CN101881777B

CN101881777B - 无需对全血样本进行预处理的超敏c反应蛋白检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN101881777B
Application number: CN 201010213990
Authority: CN
Inventors: 陈明峰; 杨青; 余嘉陵; 郑筱雯
Original assignee: SHENZHEN GOLDSITE DIAGNOSTICS Inc
Current assignee: SHENZHEN GOLDSITE DIAGNOSTICS Inc
Priority date: 2010-06-30
Filing date: 2010-06-30
Publication date: 2013-10-02
Anticipated expiration: 2030-06-30
Also published as: CN101881777A

Abstract

本发明涉及医学免疫领域，提供了一种超敏C反应蛋白检测方法，该方法直接以手指末梢全血或抗凝静脉全血作为待检样品，以兔抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶为抗体，采用定时散射比浊法进行C反应蛋白浓度检测，这种检测方法操作简便、检测速度快、检测范围宽、检测灵敏度高，从而实现了对感染性疾病及心脑血管疾病等多方面的诊断和预测。

Description

无需对全血样本进行预处理的超敏C反应蛋白检测方法及试剂盒

技术领域

本发明属于医学免疫领域，涉及C反应蛋白检测方法，还涉及超敏C反应蛋白检测试剂盒。

背景技术

C反应蛋白（C-reactiveprotein，CRP）,1930年Tillet和Francis在急性大叶性肺炎患者血清中发现能在钙离子存在时与肺炎球菌C多糖起沉淀反应而得名，是人类重要的急性期反应蛋白，急性期浓度可升高上千倍。人类C反应蛋白是由肝脏产生，由五个相同的亚基以非共价键形成环状五聚体。

C反应蛋白目前已经作为医院常规检测项目，可以在很多疾病诊断上作为辅助判断依据。C反应蛋白在炎症开始6－12小时浓度增高，24－48小时即可达到峰值，随着疾病的好转其浓度可迅速恢复至正常水平，因此可用于监测病情、评估抗生素疗效等方面。临床上采用普通C反应蛋白检测试剂盒对C反应蛋白进行检测，虽可以使用全血作为检测样本，但检测范围一般在3－200mg/L左右，最低检测限一般在3－5mg/L左右，灵敏度较低。

在儿科感染性疾病中，由于新生儿的C反应蛋白水平通常很低，用常规C反应蛋白的检测反应不出微小的变化；在心血管疾病诊断方面，CRP＜1mg/L为低危险性，1－3mg/L为中度危险性，＞3mg/L为高危险性；因此普通C反应蛋白检测试剂盒无法用于新生儿感染性疾病及心脑血管疾病方面的诊断和预测。

近年来，随着检测技术的进步，C反应蛋白检测技术也得到了提高，于是出现了超敏C反应蛋白这一概念。超敏C反应蛋白检测方法具有很好的灵敏度，能检测出较低的C反应蛋白含量，因此能用于新生儿感染性疾病及心脑血管疾病方面的诊断和预测，同时在冠心病、中风、周围血管栓塞等疾病诊断和预测中发挥着重要的作用，甚至被认为是心血管疾病危险评估的“金标准”。部分学者认为超敏C反应蛋白可以作为心血管疾病（例如：心肌梗塞）危险评估的一项独立指标。

首先，目前超敏C反应蛋白检测试剂盒都是采用血清或血浆样本进行检测，需要静脉取血且采血量大，样本使用前还需离心，无法直接采用手指微量全血作为检测样本，检测速度慢，因此不能很好的满足医院急诊和门诊快速诊断的要求，需要改进；再者，感染性疾病时机体产生的炎症反应使得C反应蛋白浓度大大的升高，严重时可达200mg/L或更高，此时如果使用最高检测限一般在15－20mg/L左右的超敏C反应蛋白检测试剂盒检测，则需要事先对样本进行一系列稀释，即浪费试剂，又操作繁琐；现有超敏C反应蛋白检测试剂盒检测范围小，不适用于感染性疾病的检测，需要改进。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测速度快、检测范围宽的超敏C反应蛋白检测方法，本发明的另一目的是提供一种可以直接使用全血作为样本、检测速度快、检测范围宽的超敏C反应蛋白检测试剂盒。

超敏C反应蛋白检测方法，包括如下步骤：

a、建立散射值与多个C反应蛋白标准品的散射值—浓度对应数据库：将多个已知不同浓度的C反应蛋白标准品分别与处理缓冲液R1试剂混匀制得抗原标准液，然后将乳胶抗体R2试剂加入抗原标准液、同时用特定蛋白分析仪测定标准品散色值，从而建立散射值—浓度对应数据库；

b、测定待检样品的散色值：将待检样品与处理缓冲液R1试剂混匀制得抗原液，然后将乳胶抗体R2试剂加入抗原液、同时用特定蛋白分析仪测定待检样品的散色值；

c、查询C反应蛋白浓度：将b步骤测定的散色值与散射值—浓度对应数据库对照，查询得知C反应蛋白浓度；

其中，乳胶抗体R2试剂中包括兔抗人C反应蛋白抗体或羊抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶。

进一步的，所述处理缓冲液R1试剂包括如下组分：0.005％~0.05％的十二烷基硫酸钠（SDS）、0.225％~0.9％的NaCl、0.078％~0.312％的NaH₂PO₄.2H₂O、0.715％~2.86％的Na₂HPO₄.12H₂O、0.09％~0.1％的叠氮钠。

进一步的，所述乳胶抗体R2试剂包括如下组分：0.1％~0.5％兔抗人C反应蛋白抗体或羊抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶、0.2％~0.8％的甘氨酸、0.09％~0.1％的叠氮钠。

进一步的，a步骤测定标准品散色值采用定时散射比浊法，即于乳胶抗体R2试剂加入抗原标准液后第M秒读取此时间段的最低散射值S1，第N秒后读取散射值S2，标准品散色值为S2与S1的差值；b步骤测定散色值采用定时散射比浊法，即于乳胶抗体R2试剂加入抗原液后第M秒读取此时间段的最低散射值S3，第N秒后读取散射值S4，散色值为S4与S3的差值；45>=M>=10；150>=N>=60。

进一步的，所述待检样品为手指末梢全血、抗凝静脉全血、血清或血浆，优选全血。

进一步的，步骤a、步骤b中，特定蛋白分析仪测定散色值时均采用单波长光进行检测；更进一步的，所述单波长光的波长为630nm~690nm。

进一步的，检测温度为30℃~37℃。

超敏C反应蛋白检测试剂盒，包括处理缓冲液R1试剂和乳胶抗体R2试剂，乳胶抗体R2试剂包括兔抗人C反应蛋白抗体或羊抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶。

进一步的，所述处理缓冲液R1试剂包括如下组分：0.01％~0.05％的十二烷基硫酸钠（SDS）、0.225％~0.9％的NaCl、0.078％~0.312％的NaH₂PO₄.2H₂O、0.715％~2.86％的Na₂HPO₄.12H₂O、0.09％~0.1％的叠氮钠。

进一步的，所述乳胶抗体R2试剂包括如下组分：0.1％~0.5％兔抗人C反应蛋白抗体或羊抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶、0.2％~0.8％的甘氨酸0.5％、0.09％~0.1％的叠氮钠。

本发明所要解决的问题在于提供一种以定时散射比浊法为检测原理，可直接使用手指末梢全血或抗凝静脉全血作为待检样品，无需预先对全血样本进行预处理，就可直接进行检测，大大提高了检测速度，简化了操作步骤。再则，采用兔抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶能将检测范围扩大至0.5－350mg/L，提高了检测灵敏度，从而实现了对感染性疾病及心脑血管疾病方面的诊断和预测。

附图说明

图1是C反应蛋白标准品测定标准曲线；

图2是试剂测试质控品的稀释线性试验图；

图3是试剂测试全血样本的稀释线性试验图；

图4是本发明中试剂和德灵公司的C反应蛋白试剂测定样本的相关图。

具体实施方式

实施例1

手指末梢全血超敏C反应蛋白检测方法，包括如下步骤：

a、建立散射值与多个C反应蛋白标准品的散射值—浓度对应数据库：采用定时散射比浊法测定多个C反应蛋白标准品的散射值；将多个2μl已知不同浓度的C反应蛋白标准品分别与600μl处理缓冲液R1试剂混匀后，制得抗原标准液，然后将60μl乳胶抗体R2试剂加入抗原标准液、同时用特定蛋白分析仪测定标准品散色值，检测时特定蛋白分析仪采用波长为630nm光；检测时于乳胶抗体R2试剂加入抗原标准液后第30秒读取此时间段的最低散射值S1，第90秒后读取散射值S2，标准品散色值为S2与S1的差值，根据多个标准品散色值与多个C反应蛋白标准品浓度，建立散射值与多个C反应蛋白标准品的散射值—浓度对应数据库——即图1所示的C反应蛋白标准品测定标准曲线。

b、测定手指末梢全血的散色值：将2μl手指末梢全血与600μl处理缓冲液R1试剂混匀10秒后，可见溶液变为红色清亮，制得抗原液，然后将60μl乳胶抗体R2试剂加入抗原液、同时用特定蛋白分析仪测定标准品散色值，检测时特定蛋白分析仪采用波长为630nm光；检测时于乳胶抗体R2试剂加入抗原标准液后第30秒读取此时间段的最低散射值S3，第90秒后读取散射值S4，散色值为S4与S3的差值3194。

c、查询C反应蛋白浓度：将b步骤测定的散色值3194与图1对照，查询得知C反应蛋白浓度为155mg/L。

为得到较为准确的检测结果，检测过程中保持温度恒定在37℃。

其中处理缓冲液R1试剂包括如下组分：十二烷基硫酸钠（SDS）0.01％、NaCl0.9％、NaH₂PO₄.2H₂O0.156%、Na₂HPO₄.12H₂O1.43%、叠氮钠0.09％。

其中乳胶抗体R2试剂包括如下组分：兔抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶0.2％、甘氨酸0.5％、叠氮钠0.09％。

实施例1提供的超敏C反应蛋白检测方法同样适用于抗凝静脉全血、血清或血浆的C反应蛋白检测。取2μl抗凝静脉全血或1.2μl血清或1.2μl血浆采用实施例1中的试剂及方法均能得到准确的结果。

实践中，在保证检测参数相同的情况下，步骤a中的散射值—浓度对应数据库完全可以应用于步骤b中的浓度，也就是说步骤b可以省略步骤a，此时检测实践只需90秒即可完成浓度检测。而目前市场上的普通和超敏C反应蛋白检测试剂盒在检测时一般需要采用双波长进行检测，而且需要先进行试剂空白的测定，然后再加入乳胶抗体进行浓度检测，操作较为繁琐，整个测试一般最少需要3分钟以上才能完成。

实施例2

精密度验证实施例：取具有溯源性的高值质控物、低值质控物各一份，对每份质控物进行10次检测，将共10次检测结果计算平均值、标准差和变异系数。结果见表1：

表1

	高值质控	低值质控
			测定次数	10	10
最大值	61.337	17.313
			最小值	60.539	16.856
平均值	61.02	16.98
			标准差	0.228	0.14
变异系数	0.37％	0.82％

由表1中变异系数可知，本发明提供的C反应蛋白检测方法具有较高的精密度。

实施例3

准确度验证实施例：取具有溯源性的血清高值质控物、血清低值质控物各一份，用试剂分别进行检测，各检测5次,计算平均值，与质控物靶值进行对照。结果见表2：

表2

	高值质控	低值质控
			测定次数	5	5
最大值	61.238	17.313
			最小值	60.539	16.856
平均值	61.06	16.80
			靶值	61.1	16.9

由表2数据可知，本发明提供的C反应蛋白检测方法具有较高的准确度。

实施例4

试剂线性试验：取一已知浓度的具有溯源性的标准品或质控物，浓度应尽量高，用生理盐水对样本进行稀释，每点测定3次，取平均值，结果与预期浓度作回归直线，计算出回归系数r的平方，结果见表3及图2：

表3

预期浓度	1	2	3	平均值
					1.528	1.503	1.532	1.518	1.518
30.550	30.623	31.067	31.753	31.147
					61.100	61.801	62.008	60.938	61.582
91.650	90.238	91.682	92.557	91.492
					122.200	125.235	122.361	122.587	123.394
152.750	152.237	150.987	151.336	151.52

由表3及图2可知，r²＝0.9998，说明本发明提供的C反应蛋白检测方法的稀释线性好。

实施例5

灵敏度的检测试验：取具有朔源性的质控品稀释至检测范围下限附近进行测定，重复测定3次，计算平均值，与质控物靶值进行对照。结果见表4：

表4

	浓度一	浓度二
			测定次数	3	3
平均值	1.432	0.62

靶值

1.50

0.6

由表4数据可知，本发明提供的C反应蛋白检测方法具有较高的灵敏度。

实施例6

人全血样本经不同倍数稀释后分别检测C反应蛋白浓度，全血样本稀释线性图见图3。由图3可知，样本经过一系列稀释后，测得的CRP实测值与CRP理论值相比偏差微小。

实施例7

图4显示了本发明中试剂和德灵公司的C反应蛋白试剂测定样本的相关图。其中X轴表示本试剂测定结果，Y轴表示德灵公司试剂测定结果，相关系数r²=0.9981,回归方程为y=0.9209x-0.5405。由图4可知本发明样本检测结果与本行业知名公司产品检测结果相比，结果无明显差异。

实施例8

超敏C反应蛋白检测试剂盒，包括处理缓冲液R1试剂、乳胶抗体R2试剂、C反应蛋白标准品；其中处理缓冲液R1试剂包括如下组分：十二烷基硫酸钠（SDS）0.005％、NaCl0.45％、NaH₂PO₄.2H₂O0.078%、Na₂HPO₄.12H₂O0.715%、叠氮钠0.09％。其中乳胶抗体R2试剂包括如下组分：兔抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶0.2％、甘氨酸0.5％、叠氮钠0.09％。

实施例9

超敏C反应蛋白检测试剂盒，包括处理缓冲液R1试剂、乳胶抗体R2试剂、C反应蛋白标准品；其中处理缓冲液R1试剂包括如下组分：十二烷基硫酸钠（SDS）0.005％、NaCl0.225％、NaH₂PO₄.2H₂O0.156%、Na₂HPO₄.12H₂O1.43%、叠氮钠0.09％。其中乳胶抗体R2试剂包括如下组分：兔抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶0.5％、甘氨酸0.2％、叠氮钠0.09％。

实施例10

超敏C反应蛋白检测试剂盒，包括处理缓冲液R1试剂、乳胶抗体R2试剂、C反应蛋白标准品；其中处理缓冲液R1试剂包括如下组分：十二烷基硫酸钠（SDS）0.01％、NaCl 0.9％、NaH₂PO₄.2H₂O 0.078%、Na₂HPO₄.12H₂O 0.715%、叠氮钠0.1％。其中乳胶抗体R2试剂包括如下组分：兔抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶0.3％、甘氨酸0.8％、叠氮钠0.1％。

实施例11

超敏C反应蛋白检测试剂盒，包括处理缓冲液R1试剂、乳胶抗体R2试剂、C反应蛋白标准品；其中处理缓冲液R1试剂包括如下组分：十二烷基硫酸钠（SDS）0.01％、NaCl 0.45％、NaH₂PO₄.2H₂O 0.312%、Na₂HPO₄.12H₂O 2.86%、叠氮钠0.1％。其中乳胶抗体R2试剂包括如下组分：兔抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶0.3％、甘氨酸0.5％、叠氮钠0.1％。

实施例12

超敏C反应蛋白检测试剂盒，包括处理缓冲液R1试剂、乳胶抗体R2试剂、C反应蛋白标准品；其中处理缓冲液R1试剂包括如下组分：十二烷基硫酸钠（SDS）0.01％、NaCl 0.225％、NaH₂PO₄.2H₂O 0.156%、Na₂HPO₄.12H₂O 1.43%、叠氮钠0.09％。其中乳胶抗体R2试剂包括如下组分：羊抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶0.2％、甘氨酸0.5％、叠氮钠0.09％。

实施例13

超敏C反应蛋白检测试剂盒，包括处理缓冲液R1试剂、乳胶抗体R2试剂、C反应蛋白标准品；其中处理缓冲液R1试剂包括如下组分：十二烷基硫酸钠（SDS）0.02％、NaCl 0.9％、NaH₂PO₄.2H₂O 0.156%、Na₂HPO₄.12H₂O 1.43%、叠氮钠0.09％。其中乳胶抗体R2试剂包括如下组分：羊抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶0.5％、甘氨酸0.2％、叠氮钠0.09％。

实施例14

超敏C反应蛋白检测试剂盒，包括处理缓冲液R1试剂、乳胶抗体R2试剂、C反应蛋白标准品；其中处理缓冲液R1试剂包括如下组分：十二烷基硫酸钠（SDS）0.02％、NaCl 0.45％、NaH₂PO₄.2H₂O 0.156%、Na₂HPO₄.12H₂O 1.43%、叠氮钠0.1％。其中乳胶抗体R2试剂包括如下组分：羊抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶0.3％、甘氨酸0.8％、叠氮钠0.1％。

实施例15

超敏C反应蛋白检测试剂盒，包括处理缓冲液R1试剂、乳胶抗体R2试剂、C反应蛋白标准品；其中处理缓冲液R1试剂包括如下组分：十二烷基硫酸钠（SDS）0.05％、NaCl 0.9％、NaH₂PO₄.2H₂O 0.312%、Na₂HPO₄.12H₂O 2.86%、叠氮钠0.1％。其中乳胶抗体R2试剂包括如下组分：羊抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶0.3％、甘氨酸0.5％、叠氮钠0.1％。

Claims

1.无需对全血样本进行预处理的超敏C反应蛋白检测试剂盒，包括处理缓冲液R1试剂和乳胶抗体R2试剂，其特征是：乳胶抗体R2试剂包括兔抗人C反应蛋白抗体或羊抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶；

所述处理缓冲液R1试剂包括如下组分：0.01%的十二烷基硫酸钠（SDS）、0.9％的NaCl、0.156%的NaH₂PO₄.2H₂O、1.43%的Na₂HPO₄.12H₂O、0.09％的叠氮钠；

所述乳胶抗体R2试剂包括如下组分：0.2%兔抗人C反应蛋白抗体或羊抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶、0.5%的甘氨酸、0.09％的叠氮钠。