CN101883793A

CN101883793A - 中和针对因子ⅷ的c1结构域的抑制性抗体的抑制活性的抗独特型抗体

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Publication number: CN101883793A
Application number: CN2007801012199A
Authority: CN
Inventors: J·-G·吉尔斯; M·G·杰奎明; J·-M·圣-雷米; C·贝伦斯
Original assignee: LFB Biotechnologies SAS
Current assignee: LFB Biotechnologies SAS
Priority date: 2007-08-23
Filing date: 2007-08-23
Publication date: 2010-11-10
Also published as: WO2009024653A1; AU2007358045A1; KR20100065158A; CA2734549A1; JP2010536363A; EP2190881A1

Abstract

本发明涉及针对结合因子VIII的C1结构域的因子VIII抑制性抗体的抗独特型单克隆抗体，还涉及产生这种抗独特型单克隆抗体的细胞系，涉及所述抗独特型单克隆抗体作为药物的用途，以及更特别地涉及它用于制造用于治疗血友病A的药物的用途。

Description

中和针对因子Ⅷ的C1结构域的抑制性抗体的抑制活性的抗独特型抗体

现有技术和引言

本发明涉及针对因子VIII抑制性抗体的单克隆抗独特型抗体，所述因子VIII抑制性抗体结合因子VIII的C1结构域，以及涉及产生这种单克隆抗独特型抗体的细胞系，涉及这种单克隆抗独特型抗体作为药物的用途，以及更特别地，涉及其用于制造治疗血友病A的药物的用途。

血友病A是与染色体X的异常相关的遗传疾病，其在受影响的人中显示了自身不能凝结。这种疾病是涉及凝结的蛋白质因子VIII(FVIII)蛋白的基因上突变的结果，其决定了血液中因子VIII的完全缺乏，或者其部分不足。

血友病A是影响血液凝固的最常见的功能不全：在法国，5000人中1名男性是患病的，其代表了患有血友病的患者的80％。另一种类型的血友病，血友病B，影响患血友病的20％的患者：它起因于其他凝结因子，称为因子IX中的缺乏。

血友病(A或B型)的当前的治疗包括静脉内施用缺乏的或缺失的凝结因子。在法国，用于治疗血友病患者的因子VIII可以以分级和生物技术法国实验室(Laboratoire

du Fractionnement et desBiotechnologies)(LFB)或国际药物实验室提供的血液衍生的药物的形式，或以通过遗传工程方法制备的重组药物的形式来获得。编码因子VIII的ADN已经被有效地分离并在哺乳动物细胞中表达(Wood等，Nature(1984)312：330-337)，它的氨基酸序列从ADNc推导出。

分泌的因子VIII(FVIII)是分子量300KDa(2332个氨基酸)的糖蛋白，在内部凝结途径的活化中起到关键作用。无活性的FVIII由六个区域组成：A1(残基1-372)、A2(残基373-740)、B(残基741-1648)、A3(残基1649-2019)、C1(残基2020-2172)和C2(残基2173-2332)，从N-末端到C-末端。在被分泌之后，FVIII作用于von Willebrand因子(vWF)，其保护FVIII对抗血浆蛋白酶。FVIII在被凝血酶裂解时从vWF上解离。这种裂解引起了B结构域的消除和异二聚体的形成。FVIII以这种形式在血浆中循环。这种异二聚体由重链(A1、A2)和轻链(A3、C1、C2)组成。

当FVIII注入到血友病患者中时，它与患者的血液循环中的vonWillebrand因子结合。活化的因子VIII作为活化的因子IX的辅助因子起作用，加速因子X向活化的因子X的转变。活化的因子X将凝血酶原转变成凝血酶。然后凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，发生凝结。

因子VIII施用遭遇的主要问题是在患者中针对因子VIII的抗体的出现，称为“抑制性抗体”。这些抗体中和了因子VIII的促凝血活性，其在注入时就失活了。因而，施用的凝结因子在可以停止出血之前被破坏了，其导致严重的并发症，因而引起治疗失效。进一步的，某些遗传学的非血友病患者可能发展出针对内源因子VIII的抑制物：这称为获得性血友病。

研究显示了抗因子VIII免疫反应是多克隆IgG型的，主要属于IgG4和IgG1亚类，更罕见地属于IgG2。IgG3亚类从不出现。轻链通常是Kappa型的。IgG4的过量呈递对于具有长期的建立的抑制物的血友病患者是更显著的。FVIII分子的C2和A2结构域是免疫反应的有帮助的目标，尽管在某些情况下，检测到针对A3结构域的抗体。当血友病患者的血浆穿过具有固定的FVIII的免疫吸附柱时，有可能纯化总抗FVIII抗体。回收的数量通常高于100μg/10mg总IgG(Gilles JG等(1993)Blood；82：2452-2461)。已经开发了动物模型来研究因子VIII的抑制物的形成；用人类重组因子VIII免疫的大鼠显示了多克隆型的快速免疫反应(Jarvis等，Thromb Haemost.1996 Feb；75(2)：318-25)。抗因子VIII抗体干扰因子VIII的功能的机制有很多，包括干扰因子VIII的蛋白水解裂解、干扰因子VIII与不同配体例如von Willebrand因子(vWF)、磷脂(PL)、因子IX、活化的因子X(FXa)或APC(活化的蛋白C)的相互作用。

容许减弱这种免疫反应的后果的几种治疗是可用的，治疗的实例例如，涉及去氨加压素(desmopressin)，去氨加压素是刺激因子VIII的产生的合成激素，凝结促进剂，例如凝血酶原复合物的浓缩物或活化的凝血酶原复合物的浓缩物，重组因子VIIa，血浆取出法和大量或中间数量的因子VIII的输注。尽管如此，这些方法是非常昂贵和低效力的。

由于这种免疫多克隆反应的体内分析的复杂性，针对因子VIII的某些结构域的单克隆抗体已经被某些科研小组分离。就此，已经分离了IgG4kappa型的人类单克隆抗体LE2E9。这种抗体针对因子VIII的C1结构域，并且抑制因子VIII的辅助因子活性和它与von Willebrand因子的结合(Jacquemin等，(2000)Blood 95：156-163)。以同样的方法，分离了针对因子VIII的C2结构域的人类单克隆抗体，称为BO2C11(IgG4kappa)，从患有血友病A、具有抑制物的患者的记忆B细胞的库产生(Jacquemin等，Blood1998 Jul 15；92(2)：496-506)。BO2C11识别因子VIII的C2结构域，抑制它与von Willebrand因子和与磷脂的结合。它完全地抑制天然的和活化的因子VIII的促凝结活性。单克隆抗体的进一步的实例是针对因子VIII的A2结构域的BOIIB2抗体。BOIIB2抗体抑制99％的因子VIII活性。通过与A2结构域结合，它可以干扰并抑制FIXa的结合，它在FVIII的这个区域内含有低亲和性结合位点，因而抑制FIXa的酶活性。作用的第二种设想的途径是干扰FVIII的异二聚形式(A2:A1和A3:C1:C2)与FVIII的异三聚形式(A2和A1和A3:C1:C2)之间的平衡，通过加速这些复合物的A2结构域的解离，使得它们无功能。(Ananyeva NM等，(2004)Blood Coagul Fibrinolysis.Mar.15(2)：109-24.Review)。

借助于这些新的工具，进一步的、更新近的针对因子VIII抑制物抗体的策略考虑施用中和抑制物抗体的抗独特型抗体(具有与其他抗体的可变区相互作用的能力的抗体)(Saint-Rémy JM等，(1999)Vox Sang；77(suppl 1)：21-24)。小鼠抗独特型抗体，称为14C12，在文献WO2004/014955中公开，在体内以剂量依赖性方式中和抗因子VIII目标抗体(单克隆抗体BO2C11)的抑制性质，所述抗因子VIII目标抗体针对因子VIII的C2结构域。抗因子VIII免疫反应是多克隆的，还开发了针对因子VIII的A2结构域的小鼠抗独特型抗体(在专利申请FR 05 08320中描述)。A2结构域是43kD的结构域，它的功能不是公知的，但已经表明了，针对因子VIII的A2结构域的抑制性抗体通过抑制过渡状态中复合物FXase/FX的转化来抑制因子VIIIa的功能(Lollar等，J Clin Invest.1994 Jun；93(6)：2497-504，Fay等，J Biol Chem.1996；271(11)：6027-6032)。

然而，针对因子VIII的免疫反应是多克隆的，因而，意味着抑制性抗体是针对不同于A2和C2结构域的结构域的。实际上，即使抗因子VIII抗体的表位特异性的研究显示大部分抑制物识别因子VIII分子的有限的区域，位于重链的A2结构域和/或轻链的C2结构域上，其他表位有时也被识别。实际上，来自患者的某些血浆含有能够结合因子VIII的轻链的C1结构域的抗体(Moreau等，2000；95(11)：3435-441；Jacquemin et al，.2000；95(1)：156-162)。

因而，总是需要进一步的工具，容许中和针对因子VIII的其他结构域的其他因子VIII抑制性抗体，以更完整地中和血友病患者的抗因子VIII多克隆反应。

因而，申请人试图开发用于治疗血友病A的新的工具，其允许中和针对因子VIII的C1结构域的抑制性抗体。

发明的详细说明

因而，本发明的第一个目标涉及针对因子VIII人类抑制性抗体的单克隆抗独特型抗体，所述抑制性抗体是针对因子VIII的C1结构域，这种抗独特型抗体具有所述抗体的每条轻链的至少一个CDR区域(互补决定区)，其中肽序列与选自序列SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：14的序列具有至少70％的同一性，并具有所述抗体的每条重链的至少一个CDR区域，其中肽序列与选自序列SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11的序列具有至少70％的同一性。

所涉及的CDR区域是CDR1和/或CDR2和/或CDR3区域。

SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的序列根据Kabat来定义[Kabat等，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，NIH Publication，91-3242(1991)]。

在特别有益的实施方式中，与每种上述序列的同一性是至少80％，优选的至少90％、95％、99％，更优选的100％。同一性的百分比通过排列要比较的两个序列并通过计算具有相同氨基酸的位置的数目，用这个数目除以序列的氨基酸的总数来计算。在任何情况下，这些序列差异完全不影响单克隆抗体对其目标的亲和性，或者它的功能。

因子VIII“抑制性抗体”或“抑制物”是指抑制因子VIII的全部或部分促凝血活性的抗体，即，通过与之结合，特别是其表位位于因子VIII上的抗因子VIII抗体。有益地，本发明的抗体具有中和针对因子VIII的C1结构域的抑制性抗体的至少20％、有益地至少30％、有益地至少40％、有益地至少50％、有益地至少60％、在更有益的方法中，至少70％、80％、90％、99％或100％的凝结抑制活性，所述抑制性抗体是本发明的抗独特型单克隆抗体的目标。中和抑制性抗体的凝结抑制活性的这种能力通过在例如“因子VIII发色团测试”(Jacquemin等(1998)Blood 92.494-506)的分析中测量存在抑制性抗体和抗独特型抗体的情况下因子VIII的活性来测定。

“抗独特型抗体”的表述是指针对目标抑制性抗体的可变区的抗体。在本发明的特定的方面，本发明的抗独特型抗体针对抑制性抗体，其中所述抗体的重链的可变区涉及种系DP-10。这种抑制性抗体可以通过用因子VIII或来自因子VIII的的片段，更特别地用包含C1结构域的全部或部分的片段来免疫，从人类(例如，来自含有抑制性抗体的患者血清)或其他动物物种，例如，来自非限制性的列表的小鼠、马、山羊、非人灵长类获得。

有益地，本发明的抗独特型抗体的目标抑制性抗体识别处于天然结构中的C1结构域。有益地，本发明的抗独特型抗体的目标抑制性抗体不识别作为R2150H突变的相同的结构域。

本发明的单克隆抗独特型抗体是人类或动物来源的。此外，它可以使用多种不同的方法获得。例如，产生抗独特型抗体的细胞可以从具有抗因子VIII抑制性抗体的患者的外周血淋巴细胞、或从健康人获得。这些细胞可以通过本领域技术人员公知的技术永生化，并根据生产抗独特型抗体的能力来选择，以中和针对因子VIII的抑制性抗体。生产本发明的单克隆抗独特型抗体的进一步的方法是通过动物、有益地为小鼠，的免疫，通过注射针对因子VIII的C1结构域的因子VIII抑制性抗体、然后通过融合脾脏淋巴细胞和骨髓瘤细胞系，有益地为小鼠骨髓瘤，随后鉴定和克隆产生针对因子VIII抑制性抗体的抗独特型抗体的细胞培养物。

在本发明的优选的实施方式中，本发明的抗独特型抗体的轻链的每个CDR区域含有与分别确定为SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ IDNO：14的序列至少70％同一性的肽序列，所述抗体的每条重链的每个CDR区域含有与分别确定为SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：11的序列至少70％同一性的肽序列。

因而，本发明的抗体的每条轻链的CDR1区域含有与SEQ ID NO：12的序列具有至少70％同一性的肽序列，其中后者具有氨基酸序列ArgAla Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn，本发明的抗体的每条轻链的CDR2区域含有与SEQ ID NO：13的序列具有至少70％同一性的肽序列，其中后者具有氨基酸序列Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser，本发明的抗体的每条轻链的CDR3区域含有与SEQ ID NO：14的序列具有至少70％同一性的肽序列，其中后者具有氨基酸序列Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Met LeuThr，本发明的抗体的每条重链的CDR1区域含有与SEQ ID NO：9的序列具有至少70％同一性的肽序列，其中后者具有氨基酸序列Gly Tyr ThrPhe Thr Thr Tyr Trp Met His，本发明的抗体的每条重链的CDR2区域含有与SEQ ID NO：10的序列具有至少70％同一性的肽序列，其中后者具有氨基酸序列Tyr Ile Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Asn PheLys Asp，本发明的抗体的每条重链的CDR3区域含有与SEQ ID NO：11的序列具有至少70％同一性的肽序列，其中后者具有氨基酸序列Ser GlyAla Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp Ala Met Asp Ser。在特别有益的方式中，与每种上述序列的同一性是至少80％，优选的至少90％、95％、99％，更优选的100％。

有益地，本发明的单克隆抗独特型抗体的每条轻链的可变区由与核酸序列SEQ ID NO：16具有至少70％同一性的核酸序列编码，其中后者具有下列氨基酸序列：

caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcacaatgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatgaact ggtatcagca gaagccaggatcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc ttcagtggcagtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa gatgctgcca cttattactgccagcagtgg agtagtaacc cacccatgct cacgttcggt gctgggacca agctggagct gaaac，所述单克隆抗独特型抗体的每条重链的可变区由与核酸序列SEQ IDNO：15具有至少70％同一性的核酸序列编码，其中后者具有下列氨基酸序列：

caggtccagc ttcagcagtc tggggctgaa ctggcaaaac ctggggcctc agtgaagatgtcctgcaagg cttctggcta cacctttact acctactgga tgcactggat aaaacagaggcctggacagg atctggaatg gattggatac attaatccta cctctggtta tactgagtac aatcagaacttcaaggacaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac atgcaactgaacagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagatcgggg gcctactataggtacgacga tgctatggac tcctggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctcag。

对于本发明来说，信号肽可以添加到序列SEQ ID NO：15和SEQ IDNO：16来分别产生例如序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，其中本发明的抗体的活性或特异性都不受这种信号肽的影响。

SEQ ID NO：1的序列对应于下列核酸序列：

atgggatgga gctggatctt tctcttcctg ttttcagtaa ctgcaggtgt ccactcccaggtccagcttc agcagtctgg ggctgaactg gcaaaacctg gggcctcagt gaagatgtcctgcaaggctt ctggctacac ctttactacc tactggatgc actggataaa acagaggcctggacaggatc tggaatggat tggatacatt aatcctacct ctggttatac tgagtacaat cagaacttcaaggacaaggc cacattgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg caactgaacagcctgacatc tgaggactct gcagtctatt tctgtgcaag atcgggggcc tactataggtacgacgatgc tatggactcc tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcag。

SEQ ID NO：2的序列对应于下列核酸序列：

atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctattca gtgcctcagt cataatgtccagaggacaaa ttgttctctc ccagtctcca gcaatcctgt ctgcatctcc aggggagaaggtcacaatga cttgcagggc cagctcaagt gtaagttaca tgaactggta tcagcagaagccaggatcct cccccaaacc ctggatttat gccacatcca acctggcttc tggagtccct gctcgcttcagtggcagtgg gtctgggacc tcttattctc tcacaatcag cagagtggag gctgaagatgctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccacc catgctcacg ttcggtgctgggaccaagct ggagctgaaa c。

在特别有益的方式中，所述序列同一性是至少80％，优选的至少95到99％。同一性的百分比通过排列要比较的2条序列并通过计算含有相同核苷酸的位置的数目，用这个数目除以序列的核苷酸的总数来计算。遗传密码简并性产生了相同的氨基酸可以由不同的核苷酸的几种三联体来编码的事实。在任何情况下，单克隆抗体对其目标的亲和性以及它中和目标抑制性抗体的抑制活性的能力都完全不受这些序列差异的影响。

在本发明的优选的方面，所述单克隆抗独特型抗体的每条轻链的可变区由核酸序列SEQ ID NO：16编码，所述单克隆抗独特型抗体的每条重链的可变区由核酸序列SEQ ID NO：15编码。

在有益的方式中，本发明的抗体的每条轻链可变区的肽序列是与序列SEQ ID NO：18具有至少70％同一性、有益地至少80％或90％、再更有益地至少99％同一性的序列。其中后者具有下列氨基酸序列：

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly GluLys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp TyrGln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn LeuAla Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr SerLeu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln GlnTrp Ser Ser Asn Pro Pro Met Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu LeuLys。

对于本发明来说，信号肽可以添加到例如序列SEQ ID NO：17和SEQID NO：18来分别产生例如，序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，其中本发明的抗体的活性或特异性都不受这种信号肽的影响。

在有益的方式中，本发明的抗体的每条重链可变区的肽序列是与序列SEQ ID NO：3具有至少70％同一性、有益地至少80％或90％、再更有益地至少99％同一性的序列。其中后者具有下列氨基酸序列：

Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Phe Ser Val Thr Ala Gly ValHis Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly AlaSer Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp MetHis Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Asp Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile AsnPro Thr Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Thr LeuThr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr SerGlu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Gly Ala Tyr Tyr Arg Tyr AspAsp Ala Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser。

在特别有益的方式中，本发明的抗体的每条轻链的肽序列是与序列SEQ ID NO：4具有至少70％的同一性、有益地至少80％或90％、再更有益地至少99％的同一性的序列，本发明的抗体的每条重链的肽序列是与序列SEQ ID NO：3具有至少70％的同一性、有益地至少80％或90％、再更有益地至少99％的同一性的序列，

优选的，本发明的抗体的每条轻链的肽序列是序列SEQ ID NO：4。其中后者具有下列氨基酸序列：

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Phe Ser Ala Ser ValIle Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala SerPro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr MetAsn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala ThrSer Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly ThrSer Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr TyrCys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Met Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr LysLeu Glu Leu Lys.

优选的，本发明的抗体的每条轻链的肽序列是序列SEQ ID NO：3。

从序列SEQ ID NO：16推出的肽序列是序列SEQ ID NO：18，从序列SEQ ID NO：15推出的肽序列是SEQ ID NO：17。其中后者具有下列氨基酸序列：

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala SerVal Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met HisTrp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Asp Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn ProThr Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu ThrAla Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser GluAsp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Gly Ala Tyr Tyr Arg Tyr Asp AspAla Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser。优选的，本发明的单克隆抗独特型抗体的每条轻链的可变区具有肽序列SEQ IDNO：18，本发明的单克隆抗独特型抗体的每条重链的可变区具有肽序列SEQ ID NO：17。

在优选的方式中，本发明的抗独特型抗体的目标抑制性抗体是以登记号LMBP 6165CB、由Collen研究基金会于2004年8月保藏在比利时微生物/质粒保藏协作保藏所(BCCM/LMBP)，Laboratorium voorMoleculaire Biologie，University of Ghent，Technologiepark 297，B-9052Zwijnaarede的抗体RHD5。这种抗体，以及它的核苷酸和肽序列在专利申请WO2005/106455中描述。抗体RHD5是针对因子VIII的C1结构域的人类单克隆IgG1抗体，最初从患有血友病A、即具有高水平抑制物的获得性严重血友病A的患者的淋巴细胞产生。这个抗体属于IgG1亚类，来源于种系DP-10。在因子VIII上所述抗体识别的表位是处于其天然结构的C1结构域，而不是与R2150H突变相同的结构域。抗体RHD5可以抑制高达98％的因子VIII活性。

本发明的抗体还涉及具有本发明的特征的任何修饰的抗体，其中一个或多个氨基酸被替换或删除。这种替换或删除可以位于分子中的任何位置。在几个氨基酸被替换或删除的情况下，可以考虑替换或删除的任何组合。可以进行本发明的抗体的可变区的这种序列修饰以提高可能与本发明的抗独特型抗体或与目标抑制性抗体接触的残基的数目。

在本发明的一个实施方式中，所述抗独特型抗体是小鼠抗体(anticorps murin)。

有益地，这种小鼠单克隆抗独特型抗体是IgG1kappa。

优选的，本发明的单克隆抗体是嵌合抗体。“嵌合抗体”的表述，要理解为它是指一种抗体，其中轻链和重链的可变区属于与轻链和重链的恒定区不同的物种。因而，本发明的抗体还含有属于非鼠物种的轻链和重链的恒定区。就此来说，能够使用所有的非鼠哺乳动物科和种，特别是，例如，人、猴、鼠科(除了小鼠)、猪科、牛科、马科、猫科、犬科以及禽类。

本发明的嵌合抗体可以使用本领域技术人员公知的重组ADN的标准技术来构建，更特别地通过使用例如Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81.pp.6851-55(1984)所描述的“嵌合”抗体构建技术，其中利用重组ADN技术来使用人类免疫球蛋白的相应区域替换来自非人哺乳动物的抗体的重链的恒定区和/或轻链的恒定区。

在本发明的特定的方面，本发明的抗体是人类杂交抗体，也就是说嵌合抗体，它的恒定部分是人类的。本发明的这个实施方式允许降低抗体在人类中的免疫原性，从而改善它在向人治疗性施用时的效力。

有益地，本发明的抗体是人源化的抗体。这种抗体可以通过将非人物种的单克隆抗体的一个或多个CDR区域(互补决定区)与人类框架区域(可变区的高度保守区域，称为框架)相连来获得，这种制造过程在本领域中已经讨论了(Jones等，Nature(1986)321：522；Riechmann等，Nature(1988)332：323)。这种针对识别FVIII的C1结构域的抑制性抗体的可变区的人源化抗体可以含有人类框架区域和序列SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：14的一个或多个CDR区域。一种本发明的特定人源化的抗体是针对识别FVIII的C1结构域的抑制性抗体的可变区的人源化抗体，其CDR区域是序列SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14的区域。

在有益的方式中，本发明的单克隆抗独特型抗体是2006年1月24日以登记号码CNCM I-3559保藏在微生物培养物国家保藏所(CollectionNationale de Cultures de Microorganismes)(CNCM，25 rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15)的杂交瘤18B6产生的抗体18B6。单克隆抗独特型抗体18B6的每条轻链的可变区由核酸序列SEQ ID NO：16编码，单克隆抗独特型抗体18B6的每条重链的可变区由核酸序列SEQ ID NO：15编码。获得杂交瘤18B6的方法在本文件的“实施例”部分中描述。

本发明的单克隆抗独特型抗体还涉及包含抗体18B6的片段的任何抗体，更特别地，包含抗体18B6的轻链可变区和/或重链可变区的任何抗体，或抗体18B6的轻链可变区和/或重链可变区的任何片段。“片段”的表述，是指F(ab′)2片段或Fab′片段或Fab片段或CDR区域、或任何这些片段或区域的任何修饰的形式。

在本发明的特定的实施方式中，本发明的单克隆抗独特型抗体是F(ab′)2片段或Fab′片段或Fab片段或CDR区域，或任何这些片段或区域的任何修饰的形式。使用木瓜蛋白酶的免疫球蛋白酶消化产生2个相同的称为“Fab片段”(抗原结合的片段)的片段和Fc片段(可结晶部分)。Fc片段是免疫球蛋白的效应物功能的支持。

使用胃蛋白酶消化，产生F(ab′)2片段，其中两个Fab片段保持被两个二硫键连接，Fc片段被分成几个肽。F(ab′)2片段由两个Fab′片段形成(一个Fab′片段由Fab和绞链区组成)，由相互链接的二硫键连接来形成F(ab′)2。

含有抗体的结合位点的这些片段，也可能丧失产生它们的完整抗体的某些性质，例如，活化补体、或结合Fcgamma受体的能力。然而，这些片段没有丧失完整抗体中和抑制性抗体的能力。因而，本发明还涉及抗体18B6的F(ab′)2、Fab′、Fab片段，或涉及CDR区域，或任何这些片段或区域的任何修饰的形式。特别地，这些片段保持了完整抗体中和RHD5抗体的能力。

本发明的进一步的目的是产生例如如上所述的抗体的稳定的细胞系。本发明的稳定的细胞系可以是人类或动物来源的。本发明的稳定的细胞系可以来源于人类永生细胞。在本发明的进一步的实施方式中，这种细胞系可以来源于动物来源，例如小鼠的永生细胞。在本发明的这个实施方式中获得的细胞系的优选的实例是以编号I-3559保藏在CNCM的细胞系18B6。在进一步的实施方式中，本发明的稳定的细胞系是一种细胞系，其在基因组的期望的位点整合了容许本发明的抗体的表达的遗传构建体。获得这种细胞的步骤是稳定转染。这种步骤可以应用于任何类型的细胞，只要它们能够维持在体外培养中。稳定的转染需要遗传构建体的整合，其可以通过同源重组或随机地进行。例如，在包含为细胞赋予抗生素抗性的感兴趣的基因的遗传构建体中的阳性选择盒的存在，证明了转基因向细胞基因组中的插入。作为亚克隆步骤的结果，从本发明的抗体获得长期的生产细胞系，例如18B6，其可以在体外培养中维持。

表达本发明的抗体的稳定的细胞系可以选自由人类细胞系、啮齿动物细胞系，例如小鼠细胞系、SP2/0、YB2/0、IR983F、人类骨髓瘤例如Namalwa，或任何人类来源的其他细胞例如PERC6、CHO细胞系，特别地CHO-K-1、CHO-Lec10、CHO-Lec1、CHO-Lec13、CHOPro-5、CHO dhfr-(CHO DX B11，CHO DG44)构成的组，或是选自Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS-7、293-HEK、BHK、K6H6、NS0、SP2/0-Ag 14和P3X63Ag8.653的进一步的细胞系。

本发明的进一步特别的主题是以登记号码CNCM I-3559保藏在微生物培养物国家保藏所(CNCM)的杂交瘤18B6。由杂交瘤18B6产生的单克隆抗独特型抗体的每条轻链的可变区由核酸序列SEQ ID NO：16编码，由杂交瘤18B6产生的单克隆抗独特型抗体的每条重链的可变区由核酸序列SEQ ID NO：15编码。杂交瘤18B6产生的抗体是抗体18B6，在本文件的“实施例”部分中描述了获得杂交瘤18B6的方法。

本发明的进一步的主题是编码本发明的抗体的重链可变区的序列SEQ ID NO：15的ADN片段，例如早先所描述的。这种ADN片段可以插入到允许多肽、优选抗体的表达的载体中，所述抗体的重链可变区由核酸序列SEQ ID NO：15编码，其推出的序列是序列SEQ ID NO：17，以导入和维持在宿主细胞中。这种载体允许这种外源核酸片段在宿主细胞表达，因为它含有这种表达所必需的序列(启动子、多聚腺苷酸序列、选择基因)。这种载体是本领域技术人员公知的，可以是腺病毒、逆转录病毒、质粒或噬菌体，这个列表不是限制性的。此外，可以使用任何哺乳动物，例如宿主细胞，其是表达本发明的多肽或抗体的细胞，例如SP2/0、YB2/0、IR983F、人类骨髓瘤例如Namalwa，或人类来源的任何其他细胞例如PERC6、CHO细胞系，特别地CHO-K-1、CHO-Lec10、CHO-Lec1、CHO-Lec13、CHO Pro-5、CHO dhfr-(CHO DX B11、CHO DG44)，或选自Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS-7、293-HEK、BHK、K6H6、NS0、SP2/0-Ag 14和P3X63Ag8.653的其他细胞系。

本发明的进一步的目标是编码本发明的抗体的轻链可变区的序列SEQ ID NO：16的ADN片段，例如早先所描述的。这种ADN片段可以插入到允许多肽、优选抗体的表达的载体中，所述抗体的轻链可变区由核酸序列SEQ ID NO：16编码，其推出的肽序列是序列SEQ ID NO：18，以导入和维持在宿主细胞中。这种载体允许这种外源核酸片段在宿主细胞表达，因为它含有这种表达所必需的序列(启动子、多聚腺苷酸序列、选择基因)。这种载体是本领域技术人员公知的，可以是腺病毒、逆转录病毒、质粒或噬菌体，这个列表不是限制性的。此外，可以使用任何哺乳动物细胞作为宿主细胞，其是表达本发明的多肽或抗体的细胞，例如SP2/0、YB2/0、IR983F、人类骨髓瘤例如Namalwa，或人类来源的任何其他细胞例如PERC6、CHO细胞系，特别是CHO-K-1、CHO-Lec10、CHO-Lec1、CHO-Lec13、CHO Pro-5、CHO dhfr-(CHO DX B11、CHODG44)，或选自Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS-7、293-HEK、BHK、K6H6、NS0、SP2/0-Ag 14和P3X63Ag8.653的其他细胞系。

本发明的进一步的目标是药物组合物，其包含本发明的抗体和至少一种赋形剂和/或至少一种药学上可接受的载体。优选的，本发明的药物组合物中含有的单克隆抗独特型抗体是抗体18B6、来自18B6的片段或区域、或包含18B6的可变区或CDR的嵌合抗体或人源化抗体，以及在本文件中早先描述的那些。本发明的药物组合物可以被配制入可以被要治疗的患者耐受任何赋形剂。这种赋形剂的实例包括水、盐水溶液、Ringer溶液、葡萄糖溶液，以及任何其他适合的水性生理溶液。赋形剂也可以含有少量的添加剂，例如，提高等渗性和组合物的稳定性的物质。这种赋形剂包括磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲剂和Tris缓冲液。这种赋形剂是本领域技术人员公知的。标准制剂可以是用于注射的液体形式，或固体制剂，其可以在施用之前重悬浮在适合的液体中。用于制备本发明的药物组合物的有用的载体有益地具有提高治疗组合物在动物或患者中的半衰期的功能，或允许活性成分的控制释放的功能。这种载体可以是能够以正常速度散布药物的、或仅在某些环境中散布药物的有机和合成的聚合物、以及进一步的化合物，也可以是脂质体，这个列表不是限制性的。

有益地，本发明的药物组合物，此外至少包含针对抑制性抗体的抗独特型抗体，所述抑制性抗体结合因子VIII的不同于C1结构域的结构域。这种其他的抗体可以是针对抑制性抗体的抗独特型抗体，所述抑制性抗体结合因子VIII的A1、或A3、或B、A2或C2结构域。实际上，发展出抑制性抗体的、患有血友病A的患者最经常地展现几种类型的抑制性抗体。此外，不同类型的抑制性抗体的数量和性质是不固定的，在患者的生命期中可以改变。因而，同一患者的不同的抑制性抗体针对因子VIII的不同结构域，特别有益的不是使用一种、而是使用针对不同抑制性抗体的几种类型的抗独特型抗体来治疗患者。

优选的，所述药物组合物包含针对结合因子VIII的C2结构域的抑制性抗体、和/或结合因子VIII的A2结构域的抑制性抗体的单克隆抗独特型抗体，以及本发明的单克隆抗体。实际上，A2和C2结构域是抗因子VIII免疫反应的主要目标。因而，包含针对结合因子VIII的C1结构域的抑制性抗体的抗独特型抗体以及针对结合C2结构域的抑制性抗体的抗独特型抗体的混合物的药物组合物，允许中和患者中存在的至少70％、有益地至少80％或90％的全部抑制性抗体。在本发明的优选的实施方式中，本发明的药物组合物包含抗体14C12(在比利时协作微生物保藏所以编号LMBP 5878CB保存)和/或抗体30D1(在CNCM以编号I-3450保藏)。在本发明的进一步优选的实施方式中，所述药物组合物包含以编号I-3510在CNCM保藏的嵌合抗体14C12，和/或衍生自抗体30D1的嵌合的或人源化的抗体，其是包含抗体30D1的可变区的抗体。

本发明的进一步的目的是本发明的抗体作为药物的用途。

本发明的进一步的目的是本发明的抗体用于制造药物的用途。有益地，这种药物被用于在患有血友病、包含针对因子VIII的C1结构域的抑制性抗体的患者中降低和/或防止和/或治疗出血。

本发明的进一步的目的是本发明的抗体用于制造用于治疗A型血友病的药物的用途。

有益地，这样治疗的A型血友病是具有抑制物的血友病。用本发明的抗体治疗的这种类型的血友病可以是先天的或获得性的。通过中和抑制性抗体，本发明的抗体使得通过向患者注射因子VIII的治疗是有效的，因为因子VIII的活性不再被抑制性抗体抑制。

本发明的进一步的目标是本发明的抗体用于中和针对因子VIII的C1结构域的抑制性抗体的体外或体内抑制活性的用途。可以进行这种过程来从患者的血液中耗尽针对因子VIII的C1结构域的抑制性抗体，然后向所述患者重新注射处理过的血液。

本发明的进一步的目标涉及包含本发明的抗体、优选的抗体18B6的药物。

本发明的进一步的目的是所述抗体用于吸附抑制性抗体的用途，例如，用以纯化因子VIII抑制性抗体。

最后，本发明的进一步的目标是本发明的抗体用于检测和/或纯化因子VIII抑制性抗体的用途。进行这种检测方法和纯化的一般过程是本领域技术人员公知的。举例来说，可以提及的是使用含有珠子的免疫纯化柱，所述珠子具有嫁接到它们表面上的本发明的抗体。仅被抗体识别的分子将自身吸附到所述珠子上。其他的将穿过所述柱。为了回收所述分子，提高的溶剂离子强度是足够的。

本发明的进一步的方面和益处将在以下实施例中描述，其将被认为是例示而不是限制本发明的范围。

附图说明

附图1：对于4只小鼠的抗独特型抗体与RHD5结合的提高(平均值)。

附图2：抗独特型抗体18B6与不溶的抗体RHD5的直接结合。

附图3：抗体RHD5与不溶的重组FVIII(recFVIII)的结合的抑制作用。

附图4：用18B6对RHD5的中和。

实施例

实施例1：针对因子VIII的C1结构域的人单克隆抗体的产生(“抗 C1抗体”)

根据在文件Jacquemin等(1998)，Blood 92，496-506和专利申请WO2005/016455中描述的操作，以下在此描述的人类淋巴样干细胞系通过患有获得性血友病A、发展了对因子VIII的免疫反应的患者的B淋巴细胞的永生化来获得。

产生单克隆抗C1 RHD5抗体的细胞系以登记号LMBP 6165CB、由Collen研究基金会于2004年8月保藏在比利时微生物/质粒保藏协作保藏所(BCCM/LMBP)，Laboratorium voor Moleculaire Biologie，University ofGhent，Technologiepark 297，B-9052 Zwijnaarede，Belgium。

RHD5抗体的重链可变区的核苷酸序列是序列SEQ ID NO：5，其中后者具有下列氨基酸序列：

atggactgga cctggaggtt cctctttgtg gtggcagcag ctgcaggtgt ccagtcccaggtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcccg ggtcgtcggt gatggtctcctgcaaggctt ctggaggcac cttcagcagc tttggtatca gctgggtgcg acaggcccctggacaagggc ttgagtgggt gggagggatc atccctatct ttggtacagc aaacaccgcacggaacttcc agaatagagt caccattacc gcggacgaat tcacgagcac agcctacatacgactgagga gcctgagatc tgaagatacg gccgtgtatt actgtgtcgg cggtcgagatgcctacagct ttgatggttt tgatgtctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca g，

RHD5抗体的轻链可变区的核苷酸序列是序列SEQ ID NO：6，其中后者具有下列氨基酸序列：

atggcatgga tccctctctt cctcggcgtc cttgtttact gcacaggatc cgtggcctcctctgggctga ctcagccaca ctcagtgtcc gtgtccccag gacagacagc caacatcacctgctctagag ataagttggg tcataaattt gcttcctggt atcaacagaa gccaggccag tcccctgctcttctcatcta tcaagacagc aagcggccct cagggatccc tgagcgattc tctggctccaactctgggaa cacagccact ctgaccatca gcgggaccca ggctatggat gaggctgactattactgtca ggcgtgggac aacaccactg ccgtattcgg cggagggacc aagttgacagtcctaagtca gccca。

相应于序列SEQ ID NO：5的肽序列是序列SEQ ID NO：7，其中后者具有下列氨基酸序列：

Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Ala GlyVal Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlySer Ser Val Met Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Phe GlyIle Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Gly Gly IleIle Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Thr Ala Arg Asn Phe Gln Asn Arg Val ThrIle Thr Ala Asp Glu Phe Thr Ser Thr Ala Tyr Ile Arg Leu Arg Ser Leu ArgSer Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Gly Gly Arg Asp Ala Tyr Ser PheAsp Gly Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser，相应于序列SEQ ID NO：6的肽序列是序列SEQ ID NO：8，其中后者具有下列氨基酸序列：

Met Ala Trp Ile Pro Leu Phe Leu Gly Val Leu Val Tyr Cys Thr Gly SerVal Ala Ser Ser Gly Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Val Ser Pro Gly GlnThr Ala Asn Ile Thr Cys Ser Arg Asp Lys Leu Gly His Lys Phe Ala Ser TrpTyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Ala Leu Leu Ile Tyr Gln Asp Ser LysArg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr AlaThr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys GlnAla Trp Asp Asn Thr Thr Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr ValLeu Ser Gln Pro。

或者，具有需要的性质的抗体可以通过免疫动物来产生。在这种情况下，人类因子VIII与佐剂注射到小鼠中。通过融合脾脏淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞系来获得单克隆抗人类抗体。鉴定产生抗因子VIII抗体的细胞上清液，并通过限制稀释来克隆。这种方法的一般性说明可以在Current Protocols in Immunology，Chapter 2，John Wiley&Sons，Inc，1994中找到。以下描述了具有期望的性质的抑制物的进一步选择。

实施例2：抗独特型抗体18B6的产生

I.小鼠免疫

四只6周龄Balb/c雌性小鼠用悬浮在完全弗氏佐剂(ACF)(第一次免疫)中的、然后悬浮在弗氏不完全佐剂(AIF)中的10μg FVIII RHD5抗体的人类抗C1结构域在爪垫中皮下地注射(SC)三次。

第一次放血(放血0)在免疫之前(在第0天(J0)放血)进行，然后如下进行注射和放血：

J1：注射N°1(存在完全弗氏佐剂的情况下10μg RHD5抗体)

J15：放血N°1

J16：注射N°2(在存在弗氏不完全佐剂的情况下10μg RHD5抗体)

J28：放血N°2

J29：注射N°3(在存在弗氏不完全佐剂的情况下10μg RHD5抗体)

J44：放血N°3

II.小鼠的免疫反应的评估

为了评估不同的放血中抗RHD5抗体的存在，进行直接结合的ELISA分析。为此，3μg/ml的RHD5抗体或对照IgG1进行不溶解化，50μg/孔，un甘氨酸缓冲液，在4℃过夜(甘氨酸缓冲液＝0.1M甘氨酸、0.17M NaCl，pH 9.2)。用PBS/Tween进行三次洗涤(PBS＝140.0mM NaCl，2.6mM KCl，1.4mM KH₂PO₄，8.1nM Na₂HPO₄.2H₂O，pH 7.4)。系统在室温下(RT)使用100μl/孔的Magic缓冲液(Magic缓冲液＝50mM Tris、0.17M NaCl、1％BSA，pH 7.2)保持饱和30分钟。后来，放出的血液在Magic缓冲液中稀释到1/10、1/100、1/1000和1/10000，在室温下孵育2小时(50μl/孔)。然后，在PBS/Tween中进行3次洗涤。随后，系统与HRP(辣根过氧化酶)(Bio-Rad)标记的1μg/ml山羊多克隆小鼠抗IgG抗体在室温系孵育2小时(50μl/孔)(在Magic缓冲液中稀释)。然后，系统用PBS/Tween洗涤3次，用发色团(邻-苯基二胺)进行显示，获得的颜色的强度使用具有相应于波长490/650nm的滤光器的读出器读取(读出器Emax Molecular Devithese，Sunnyvale，CA)。

使用对照IgG1获得的光密度的结果：

稀释度1000X	小鼠1	小鼠2	小鼠3	小鼠4
稀释度1000X	小鼠1	小鼠2	小鼠3	小鼠4	放血0放血1放血2放血3	0.0310.0190.0260.027	0.0190.0200.0230.063	0.0180.0250.1690.150	0.0180.0280.0450.024

表1

使用RHD5获得的光密度的结果：

稀释度1000X	小鼠1	小鼠2	小鼠3	小鼠4
稀释度1000X	小鼠1	小鼠2	小鼠3	小鼠4	放血0放血1放血2放血3	0.0470.4460.6320.570	0.0200.1880.6850.708	0.0120.1420.6480.778	0.0180.1570.9110.852

表2

获得的结果在附图1中描绘。

结论：每只小鼠正确地应答并与RHD5 Fab片段的注射类似地起反应。在任意的方式中，选择小鼠n°4来进行融合。

III.融合和筛选

进行小鼠n°4的脾脏淋巴细胞与骨髓瘤SP2/0的细胞的融合。以对于本领域技术人员常规的途径进行融合(J.G.Gilles等，Blood(2004)103：2617-23；P.Cornelis，《Les anticorps monoclonaux》，Revue IRE，vol.7，N°4，1983)。

根据有限稀释的原则将细胞在含有次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的DMEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)中连续地扩增，在直接结合ELISA分析中检测测试为阳性的克隆，例如早先在II点中描述的那样。

结合的特异性通过不溶解的具有非相关特异性、在实验室中生产的人类IgG1抗体来确认。

为了确定杂交瘤稳定性，以从200μl到5ml的不同培养基体积在克隆扩增期间重复表位筛选测试(测试1到3)。

测试1＝在200μl的孔中测量

测试2＝在1ml的孔中测量

测试3＝在5mL的瓶中测量

在不同的表位筛选期间获得的结果在以下表格中概述：

	筛选1	筛选2	筛选3	筛选3/IgG1	抑制作用：Elisa	中和：功能测试
	筛选1	筛选2	筛选3	筛选3/IgG1	抑制作用：Elisa	中和：功能测试	1A1	+	-	-	-
1F3	+	+	+	-	+(92.5％)	+(100％)	1A1	+	-	-	-
1F3	+	+	+	-	+(92.5％)	+(100％)	2A1	+	-	-	-
2C9	+	+	+	+			2A1	+	-	-	-
2C9	+	+	+	+			3G9	+	+	+	+
4B7	+	+	-	-			3G9	+	+	+	+
4B7	+	+	-	-			4B10	+	+	+	+
4D5	+	+	+	+			4B10	+	+	+	+
4D5	+	+	+	+			5B11	+	+	+	-	+(93.6％)	+(100％)
5E1	+	-	+/-	+			5B11	+	+	+	-	+(93.6％)	+(100％)
5E1	+	-	+/-	+			5G3	+	+	+	+
5H7	+	-	-	+			5G3	+	+	+	+
5H7	+	-	-	+			5H8	+	+	+/-	+
6A9	+	+	+	+			5H8	+	+	+/-	+
6A9	+	+	+	+			6E1	+	+	+/--	+
6H7	+	+	+	+			6E1	+	+	+/--	+
6H7	+	+	+	+			6H8	+	+	+	+
9D2	+	-	-	+			6H8	+	+	+	+
9D2	+	-	-	+			10D2	+	+	+	-	+(93.6％)	+(100％)
10G8	+	+	+	-	-		10D2	+	+	+	-	+(93.6％)	+(100％)
10G8	+	+	+	-	-		11C5	+	+	+	-	-
11D7	+	-	-	-			11C5	+	+	+	-	-

	筛选1	筛选2	筛选3	筛选3/IgG1	抑制作用：Elisa	中和：功能测试
	筛选1	筛选2	筛选3	筛选3/IgG1	抑制作用：Elisa	中和：功能测试	11G3	+	+	+	+
12D7	+	+	+	-	-		11G3	+	+	+	+
12D7	+	+	+	-	-		12G3	+	-	-	-
12H12	+	+	+	-	-		12G3	+	-	-	-
12H12	+	+	+	-	-		13A1	+	+	+	-	+(90.9％)	+(95.6％)
13C3	+	+	+	-	+(93.6％)	+(100％)	13A1	+	+	+	-	+(90.9％)	+(95.6％)
13C3	+	+	+	-	+(93.6％)	+(100％)	13D7	+	+	+	-
13H5	+	+	+/-	+			13D7	+	+	+	-
13H5	+	+	+/-	+			14H1	+	+	-	-
14D11	+	+	+/--	+			14H1	+	+	-	-
14D11	+	+	+/--	+			14F11	+	+	+	-	+(83.6％)	+(100％)
14H2	+	+	+	+			14F11	+	+	+	-	+(83.6％)	+(100％)
14H2	+	+	+	+			14H5	+	+	+	+
15B4	+	+	-	-			14H5	+	+	+	+
15B4	+	+	-	-			15F6	+	-	-	+
16B4	+	+	+	-	+(94％)	+(90.9％)	15F6	+	-	-	+
16B4	+	+	+	-	+(94％)	+(90.9％)	16F6	+	+	+	-	-
17A5	+	+	+	+			16F6	+	+	+	-	-
17A5	+	+	+	+			17C4	+	+	+	-	+(92.4％)	+(100％)
18A5	+	+	+	-	-		17C4	+	+	+	-	+(92.4％)	+(100％)
18A5	+	+	+	-	-		18A9	+	+	+	-	-

	筛选1	筛选2	筛选3	筛选3/IgG1	抑制作用：Elisa	中和：功能测试
	筛选1	筛选2	筛选3	筛选3/IgG1	抑制作用：Elisa	中和：功能测试	18B6	+	+	+	-	+(93.1％)	+(100％)
18C4	+	+	+	+			18B6	+	+	+	-	+(93.1％)	+(100％)
18C4	+	+	+	+			19C4	+	+	+	+
19G3	+	+	-	+/-			19C4	+	+	+	+
19G3	+	+	-	+/-			20A7	+	+	+	+
20C4	+	-	-	-			20A7	+	+	+	+
20C4	+	-	-	-			20G3	+	-	-	-
21D8	+	+	+	-	+(93.8％)	-	20G3	+	-	-	-
21D8	+	+	+	-	+(93.8％)	-	22H7	+	-	+	+
23A7	+	+	+	-	-		22H7	+	-	+	+
23A7	+	+	+	-	-		23E3	+	+	-	-
23G2	+	-	+/-	-	-		23E3	+	+	-	-
23G2	+	-	+/-	-	-		24D5	+	+	+	-	+/-(56.3％)	+/-(76.9％)
24D12	+	+	+	+			24D5	+	+	+	-	+/-(56.3％)	+/-(76.9％)
24D12	+	+	+	+			24E3	+	-	-	-
28C10	+	-	-	-			24E3	+	-	-	-

表3

IV.使用培养物上清液的抑制作用分析

如在表3中所示，使用培养物上清液进行抑制作用的测试。进行这种分析来从克隆中选择抗独特型抗体，其精确地识别定位于Ac RHD5的抗体决定簇水平上的表位决定簇。在ELISA分析中测试所述抗独特型抗体对RHD5与不溶性FVIII的结合的抑制作用。

在甘氨酸缓冲液中2μg/ml的重组因子VIII(recFVIII)(Baxter)，50μl/孔进行不溶解化，在室温下保持2小时。0.6μg/ml终浓度的RHD5抗体(或不相关的IgG1)与Magic缓冲液中稀释度1/1、1/2和1/4的培养物上清液预孵育2小时。反应孔用PBS/Tween缓冲液洗涤3次，然后用100μl/孔的Magic缓冲液饱和(在室温下30分钟)。以后，培养物上清液与50μl的RHD5(或不相关的IgG1)(在室温下2小时，Magic缓冲液)孵育，然后，进行3次洗涤。通过添加50μl/孔的Magic缓冲液中1μg/ml的小鼠多克隆人类抗IgG HRP标记的(Southern Biotechnology)抗体的溶液，检测与不溶的recFVIII结合的RHD5抗体。用PBS/Tween进行三次连续的洗涤，然后用发色团(OPD邻-苯基二胺)进行显示，获得的颜色的强度使具有相应于波长490/650nm的滤光器的读出器读取(读出器Emax Molecular Devithese，Sunnyvale，CA)。

结论：

如表3所示，11个克隆能够特异性地抑制与不溶解的recFVIII结合的RHD5抗体。(N.B.：阴性值，表示结合抗体决定簇的外部区域的可能性，或者反映培养物上清液中不足的Ac浓度。然而，对于阳性的数目，根据以下的测试淘汰阴性孔)。

V.使用培养物上清液的功能测试：RHD5抗体抑制性活性(抗因子 VIII)的中和的测量

在Magic缓冲液中，在37℃，以1μg/ml的浓度将RHD5抗体与在抑制作用测试期间选择的不同克隆的上清液孵育(稀释3倍、6倍、12倍和24倍)。在30分钟之后，添加0.5U/mL终浓度的FVIII Kogenate(Bayer)，在37℃进行互补孵育30分钟。样品在Magic缓冲液中稀释30X，然后根据厂家的说明书添加产色DADE测试的试剂(因子VIII产色的，Dade BehringGmbh，Marburg，Germany)。

如在表3中所示，10个克隆能够中和Ac RHD5的抑制性活性。选择抗体18B6来按以下过程使用，作为结果和中和曲线的函数。

VI.选择的18B6抗RHD5克隆的扩大生产

在DMEM培养基中生产抗独特型抗体18B6。这种生产继之以在蛋白G亲和柱上纯化(其允许抗体的纯化、然后浓缩，因而进一步确定获得的抗独特型抗体特异性)。

纯化：18B6：以8.48mg/ml产生8ml

VII.特异性评估

根据与II和IV点中描述的相同方案使用ELISA评估各个制品。

1.ELISA分析：抗独特型抗体18B6与不溶的抗体RHD5的直接结合

抗独特型抗体18B6与不溶的抗体RHD5的直接结合在附图2中说明。曲线显示了，抗体18B6与RHD5的结合是剂量依赖性的。

2.ELISA分析：抗体RHD5结合不溶的重组FVIII的抑制作用。

根据IV点中描述的方案测量RHD5抗体结合不溶的重组FVIII的抑制作用。使用的RHD5的浓度等于2μg/ml。

18B6浓度μg/ml	结合的抑制(％)
18B6浓度μg/ml	结合的抑制(％)	502512.56.253.121.560.780.390.1950.098	96.197.296.996.794.190.350.39.200

表4

结果在附图3中示出。在2.5的RHD5/18B6摩尔比下获得了RHD5结合FVIII的50％抑制，而等摩尔的比例抑制92％的这种结合。

3.功能测试：RHD5抗体抑制性活性(抗FVIII)的中和的测量

方案与V点中描述的相同，最终的RHD5浓度0.4μg/ml，纯化的抗独特型抗体的曲线从4到0.002μg/ml终浓度。

结果在以下的表5中给出：

抗-Id浓度(μg/ml)	中和(％)
抗-Id浓度(μg/ml)	中和(％)	41.330.440.1480.0490.01650.00550.001830.00060.0002	89.581.254.327.4118.86.78.96.70

表5

结果在附图4中说明。以等摩尔的RHD5/18B6比例获得了RHD5抑制活性的50％中和。

4.使用“表面胞质团共振Biacor”方法的抗独特型抗体18B6的结合动力学测量

利用Pharmacia Biosensor BIAcore(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Suède)通过使用“表面胞质团共振Biacore”方法评估了抗独特型抗体18B6对抑制物RHD5抗体的结合动力学。RHD5抗体固定在CM5探针的活化的表面上。抗独特型抗体18B6浸入固定在探针表面的不同的RHD5浓度中。测定缔合和解离常数：

K_a(M-1S-1)＝4.26x10³

K_d(S-1)＝1.45x10^-5

K_D：M.3.4x10^-9

5.抗独特型抗体18B6亚类的表征

为了确定抗体18B6的子集，使用Roche的IsoStrip系统(比色条带)。抗体18B6被鉴定为IgG1 Kappa。

VIII.抗体18B6的序列

为了进行测序，使用Quick Prep Micro ARNm纯化试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Suède)分离产生抗独特型抗体18B6的杂交瘤的ARNm。使用第一链ADNc合成试剂盒(AmershamPharmacia Biotech)合成ADNc。编码重链(VH)和轻链(VL)的ADNc使用与小鼠中潜在存在的不同基因家族相应的特异性引物通过PCR(聚合酶链式反应)来扩增。通过QIA quick Gel提取试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)从1.5％的琼脂糖凝胶分离PCR产物，用pGEM-T Easy载体系统(Promega，Madison，WI)克隆。阳性菌落的质粒ADN通过High PurePlasmid分离试剂盒(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)分离，用Seqenase(US Biochemical，Cleveland，OH)双向地测序。

IX.18B6抗体的特别的性质

抗体18B6完全地抑制RHD5抗体结合它的抗原，因子VIII。RHD5抗体带有与18B6的互补的独特型。

抗体与抗原的结合涉及与多个氨基酸相应的6到12个埃²

的相互识别的对接，其通过氢键、疏水性或极性引力和范德华(VanderWals)桥相互缔合。

在功能水平上，当抗体完全地抑制抗体与抗原的结合时，这意味着抑制性抗体带有抗原的“内部图像”，也就是说，模拟抗原的3-D结构的三维结构。

虽然18B6抗体的一级结构(氨基酸序列)显示了与因子VIII的C1结构域的低同一性，18B6抗体的二级结构与FVIII的C1结构域的二级结构的比较、RHD5抗体的抗原性目标、18B6的三维建模表明，通过与C1结构域的3-D结果重叠，18B6的轻链(VL)的可变部分呈现了C1结构域的内部图像。

这种观察赋予了18B6抗体特别的、新的和不可预见的性质。换句话说，通过用抗体例如RHD5的免疫产生类似于18B6的抗体的任何努力事实上没有产生与18B6相同的抗体。

序列表

<110>分级和生物技术法国实验室

<120>中和针对因子VIII的C1结构域的抑制性抗体的抑制活性的抗独特型抗体

<130>-

<160>18

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>424

<212>DNA

<213>小鼠

<400>1

atgggatgga gctggatctt tctcttcctg ttttcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag 60

gtccagcttc agcagtctgg ggctgaactg gcaaaacctg gggcctcagt gaagatgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac ctttactacc tactggatgc actggataaa acagaggcct 180

ggacaggatc tggaatggat tggatacatt aatcctacct ctggttatac tgagtacaat 240

cagaacttca aggacaaggc cacattgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 300

caactgaaca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt tctgtgcaag atcgggggcc 360

tactataggt acgacgatgc tatggactcc tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 420

tcag 424

<210>2

<211>391

<212>DNA

<213>小鼠

<400>2

atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctattca gtgcctcagt cataatgtcc 60

agaggacaaa ttgttctctc ccagtctcca gcaatcctgt ctgcatctcc aggggagaag 120

gtcacaatga cttgcagggc cagctcaagt gtaagttaca tgaactggta tcagcagaag 180

ccaggatcct cccccaaacc ctggatttat gccacatcca acctggcttc tggagtccct 240

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttattctc tcacaatcag cagagtggag 300

gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccacc catgctcacg 360

ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa c 391

<210>3

<211>141

<212>PRT

<213>小鼠

<400>3

Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Phe Ser Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Thr Tyr Trp Met His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Asp Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Gly Ala Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp Ala Met

115 120 125

Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

<210>4

<211>130

<212>PRT

<213>小鼠

<400>4

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Phe Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser

50 55 60

Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

100 105 110

Ser Ser Asn Pro Pro Met Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Leu Lys

130

<210>5

<211>421

<212>DNA

<213>人

<400>5

atggactgga cctggaggtt cctctttgtg gtggcagcag ctgcaggtgt ccagtcccag 60

gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcccg ggtcgtcggt gatggtctcc 120

tgcaaggctt ctggaggcac cttcagcagc tttggtatca gctgggtgcg acaggcccct 180

ggacaagggc ttgagtgggt gggagggatc atccctatct ttggtacagc aaacaccgca 240

cggaacttcc agaatagagt caccattacc gcggacgaat tcacgagcac agcctacata 300

cgactgagga gcctgagatc tgaagatacg gccgtgtatt actgtgtcgg cggtcgagat 360

gcctacagct ttgatggttt tgatgtctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca 420

g 421

<210>6

<211>385

<212>DNA

<213>人

<400>6

atggcatgga tccctctctt cctcggcgtc cttgtttact gcacaggatc cgtggcctcc 60

tctgggctga ctcagccaca ctcagtgtcc gtgtccccag gacagacagc caacatcacc 120

tgctctagag ataagttggg tcataaattt gcttcctggt atcaacagaa gccaggccag 180

tcccctgctc ttctcatcta tcaagacagc aagcggccct cagggatccc tgagcgattc 240

tctggctcca actctgggaa cacagccact ctgaccatca gcgggaccca ggctatggat 300

gaggctgact attactgtca ggcgtgggac aacaccactg ccgtattcgg cggagggacc 360

aagttgacag tcctaagtca gccca 385

<210>7

<211>140

<212>PRT

<213>人

<400>7

Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Ala Gly

1 5 10 15

Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ser Ser Val Met Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe

35 40 45

Ser Ser Phe Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Thr Ala

65 70 75 80

Arg Asn Phe Gln Asn Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Phe Thr Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Ile Arg Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Val Gly Gly Arg Asp Ala Tyr Ser Phe Asp Gly Phe Asp

115 120 125

Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

<210>8

<211>128

<212>PRT

<213>人

<400>8

Met Ala Trp Ile Pro Leu Phe Leu Gly Val Leu Val Tyr Cys Thr Gly

1 5 10 15

Ser Val Ala Ser Ser Gly Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Val Ser

20 25 30

Pro Gly Gln Thr Ala Asn Ile Thr Cys Ser Arg Asp Lys Leu Gly His

35 40 45

Lys Phe Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Ala Leu

50 55 60

Leu Ile Tyr Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe

65 70 75 80

Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr

85 90 95

Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Asn Thr

100 105 110

Thr Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Gln Pro

115 120 125

<210>9

<211>10

<212>PRT

<213>小鼠

<400>9

Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met His

1 5 10

<210>10

<211>17

<212>PRT

<213>小鼠

<400>10

TyrIle Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Asn Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210>11

<211>13

<212>PRT

<213>小鼠

<400>11

Ser Gly Ala Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp Ala Met Asp Ser

1 5 10

<210>12

<211>10

<212>PRT

<213>小鼠

<400>12

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn

1 5 10

<210>13

<211>7

<212>PRT

<213>小鼠

<400>13

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210>14

<211>11

<212>PRT

<213>小鼠

<400>14

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Met Leu Thr

1 5 10

<210>15

<211>367

<212>DNA

<213>小鼠

<400>15

caggtccagc ttcagcagtc tggggctgaa ctggcaaaac ctggggcctc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacctttact acctactgga tgcactggat aaaacagagg 120

cctggacagg atctggaatg gattggatac attaatccta cctctggtta tactgagtac 180

aatcagaact tcaaggacaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcaactga acagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagatcgggg 300

gcctactata ggtacgacga tgctatggac tcctggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360

tcctcag 367

<210>16

<211>325

<212>DNA

<213>小鼠

<400>16

caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60

atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatgaact ggtatcagca gaagccagga 120

tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cacccatgct cacgttcggt 300

gctgggacca agctggagct gaaac 325

<210>17

<211>122

<212>PRT

<213>小鼠

<400>17

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Ala Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp Ala Met Asp Ser Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>18

<211>108

<212>PRT

<213>小鼠

<400>18

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Met

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

PCT/RO/134表

申请人或代理人档案号11465/27(2)

国际申请号PCT/FR2007/001398

关于保藏的微生物或其它生物材料的说明

(PCT细则13之二)

PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月再版)

Claims

1.针对因子VIII人类抑制性抗体的单克隆抗独特型抗体，所述抑制性抗体针对因子VIII的C1结构域，其特征在于所述抗体的每条轻链的至少一个CDR区域(互补决定区)含有与选自序列SEQ ID NO：12、SEQID NO：13、SEQ ID NO：14的序列具有至少70％同一性的肽序列，以及其中所述抗体的每条重链的至少一个CDR区域具有与选自序列SEQID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11的序列具有至少70％同一性的肽序列。

2.根据权利要求1的抗体，其特征在于所述抗体的每条轻链的每个CDR区域含有分别与序列SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQID NO：14具有至少70％同一性的肽序列，以及其中所述抗体的每条重链的每个CDR区域具有分别与序列SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11具有至少70％同一性的肽序列。

3.根据权利要求1或2的任一项的抗体，其特征在于所述抗体的每条轻链的可变区由与核酸序列SEQ ID NO：16具有至少70％同一性的核酸序列编码，以及其中所述抗体的每条重链的可变区由与核酸序列SEQ ID NO：15具有至少70％同一性的核酸序列编码。

4.根据前述权利要求的任一项的抗体，其特征在于所述抗体的每条轻链的可变区由核酸序列SEQ ID NO：16编码，以及其特征在于所述抗体的每条重链的可变区由核酸序列SEQ ID NO：15编码。

5.根据前述权利要求的任一项的抗体，其特征在于其每条轻链的可变区的肽序列是具有与序列SEQ ID NO：18至少70％的同一性的序列，以及其每条重链的可变区的肽序列是具有与序列SEQ ID NO：17的至少70％的同一性的序列。

6.根据前述权利要求的任一项的抗体，其特征在于从序列SEQ IDNO：16推出的肽序列是序列SEQ ID NO：18，以及其特征在于从序列SEQ ID NO：15推出的肽序列是序列SEQ ID NO：17。

7.根据前述权利要求的任一项的抗体，其特征在于所述抑制性抗体是抗体RHD5(以编号LMBP 6165CB保藏在保藏所BCCM/LMBP)。

8.根据前述权利要求的任一项的抗体，其特征在于所述抗独特型抗体是小鼠抗体。

9.根据权利要求8的抗体，其特征在于所述抗独特型抗体是IgG1kappa。

10.根据前述权利要求的任一项的抗体，其特征在于所述抗体是嵌合抗体。

11.根据权利要求10的抗体，其特征在于所述抗体是人类杂交抗体。

12.根据权利要求1到9的任一项的抗体，其特征在于所述抗体是人源化的抗体。

13.根据前述权利要求的任一项的抗体，其特征在于它为F(ab′)2片段、Fab′片段、Fab片段、CDR区域和这些片段或区域的任一个的任何修饰的形式。

14.根据前述权利要求1到9的任一项的抗体，其特征在于它能够由以登记号码CNCM I-3559保藏在微生物培养物国家保藏所(CNCM)的杂交瘤18B6产生。

15.产生根据权利要求1到13的任一项的抗体的稳定细胞系。

16.根据权利要求15的稳定细胞系，选自由SP2/0、YB2/0、IR983F、人类骨髓瘤Namalwa、PERC6、细胞系CHO，特别是CHO-K-1、CHO-Lec10、CHO-Lec1、CHO-Lec13、CHO Pro-5、CHOdhfr-、Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS-7、293-HEK、BHK、K6H6、NS0、SP2/0-Ag 14和P3X63Ag8.653构成的组。

17.以登记号码CNCM I-3559保藏在微生物培养物国家保藏所(CNCM)的杂交瘤18B6。

18.一种针对因子VIII人类抑制性抗体的单克隆抗独特型抗体，所述抑制性抗体针对由以登记号码CNCM I-3559保藏在微生物培养物国家保藏所(CNCM)的杂交瘤18B6产生的因子VIII的C1结构域。

19.具有序列SEQ ID NO：15的ADN片段，所述序列SEQ ID NO：15编码根据权利要求1到14的任一项的抗体的重链可变区。

20.具有序列SEQ ID NO：16的ADN片段，所述序列SEQ ID NO：16编码根据权利要求1到14的任一项的抗体的轻链可变区。

21.药物组合物，包含根据权利要求1到14的任一项的抗体，和至少一种赋形剂和/或至少一种药学上可接受的载体。

22.根据权利要求21的组合物，特征在于它包含针对抗FVIII抗体的至少一种抗独特型抗体，所述抗FVIII抗体针对因子VIII的不同于C1结构域的结构域。

23.根据权利要求21或22的任一项的组合物，特征在于它包含针对抗FVIII抗体和/或针对因子VIII的A2结构域的抗体的抗独特型抗体，所述抗FVIII抗体针对因子VIII的C2结构域。

24.根据权利要求1到14的任一项的抗体的用途，用于制造药物。

25.根据权利要求1到14的任一项的抗体的用途，用于制造用于治疗A型血友病的药物。

26.根据权利要求25的用途，其中所述A型血友病是具有抑制物的血友病。

27.根据权利要求1到14的任一项的抗体的用途，用于体外中和针对因子VIII的C1结构域的抑制性抗体的抑制活性。

28.根据权利要求1到14的任一项的抗体的用途，用于因子VIII抑制性抗体的体外检测和/或纯化。

29.一种包含根据权利要求1到14的任一项的抗体的药物。