CN101886097A - 高纯度茶黄素的制备工艺及其作为制备抗流感病毒药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高纯度茶黄素的制备工艺，其制备过程为：将绿茶经乙酸乙酯提取后，进行茶多酚底物组成和浓度的调整，然后加入用新鲜茶叶制备的发酵酶，通入氧气进行搅拌发酵，然后经分离、浓缩、水洗、转溶、柱分离，浓缩，最后进行干燥、粉碎、过筛，从而得到合格的茶黄素产品。通过该工艺制得的本方法采用了调整酶底物技术，利用可控性纯有机相氧化发酵，可制得高纯度、具有特定化学组成的茶黄素产品，具有绿色环保，质量稳定，收率高，以及成本低等特点，并解决了传统的酯、水、渣混合相发酵后无法三相分离的问题，从而能够进行稳定可控的工艺化生产。制得的高纯度茶黄素应用于制备抗流感病毒药物。

Description

高纯度茶黄素的制备工艺及其作为制备抗流感病毒药物的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种制备茶黄素的工艺，尤其涉及一种高纯度茶黄素的制备工艺，以及其作为制备抗流感病毒(H1N1)药物的应用。

(二)背景技术

1、茶黄素化学结构及生理功能

茶黄素是茶叶中儿茶素类物质经发酵氧化而形成的大芳香环类的一种天然色素，属于多酚羟基具茶骈酚酮结构的物质，最早是由红茶中发现，是红茶中最主要的活性物质。在红茶加工过程中，茶叶中的儿茶素(catechins)被氧化形成茶黄素(theaflavins，TF)和茶红素(thearubins，TR)等。传统上也将这种氧化过程称为发酵。茶黄素茶红素赋予红茶所特有的颜色和味道。

茶黄素主要由四种化合物组成：茶黄素单体(theaflavin，TF1)、3-没食子酸酯茶黄素单体(theaflavin-3-gallate，TF2a)、3’-没食子酸酯茶黄素单体(theaflavin-3′-gallate，TF2b)和3，3’-二没食子酸酯茶黄素单体(theaflavin-3，3′-digallate，TF3)，一般将其统称为茶黄素。茶黄素的化学结构为：

图1茶黄素化学结构

茶黄素具有广泛的生物活性和生理功能。经体外实验、动物实验及人体临床实验，证实其主要的生理功能：

(1)对心脑血管疾病方面的功效，主要表现为调节血脂异常、抗凝、促纤溶、降低血黏度作用、抗脂质过氧化作用、对动物心肌细胞急性缺血损伤有保护作用、改善微循环等。

(2)抗菌消炎方面，茶黄素及茶黄素的4个单体对肉毒芽孢杆菌、肠炎杆菌、金色葡萄球菌、荚膜杆菌、腊样芽胞杆菌、志贺细菌均有显著的抑制作用。茶黄素中的茶黄素没食子酸酯，在1mg/mL浓度下，24小时可完全杀死百日咳。

(3)强抗氧化剂，可用于清除自由基。

(4)茶黄素还具有抑制肿瘤生长，抑制爱滋病病毒功效，研究表明，茶黄素及没食子酸酯对艾滋病毒(包括人体免疫缺损病毒I型(HIV-1))的逆转录酶及各种细胞的DNA和RNA聚合酶活性有抑制作用。茶黄素及其没食子酸酯不仅抑制逆转录酶，而且抑制人体DNA聚合酶α、β、γ以及大肠杆菌的RNA聚合酶。茶黄素强大的药理功效正被应用到多个领域，目前已出现了茶黄素的保健药品，抗氧化制品及肿瘤和爱滋病的辅助治疗用品。随着功效应用的研究和临床试验的深入，茶黄素将被应用到更多的方面。

2、茶黄素生产的茶原料及茶黄素生产方法

(1)茶品种的选择

从茶黄素生产的原料方面来看，目前国内生产厂家主要是采用小叶种茶叶(Camellia sinensis var.sinensis)，即传统的绿茶。从植物分类学角度来说，茶树属山茶科山茶属，为多年生常绿木本植物。一般为灌木，在热带地区也有乔木型茶树高达15-30米，基部树围1.5米以上，树龄可达数百年至上千年。茶树学名为[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]。在[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]下，茶树又分为两个重要的变种：Camellia sinensis var.sinensis-茶种(中国种)，俗称小叶种茶。国内的大部分绿茶均为小叶种茶。Camellia sinensis var.assamica-普洱种(阿萨姆种)，俗称大叶种茶。最具代表性的是普洱茶，以及印度阿萨姆种茶。

大叶种茶与小叶种茶的主要区别体现在以下几个方面：

形态区别。大叶种角质层厚度2～4μm；中小叶种角质层厚度4～8μm。大叶种栅栏组织通常只有1层，遮荫下会增加；中小叶种有栅栏组织2层，多达3层。大叶种栅栏组织细胞内叶绿体较多，有60～100片层，光合速率较高，海绵组织比较多而松，叶背的气孔大而细，叶色多带黄绿，叶尖较锐长，梗和节间长，单位叶片面积的气孔数较少，气孔的保卫细胞较大，蒸腾速率快；小叶种栅栏组织细胞内叶绿体较少，有20～40片层，光合速率较低，海绵组织少而密，叶背气孔多而密，叶色多浓绿：叶尖较钝。据严学成研究，大叶种茶树气孔密度约100个/mm²，最多为150～180个/mm²；中小叶种约200～260个/mm²。

一般大叶种叶大柔软，叶面的革质层也比较薄；而小叶种叶片小而脆硬，叶面的革质层较厚，叶片硬脆，对制茶品质不良，但有利于抗逆性。大叶种的栅栏组织与海绵组织的比例为1∶2或1∶3，而小叶种的比例为1∶1或1∶1.5，即大叶种的海绵组织细胞较小叶种多。因此，茶多酚、咖啡碱等有效物质较多，制成的茶味道浓烈。小叶种的栅栏组织较多，胡萝卜素、叶黄素总量高，这些萜烯类衍生物可分解成β-紫罗酮和茶螺烯酮等香气物质，所以小叶种可以制出高香的茶叶。

化学成分的差异。茶叶内含成分中茶多酚、氨基酸和咖啡碱含量是茶树品种最重要特性。茶树品种不同。物质代谢类型也不同，其生化特性的差异也反映在茶树新梢多酚类的含量与组成上。南方大叶种碳代谢强烈，茶多酚代谢旺盛，茶多酚、儿茶素总量、酯型儿茶素(EGCG及ECG)和酚/氨比值大，形成茶黄素的潜力大，适制红茶、普洱茶。中小叶种氮代谢和氨基酸代谢旺盛，氨、氨基酸、茶氨酸含量高，其香气、滋味高爽，适合制作绿茶。

云南大叶种茶树的鲜叶含有较高的茶多酚，其中儿茶素含量占茶多酚总量的70％，而一般小叶种茶树的鲜叶茶多酚含量较低。一般来说，茶叶中儿茶素类化合物的组成中以EGCG含量最高，其次是ECG和EGC，但在云南大叶种中ECG含量几乎接近EGCG，而且EC和C的含量和EGC相近，甚至超过EGC的含量。有研究表明，小叶种儿茶素中EGCG与ECG之比远大于大叶种儿茶素，小叶种儿茶素中平均比值为3.5598，大叶种儿茶素中平均比值为1.3245，说明小叶种儿茶素中EGCG所占的比例远高于大叶种儿茶素中EGCG的比例。大叶种儿茶素的酯型儿茶素的比例大于小叶种儿茶素的酯型儿茶素的比例，说明大叶种中酯型儿茶素的质量分数大于小叶种儿茶素中酯型儿茶素的质量分数，致使大叶种儿茶素的，抗氧化效果强于小叶种儿茶素。

(2)当前茶黄素的生产技术

目前茶黄素生产主要集中在中国，而国内真正生产茶黄素的厂家也很少。生产茶黄素的生产工艺很比较落后。目前茶黄素的生产主要采用以下方法：

a.传统方法从红茶中提取精制而得茶黄素；

b.采用化学发酵法将茶多酚转化为茶黄素；

c.采用传统的游离酶发酵法生产茶黄素。

这些技术的主要缺点为：工艺工业化能力很差，工艺化过程出现大量不能解决的问题，例如，工业化生产时酶转化率低，而且难以控制；生产出的茶黄素产品纯度低(茶黄素含量20％以下)；产品质量控制困难，例如，产品的色泽不一，以及溶解度、澄清度等不够理想；收率低；生产成本大；以及生产过程中用强酸强碱，产生大量的废水，环境污染严重。

公开号为CN101285081A的发明专利申请，公开了一种制备茶黄素的新工艺，其虽提高了茶黄素产品的纯度，茶黄素含量可达45％，但其纯度仍然偏低，且按此工艺生产的茶黄素产品中，茶黄素单体TF1的含量比例高，而茶黄素单体TF1与其他三种单体相比，茶黄素单体TF1的作用差，茶黄素单体TF1的含量高，致使茶黄素产品的产品功效降低。

3、流感、流感病毒以及神经氨酸酶抑制剂

流感是一类具有高度传染性的急性呼吸道疾病，自古以来一直危及人类的健康。流感是由流感病毒所引起的，从社区性流行病或世界性流行病的角度来看，这类高度传染的病毒性疾病都是造成发病率和死亡率的主要原因之一。流感之所以能够快速传播，主要在于流感病毒本身具有高度传染性，而且流感病毒的潜伏期很短，以及在病毒脱落阶段呼吸道分泌物中所具有的高病毒值(highvirus titer)病毒传播所致。通过咳嗽和喷嚏而散发出含有大量病毒的呼吸道分泌液，这是人类流感传播的主要方式。通过直接或间接接触也是造成病毒传播的可能途径。病毒经快速复制后可感染整个上、下呼吸道，病毒需要大约5-7天的时间才能脱落到鼻咽分泌液中，然后再经1-4天的潜伏期，开始出现各种流感症状，包括发烧，并伴随着各种呼吸道疾病，如咳嗽、流鼻涕、头痛、乏力以及肌肉疼痛等系统性或非系统性症状。多种系统性症状的发作，会影响肺、心脏、大脑、肝脏和肌肉等器官的功能，甚至造成死亡。每年大约占世界人口总数20％的人群会得流感，并对全球产生一定的影响。例如，2009年的甲型流感造成全国性的恐慌和警觉，国家采取了积极的应对措施来控制其可能的蔓延。

流感病毒属于正粘液(Orthomixoviridae)病毒中的一类成员。根据病毒核衣壳蛋白质(Nucleocapsid Protein，NP)和基质蛋白(Matrix Protein，MP)之间的不同抗原性，可以将流感分为三种类型，即甲型、乙型和丙型流感。其中甲型流感又可根据病毒表面上的糖蛋白血凝素(Glycoproteins Hemagglutinin，HA)和神经氨酸(Neuraminidase，NA)的不同而作进一步的划分。

神经氨酸酶是分布于甲型和乙型流感病毒被膜上的一种醣蛋白，它具有抗原性，可以催化唾液酸水解，协助成熟流感病毒脱离宿主细胞感染新的细胞，在流感病毒的生活周期中扮演了重要的角色。在甲型流感病毒中，神经氨酸酶的抗原性会发生变异，这成为划分甲型流感病毒亚型的依据。

分布于流感病毒包膜表面的神经氨酸酶是一个四聚体，由四个结构完全相同的单体亚基组合而成，其中每两个亚基通过一个二硫键相互链接，每两对单体即四个单体组成一个四聚体。每一个单体由球形的头部和细长的颈部两部分组成，头部是神经氨酸酶的活性部位，颈部则负责将蛋白锚定在病毒包膜表面。四聚体蛋白通过纤细的颈部与包膜连接，形状犹如蘑菇。1983年人们通过X射线衍射实验测定了神经氨酸酶头部的三级结构。实验测定结构显示，神经氨酸酶的活性头部是由六个β片层围绕成的桶状结构，桶状结构的内部是该酶的催化中心。实验显示，在所有亚型甲型流感病毒和乙型流感病毒表面分布的神经氨酸酶之间，一级结构即氨基酸序列的同源性并不高，仅有30％的氨基酸残基是同源的，但是亚基催化中心的附近的一段10余个残基组成的序列却高度保守。

目前，预防和治疗流感的最主要手段是注射疫苗和药物。但在很多情况，单纯地注射疫苗也不能完全解决问题。疫苗的短缺无法保证所有需要人员都能及时接种，同时更为重要的是能否开发出具有高效的抗病毒剂。在流感季节，随着某种疫苗的使用，病毒的抗原性也会不断发生改变，使得疫苗的预防和保护能力降低，这就有可能使得高危性人群更容易发生流感的蔓延和传播。因此，预防和治疗流感的药物开发就显得尤为重要。其中应用最多的有效药物为神经氨酸抑制剂，它可以通过竞争结合酶活性位点来抑制神经氨酸酶活性，从而有效抑制病毒的进入和释放。

(三)发明内容

1、一种高纯度茶黄素的制备工艺

本发明的第一目的在于克服上述不足，提供一种生产的茶黄素产品的纯度高，且其中的茶黄素单体TF1含量低、产品功效强的高纯度茶黄素的制备工艺。

本发明的第一目的是这样实现的：一种高纯度茶黄素的制备工艺，其特征在于：所述工艺包括、但不限于如下步骤：

a.发酵原液的制备：将绿茶加入到提取器中，然后加入有机溶剂，在25℃～60℃下搅拌提取10-60min，出料，然后再加入有机溶剂同法再提取一次，合并提取液，浓缩提取液至含固率为0.5％～5％(质量比)；

b.将a步骤的浓缩液加入到水洗器中进行水洗，将水洗后的浓缩液，冷却至室温作为发酵原液备用；

c.发酵酶的制备：将新鲜茶叶用纯水或浓度为0.01％～1％的柠檬酸水溶液润湿，经冷冻，粉碎处理后作为发酵酶备用；

d.发酵：将上述b步骤中的发酵原液加入到发酵器中，再加入c步骤中的发酵酶，均匀通入气体进行搅拌发酵，温度控制在20℃～60℃，其中：发酵原液与酶的重量比为5∶1～40∶1；

e、分离：将d步骤处理过的发酵液通过滤网分离成滤液和滤渣两部分；

f、浓缩：将e步骤分离得到的滤液进行控温浓缩，至含固率为5％～30％；

g、水洗：将f步骤中的浓缩液置于水洗器中，加入酸性水溶液，搅拌混合进行水洗，然后静置，分层后分去下层水相，同法水洗1～20次，其中，每次加入的酸性水溶液与浓缩液的体积比为0.1～20∶1，水洗后分别收集有机相和水相，水相经浓缩干燥后得副产品，有机相留作备用；

h、转溶：将g步骤中的有机相中加入纯水，其中纯水的加入量与有机相中发酵液的加入量的重量比为1～1∶50，然后进行控温浓缩；

i、柱分离：将上述h步骤中转溶后的茶黄素水溶液冷却至室温，上层析柱，上柱完毕后，进行水洗，解吸，分级收集，收集其中富集TF2a，TF2b，TF3的茶黄素的解析液进行下步处理，其余部分解析液作为副产品；

上述柱分离过程中，工艺参数为：树脂为大孔吸附树脂；装柱径高比为1∶4至1∶25；上柱量以上柱流出液中检测出有TF2a为准；水洗溶剂为5％～40％(质量比)的乙醇水溶液，水洗流出速度为0.5～5BV/H；解吸溶剂为20％～95％(质量比)的乙醇水溶液，解吸流出速度为0.5～5BV/H；整个工艺操作过程操制温度为0～60℃；

j、浓缩：将上述i步骤中收集的富含TF2a，TF2b，TF3的茶黄素的解析液通过减压浓缩回收溶剂或通过反渗透浓缩回收溶剂；回收溶剂后将浓缩液冷却至30℃～60℃，过滤，收集滤液，再进一步浓缩，将溶液的含固率控制为10％～80％(质量比)；

k、干燥：将上述j步骤中的最终浓缩液进行干燥，粉碎，过筛后得到合格的茶黄素产品。

本发明水洗工艺原理：

茶黄素的四种单体是由儿茶素单体(主要为EGC、EGCG、EC、ECG四种单体)两两缩合而成，通过有效的控制发酵底物中儿茶素的种类和量，从而有效的控制发酵生成的茶黄素的组成。

水洗工艺就是将提取出的茶叶提取液通过纯水或酸水进行反萃取(，由于几种儿茶素单体在酯水两项中的两配比例不同，通过水或酸水反萃取，可以将易溶于水的单体或杂质部分去除)，从而将茶叶提出液中非儿茶素种类的含量降低和特定儿茶素EGC单体含量降低，从而使发酵生成的茶黄素中TF1含量在可控的低含量范围内(注：TF1由EGC和EC两种儿茶素缩合而成)，同时提高其它茶黄素单体的含量。

柱分离的作用：去除产品中的杂质的同时，去除部分TF1。

本发明的有益效果是：

(1)采用大叶种绿茶作为茶黄素的生产原料，采用乙酸乙酯直接提取，制备发酵原料液，并与后面的生物发酵有机的组合起来，从而最大程度的降低了生产成本。

(2)使用鲜茶叶作为原料，并通过上述酶制备技术制备出的酶，作为生物发酵中的催化酶(主要利用茶叶中自身的PPO酶)，使发酵过程温和易于控制，使生产出的产品为真正的绿色产品。

(3)通过理论研究、分析，我们严格控制了发酵的底物儿茶素构成，使发酵生成的茶黄素单体的组成更合理，同时又通过柱分离纯化，使生产出的茶黄素产品纯度更高。此工艺生产出的产品含量可达80％以上，且功效更全面。

(4)使用纯有机相氧化发酵，解决了传统的游离酶发酵法中酯、水、渣混合相发酵后无法进行三相分离的问题(常出现无法过滤及乳化问题)，从而能够很稳定的进行工业化生产，并且生产出的产品收率和含量明显增高，同时生产中杜绝了废水的产生。

(5)采用水洗法进行纯化处理后，产品的含量得到大幅度提高，咖啡因得到了清除，避除了传统工艺中用有毒溶剂脱除咖啡因的方法。

(6)转溶后的茶黄素水溶液，经过一定程度的冷却后使部分不溶性的杂质彻底析出来，再通过滤网过滤，从而使生产出的茶黄素产品水溶性增强，色泽变鲜。

(7)采用真空冷冻干燥或喷雾干燥，可最大程度的防止茶黄素在干燥过程中变质，使产品含量、口感、色泽等质量指标明显提高。

根据本发明方法生产的茶黄素纯度可达80％以上，其中茶黄素单体(theaflavin，TF1)的含量小于4％，而3-没食子酸酯茶黄素单体(theaflavin-3-gallate，TF2a)、3’-没食子酸酯茶黄素单体(theaflavin-3′-gallate，TF2b)和3，3’-没食子酸酯茶黄素单体(theaflavin-3，3′-digallate，TF3)均达到较高的含量水平。本发明方法生产的茶黄素的特性如表1所示。

表1本发明方法生产的茶黄素产品的质量规格/标准

2、一种茶黄素作为制备抗流感病毒药物的应用

本发明第二目的是：上述工艺制备的高纯度、特定组成的茶黄素在医药、保健食品/功能食品/膳食补充剂方面的应用和使用剂量。

本发明的第二目的是这样实现的：将按上述工艺制得的高纯度茶黄素应用于制备抗流感病毒药物。

1)茶黄素抗流感病毒功能和作用

本发明利用已建立的神经氨酸酶抑制剂筛选模型和细胞水平抗流感病毒模型，对不同纯度的茶黄素(茶黄素60％和茶黄素80％)提取物进行了神经氨酸酶抑制活性和细胞水平抗流感病毒评价。

实验所用流感病毒菌株A/PR/8/34(H1N1)：由中国疾病控制中心提供；茶黄素60％(TF60)和茶黄素80％(TF80)，由江苏德和生物科技有限公司生产和提供；并采用扎那米韦(Zanamivir)药物作为阳性对照。

实验结果见表2和表3。

表2茶黄素及其衍生物NA(H1N1)抑制活性

表3茶黄素及其衍生物细胞水平病毒(H1N1)抑制活性

表2和表3的实验结果表明，在神经氨酸酶抑制剂筛选模型中，由江苏德和生物科技有限公司生产和提供的60％茶黄素和80％茶黄素均显示了一定的神经氨酸酶抑制活性，其50％抑制率浓度(IC50)分别为28.88±2.32μg/ml和23.63±2.09μg/ml；抑制率分别为64％和81％，但与阳性药物比，活性较低。

在流感病毒感染的细胞模型中，60％茶黄素和80％茶黄素50％细胞毒性浓度(CC50)均大于100(超出了最大量的检测水平)，说明茶黄素在细胞水平均显示出极低的毒性。

对流感病毒H1N1(A/PR/8/34)感染引起的细胞致病效应(CPE)均具有明显的抑制活性，50％细胞致病浓度(IC50)分别为34.43μg/ml和27.39μg/ml，结果表明80％茶黄素的CPE抑制活性要高于60％茶黄素，显示了较好的剂量依赖关系。

60％茶黄素和80％茶黄素的治疗指数(TI＝CC50/IC50)分别为＞2.9和＞3.7，表明80％茶黄素在对CPE抑制活性方面比60％茶黄素具有更好的选择性、有效性和可利用性。

高纯度茶黄素(80％)显示出一定的神经氨酸酶抑制作用，对流感病毒H1N1(A/PR/8/34)感染引起的细胞致病效应(CPE)均具有明显的抑制活性，作为天然和安全的茶提取物，在预防流感疾病方面具有潜在的开发价值。

2)治疗和预防流感的途径

根据本发明所生产的茶黄素具有特定的组成，可以应用于人和动物用药品中。当用于预防甲型流感病毒时，可以单独使用本发明所生产的特定组成茶黄素，也可以同其它物质，包括其它具有疗效作用的活性成分一道使用。

本发明所生产的特定组成茶黄素最佳处理途径为经口服用，这样可以使本发明所生产的特定组成茶黄素释放到血液中。本发明所生产的特定组成茶黄素可以以口服缓释系统为载体。多聚物质可以用作这种口服缓释载体。这类多聚物包括羟丙基甲基纤维素和羟乙基纤维素。

包有肠溶衣涂层的制备物也可以用作口服缓释途径。肠溶衣材料包括具有溶解度依赖pH的聚合物(即pH值控制释放)，具有缓慢或pH依赖型的溶胀、溶解或消逝聚合物(即时间控制释放)，在酶的作用下能够降解的聚合物(即酶控制释放)，以及可以形成硬壳的聚合物，硬壳随着压力的增加而破碎(即压力控制释放)。

也可以利用渗透压来作为缓释运载系统(Verma et al.，Drug Dev.Ind.Pharm.，2000，26：695708)。利用OROS.TM.渗透装置来作为缓释口服输送装置(Theeuweset al.，U.S.Pat.No.3,845,770；Theeuwes et al.，U.S.Pat.No.3,916,899)。

本发明所制备的茶黄素物可以制成口服胶囊。胶囊壳可以对本发明所制备的茶黄素提供比较好的保护，避免在光和/或氧的作用下发生氧化。胶囊最好是有胶囊壳和胶囊充填物组成，无论是外壳或填充材料本身都可以含有辐射阻断剂和/或抗氧化剂。

胶囊壳材料是由胶凝剂、水和增塑剂组成。囊壳材料包括硬质胶体和软质胶体。胶凝剂可以是，但不限于是明胶(gelatin)、改性淀粉(modified starch)、鹿角菜胶(carrageenan)、格兰胶(gellan)、甘露聚糖胶(mannan gum)、直链淀粉(amylose)、黄原胶(xanthan)、褐藻胶(alginates)、琼脂(agar)、瓜尔豆胶(guar)、阿拉伯胶(arabic)、果胶(pectin)、环糊精(cyclodextrin)，以及上述胶质物质的的混合物。胶囊壳也可以包括使用乳化剂、增稠剂、防腐剂、香料香精、甜味剂、色素、抗辐射剂、遮光剂、抗氧化剂，以及具有咀嚼性的物质等。

明胶，是由动物副产品的水解来生产的，例如动物骨，皮和结缔组织，其中含有胶原蛋白。牛和猪是动物明胶的主要来源。

改性淀粉，包括非回生性淀粉，通过对植物来源的淀粉进行化学修饰而衍生出来的出一类淀粉。植物源包括玉米，糯玉米，马铃薯，小麦，大米，木薯，高粱等。改性淀粉主要是淀粉的醚和酯类衍生物，包括羟丙基，羟乙基，琥珀酸，辛烯基琥珀酸淀粉衍生物。其他可使用的改性淀粉包括由上述经化学修饰的淀粉所衍生出的热转换性淀粉，流动性淀粉或薄沸腾性淀粉。这些材料分子量比较低，可以通过加热方法来制备，改性淀粉易于受到水解酸和/或热处理等因素的影响。

卡拉胶是一种由海藻衍生的一类天然海藻硫酸多糖胶体，并且是半乳糖和3-6-无水半乳糖共聚物的混合物。卡拉胶存在着不同的类型(例如，卡帕，丝毫，拉姆达等)，这些胶都有可能会用于本发明中。

结冷胶是一种由好氧微生物伊乐假单胞菌(Pseudomonas elodea)发酵而得的胞外多糖。有各种形式的结冷胶，包括但不限于本土，脱乙酰，deacylated澄清，部分脱乙酰，部分deacylated澄清都可以用在本发明中。

甘露聚糖胶包括半乳甘露聚糖胶，葡甘聚糖，以及其混合物。因此，甘露聚糖胶包括但不限于，刺槐豆胶，魔芋胶，塔拉胶和肉桂胶。

胶囊充填物中含有有效剂量的茶黄素。胶囊充填物质可以是液态、半固态、固态、以及凝胶型式。胶囊充填物质中可以包括药物载体，在产品存贮期间，药物载体应该不影响胶囊壳材料的稳定性。

可以在充填物质中添加的适宜液态药物载体包括，但不限于中性油、矿物油、水、醇、聚二醇、植物油及糖浆。比较好的药物载体是植物油，更好的是玉米油、花生油、红花油、葵花子油和大豆油。液态药物载体中也可以包括乳化剂、增稠剂、防腐剂、香精香料、甜味剂、色素、抗辐射剂、抗氧化剂、遮光剂以及具有咀嚼特性的物质。

咀嚼物质，包括但不限于，树胶(Chicle)，(Chiquibul)，冠胶(Crown gum)，古塔胶(Gutta hang kang)，巴拉塔(Massaranduba balata)，Massaranduba巧克力胶(Massaranduba chocolate)，Nispero，莱希卡斯皮(Leche caspi)，Pendare，佩里洛(Perillo)，莱希德(Leche de vac)，尼日尔古塔(Niger gutta)，Tunu，Chite与天然橡胶(Natural rubber)。香料品包括但不限于，樱桃糖浆，柠檬酸，葡萄糖，挥发油，香兰素，肉桂油，橙油，薄荷油，草莓油，肉豆蔻油。比较好的增稠剂是蜂蜡，而较好的乳化剂是卵磷脂。其他熟练技术人员所熟知的增稠剂和乳化剂也可用于本发明中。比较好的抗氧化剂包括维生素C和维生素E。

胶囊填充材料是由约1％至20％的茶黄素，约1％至5％的抗氧化剂，约5％至90％左右的药学上可接受的载体，约1％至20％的乳化剂，以及1％至20％的增稠剂。

3)使用剂量

口服剂量通常为本发明生产的特定组成茶黄素的疗效剂量。本发明生产的特定组成茶黄素的使用量为5％-30％(重量比)，每次服用剂量为70毫克至400毫克。

本发明所制备的茶黄素作为药物成分可以采用各种服用形式，包括溶液、悬浮液、乳化液、片剂、丸剂、颗粒、固态冲剂、胶囊；胶囊含有液体，粉末，缓释制剂，乳化液或任何其他经口服用的形式。在一个例子中，药学上可接受的载体是胶囊(see e.g.，Grosswald et al.，U.S.Pat.No.5,698,155)。还有其他适用的药物载体(see Remington，″The Science and Practice of Pharmacy，″19.sup.thEdition，1995)。口服药物成分可以包含一个或多个其它可选用的成分，例如果糖等甜味剂，阿斯巴甜或糖精，三氯蔗糖，甜叶菊甜味剂，罗汉果甜味剂；香料，如薄荷，冬青油，或樱桃着色剂；以及防腐剂，如苯甲酸钠、山梨酸钾、聚赖氨酸和其它天然防腐剂等，以提供比较可口的制备物。此外，如果采用片剂形式，可以对其进行涂层处理，使药物成份在胃肠道缓慢地分解和吸收，从而使药物成份发挥更长时间的作用。

对于液体口服制剂，如悬浮液，溶液，可用的输送载体，赋形剂或稀释剂，包括水，盐水，二元醇(如丙二醇)，烷基乙二醇(如聚乙二醇)油类，醇类，pH值在4-6的微酸性缓冲液(例如，乙酸盐、柠檬酸盐，抗坏血酸盐在5.0毫摩尔-50.0毫摩尔)等。此外，也可以添加香味剂，防腐剂，着色剂，胆汁盐，乙酰肉碱等。

本发明生产的高纯度、特定组成的茶黄素组分可以通过口服来用于辅助治疗流感患者。通过服用本发明所制备的茶黄素，可以抑制流感病毒神经氨酸酶的活性，是一种针对流感疾病的预防措施。因此，本发明制备的茶黄素，通过服用可以针对具有疑似上述疾病的患者提供一种预防性措施。因此，本发明所制备的茶黄素，可以用于治疗或预防一种流感疾病，或同时兼顾预防另一种疾病，例如，预防流感病毒，同时提高肌体免疫力的能力。

本发明制备的化合物在治疗和预防上述所列各种疾病时的适用性，可以由本发明提供的方法来确定。因此，在本发明所制备的茶黄素和/或药物组成对上述疾病或失调的治疗或预防时，那些在相关领域的技术人员完全有能力来进行检测和使用。

本发明所制备的茶黄素的有效治疗剂量可以提供一定的治疗或预防作用，而不会对人体产生实质性的毒性。本发明所制备的茶黄素的毒性可以通过标准毒理学评价程序来进行评价。本发明所制备的茶黄素的毒性和疗效比值为治疗指数。实验证明本发明所制备的茶黄素在治疗和预防甲型流感时，显示出相当高的治疗指数(见表2)。

(四)附图说明

图1为本发明的工艺流程图。

(五)具体实施方式

实施例1：

参见图1，本发明一种高纯度茶黄素的制备工艺，其工艺步骤如下：

a.发酵原液的制备：将大叶种绿茶加入到提取器中，茶叶经粉碎至5-60目的细度为佳，然后加入有机溶剂，绿茶叶和所添加的有机溶剂比例控制在1∶5-1∶30(质量比)，混合物在10℃～90℃下搅拌提取10-120min，出料，然后再加入有机溶剂同法再提取一次，合并提取液，在真空度0.085-0.054Mpa，温度56℃-80℃条件下浓缩提取液至含固率为0.5％～5％(质量比)；

b.将a步骤的浓缩液加入到水洗器中进行水洗，水洗达到设计要求的质量标准(设计要求的质量标准为：经水洗后的浓缩液中儿茶素为可控的几种单体)，将水洗后的浓缩液，冷却至室温作为发酵原液备用；

c.发酵酶的制备：将新鲜茶叶用纯水或浓度为0.01～1％的柠檬酸水溶液润湿，经至少2小时的冷冻，然后经粉碎处理，作为发酵酶备用；

d.发酵：将上述b步骤中的发酵原液加入到发酵器中，再加入c步骤中的发酵酶，发酵原液与酶的重量比为5∶1～40∶1，均匀通入气体，例如纯氧气、净化空气，进行搅拌发酵，搅拌速度控制在30～150转/分钟，2小时-12小时，温度控制在20℃～60℃；

e、分离：将d步骤处理过的发酵液通过滤网分离成滤液和滤渣两部分；

f、浓缩：将e步骤分离得到的滤液在旋转蒸发器中进行控温浓缩，至含固率为5％～30％(质量比)；

g、水洗：将f步骤中的浓缩液置于水洗器中，加入酸性水溶液，搅拌混合进行水洗，然后静置，分层后分去下层水相，同法水洗1～20次，其中，每次加入的酸性水溶液与浓缩液的体积比为0.1∶1～20∶1，水洗后分别收集有机相和水相，水相经浓缩干燥后得副产品，有机相留作备用；

h、转溶：将g步骤中的有机相中加入纯水，其中纯水的加入量与有机相中发酵液的加入量的重量比为1∶1～1∶50，，然后进行控温浓缩；

i、柱分离：将上述h步骤中转溶后的茶黄素水溶液冷却至室温，上层析柱，上柱完毕后，进行水洗，解吸，分级收集(解析流出液通过HPLC跟踪检测)，收集其中富集TF2a，TF2b，TF3的茶黄素的解析液进行下步处理，其余部分解析液作为副产品；

上述柱分离过程中，工艺参数为：树脂为大孔吸附树脂；装柱径高比为1∶4至1∶25；上柱量以上柱流出液中检测出有TF2a(茶黄素的一种单体)为准；水洗溶剂为5％～40％(质量比)的乙醇水溶液，水洗流出速度为0.5～5BV/H；解吸溶剂为20％～95％(质量比)的乙醇水溶液，解吸流出速度为0.5～5BV/H；整个工艺操作过程操制温度为0～60℃；

j、浓缩：将上述i步骤中收集的富含TF2a，TF2b，TF3的茶黄素的解析液通过减压浓缩回收溶剂或通过反渗透浓缩回收溶剂；回收溶剂后将浓缩液冷却至30℃～60℃，过滤，收集滤液，再进一步浓缩，将溶液的含固率控制为10％～80％(质量比)；

k、干燥：将上述j步骤中的最终浓缩液进行干燥，粉碎，过筛后得到合格的茶黄素产品。

其中，干燥方式采用喷雾干燥或真空冷冻干燥。

实施例2：

参见图1，本实施例作为对上述方案的优化，在上述a步骤发酵原液的制备过程中，加入的有机溶剂为乙酸乙酯，绿茶和每次加入的乙酸乙酯的重量比为1∶10～1∶30；所述发酵原液的制备过程中提取的浓缩液进行了水洗(b步骤)，水洗后对溶液中儿茶素单的组成进行了控制；在c步骤所述的酶制备过程中，要在0℃以下冷冻，例如-10℃-0℃，并至少冷冻2h，粉碎后鲜茶叶细度在80目以上；在上述d步骤中所述的发酵过程中通入的气体为纯氧或净化空气；在上述f和h步骤中所述的浓缩和转溶过程中温度应控制在80℃以下，例如40℃-80℃；在上述g步骤中所述的水洗步骤中加入的酸性水溶液为0.05％～1％的柠檬酸水溶液；在上述i步骤中所述的柱分离过程中采用的树脂为大孔吸附树脂；所述的柱分离过程中所用的解吸溶剂为20％～95％(质量比)的乙醇水溶液；在上述k步骤中所述的干燥过程中，真空冷冻干燥是在-35℃以下结冻成冰块，真空度为0.6～1毫米汞柱，使茶黄素浓缩液结冻的冰块中水分汽化蒸发，然后以每小时升温3℃的速度升到0℃，再以每小时5℃的速度升到25℃～30℃，保持1～2h，使产品的含水量达到3％～5％，最后解除真空状态。

实施例3：

参见图1，本实施例作为本发明的最佳方案，其步骤为：

a.发酵原液的制备：将大叶种绿茶加入到提取器中，茶叶经粉碎至5-60目的细度为佳，然后加入乙酸乙酯，绿茶叶和所添加的乙酸乙酯比例控制在1∶5-1∶30(重量比)；混合物在25℃～60℃下搅拌提取10分钟～60分钟，出料，然后再加入乙酸乙酯同法再提取一次，合并提取液，在真空度0.085-0.054Mpa，温度56℃-80℃条件下浓缩提取液至含固率为0.5％～5％(质量比)；

b.水洗：将浓缩液加入到水洗器中进行水洗，水洗达到设计要求的质量标准(设计要求的质量标准为：经水洗后的浓缩液中儿茶素为可控的几种单体)，将水洗后的浓缩液，冷却至室温作为发酵原液备用；

c.发酵酶的制备：将新鲜大叶种茶叶用纯水或浓度为0.01％～1％的柠檬酸水溶液润湿，经至少2小时的冷冻，然后经粉碎处理，细度控制在至少80目，作为发酵酶备用；

d.发酵：将上述发酵原液加入到发酵器中，再加入上述发酵酶制备物，发酵原液与酶的重量比为5∶1～40∶1，均匀通入气体，例如纯氧气，进行搅拌发酵，搅拌速度控制在50-100转/分钟，温度控制在20℃～60℃；

e.分离：将前述发酵步骤处理过的发酵液通过滤网分离成滤液和滤渣两部分；

f.浓缩：将前述分离步骤分离得到的滤液在旋转蒸发器中(型号：RE-200，生产商：上海科星仪器公司)进行控温浓缩，至含固率为5％～30％(质量比)；

g.水洗：将前述浓缩步骤中的浓缩液置于水洗器(梨形分液漏斗，500ml，生产商：上海申迪玻璃仪器公司)中，加入酸性水溶液，搅拌混合进行水洗，然后静置，分层后分去下层水相，同法水洗1～20次，其中，每次加入的酸性水溶液与浓缩液的体积比为0.1∶1～20∶1，水洗后分别收集酯相和水相，水相经浓缩干燥后得副产品，酯相留作备用；

h、转溶：将前水洗步骤中的酯相中加入纯水，其中纯水的加入量与酯相中发酵液的加入量的重量比为1∶1～1∶50，然后进行控温浓缩，温度控制在80℃以下为宜；

i、柱分离：将上述转溶步骤中转溶后的茶黄素水溶液冷却至室温，上层析柱；上柱完毕后，进行水洗，解吸，分级收集(解析流出液通过HPLC跟踪检测)；收集其中富集TF2a，TF2b，TF3的茶黄素的解析液进行下步处理，其余部分解析液作为副产品；

上述柱分离过程中，工艺参数为：树脂为大孔吸附树脂；装柱径高比为1∶4至1∶25；上柱量以上柱流出液中检测出有TF2a(茶黄素的一种单体)为准；水洗溶剂为5％～40％(质量比)的乙醇水溶液，水洗流出速度为0.5～5BV/H；解吸溶剂为20％～95％(质量比)的乙醇水溶液，解吸流出速度为0.5～5BV/H；整个工艺操作过程操制温度为0℃～60℃；

j、浓缩：将上述诸分离步骤中收集的富含TF2a，TF2b，TF3的茶黄素的解析液通过减压浓缩回收溶剂或通过反渗透浓缩回收溶剂。回收溶剂后将浓缩液冷却至30℃～60℃，过滤，收集滤液，再进一步浓缩，将溶液的含固率控制为10％～80％(质量比)；

k、干燥：将上述浓酥步骤中的最终浓缩液进行干燥，粉碎，过筛后得到合格的茶黄素产品。

实例4

制备茶黄素软凝胶

蜂蜡(2公斤)加入橄榄油(500公斤)在80℃搅拌30分钟，冷却到40℃。再混合实施例1的方法制备的茶黄素(100公斤)，搅拌均匀。制得的茶黄素、蜂蜡和橄榄油混合物中放入明胶粉末，制成茶黄素软凝胶胶囊。每个软胶囊700毫克左右，其中约75毫克的茶黄素的混合物。

实例5

茶黄素微胶囊的制备。以环糊精为壁材，将本发明所制备的茶黄素粉末进行微胶囊化，制成具有一定缓释作用的微胶囊。茶黄素微胶囊能够进一步地改善溶解性，在其它加工过程中减少粉尘，方便加工处理，同时保护活性茶黄素免受外界不良环境的影响，例如光、热和氧的影响，从而延长茶黄素的保存期。茶黄素微胶囊具有一定的缓释作用，延长茶黄素的发挥功效的时间，这在药物和保健食品/功能食品/膳食补充剂，以及其它产品中的应用中是非常重要的。

在制备用于微胶囊的茶黄素粉末中，首先以菜籽油为分散介质，在初步的乳化条件中，最佳的乳化条件为：环糊精的浓度为5％、表面活性剂Span-80的浓度为2％、Tween-20的浓度为0.05％、明胶的浓度为3％、搅拌速度为900r/min、乳化温度为37.5℃。通过最佳乳化条件制备的乳液，采用单凝聚法制备茶黄素微胶囊，用50％硫酸铵溶液，使菜籽油中的壁材CAP析出，形成初步的微胶囊，过滤，取上层微胶囊油液，缓慢注入3％CAP和1.5％明胶混合液中，进行第二次乳化，在200r/min的搅拌速度下乳化5min，用冰醋酸调节乳液的pH值至3.0，固化30min，取乳液置于喷雾干燥机中进行喷雾干燥。制成样品。

茶黄素还可以用于制备片剂、口服液、固体冲剂、液体饮料、能量棒、口香糖。

名词定义：

1)本发明中的“有机溶剂”术语是指任何可以溶解茶叶中多酚类物质的惰性有机溶剂，包括但不限于酯类、醇类、酮类和醚类。这里所使用的“惰性”术语是指在本发明中的茶黄素生产过程中所使用的某一有机溶剂不会影响茶多酚转化成茶黄素的氧化过程。在本发明中所使用的酯类包括，但不限于乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯和/或乙酸异丙酯。在本发明中所使用的醇类包括，但不限于乙醇、丙醇及异丙醇。在本发明中所使用的酮类包括，但不限于丙酮和/或丁酮。在本发明中所使用的醚类包括，但不限于乙醚、丙醚和/或甲基叔丁醚。

2)在本发明中所使用的“发酵原料液”是指含有茶多酚、而且具有特定儿茶素单体比例的茶叶有机溶剂萃取物。

3)本发明中所使用的“发酵酶”是指茶叶中自然存在的内源酶，如多酚氧化酶和多酚过氧化物酶。

4)在本发明中所使用的“儿茶素”是指儿茶素单体[(+)-catechin，(C)]、没食子儿茶素单体[(+)-gallocatechin，(GC)]、表儿茶素单体[(-)-epicatechin，(EC)]、3’-没食子酸表儿茶素单体[(-)-epicatechin-3-gallate，(ECG)]、表没食子儿茶素单体[(-)-epigallocatechin，(EGC)]，以及3-表没食子儿茶素没食子酸酯单体[(-)-epigallocatechin-3-gallate，(EGCG)]。

Claims (8)

1.一种高纯度茶黄素的制备工艺，其特征在于：所述工艺包括、但不限于如下步骤：

a、发酵原液的制备：将绿茶加入到提取器中，然后加入有机溶剂，在10℃～90℃下搅拌提取10-120min，出料，然后再加入有机溶剂同法再提取一次，合并提取液，浓缩提取液至含固率为0.5％～5％(质量比)；

b、将a步骤的浓缩液加入到水洗器中进行水洗，将水洗后的浓缩液，冷却至室温作为发酵原液备用；

c、发酵酶的制备：将新鲜茶叶用纯水或浓度为0.01％～1％的柠檬酸水溶液润湿，经冷冻，粉碎处理后作为发酵酶备用；

d、发酵：将上述b步骤中的发酵原液加入到发酵器中，再加入c步骤中的发酵酶，均匀通入气体进行搅拌发酵，温度控制在20℃～60℃，其中：发酵原液与酶的重量比为5∶1～40∶1；

e、分离：将d步骤处理过的发酵液通过滤网分离成滤液和滤渣两部分；

f、浓缩：将e步骤分离得到的滤液进行控温浓缩，至含固率为5％～30％；

g、水洗：将f步骤中的浓缩液置于水洗器中，加入酸性水溶液，搅拌混合进行水洗，然后静置，分层后分去下层水相，同法水洗1～20次，其中，每次加入的酸性水溶液与浓缩液的体积比为0.1～20∶1，水洗后分别收集有机相和水相，水相经浓缩干燥后得副产品，有机相留作备用；

h、转溶：将g步骤中的有机相中加入纯水，其中纯水的加入量与有机相中发酵液的加入量的重量比为1～1∶50，然后进行控温浓缩；

i、柱分离：将上述h步骤中转溶后的茶黄素水溶液冷却至室温，上层析柱，上柱完毕后，进行水洗，解吸，分级收集，收集其中富集TF2a，TF2b，TF3的茶黄素的解析液进行下步处理，其余部分解析液作为副产品；

上述柱分离过程中，工艺参数为：树脂为大孔吸附树脂；装柱径高比为1∶4至1∶25；上柱量以上柱流出液中检测出有TF2a为准；水洗溶剂为5％～40％(质量比)的乙醇水溶液，水洗流出速度为0.5～5BV/H；解吸溶剂为20％～95％(质量比)的乙醇水溶液，解吸流出速度为0.5～5BV/H；整个工艺操作过程操制温度为0～60℃；

j、浓缩：将上述i步骤中收集的富含TF2a，TF2b，TF3的茶黄素的解析液通过减压浓缩回收溶剂或通过反渗透浓缩回收溶剂；回收溶剂后将浓缩液冷却至30℃～60℃，过滤，收集滤液，再进一步浓缩，将溶液的含固率控制为10％～80％(质量比)；

k、干燥：将上述j步骤中的最终浓缩液进行干燥，粉碎，过筛后得到合格的茶黄素产品。

2.根据权利要求1所述的一种高纯度茶黄素的制备工艺，其特征在于：所述发酵原液的制备过程中绿茶和每次加入的有机溶剂的重量比为1∶10～1∶30。

3.根据权利要求1所述的一种高纯度茶黄素的制备工艺，其特征在于：所述酶的制备过程中要在0℃以下冷冻并至少冷冻2h，粉碎后鲜茶叶在80目以上。

4.根据权利要求1所述的一种高纯度茶黄素的制备工艺，其特征在于：所述发酵过程中发酵原液和发酵酶的重量比为5∶1-20∶1。

5.根据权利要求1所述的一种高纯度茶黄素的制备工艺，其特征在于：所述的干燥过程采用真空冷冻干燥，其是在-35℃以下结冻成冰块，真空度为0.6～1毫米汞柱，使茶黄素浓缩液结冻的冰块中水分汽化蒸发，然后以每小时升温3℃的速度升到0℃，再以每小时5℃的速度升到25℃～30℃，保持1～2h，使产品的含水量达到3％～5％，最后解除真空状态。

6.一种茶黄素作为制备抗流感病毒药物的应用，其特征在于：将权利要求1制得的高纯度茶黄素应用于制备抗流感病毒药物。

7.根据权利要求6所述的一种茶黄素作为制备抗流感病毒药物的应用，其特征在于：所述抗流感病毒药物剂型为溶液、悬浮液、乳化液、片剂、丸剂、颗粒、固态冲剂或胶囊。

8.根据权利要求6所述的一种茶黄素作为制备抗流感病毒药物的应用，其特征在于：所述茶黄素的使用量重量比为5％-30％，每次服用剂量为70毫克至400毫克。