，降低了检测成本。

附图说明

图1为表面等离子体共振仪芯片结构示意图；

图2为实施例1中的标准曲线；

1-玻璃片基片，2-金膜层，3-单分子烷基链层，4-分子印迹聚合物膜层。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

一种表面等离子体共振传感器芯片，如图1所示，包括玻璃基片1、金膜层2、单分子烷基链层3和分子印迹聚合物膜4；该芯片由下往上依次为玻璃基片1、金膜层2、单分子烷基链层3和分子印迹聚合物膜4；

所述的单分子烷基链层3的结构式为Au-(CH₂)₁₁CH₃；

所述分子印迹聚合物膜4由模板分子、功能单体、交联剂、制孔剂以及光引发剂经光照聚合反应得到，模板分子为所要印迹的目标分子睾酮，功能单体为甲基丙烯酸；交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；制孔剂为乙腈；

1)采用真空蒸镀的方法在玻璃基片1上镀金膜层2；具体蒸镀的方法为：将2.5×30cm的LASFN9玻璃片放入立式染色缸里，采用2％的去污剂水超声清洗15分钟，然后在二次蒸馏水中超声浸泡15分钟，最后用乙醇清洗2次，将载玻片用氮气吹干；之后在新制的Piranha溶液即H₂SO₄与30％H₂O₂的体积比为3∶1的溶液中于60℃加热一个小时；再依次用蒸馏水、乙醇冲洗，用氮气吹干；将清洗好的玻璃片进行真空蒸镀99.99％的金，真空度为1×10^-5以上，蒸镀速率为

厚度为47nm；

2)将步骤1)中得到的玻璃基片1浸入十二烷基硫醇乙醇溶液中，室温放置24h，浸泡完成后在金膜层2上自组装一层单分子烷基链层3；

3)将步骤2)中得到的玻璃基片1装入表面等离子体共振传感器中，表面等离子体共振传感器中的流通池用透紫外光的BK7玻璃片盖住，在BK7玻璃片背后安装波长λ为365nm的UV-LED点光源；向表面等离子体共振传感器中的流通池中注入聚合溶液，然后用波长λ为365nm的UV-LED点光源照射聚合溶液，光照70分钟后停止光照；溶液的组成为：25mM睾酮模板分子，100mM甲基丙烯酸，150mM二甲基丙烯酸乙二醇酯交联剂以及0.5％克/毫升二苯甲酮光引发剂的乙腈溶液；

4)在步骤3)得到的玻璃基片1用体积比为7∶3的乙腈与乙酸混合溶液洗脱模板分子，得到睾酮分子印迹识别敏感芯片；

5)将睾酮分子印迹识别敏感芯片固定在表面等离子体共振传感器中，将有机溶剂乙腈注入表面等离子体共振传感器中的流通池，使乙腈在流通池和表面等离子体共振传感器中的溶剂瓶中循环，当表面等离子体共振传感器的反射光强稳定不变时，对芯片进行角度扫描，记录表面等离子体共振光谱图，得到芯片在有机溶剂中的共振角度θ¹＝69.00°；

6)利用有机溶剂乙腈分别配制不同浓度的睾酮标准溶液，浓度分别为：10^-20mol/L、10^-18mol/L、10^-16mol/L、10^-14mol/L、10^-12mol/L、10^-10mol/L、10^-8mol/L和10^-6mol/L，然后按照由低到高的浓度顺序，分别单独注入流通池，使睾酮标准溶液在流通池和试剂瓶中循环；每注入一种标准溶液后，监测动力学吸附曲线，待反射光强稳定不变时，再次注入有机溶剂直至反射光强再次稳定不变时，对芯片进行角度扫描，记录表面等离子体共振光谱图，得到每种标准溶液对应的共振角度θⁿ；

7)利用表面等离子体共振光谱图计算每种标准溶液相对于有机溶剂的共振角度θ¹的角度位移值Δθ，Δθ＝θⁿ-θ¹，见表1，然后以Δθ为纵坐标，以睾酮标准溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线，相关系数为R²＝98.82％；如图2所示；

8)将待测样品溶液注入流通池，使待测样品溶液在流通池和样品瓶中循环，监测动力学吸附曲线，待反射光强稳定时，再次注入有机溶剂直至反射光强再次稳定不变时，对芯片进行角度扫描，记录表面等离子体共振光谱图，得到待测样品的共振角度θ^x＝69.46，计算待测样品相对于有机溶剂的共振角度θ¹的角度位移值Δθ^x＝0.46，Δθ^x＝θ^x-θ¹，根据Δθ^x在标准曲线上得到睾酮的含量为10^-13.7mol/L，如图2所示。

表1不同浓度溶液的共振角变化值

浓度(-logM，mol/L)	θⁿ	Δθ
			20	69.06	0.06
19	69.16	0.16
			18	69.28	0.28
17	69.38	0.38
			16	69.58	0.58
10	69.76	0.76
			8	69.96	0.96
6	70.06	1.06

Claims

1.一种利用表面等离子体共振传感器检测睾酮的方法，其特征在于具体步骤为：

上述步骤1)、步骤2)及步骤4)中的有机溶剂均相同，为二氯甲烷、正己烷、三氯甲烷、甲醇、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺中的一种或两种。