CN101878033A - 治疗或预防肠道炎症性疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及源自酵母的葡聚糖在治疗或预防动物的炎症性肠疾病和异常肠功能的相关疾病中的用途，所述葡聚糖具有β-(1，3)-主链，该β-(1，3)-主链具有一个或多个与其相连的β-(1，3)-侧链，本发明特别地涉及使用诸如来自酿酒酵母的可溶性葡聚糖在优选口服给药时的用途。本发明还涉及利用源自菊科的粕或蛋白质的炎症性肠疾病和异常肠功能的相关疾病的替代治疗。

Description

治疗或预防肠道炎症性疾病的方法
本发明涉及葡聚糖治疗或预防肠道炎症性疾病的用途。本发明还涉及源自菊科(Asteraceae)的粕(meal)，特别是蛋白质，治疗或预防肠道炎症性疾病的用途。
葡聚糖是在植物、细菌和真菌的细胞壁中发现的一组异质葡萄糖聚合物。本文所述的β-葡聚糖基础结构单元是包含β(1→3)连接的葡糖基单元或由β(1→3)连接的葡糖基单元组成的主链和侧链。取决于分离的来源和方法，β-葡聚糖在侧链上具有各种程度的分支和各种程度的连接。侧链上连接的频率和类型决定分子的生物活性。真菌和酵母来源的β-葡聚糖通常不溶于水，但是可以通过酸水解或通过向分子导入像磷酸、硫酸、胺、羧甲基等外来基团的衍生化作用变得可溶。
在欧洲、亚洲和美国，β-葡聚糖，特别是来自面包酵母(Bakers’yeast)的β-葡聚糖，已经长期用作动物的饲料添加剂，在创伤治疗中用作人的膳食补充物，以及用作护肤霜(skin cream)制剂的活性成分。而且，如在WO02058711中其用于治疗癌症所示，葡聚糖已经被用作功能性药剂。在本文的语境中，β-葡聚糖被视为免疫刺激剂，其部分地通过诱导被很好地调节的和局部的炎症反应而增加白细胞的活性。
溃疡性结肠炎和克罗恩病(Crohn’s disease)是难治愈的慢性肠道疾病。这两种疾病由于它们类似的症状而通常被共同归为构成炎症性肠疾病(在下文中称为IBD)的两种主要状况。假定全世界有多达4百万的人患有一种形式的IBD。在挪威，每年有600和300人分别被诊断为溃疡性结肠炎和克罗恩病。IBD的原因目前还不得而知。现有技术将环境、营养和遗传因素以及甚至吸烟和细菌/病毒感染定义为该疾病的可能原因。该疾病在高加索人种、妇女和较年幼的人中最常见。
目前，IBD不能治愈，其通过小心地控制患者的环境，连续地控制肠功能以及通过药物来进行控制。常见的药物包括抗炎症药物以及免疫抑制剂。在许多情况下，也用像除去部分肠的手术方法对抗该疾病。
最近的发现表明，IBD是由于缺乏诸如寄生虫和蠕虫的常规靶标而导致的。免疫系统因而在肠中转向其他靶标。这种假与广泛应用于像哮喘和过敏的状况的卫生学假说密切相关。
益生素和益生菌在治疗IBD中也引起了日趋增加的兴趣。
本发明的另一方面是治疗与诸如鱼和哺乳动物的动物的消化道有关的疾病，特别是异常肠功能或消化道的变化。目前主要的问题是不断增加的将诸如大豆粕和向日葵粕(sunflower meal)用作鱼和诸如哺乳动物的其他动物的饲料中的营养成分。由于大豆产品的价格低、可用蛋白的含量高且具有很好地平衡的氨基酸谱(profile)、组成恒定以及供应稳定，而是食肉、杂食和食草的鱼和其他动物的饲料中有价值的成分。
最近年来，动物饲料中植物蛋白的浓度明显地增加了，这导致了诸如炎症和其他状况的不良副作用，因而降低了重量增长、饲料转化和效率以及养殖动物的特性(performance)。植物蛋白含有像广谱抗营养因子(ANF)的物质，其向鱼的生理施加压力并导致动物消化系统的不良反应。
如向鱼饲喂大豆所观察到的，植物蛋白粕还可以诱导动物肠的形态变化。对于鱼而言，这种发病机理被归类为非感染性亚急性炎症，其特征为增殖增加、更新以及消化系统粘膜中未成熟细胞的数目增加。这导致粘膜中内源化合物如消化酶的再吸收降低，以及肠表面积减少。肠中细菌组成也发生改变。这种状况可以减弱鱼对疾病的抗性，并且似乎与免疫机制有关，该免疫机制类似于和超敏反应类似的那些免疫机制。
对于大部分这些植物蛋白，如大豆和向日葵粕而言，作为实用的商业限制，向饲料中添加的植物蛋白的通常水平为约10％。
除了动物饲料中较高水平的植物蛋白以外，动物饲料中的其他成分可以在动物消化系统中导致不良影响。这些成分的实例是环境毒素或通常较高浓度的其他存在的饲料成分，如碳水化合物。
尽管葡聚糖技术起源于上世纪中叶，但是不同葡聚糖在不同环境中的特定作用模式和效果以及它们对于许多不同疾病和状况的功能尚未得到完全充分的研究。本领域中唯一确定的是，葡聚糖本身不能被视为一组分离的分子，因为具有不同分子结构和来源的葡聚糖对于各种疾病和状况具有非常不同的影响。
作用的确切模式仍然不得而知。某些学说集中于被免疫系统认为是毒性病原体的葡聚糖的来源，而其他学说集中在分子水平，如侧链的数目、类型或空间位置。其他学说集中于葡聚糖单元的三螺旋结构，而其他学说再次涉及像分子量和受体结合亲和力等因素的特征。之前的研究表明，不同葡聚糖的来源和常见的分子结构本身可能是它们对抗不同疾病的功能的共同特性(denominator)。
在这种活性的不确定性和可变性中，本发明的发明人发现IBD可以通过利用具有特定分子结构的某些类型的葡聚糖来治疗。
本发明的葡聚糖具有β-1，3主链，即，主链由β-1，3连接的吡喃葡萄糖单元构成。所述葡聚糖具有一个或多个β-1，3侧链，即，侧链通过β-1，6连接与主链相连，其中所述侧链由β-1，3连接的吡喃葡萄糖单元构成。所述侧链包含2个或更多个，通常为3、4、5、10个或更多个β-1，3连接的吡喃葡萄糖单元。
本发明提供具有β-1，3主链的葡聚糖在治疗IBD或异常肠功能的相关疾病中的用途，所述β-1，3主链具有一个或多个与其相连的β-1，3侧链。优选地，在人和非类人动物肠疾病中治疗IBD，或治疗具有和人IBD一样的要素的异常肠功能。在包括诸如狗和猫的宠物在内的某些动物中，IBD本身已经被诊断，因此可以进行治疗。
在本发明中，通过任何可能的给药模式向个体给予葡聚糖，但优选口服。
药物可以作为膳食方案的部分进行给药。可以将药物配制成营养品、动物饲料、食品、营养品的一部分、动物饲料的一部分、食品的一部分和/或佐剂。可以向任何动物给予含有葡聚糖的药物，包括人、非人类灵长类和其他哺乳动物、驯养和家畜动物、鸟和鱼，包括养殖的鸟和伴生鸟(companion bird)如鹦鹉，以及养殖的鱼和宠物鱼在内。具体实例包括犬、猫、马、奶牛、猪、山羊、大鼠、小鼠以及绵羊。本发明清楚地表明，这些类型的葡聚糖可以用于预防和/或治疗如在本说明书中的下文中进一步示例的哺乳动物和鱼的IBD和相关的疾病。
本发明中所用的酵母葡聚糖可以处于天然状态，如在完整的酵母中，或者它们可以以某种方式进行加工，即从其他细胞组分分离葡聚糖，将葡萄糖衍生化和/或与天然存在的结构相比改变化学结构。衍生的葡聚糖优选地含有下述基团：硫酸、胺、乙酸、磷酸、膦酸或羧甲基。葡聚糖化学结构的其他改变通常包括主链长度的减小和/或支链和/或侧链的长度或复杂性的降低。
优选地，葡聚糖不处于其天然状态，即，不以完整的细胞或甚至完整的细胞壁组分存在，而是被加工成部分地分离自在自然界中发现的其他细胞壁组分，例如蛋白质和几丁质。酸或碱处理或者酶促处理获得用于本发明的优选葡聚糖。这类葡聚糖的分子量在下文给出。
如通过酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)示例的，葡聚糖可以来自各种不同的来源，但是优选来自酵母。
本发明的葡聚糖包括可溶性和颗粒葡聚糖，这两种葡聚糖都是有效的。
在不限制于理论的情况下，可溶性和颗粒葡聚糖被认为利用相同的机制在治疗肠道的炎症性疾病中发挥它们的功能。
用于本发明的优选的含有β-葡聚糖的产品，含有作为总细胞组分百分比的至少75％、优选至少80％的碳水化合物。在这类碳水化合物中，主要是葡聚糖。
本发明有用的β-葡聚糖产品的实例包括但不限于如由Biothera生产的葡聚糖产品Imucell和由CarePharma Co，Ltd.经销的葡聚糖产品Immiflex(以前为Fluflex)。
有用的β-葡聚糖包括但不限于如PCT/IB95/00265和EP 0759089所述的颗粒酵母细胞壁葡聚糖和可溶性酵母细胞壁葡聚糖。
取决于酵母的株系和类型，葡聚糖构成酵母细胞壁干重的高达25％。在从酵母分离β-葡聚糖的过程中，除去了甘露糖蛋白以及大部分细胞的内容物，从而留下组成β-葡聚糖层的“空壳”颗粒(“ghost”particle)或完整的葡聚糖颗粒。这类β-葡聚糖的实例包括但不限于β-1，3/1，6葡聚糖产品，其由Biothera公司以APG 3-6销售。如果β-葡聚糖分离自自溶的酵母，则细胞壁破坏的更厉害，从而获得破裂的空壳颗粒。
提供葡聚糖的来源的其他酵母包括啤酒酵母(Brewers yeast)；念珠菌(Candida sp.)，如白色念珠菌(Candida albicans)、阴沟念珠菌(Candidacloacae)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、产朊念珠菌(Candida utilis)；汉逊酵母(Hansenula sp.)，如温奇汉逊酵母(Hansenula wingei)、Hansenulaarni、Hansenula henricii和美洲汉逊酵母(Hansenula americana)；组织胞浆菌(Histoplasma sp.)；克勒克酵母(Kloeckera sp.)；克鲁维酵母(Kluyveromyces sp.)，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、多孢克鲁维酵母(Kluyveromycespolysporus)；毕赤酵母(Pichia sp.)；红酵母(Rhodotorula sp.)；酵母(Saccharomyces sp.)，如德氏酵母(Saccharomyces delbruekii)、罗氏酵母(Saccharomyces rosei)、微球酵母(Saccharomyces microellipsodes)、卡尔斯伯根糖酵母(Saccharomyces carlsbergensis)或不同的酵母株，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)R4(NRRL Y-15903)和R4Ad(ATCC No.74181)；裂褶菌(Schizophyllum sp.)；裂殖酵母(Schizosaccharomyces sp.)，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；串酵母菌(Torula sp.)以及球拟酵母(Torulopsis sp.)。
葡聚糖的其他来源是具有如本发明中所定义的分子结构的蘑菇或其他真菌、藻类、草或细菌，该分子结构是β-1，3连接的葡聚糖主链，该主链具有通过β-1，6连接与其相连的一个或多个β-1，3侧链。
在动物饲料和养殖工业中，使用有机体的细胞，最常见的是酵母细胞，并将该细胞直接饲喂给动物。这些产品具有不同的形式和形状，如压缩、液态、破裂、干燥、活性细胞、无活性细胞以及诸如活性干燥、瞬时活性干燥和无活性干燥的组合。这些产品最通常是用于诸如酿造或烘焙的其他生产过程的细胞的残留，并且被视为有价值的葡聚糖来源。本发明的葡聚糖还可以以未纯化的方式使用，意即作为完整的细胞、生产中间产物、用其他组分部分处理的中间产物，或者用作完全或部分地分离自其他细胞组分的提取的葡聚糖产品。特别是，更加加工的葡聚糖对于非人类用途是优选的。
可方便地使用加工的产品或细胞提取物实现本发明的效果。这些产品可以是水解或自溶的细胞、部分或完全纯化的细胞壁。适合不同类型的用途的各种形式的所有的这些产品都是可用的：液态、半糊状、糊状、精细粉末、油包衣的粉末、微粒粉末，在此处仅描述了一些形式。
含有分离的碳水化合物组分的产品可以是两种或更多种组分(如，来自酵母细胞壁)的组合产品，例如葡聚糖和甘露聚糖的组合。
甘露聚糖是含有高比例的甘露糖亚基的多糖。优选地，甘露聚糖由D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖以约3∶1∶1的比率组成。
可以将葡聚糖与其他组分混合，例如细胞壁的其他部分，如甘露聚糖；或者与不是细胞壁的一部分的组分，例如维生素或矿物质，以及在药物、营养、食品、动物饲料以及兽医工业中经常使用的其他试剂。这组产品的实例是与矿物质和维生素组合的即用葡聚糖产品，以及组合了葡聚糖与其他抗IBD试剂的营养品。
除了1，3连接的侧链以外，葡聚糖还可以具有一个或多个1，6-连接的侧链。然而，优选的葡聚糖是用酸或酶或任何其他合适的方法处理以明显降低或消除葡聚糖中重复的(1，6)-连接的葡萄糖分子的数目的那些葡聚糖，或者以低水平的1，6-连接存成的那些葡聚糖。这些(1，6)-连接的葡萄糖分子主要采用β-构象，并且通常见于β-葡聚糖分子的侧链中。取决于葡聚糖的来源，β-1，6-连接的葡萄糖部分可以从一个葡萄糖部分至大比例的葡萄糖部分而发生变化。所得的优选葡聚糖具有β-1，3-主链和β-1，3侧链，该侧链通过一个β-1，6-连接与主链相连，该β-1，6-连接不被消除处理所切割。这些产品可以是颗粒、半可溶或可溶的。这些修饰的葡聚糖分子优选地源自酿酒酵母(S.cerevisiae)。
优选的葡聚糖基本上不含重复的β1，6-连接的葡糖基单元。因此，分支点的1，6-连接不提供“重复的”β1，6-连接的葡糖基单元，但是可能与相邻的残基一起提供“重复的”β1，6-连接的葡糖基单元。“基本上不含”意即少于2％、优选少于1％的总葡糖基单元。这种产品的实例如图1所示，其是重复的β-1，6-连接的葡糖基单元少于1％的支链β-1，3-葡聚糖的1H-NMR谱。
因此，葡聚糖分子中优选少于10％、更优选少于5％、最优选少于3％或2％的糖苷键是(1，6)连接。
诸如酶处理的某些处理可以在侧链中留下高达4个未被切割的β-1，6-连接的葡糖基单元。这类分子也“基本上不含”重复的β1，6-连接的葡糖基单元。
本发明所用的葡聚糖可以是单一的提取组分或者具有不同分子量的两种或更多种不同组分的形式。
本申请的葡聚糖最优选的来源是来自酿酒酵母的细胞壁。其中，用于本发明的优选来源是可溶性酵母产品SBG(可溶性β葡聚糖)，其是由总部位于挪威的公司Biotec Pharmacon ASA生产的。
该产品是未衍生化的(就化学修饰基团而言)水性可溶性β-1，3/1，6-葡聚糖，其通过NMR和化学分析的特征是由β-1，3-连接的D-葡萄糖的聚合物组成，该聚合物含有β-1，3和β-1，6-连接的D-葡萄糖的侧链，其中侧链中β-1，6部分的数目(不包括位于主链/侧链分支点的β-1，6部分)与酵母细胞壁中所述葡聚糖的结构相比明显降低。这种组成的实例如下所示：
  组分   值/范围   通常值
  水   977-983克/kg   980
  碳水化合物   18-22克/kg   20
  蛋白质   最大1克/kg   ＜1
  灰分   最大1克/kg   ＜1
  脂类   最大1克/kg   ＜1
SBG的分子结构如下所示：
Figure GPA00001137464400071
n≥0；R＝H或(C6H8-10O5)m；m(R1+R2)＝35至2000个葡糖基单元
可以通过下述方法之一实现β-(1，6)-连接的葡糖基残基的降低以制备上文的本发明的优选葡聚糖：
i)酶促处理，例如，如挪威专利300692中所述：
通过使用特异性地作用于聚葡萄糖链中的β-1，6-连接的酶进行酶处理来选择性地除去如美国专利5,401,727中制备的微粒产品中的β-1，6-连接的葡萄糖的侧链。将微粒产品(0.2克)悬浮于40ml、50mM、pH为5.0的乙酸铵缓冲液中，并与20单位的β-1，6-葡聚糖酶混合。将混合物于37摄氏度下连续搅拌6小时，并通过煮沸5分钟来终止酶的作用。将残留的酶处理的颗粒通过离心和重悬浮在无菌蒸馏水中反复洗涤。所得的产物是分支的β-1，3葡聚糖，其具有在分支点通过β-1，6-连接相连的β-1，3-葡聚糖侧链，并且在从分支点延伸的侧链中基本上不含β-1，6-连接的葡萄糖。关键步骤是用β-1，6-葡聚糖酶于32℃-40℃下将颗粒葡聚糖孵育3-9小时。
ii)甲酸处理：例如可以将美国专利5,401,727所制备的微粒产品悬浮在甲酸中并加热。将悬浮液冷却并除去游离的甲酸。
用于本发明的优选的含有葡聚糖的制剂是分子量(MW)大于6000道尔顿的可溶性β-葡聚糖的混合物，其相互作用以获得较高级别(order)的构象。例如，如上文所示的数值MW大于6kDa、优选MW为6kDa-30kDa的直链β-1，3-葡聚糖链与具有从主链内部延伸的β-1，3连接的侧链的分支高分子量β-1，3-葡聚糖(例如，MW大于15kDa)的混合物。
优选地，葡聚糖单链的平均分子量为约20kDa，并且范围是约6kDa至约30kDa，优选的范围是15kDa-25kDa。在单链形式中，葡聚糖可以以构象的混合物存在，该构象包括随机卷曲、凝胶基质或聚集、三螺旋及单螺旋。当在水性溶液中时，分子可以参与链间相互作用，从而通过高效凝胶色谱分析时产生高达5000kDa的高分子量形态。优选的组成是在水溶液中形成凝胶样形态的那些组成，从而证明了复杂的分子间相互作用。
用于与本发明关联的仍然另一优选的产品是NBG(挪威β葡聚糖)，其是由Biotec Pharmacon ASA生产的颗粒酵母产品。NBG是源自面包酵母(酿酒酵母)的产品。该产品是天然未衍生化的(就化学修饰基团而言)颗粒β-1，3/1，6-葡聚糖，其通过NMR和化学分析的特征是由β-1，3-连接的D-葡萄糖的聚合物组成，该聚合物含有β-1，3和β-1，6-连接的D-葡萄糖的侧链。
NBG的化学组成的通常值如下所示：
  组分   重量％   通常范围％
  碳水化合物   最小75   75-80
  脂类   最大5   3-5
  氮   最大1.4   0.8-1.2
  灰分   最大12   8-10
  总固体   最小95   95-98
用于本发明的优选β-葡聚糖，SBG和NBG的基本共有分子结构如下所示：
Figure GPA00001137464400091
R＝H或(C6H8-10O5)1-50；n＝35-2000；
SBG和NBG特别适合向人给药。
用于本发明，特别是用于向非人类接受者给药的另一优选葡聚糖来源是PatoGardTM，其是由总部位于挪威的公司Immunocorp销售的。所述产品的组成如下所示：
  组分   重量％
  碳水化合物   最小40
  蛋白质   最大32
  灰分   最大8
  脂类   最大15
  水分   最大8
碳水化合物组分的通常值如下所示：
  组分   占总碳水化合物的％
  葡聚糖   20
  甘露聚糖   25
  几丁质   ＜1
  糖原   ＜2
通常，PatoGardTM含有约20％-30％重量比的蛋白质、20％-35％的β-葡聚糖和20％-35％的甘露糖。
仍然特别用于非人类接受者的另一优选来源是水解的酵母产品即
Figure GPA00001137464400092
饲料配料(
Figure GPA00001137464400093
Feed Ingredient)，其是由总部位于挪威的公司Immunocorp销售的。所述产品的组成如下所示：
  组分   按重量计％   通常范围％
  碳水化合物   最小60   63-68
  β-1，3/1，6-葡聚糖   最大54   57-61
  脂类   最大18   13-18
  蛋白质   最大8   5-7
  灰分   最大12   6-10
  组分   按重量计％   通常范围％
  总固体   最小92   94-97
替代选择是
Figure GPA00001137464400101
其具有如下组成：
  组分   重量％   通常范围％
  碳水化合物   最小65   65-70
  脂类   最大15   12-14
  蛋白质   最大8   5-7
  灰分   最大10   5-9
  干物质   最小92   94-97
另一优选的葡聚糖来源是
Figure GPA00001137464400102
其具有如下组成：
  组分   占干物质的％   通常范围％
 β-1，3/1，6-葡聚糖   最小95   96-99
 脂类   最大1   0-1.0
 灰分   最大2   0.1-1.0
 蛋白质   最大1   0-1.0
其他
Figure GPA00001137464400103
产品包括浸渍级(
Figure GPA00001137464400105
Immersion Grade)、
Figure GPA00001137464400106
佐剂(
Figure GPA00001137464400107
Adjuvant)和
Figure GPA00001137464400108
悬浮液(F1 Suspension)。
Figure GPA000011374644001010
饲料配料是优选的。
Figure GPA000011374644001011
和
Figure GPA000011374644001012
都适合于本文所述的全部方法和用途。
在某些情况下，其中葡聚糖基本上被纯化的酵母葡聚糖产品，如由Immunocorp销售的MacroGardTM，以及类似的产品，是优选的。可以根据这些产品的源自酵母细胞壁的葡聚糖和甘露聚糖总含量的比率来定义这些产品，即基本上它们的总碳水化合物含量比它们的源自酵母细胞壁的总蛋白质含量。通常，这类产品的源自酵母细胞壁的总碳水化合物含量与源自酵母细胞壁的总蛋白质含量的比为至少7∶1，优选为至少10∶1或12∶1，如约15∶1。
对于其他应用，酵母葡聚糖产品，其中的葡聚糖被纯化较低程度的葡聚糖产品，如由Immunocorp销售的PatoGardTM，以及类似的产品，是优选的。通常，这类产品的源自酵母细胞壁的总碳水化合物含量比源自酵母细胞壁的总蛋白质含量为1∶1至7∶1，优选为1∶1至5∶1。
本发明的优选颗粒β-葡聚糖可以通过下述方法制备：
通过在碱和酸中重复提取干酿酒酵母，例如根据美国专利5,401,727(通过引用并入本文)所述的方法。所述的提取过程除去酵母细胞中的胞质组分以及位于细胞表面的含有甘露糖的多糖和蛋白聚糖。根据这种方法制备的产品由β-1，3β-1，6-葡聚糖组成，并且粒径为2-5微米。这种微粒β-1，3β-1，6-葡聚糖的化学结构的特征是83％的β-1，3连接的葡萄糖、6％的β-1，6连接的葡萄糖和5％的β-1，3，6连接的葡萄糖，并且该微粒β-1，3β-1，6-葡聚糖是以β-1，3，6-连接的葡萄糖作为分支点的β-1，3-葡聚糖链。
本发明的颗粒葡聚糖的分子量为5000Da-1,000,000Da，优选为25kDa-500kDa，更优选为150kDa-300kDa，并且最优选为约250kDa。
可以如WO/2001/062283(通过引用并入本文)所述，使上文所述的颗粒葡聚糖增溶。因此，甲酸既既可以用于降低葡聚糖中β-(1，6)-连接的葡糖基残基数目，也可以用于使葡聚糖增溶。
本领域技术人员在本发明的教导下可以容易地鉴定或分离β-1，3-葡聚糖家族中的其他结构和/或结构构象。因此，上文是实现高效产品的指导，但并非是对甚至更高效产品的限制。当被给予时，相对于目前示例的制剂，复杂混合物的分离结构元素可以具有改善的效果。
用于配制用于本发明的含有葡聚糖的组合物的合适载体或辅助剂，包括碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露糖醇及其他糖、滑石、乳蛋白、明胶、淀粉、维生素、纤维素及其衍生物、动物和植物油、聚乙二醇以及诸如无菌水、醇、甘油和多元醇的溶剂。所述组合物的pH和各种组分的确切浓度根据常规技术来调整。
优选地制备医药和兽医用途的组合物，并以剂量单位给药。本文所用的术语“剂量单位”及其语法等同物是指适合作为用于人或非人类个体的单一剂量的物理上离散单位，每个单位含有经计算与所需的诸如稀释剂或媒介物的生理耐受载体联合产生期望的治疗效果的预定有效量的葡聚糖。
所述组合物可以包含适合向个体给药的形式的单独活性成分，或者所述组合物通常包含葡聚糖和一种或多种生理可接受的载体、一种或多种其他活性成分或者上述的某些组合。
本文所述的制剂可以通过任何已知的方法或今后在药学、兽医学、动物和人类营养等领域发展的方法来制备。通常，这类制备方法包括下述步骤：使活性成分与载体或者一种或多种其他附属成分联合，然后，如果需要或期望，将产品成型或包装成期望的单个或多个剂量单位。本发明的组合物的控释或缓释制剂可以利用常规技术来制备。
包含在用于本发明的组合物中的活性化合物的剂量水平可以变化。葡聚糖的功能性剂量范围可以由本领域普通技术人员容易地确定。例如，当口服给药时，用于人的功能性剂量范围和有效量为0.1-500mg/kg b.w./天，优选为1-100mg/kg b.w./天，最优选为5-30mg/kg b.w./天。当胃肠外给药时，合适的功能性剂量范围时0.1-10mg/kg b.w./天。
本发明的组合物可以以物品(article)或载体的形式呈现，例如片剂、包衣片剂、锭剂、药片、糖浆或酏剂、脂质体、粉末/滑石或者其他固体、溶液、乳液、悬浮液、液体、喷雾剂、凝胶、滴剂、气雾剂、灌注液、软膏、泡沫、乳剂、凝胶、贴剂(paste)、微胶囊、控释制剂、缓释制剂或者任何其他物品或载体，所述任何其他物品或载体在任何给定和预期的时间点，根据给药的优选模式是可能或有用的。
给药途径对熟练的技术人员是显而易见的，并且取决于包括被治疗的疾病的类型和严重性、被治疗的个体的类型和年龄等在内的任何数目的因素。最优选的给药途径是口服，任选地通过管饲法给药。
适合葡聚糖(优选可溶性葡聚糖)口服给药的制剂包括但不限于水性或油性悬浮液、水性或油性溶液或者乳液。这类制剂可以通过任何方式来给药，所述方式包括但不限于软明胶胶囊。可以通过液体形式或者意图在使用前用水或其他合适媒介物还原的干产品形式来制备、包装和销售适合口服给药的本发明的药物组合物的液体制剂。对于颗粒产品而言，可能使用其他给药方式，其包括但不限于胶囊、片剂、粉剂、粒剂、锭剂、滴剂、栓剂或适合颗粒产品的任何其他给药方式。
当症状出现时或甚至症状没有出现时，可以间歇地重复治疗。其可能与在预期激发之前的两周和/或激发后的几周，给予组分有关。对于慢性状况的治疗，连续使用也是可能的。
可以单独提供葡聚糖或与其它药剂组合提供，以提供有效组合。因此，在另一实施方案中提供含有(a)如上文所述的葡聚糖和(b)用于治疗IBD或异常肠功能的相关疾病的第二活性剂的产品，作为在治疗IBD或异常肠功能的相关疾病中同时、单独或依次使用的组合制剂。优选地，第二活性剂源于菊科植物，并且优选为源自菊科植物的含有蛋白质的组分，即粕，例如向日葵粕，源自其中的油已经被大部分除去的产品。
因此，可能采用单独的葡聚糖，两种或更多种的葡聚糖的组合，或者如果合适的话，采用葡聚糖和另一种医药物质的组合。对于包含两种或更多种葡聚糖的组合物而言，可能采用源自相同或不同种类或者源自相同种类但是通过不同方法制备的的不同的葡聚糖。
熟练的技术人员/医师能够选择可与葡聚糖一起使用的医药物质，用于治疗相关疾病状况。合适的其他医药物质的实例为，但不限于，免疫抑制剂例如硫唑嘌呤(咪唑硫嘌呤(Imuran))，氨甲蝶呤(重氮片(Folex)、甲氨蝶呤胶囊(Rheumatrex))或6-巯基嘌呤(硫基嘌呤(Purinethol)、6-MP)，和环孢霉素A(山地明(Sandimmune)，新山地明(Neoral))；柳氮磺吡啶(Azulfadine)，氨水杨酸(mesalamine，美沙拉嗪(Asacol)、颇得斯安(Pentasa))和奥沙拉嗪(地泊坦(Dipentum))；类固醇例如以强的松，甲基强的松龙或布地奈德(Entocort EC)为实例的类固醇，抗生素例如甲硝唑或泰乐菌素；生物制剂例如静脉内给药的英利昔单抗(Remicade)；以及在补充医学中使用的可选择和不同的药剂，例如鱼油和包括但不限于芦荟制品(aloe vera)、丁酸盐、乳香(boswellia)、益生菌和烟碱的其它试剂。
通常，β-葡聚糖能够每天数次对动物进行给药，或者可以不那么频繁给药，例如一天一次。例如该治疗取决于IBD或相关疾病的类型，状况的严重程度和每个患者的状况。葡聚糖治疗可以与任何其它治疗方案紧密相互关联，并能够处于任何其它药剂的给药之前、与其同时存在或在其之后。
可以将本发明所述的葡聚糖或两种或多种葡聚糖的组合物用作预防，用于在IBD疾病条件爆发之前预防该疾病，或者用作IBD被诊断后的治疗。因此本文所用的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括但不限于预防治疗，即预防，并且也包括稳定，例如如果不治疗将会恶化的疾病的治疗，但是该治疗不会导致疾病的治愈。对于IBD或异常肠功能的相关疾病来说，“治疗(treatment)”包括在一种或多种、优选多于一种的症状或风险因素中可测量的和有益的改善。优选地，在一种或多种症状中，并且更优选地由患者和/或治疗医师根据该疾病的历史表现或其预期(例如在预防治疗的情况下)得出改善了IBD或相关疾病的结论。
术语“IBD”是指炎症性肠疾病(下文称为IBD)，该炎症性肠疾病主要包括引起肠炎症的两种慢性疾病：溃疡性结肠炎和克罗恩病。尽管这两种疾病具有一些共同的特征，但是具有主要关于炎症性变化的性质和位置的某些重要的差异。溃疡性结肠炎为主要限于大肠，也称作结肠的炎症性疾病。在溃疡性结肠炎中，肠道内壁或粘膜变得发炎并发展成溃疡。克罗恩病在其涉及的肠区域与溃疡性结肠炎不同-最常见的是其影响小肠的最后部分、末端回肠和部分大肠。然而，克罗恩病也可攻击胃肠道的任何部分。通常，克罗恩病趋于牵连整个肠壁，而溃疡性结肠炎仅影响肠的内壁。占很少的病例是其它形式的IBD，例如胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、导流结肠炎、白塞综合征(Behget′s syndrome)、感染性肠炎和未确定型结肠炎。
“异常肠功能的相关疾病”包括患者表现出连续或零星的肠功能受损的疾病或状况，其通常与肠道蠕动和/或肠炎的改变有关。此类相关疾病或状况包括便秘、腹泻和大便失禁，以及由于肠切除手术或类似情况而导致的状况或疾病。
本发明还提供包含本文所述葡聚糖和信息材料的试剂盒或给药装置，该信息材料描述了将葡聚糖给予人或其它动物用于治疗IBD或异常肠功能的相关疾病。该试剂盒或给药装置可具有含有葡聚糖的隔间(compartment)。如本文所述的“信息材料”包括但不限于对于本发明组合物的指定用途，能够用来传达其用途的出版物、录音、图表或任何其他表达媒介。
本文所述的菊科蛋白质本身(独立于葡聚糖的存在)可用于治疗腹泻。与用不符合本发明的可比较的类似的饲料所看到的情况相比，这样的治疗包括腹泻的相对降低。基于粪便中干物质的量，能够评估腹泻。治疗还包括预防，即饲料预防其他预期水平的腹泻。
本文所述的菊科蛋白质也可以用于治疗肠疾病和改善肠健康状况中。相关的肠病通常是炎性的，并且包括炎症性肠疾病或炎症性肠综合征。
菊科优选源自向日葵属，最优选地其为向日葵(Helianthus annus)(向日葵)。
如果将菊科蛋白质作为动物饲料制剂的一部分进行给予的情况下，菊科粕通常会占总饲料制剂的2％-50％，优选5％-40％，更优选8％-30％。
因此，在另一方面中，本发明提供了菊科蛋白质，用于治疗或预防动物中的肠疾病。
如果本文引用了菊科或其它植物蛋白质，除非上下文另有明确，应理解的是可以使用菊科或其它植物粕。在另一方面中，在本文所述的各种不同的制剂和方法中，除了菊科粕的蛋白质部分外，菊科粕的其它组分也可以用来代替菊科蛋白质。
术语“粕”是本领域公知的术语，用来指例如在压榨和溶剂提取方法中，将一些或大多数油从植物、种子或豆子等中除去之后的残余物。因此，通常被定义成油籽蛋白质的这些植物蛋白质来源也可以整体供给，但是更通常将它们作为除去油后的副产物供给。
向日葵粕包括蛋白质、纤维、灰分、脂肪和油残余物。除其它变量外，向日葵粕的组成取决于种子的油含量、去壳的程度、油提取的效率和除去油的温度。
因此，在另一方面，本发明提供了菊科粕或源自菊科粕的任何因子如蛋白质，用于治疗IBD或异常肠功能的相关疾病。上述关于用于葡聚糖制剂和治疗的靶种类的讨论，已做必要修正，适用于源于菊科的产物的用途。人、鱼和牲畜哺乳动物是优选的。
“有效量”是指有效改善疾病的症状或改善、治疗、预防、延迟疾病发作或抑制疾病的进展的化合物的量。最终，主治医师或兽医将决定合适的量和剂量治疗方案。可以与载体材料组合来制备单一剂量的活性成分的“有效量”将根据治疗的个体和给药的具体模式而变化。
在本公开中引用了各种不同的文献，包括如出版物和专利。在其相关部分中，所有此类文献通过引用在此并入。引用任何给定的文献不应解释为承认其是关于本发明的现有技术。如果本书面文件中术语的任何意义或定义与通过引用而并入的文献中该术语的任何意义或定义在某种程度上冲突，以指定给本书面文件中术语的意义或定义为准。
对于包括在本发明中使用的各种成分在内的组分，本文引用的是商品名。在此本发明人并非意图受限于某些商品名下的材料。与通过商品名引用的材料等同的材料(例如从使用不同名称或引用编号的不同来源获得的材料)可以在本文的描述中被代替或使用。
本文所描述的组合物可包含本文所描述的任意成分，基本上由其组成或由其组成。
对于本说明书的目的，应清楚理解的是单词“包含(comprising)”是指“包括但不限于”，并且单词“包含(comprises)”具有相应的意思。因此，单词“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”要理解成包括在内，而不是排斥在外。
除非上下文另有明确的说明，否则本文和权利要求中所用单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“这个(the)”包括复数涵义。
除非另有定义，否则在本发明领域中，本文所用的所有的技术和科学术语以及任何缩略语都具有与本领域普通技术人员通常所理解的具有相同的意思。
下述实施例旨在说明本发明，并教导本领域普通技术人员执行并使用本发明。这些实施例并非意图以任何方式限制本发明。在下述实施例和附图中进一步描述本发明。其中：
图1为具有小于1％的重复的β-1，6-连接的葡萄糖基单元的支链β-1，3-葡聚糖的1H-NMR光谱。所观察到的不同的化学位移显示在下述表1中：
表1
  化学位移(ppm)   归属   注解
5,00 H1RT(α)   用于还原端(RT)的α-端基异构体中的H1，
  化学位移(ppm)   归属   注解
4,54 H1BC   (1-3)-连接的葡萄糖基重复单元(GRUs)的主链中的H1
4,39   H1NRT+H1RT(β)   非还原端(NRT)+还原端(RT)的β-端基异构体中的H1
  4,27   H1(1-6)SC   (1-6)-连接的侧链中的H1
  4,03   H6(1-6)SC   (1-6)-连接的侧链中的H6
3,72 H6BC   (1-3)-连接的葡萄糖基重复单元(GRUs)的主链中的H6
3,48   H3BC+H6’BC   (1-3)-连接的葡萄糖基重复单元(GRUs)主链中的H3和H6’
3,30-3,24   H2BC+H4BC+H5BC   (1-3)-连接的葡萄糖基重复单元(GRUs)的主链中的H2、H4和H5
  3,09   H2NRT   非还原端(NRT)中的H2
  3,02   H2(1-6)SC   (1-6)-连接的侧链中的H2
  2,54   DMSO   溶剂峰
图2显示在按照下文实施例1的限定处理的动物中，体重变化的对比。
图3显示按照下文实施例1的限定处理的动物的存活率。
图4显示根据下文实施例1限定的实验设计，在急性结肠炎中，(A)代表性的结肠部分和(B)结肠炎和组织损伤的分级比较。
图5显示根据下文实施例1所限定的模型处理的小鼠的(A)代表性的结肠长度图示和(B)结肠长度的分布。
图6显示根据下文实施例1所限定的模型处理的小鼠的(A)脾脏重量分布和(B)胸腺重量。
图7为显示大西洋鲑鱼粪便中干物质的百分比的图，这是腹泻的良好指标。
图8为显示在按照下文实施例1的限定处理的动物中的急性结肠炎中，一系列与全身炎症有关的所选择介质的水平的图。
图9显示按照下文实施例4的限定处理的小鼠的(A)体重和(B)平均流体消耗。
图10显示按照下文实施例4的限定处理的小鼠的(A)宏观可见的淋巴集结(Peyer’s patch)的数量和(B)福尔马林固定的肠系膜淋巴结的横截面面积。
图11显示按照下文实施例4的限定处理的小鼠的(A)淋巴集结和(B)肠系膜淋巴结的主要淋巴细胞亚群的组成。
图12显示在按照下文实施例4的限定处理的小鼠的远侧结肠中，Ki67阳性细胞、增生的肠上皮细胞的(A)数量和(B)分布；(C)代表性染色图。
图13显示在按照下文实施例4的限定处理的小鼠中，AB/PAS阳性杯状细胞的(A)数量和分布，以及(B)代表性染色图。
实施例
实施例1.可溶性β-葡聚糖对实验性结肠炎的影响
1.1.实验设计
建立模型来评估可溶性葡聚糖(在此其是从Biotec Pharmacon ASA公司购买的产品SBG)对治疗炎症性肠疾病的影响，在此以溃疡性结肠炎作为示例。
通过与饮用水中溶解的右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)接触7天，诱导实验性结肠炎。在诱导结肠炎之前，如下所述将动物预处理7天。在经历4天的急性/恢复阶段后处死小鼠。
将动物分成四个实验组：
1.整个实验过程中，对对照动物(n＝12)提供一般的饮用水。
2.整个实验过程中，对SBG处理的动物(n＝12)提供饮用水中的SBG(100mg/L)。
3.在诱导期(7天)中，对DSS处理的动物(n＝16)提供DSS(1.5％w/v)。在预处理期(7天)和急性/恢复期(4天)中给予一般的饮用水。
4.在诱导阶段(7天)中，对SBG+DSS处理的动物(n＝15)提供溶解在含有SBG(100mg/L)的水中的DSS(1.5％w/v)。在预处理阶段(7天)和急性/恢复阶段(4天)中，给予饮用水中的SBG(100mg/L)。
1.2实验详述
每天监测动物的发病率和体重的一般体征，并记录流体消耗。人道终点的主要标准是降低的体重大于基准体重的20％。由于动物福利的原因，对没有满足体重标准的估计明显垂死的小鼠实施安乐死。
在心脏穿刺之前，通过皮下注射
Figure GPA00001137464400191
和咪达唑仑(50-75μL/10g体重)将动物麻醉。死后，切除结肠、脾脏和胸腺。在固定之前，将结肠用冷的PBS冲洗并分成近侧结肠段、中间结肠段和远侧结肠段。将所有的样品置于冰上并在福尔马林中固定，用于随后的制备和分析。
通过研究体重变化、存活率、结肠炎和组织损伤、疾病相关的结肠变短及脾脏和胸腺重量的变化，以及循环中炎症性介质的水平变化来评估结果。
由不了解样品特性和研究组的受过培训的病理学者来评估结肠炎和组织损伤。以炎症性细胞浸润(评分0-3)、组织损伤(评分0-3)、淋巴聚集的不存在或存在(评分0或1)和上皮再生的不存在或存在(评分0或1)的组合来表示组织病理学评分。通过将评分与形成溃疡的面积的比例相乘来校正组织损伤评分(0-25％＝×1、25-50％＝×2、50-75％＝×3和75-100％＝×4)(表2)。将从近侧结肠段、中间结肠段和远侧结肠段获得的评分相加来计算总评分。
表2.组织病理学评分标准
炎症性细胞浸润                                评分0-3
固有层中偶尔存在炎症性细胞                    0
固有层中炎症性细胞数目增加                         1
扩展进入粘膜下层的炎症性细胞汇合                   2
炎症性浸润液跨壁扩展                               3
组织损伤                                           评分0-3
无粘膜损伤                                         0
淋巴上皮病变                                       1
表面粘膜糜烂或病灶性溃疡                           2
大面积的粘膜损伤和扩展进入肠壁的更深结构           3
上皮表面的溃疡面积                                 因子1-4
0-25％                                             1
25-50％                                            2
50-75％                                            3
75-100％                                           4
淋巴聚集                                           评分0-1
不存在                                             0
存在                                               1
上皮再生                                           评分0-1
不存在                                             0
存在                                               1
注意表2：
在源自近侧结肠部分、中间结肠部分和远侧结肠部分的活组织检查中，建立组织学评分以使结肠炎和损伤的程度量化，并将其结合至总评分。当记录的组织损伤评分≥2时，将该评分乘以对应于受影响的面积的因子。
1.3结果：
口服SBG给药降低结肠炎相关的体重减轻
监测体重减轻即关键的临床症状，来评价SBG对实验性IBD的保护作用。在通过将DSS给予雄性BALB/c小鼠7天来诱导急性结肠炎之前，用SBG或一般的饮用水将雄性BALB/c小鼠预处理7天。在实验期间，对对照(Ctr)动物[基线重量22.7(21.4-24.0)g；平均及(范围)，n＝12]提供一般的饮用水。
在实验期间，对SBG处理的动物[基线重量22.2(20.3-24.9)g；平均及(范围)，n＝12]提供饮用水中的SBG(100mg/L)。在诱导期中，对DSS处理的动物[基线重量22.3(20.6-23.4)g；平均及(范围)，n＝16]提供DSS(1.5％w/v)。在预处理阶段和急性/恢复阶段给予一般的饮用水。
在诱导期中，对SBG+DSS处理的动物[基线重量22.1(19.4-24.0)g；平均及(范围)，n＝15]提供溶解在含有SBG(100mg/L)的水中的DSS(1.5％w/v)。在预处理阶段和急性/恢复阶段，给予饮用水中的SBG(100mg/L)。在预处理、诱导结肠炎期间和DSS终止后的四天中，每天记录体重和流体消耗。
在DSS处理的动物中，我们观察到在第14天至第17天之间重量显著减轻约15％。尽管在结肠炎诱导之前、在结肠炎诱导的过程中以及在结肠炎诱导之后，用SBG处理的动物经历了中度的重量减轻，但与只有DSS的组相比，DSS+SBG组相对防止了结肠炎相关的重量减轻(在第16天和第17天P＜0.05，在第18天P＜0.01以及在第19天P＜0.001，DSS+SBG对比DSS)(图2)。
此外，与DSS组相比，在SBG+DSS组中重量降低的起始被稍稍延迟。在实验期间，无结肠炎对照动物的重量稳定增加。我们没有观察到SBG动物和接受一般的饮用水的小鼠之间体重动力学的任何差异(图2)。
为了估计SBG日剂量和DSS接触，监测流体消耗。记录的平均值约为5-7mL/小鼠/天(没有显示数据)，对应于20-30mg/kg的SBG日剂量。
口服SBG给药降低结肠炎相关的死亡率
DSS接触诱导的临床症状包括便血、腹泻、直肠出血、不活泼、不能梳毛，以及在严重的情况下弯腰驼背的姿势和浑身发抖。由于动物健康福利的原因，对明显垂死的小鼠实施安乐死。严重的结肠炎相关的体重减轻与死亡率有关，因此，由于人道因素，处死经历重量减轻超过基线重量的20％的小鼠。
DSS终止后四天，口服SBG处理增加了存活至计划终点的小鼠的比例(P＝0.041，DSS+SBG对比DSS)(图3)。在DSS+SBG组中，在计划终点之前，15只动物中仅有1只不得不被处死，相比之下，在DSS组中16只小鼠中有6只被处死。并且，与DSS+SBG组(图3)相比，其需要处死的动物出现的更早。
口服SBG给药降低DSS诱导的结肠炎和组织损伤
为了研究SBG给药是否能够防止DSS诱导的炎症和溃疡，检查近侧结肠、中间结肠和远侧结肠的组织切片。专注于炎症性细胞浸润和组织损伤的存在和程度及淋巴聚集的存在和不存在以及上皮再生的体征，并确定组织病理学评分(参见表2)。
在对照组或SBG组中没有观察到明显的病理学。另一方面，在DSS组中，观察到扩展进入粘膜下层相当大的炎症性细胞浸润和涉及透壁的严重情况。透露出粘膜微体系结构的严重畸变，该严重畸变包括缺少清晰隐窝及杯状细胞，中度至重度的溃疡，和一些情况下带有上皮细胞的完全缺失。还辨别出粘膜水肿肠壁变厚的体征(图4a)。
尽管在来自DSS+SBG处理的小鼠的切片中，结肠炎的明显组织学体征是显而易见的，但是在该组中获得了明显更低的组织病理学评分(P＝0.027，DSS+SBG对比DSS)(图4b和表3)。在结肠远侧部分中，炎症和组织损伤出现的更显著(没有显示数据)。
口服SBG给药降低结肠炎相关的结肠缩短
结肠缩短是确立已久的DSS诱导的结肠炎的疾病相关的特征。为了进一步评估SBG对实验性结肠炎的保护能力，切除结肠并测量其长度。
在没有炎症性状况下，口服SBG给药没有显示出对结肠长度具有影响。在DSS组中，结肠比对照动物的结肠大约短了30％。尽管DSS+SBG组中的结肠长度明显受到与DSS接触的影响，但是该结肠明显比DSS组中的结肠更长(P＝0.005，DSS+SBG对比DSS)(图5a、b和表3)。
因为DSS组中6个最短的结肠都来源于由于疾病发展而过早被实施安乐死的动物，所以结肠缩短与疾病的严重程度具有良好的相关性。我们还观察到与DSS+SBG组和对照组中的粪便颗粒相比，来自DSS的结肠含有大量未成形的粪便。远端宏观壁增厚和肠透明度的损失在DSS和DSS+SBG组中明显可见，尽管其在DSS组中显现的更显著。
在急性结肠炎中口服SBG给药调节脾脏和胸腺的重量
为了研究在急性结肠炎中，口服SBG给药是否能够对淋巴组织具有影响，死后收集脾脏和胸腺。与对照动物相比，由于结肠炎的严重程度而过早被实施安乐死的小鼠的脾脏和胸腺的质量降低，这表明重量降低与结肠炎相关的发病率有关(图6，空心符号)。
识别出对照组与DSS组之间的脾脏重量没有总体差异。然而，在DSS+SBG组中，脾脏重量明显高于在DSS组中所观察到的脾脏重量(P＝0.046，DSS+SBG对比DSS)(图6a和表3)。尽管没有统计上的意义，但是与对照小鼠相比，SBG组显现出具有稍稍更高的脾脏重量。
此外，口服SBG给药显现出限制结肠炎相关的胸腺退化(P＝0.042，DSS+SBG对比DSS)(图6b和表3)。
表3.数据汇总
Figure GPA00001137464400231
口服SBG给药限制了急性结肠炎中的全身炎症
为了研究口服SBG给药是否能够对全身炎症具有影响，在四个处死后的小鼠实验组中，确定各种不同的炎症性介质的水平。
由图8可以看出，与对照组相比，在DSS小鼠中，TNFα、IFNγ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、GM-CSF、MCP-1和MIP-1β的水平均都增加了。然而，与DSS组相比，在DSS+SBG组中这些炎症性介质的水平都降低了，这表明在急性结肠炎中，SBG能够通过降低这些炎症性介质的水平来降低全身炎症，该炎症性介质的水平的增加与该疾病有关。
在DSS组与DSS+SBG组之间，观察到IL-4、IL-9、IL-12p40、IL-12p70、嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)、受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(Rantes)、KC、MIP-1α和G-CSF的水平没有总体差异
1.4结论：
实施例1明显表明口服SBG给药对DSS诱导的实验性IBD具有有利效果。
1)在实验动物中，口服SBG处理降低结肠炎相关的重量减轻。
2)在实验性IBD中，口服SBG处理降低结肠炎相关的死亡率。
3)在实验性结肠炎中，口服SBG处理降低结肠炎和组织损伤。
4)在实验性结肠炎中，口服SBG处理降低结肠炎相关的结肠缩短。
5)口服SBG处理限制结肠炎相关的胸腺退化。
6)在急性结肠炎中，口服SBG处理限制全身炎症。
1.5其他实验细节：
口服SBG给药对急性结肠炎中重量减轻的影响
在通过口服接触DSS 7天诱导急性结肠炎之前，用SBG或一般的饮用水对小鼠进行了7天的预处理。在预处理、结肠炎诱导期间以及急性-和最初恢复期(Acu/rec)的随后的4天期间，每日记录体重，然后将动物处死。在整个实验中，对照动物(Ctr，n＝12)接受了一般的饮用水。SBG处理的动物(SBG，n＝12)接受了补充SBG的饮用水(100mg/mL)。DSS处理的动物(DSS，n＝16)在预处理阶段接受了一般的饮用水，在诱导阶段接受了补充DSS的饮用水(1.5％w/v)，并在急性-/恢复阶段接受了一般的饮用水。DSS和SBG的组合处理的动物(DSS+SBG，n＝15)在预处理阶段接受了补充SBG的饮用水，在诱导阶段接受了补充了组合的DSS/SBG的饮用水，并在急性-/恢复阶段接受了补充了SBG的饮用水。体重表达为基线(BL)值的百分比，平均值±SEM。E＝安乐死小鼠：体重降低＞20％或垂死。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，DSS对比DSS+SBG，通过用Bonferroni posttest进行双因素方差分析来确定。给出的数据自两个独立的实验收集。
口服SBG给药对急性结肠炎中存活的影响
在通过如上所述口服接触DSS诱导急性结肠炎之前，用SBG或一般的饮用水对小鼠进行预处理。在除去DSS后的4天的急性-/恢复阶段记录死亡/强迫安乐死并表达为最初组规模的百分比。人道的终点标准为体重减轻大于基线体重的20％。不符合体重减轻标准的确实垂死的动物也被实施安乐死。给出的数据自两个独立的实验收集。
口服给予SBG对急性结肠炎中结肠发炎和组织损伤的影响
在通过如上所述口服接触DSS诱导急性结肠炎之前，用SBG或一般的饮用水对小鼠进行预处理。死后，切除结肠，用PBS冲洗并准备进行组织学分析。检查福尔马林固定、石蜡包埋及H&E染色的切片的炎症细胞浸润、组织损伤、淋巴聚集和表皮再生的存在和不存在(表2)。A)来自对照动物(Ctr，上左)、SBG处理的动物(SBG，上右)、DSS处理的动物(DSS，下左)以及DSS和SBG的组合处理的动物(DSS+SBG，下右)的代表性远端结肠H&E切片，原物放大100×。B)评估了近端、中端和远端结肠段并计算了每只小鼠的总体组织病理学分数。空心符号表示在预定的终点前由于动物福利的原因而被实施安乐死的动物。条代表中间值。给出的数据自两个独立的实验收集。
口服SBG给药对结肠炎相关的结肠缩短的影响
在通过如上所述口服接触DSS诱导急性结肠炎之前，用SBG或一般的饮用水对小鼠进行预处理。死后，切除结肠并测量了结肠长度。A)从对照动物(Ctr)、SBG处理的动物(SBG)、DSS处理的动物(DSS)以及DSS和SBG的组合处理的动物(DSS+SBG)切除的结肠的代表性照片。图片已经被数字化增强(Adobe Photoshop CS 8.0，Adobe SystemsInc.，San Jose，CA，USA)。B)结肠长度，单位mm。空心符号表示在预定的终点前由于动物福利的原因而被实施安乐死的动物。条代表中间值。给出的数据自两个独立的实验收集。
口服SBG给药对急性结肠炎中脾脏和胸腺重量的影响
在通过如上所述口服接触DSS诱导急性结肠炎之前，用SBG或一般的饮用水对小鼠进行预处理。死后，切除脾脏(A)和胸腺(B)。用福尔马林固定后，记录器官重量(mg)。空心符号表示在预定的终点前由于动物福利的原因而被实施安乐死的动物。条代表中间值。给出的数据自两个独立的实验收集。
实施例2
2.1实验设计：
用具有异常高浓度的植物蛋白的动物饲料产品测试了饲料β-1，3/1，6-葡聚糖产品
Figure GPA00001137464400261
和水解的酵母细胞/完整酵母细胞产品PatoGardTM的效果。高蛋白饲料的目的是在肠内产生疾病状态并评价产品
Figure GPA00001137464400262
和PatoGardTM在预防和治疗这样的疾病状况中的作用。在这些试验中使用的鱼是大西洋鲑鱼(Salmo salar)。
植物蛋白的含量大于15％通常导致鱼的结肠健康下降，因为鱼不习惯这种高蛋白饮食。在该试验中，将总蛋白含量增加至32％从而导致对鱼结肠的有害影响。为了研究不同植物蛋白的影响的目的，使用了大豆蛋白和向日葵蛋白两者并与金牌标准(golden standard)进行了比较，所述金牌标准易于消化鱼粕产品。
该试验共包括九个不同的组。用PatoGardTM和
Figure GPA00001137464400263
(65％，β-1，3/1，6-葡聚糖)喂食不同的组。对照组仅接受了所制备的含有高植物蛋白的动物饲料。从下文的表4中能够看出分布。
饲料1FM：仅含鱼粕的饲料
饲料2：FMS：含鱼粕和32％的大豆的饲料
饲料3：FMSPG：含2000mg PatoGardTM的组2饲料
饲料4：FMSMG：含1000mg
Figure GPA00001137464400264
组2饲料
饲料5：FMSS：含鱼粕、15％的大豆和15％的向日葵粕的饲料
饲料6：FMSSPG：含2000mg PatoGardTM的组5饲料
饲料7：FMSSMG：含1000mg
Figure GPA00001137464400271
的组5饲料
这七组由150条鱼组成，饲养在海中的5×5×5米小径盆地(trailbasin)中。用各自的饲料喂养各组71天。这段时期之后对鱼进行测量并称体重，并自27条随机挑选的鱼的肠提取组织样品。用标准方法登记组织变化并在Urán-评分后分类。评分集中于(1)核上泡的存在和大小(2)简单皱襞(simple fold)的固有层的扩展程度(3)基础皱襞与致密层之间的结缔组织的量以及(4)粘膜皱襞的增厚程度。每一检测点按照1-5的等级进行分类，其中1表示未损伤且5为致命损伤。
2.2结果与讨论：
表4：用Uran评分测量组1-7饲料的肠健康
  喂养组   定义饲料   Uran评分
  2   FMS   3,68
  3   FMSMG   3,43
  4   FMSPG   3,37
  5   FMSS   2,05
  6   FMSSMG   1,61
  7   FMSSPG   1,23
  1   FM   1,13
通过向饲料中添加PatogardTM和
Figure GPA00001137464400272
(组3、4、6和7)，大大降低了组2和组5鱼饲料中的有害肠健康。相对于仅包含大豆或包含大豆与向日葵的组合的饲料，添加PatogardTM导致了明显的降低。这些结果清楚地表明，PatogardTM和
Figure GPA00001137464400273
均消除饲料中植物蛋白的有害影响并因此导致肠健康获得改善。
实施例3
3.1成分和饮食：
饮食的配方和组成分别在表5和表6中给出。通过用Skretting(Norway)进行高压湿法挤压，生产基于标准鱼粕的对照饮食(FM)，含13.2％的提取并烘烤的大豆粕[SBM]和13.5％的提取的向日葵粕[SFM](FM+SS)的高蔬菜饮食，以及含29.9％的大豆粕(FM+S)的高蔬菜饮食。颗粒大小为6mm，并在涂敷鱼油前，将所有的饮食干燥。在涂敷油之前，首先用每kg饮食1000mg的
Figure GPA00001137464400281
(FM+SS+1000MG)或2000mg的
Figure GPA00001137464400282
(FM+SS+2000PG)，涂敷批量基础FM+SS饮食。同样，对用每kg饮食500(FM+S+500MG)或1000(FM+S+1000MG)mg
Figure GPA00001137464400283
或者1000(FM+S+1000PG)或2000(FM+S+2000PG)
Figure GPA00001137464400284
预涂敷批量基础FM+S饮食。这给出一系列九种实验性饮食。
表5.实验性饮食的配方
Figure GPA00001137464400285
*磷酸二氢钙
表6.实验性饮食的组成
  基础饮食   FM   FM+S   FM+SS   FM+S   FM+SS
  添加物   MG   PG   MF   PG   MG   PG
  剂量，mgkg-1   500   1000   1000   2000   1000   2000
  干物质，g   937.3   934.0   941.0   933.1   930.3   932.7   930.8   940.8   942.7
  粗蛋白*，g   385.0   348.5   340.9   347.3   346.0   351.0   345.8   341.2   359.5
  脂质，g   336.7   327.6   347.6   335.0   319.6   331.9   326.1   348.6   352.5
  淀粉，g   100.6   53.9   57.1   58.0   53.7   59.6   54.2   56.7   71.3
  灰分，g   80.0   62.8   68.6   63.2   59.7   64.9   62.6   69.1   73.4
  能量，MJ   24.3   24.2   24.7   24.4   24.2   24.1   24.0   24.6   24.9
*CP；N×6.25
3.2鱼、培养条件和取样：
给大西洋鲑鱼喂食实验性饮食，共69-71个饲养日。实验前，给鱼喂食商购的饮食(Skretting AS，Stavanger，Norway)。实验在2006年的第25周开始并在第36周结束。实验过程中的水温为12.3℃-17.4℃，平均为15.3℃。
实验开始时，27组鲑鱼(679g，每组150条鱼)被随机分配至5×5×5m3的海围栏中。然后在三个随机实验性设计中，将每种饮食分配给三组鱼。通过电驱动喂食器，对鱼连续喂食，如Einen(1999)所述，自围栏的下方收集未被吃掉的饲料并向上泵入金属网过滤器。计划喂料速率为过量15％，并如Helland et al.(1996)所述，每三天根据所记录的过量喂食进行调整。
在试验开始时和第70个饲养日对鱼整批称重。在最后称重时，将相当数量的鱼用三卡因甲基磺酸盐(MS 222，Argent ChemicalLaboratories Inc.，Redmont，Wa，USA)麻醉，并如Austreng(1978)所述进行挤压以收集粪便，用于可消化性评估。收集每一围栏的粪便样品并立即在-20℃下冷冻。
3.3化学分析和组织学检查：
分析前将粪便冷冻干燥。分析了饮食和冷冻干燥的粪便的干物质、灰分、氮、脂质、淀粉(作为α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶水解后的葡萄糖进行测定，随后通过“GODPOD法”(Megazyme，Bray，Ireland)测定葡萄糖)、总能量(Parr 1271弹式热量计，Parr，Moline，IL，USA)和钇(在Jordforsk，Norway，通过电感耦合等离子体(ICP)质谱法，如之前Refstie et al.(1997)所述)。
3.4统计学分析：
通过SAS计算机软件(SAS，1985)中的一般的线性模型(GeneralLinear Model)程序分析结果。对每个围栏的平均结果进行单因素方差分析(ANOVA)，以饮食作为独立的因素。邓肯法多重比较检验显示出显著差异。显著水平为P≤0.05，且结果被表示为平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)。
3.5结果与讨论：
与喂食FM饮食时相比，喂食FM+S和FM+SS饮食通常导致粪便中的干物质含量较低(即，水较多)，这表示腹泻(下文的表7)。
表7.喂食实验饮食70天后鱼对营养物的表观消化率及鱼对氮和能量的表观保留(n＝3)。
栏中不同的上标abcd表示通过邓肯法多重比较检验所显示的显著差异(P＜0.05)。
当比较FM+SS饮食时，在添加2000mg kg-1的PG时，这获得明显改善，并且当添加1000mg kg-1的MG时，腹泻疾状况也倾向于改善。当添加至FM+S基础饮食中时，未观察到MG和PG的此类作用。
实施例4.可溶性β-葡聚糖对小鼠的肠和与肠相关的淋巴组织的影响
4.1实验设计：
建立了模型以评估可溶性葡聚糖(在这里是来自Biotec PharmaconASA公司的产品SBG)对健康小鼠的肠和与肠相关的淋巴组织(GALT)以及肠上皮的影响。通过研究体重变化、流体消耗、淋巴集结(Peyer′spatch，PP)的数量和淋巴细胞组成、肠系膜淋巴结(MLN)的横截面面积和淋巴细胞组成以及Ki67-阳性细胞和杯状细胞的数量和分布，对结果进行了评估。通过肉眼观察切除的肠，确定了肉眼可见的PP的数量。通过分析苏木精和伊红(H&E)染色的切片，确定福尔马林固定的MLN的横截面面积。通过流式细胞仪检查PP和MLN中主要的淋巴细胞亚群的组成。通过免疫组织化学鉴别增殖的细胞、Ki67-阳性细胞、肠上皮细胞。
在进入实验前，将雄性BALB/c小鼠在Rikshospitalet UniversityHospital，Oslo，Norway的Centre for Comparative Medicine的最小疾病单元(minimal disease unit)中维持至少一周。将动物饲养在笼中，每笼2只小鼠，供应水并照惯例随意喂食。将笼保持在21±1℃和55+10％的相对湿度下。光照条件由具有一小时的黄昏和黎明的交替的12h光/暗循环构成。
将小鼠随机分配成两个实验组；分别接受补充SBG的水(100mg/L)或一般的饮用水的SBG处理的小鼠和对照(Ctr)小鼠，随意喂食20天(0-19)。在整个实验中记录了体重和流体消耗并监测了小鼠发病的临床体征。
进行了三次相同但独立的实验。在头两次实验中，收集用于随后的组织学研究而保藏的组织样品，而在第三次实验中收集用于流式细胞仪分析的新鲜材料。
在心脏穿刺之前，通过皮下注射
Figure GPA00001137464400311
和咪达唑仑(50-75μL/10g体重)将动物麻醉。将死后的小鼠浸泡在70％的乙醇中并固定至解剖板。将腹腔打开并将MLN、腹股沟淋巴结(ILN)、脾脏和肠切除。检查小肠的肉眼可见的PP并切除了鉴别出的PP。用冷PBS冲洗结肠以在固定之前除去所含的粪便。将所收集的用于随后的组织学分析的组织样品保存在冰上，并在10％的福尔马林中、于4℃下固定24h。将固定的组织样品转移至含0.1％福尔马林的PBS中，并在4℃下储存，用于随后的制备和分析。将所分离的用于随后的流式细胞仪分析的PP、MLN、ILN和脾脏转移至冰冷的FM中。将通过心脏穿刺收集于锂肝素真空管中的血保存在冰上直至随后的分析。
组织化学和免疫组织化学
用自动组织处理器处理福尔马林固定的活组织并随后包埋在石蜡中。将切片切至4μm并放在被多聚赖氨酸涂敷的载玻片上。由不清楚样品身份的测试者进行显微镜和图像分析。
MLN横截面面积
用苏木精和伊红(H&E)将MLN切片手工染色，并在配备有数码相机和成像软件的光学显微镜中检查。通过用显微镜成像软件中的特征模块(build in feature)分析显微照片来计算MLN横截面面积。简言之，使用内插的绘图工具标记MLN切片的周围，并基于所包括的像素数量来计算面积。
杯状细胞计数
使来自远端结肠的切片在二甲苯和乙醇中脱去石蜡，并在蒸馏水中再水化，然后在自动组织染色器中用苏木精、阿尔新蓝和高碘酸-希夫试剂染色。在光学显微镜中检测结肠切片。通过对显示完整隐窝(crypt)高度的20个取向较好的隐窝中的AB/PAS阳性细胞进行计数来确定杯状细胞的数量，并表达为每隐窝中阳性细胞的平均数量。杯状细胞的隐窝间分布表示为隐窝的底部、中部和上部1/3中阳性细胞的数量。用配备有相机的光学显微镜获取说明性显微照片。
免疫组织化学
使来自远端结肠活组织的福尔马林固定的切片在二甲苯和乙醇中脱去石蜡，在PBS中再水化；并使其在CA抗原修复缓冲液中沸腾20分钟。在4℃下用一抗或者浓度和同种型匹配的对照抗体孵育切片过夜。在PBS中洗涤之后，在室温下用荧光燃料缀合的二抗孵育切片3h(小时)。用Hoechst染色法将核染色。在配备有数码相机和成像软件的荧光显微镜中检测切片。
通过分析数码照片，确定增殖的Ki67阳性上皮细胞的数量和增殖区的大小。选择了显示完整隐窝高度的切片的区域，用于分析。细胞计数表达为每一隐窝中阳性细胞的平均数，对至少8个隐窝进行计数，并且增殖区表达为总隐窝高度的百分比。
通过对明确位于上皮中的CD3阳性细胞进行计数，确定IEL数量。直接在荧光显微镜中拍摄结肠切片的整个周边。
流式细胞仪
破坏脾脏、MLN、ILN和PP，并用尖端为扁平铲状的镊子在FM缓冲液中的尼龙网的两个外壳之间研磨。用新鲜的尼龙网过滤匀浆，离心(1400rpm/410g，4℃下4分钟)并在FM中洗涤，以产生单细胞悬浮液。于黑暗中在冰上，用100μL染色混合物，将1百万个MLN-、ILN-和PP细胞及300μL全血孵育30min，该混合物在FM缓冲液中由抗体和每100μL 0.1mg大鼠IgG构成。在FM中洗涤细胞，如上所述进行离心，并于黑暗中在冰上用APC-Cy7缀合的链霉抗生物素孵育20min，以标记所用的生物素化的抗体。在FM中洗涤后，将源自组织的单细胞重悬浮于低聚甲醛(1％，于PBS中)，并于黑暗中在冰上孵育5min，进行固定。除去固定剂并将细胞重悬浮于FM中，并于4℃下避光储存，用于随后的流式细胞仪分析。通过按照厂家的说明书使红细胞在OptiLyse B中裂解，准备分析来自全血染色反应的白细胞。通过离心除去裂解液，将细胞固定，重悬浮于FM中，并储存，用于如上所述的分析。将未染色的脾脏、MLN、ILN、PP和OptiLyse B处理的全血细胞作为对照。在流式细胞仪上分析细胞悬浮液。
统计学分析
体重和流体消耗数据表达为带有平均值的标准偏差(SD)的平均值，并用双因素方差分析(ANOVA)和修正差别后检验(Bonferroni posttest)进行分析。PP数量、MLN横截面面积、杯状细胞数量、上皮增殖和IEL数量表达为中间值并用曼-怀二氏检验(Mann-Whitney test)进行分析。淋巴细胞组成的流式细胞仪数据表达为带有标准偏差(SD)的平均值，并用曼-怀二氏检验进行分析。通过Grubb’s离群检测检验(Grubb’s outlier diction test)来鉴别高度可疑的离群值，其不可能代表来自高斯群体的随机取样，并自以后的分析中排除。用GraphPad Prism，版本4(GraphPad Sofeware，San Diego，CA，USA)进行所有的统计学分析。P＜0.05的差异被认为是统计学显著的。
4.2结果：
SBG补充对体重和流体消耗的影响
将雄性BALB/c小鼠随机分配成两个实验组：接受补充SBG的饮用水的组(SBG)和接受纯饮用水的对照组(Ctr)。为了监测响应口服SBG给药的实验动物的总体健康状况，记录体重。小鼠的体重稳定地增加，且Ctr与SBG处理的动物之间没有观察到体重动力学差异(图9)。SBG似乎耐受良好并且没有注意到发病的临床体征。
为了进一步研究SBG补充对食欲和总体活动的影响，并且重要的是为了评估所摄取的SBG每日剂量及总剂量，计算了每只小鼠的平均流体消耗。流体消耗大约为4-7ml/小鼠/天，相当于SBG组中15-30mg/kg体重的每日β-葡聚糖剂量。没有记录到实验组之间的流体消耗差异(图9)。
口服SBG给药影响粘膜诱导部位
为了研究口服SBG给药对GALT、PP和MLN的影响，检查了基本粘膜诱导部位和调整部位。在SBG组中，小肠中的肉眼可观察到的PP的中间数量，比我们在Ctr组中观察到的中间数量高大约40％(P＜0.01)(图10A)。此外，我们识别出SBG处理的小鼠中MLN大小显著增加。在SBG组中，分离的MLN的中间横截面面积比我们在Ctr组中观察到的中间横截面面积大约35％(P＜0.05)(图10B)。假定LN为球形，这相当于估计体积增加50-60％。
尽管口服SBG给药后GALT有明显变化，实验组之间主要的淋巴细胞群的特征(CD4pos、CD8pos、CD19pos细胞)没有显示出差异，无论是PP还是MLN(图11)。同样，口服SBG给药未改变代表全身隔间(systemic compartment)的血液白细胞、脾脏和ILN单一细胞悬浮液中的淋巴细胞组成(数据未显示)。流式细胞仪分析表明，在检测的所有细胞制剂中，存在Dectin-1pos细胞、主要的MHC II类pos、CD11bpos或CD11cpos细胞，即巨噬细胞和树突细胞(DC)。然而，口服SBG给药似乎没有改变该β-葡聚糖受体的表达模式。在自SBG处理的小鼠中分离的MLN单一细胞中，3.5±1.8％为Dectin-1阳性，而Ctr动物中3.3±1.2％为阳性(平均值±SD)。PP的相应数值为0.22±0.04％对0.23±0.05％，ILN的为3.2±1.2％对3.4±0.7％，脾脏的为6.5±1.6％对7.1±1.2％，以及血液白细胞的为7.9±1.6％对8.0±1.9％。
口服SBG给药增加上皮增殖
为了检查不同的肠上皮细胞类型所介导的天然防御功能，我们首先分析了产粘液的杯状细胞的数量和分布。口服SBG给药没有影响远端结肠中杯状细胞的数量或隐窝内分布。SBG处理的小鼠中每个隐窝内AB/PAS阳性杯状细胞的数量为6.6[3.1-8.8]，相比之下Ctr组中为7.6[5.4-10.3](平均值和[范围])(图13)。我们还对IEL的切片进行了染色，但是在远端结肠切片中鉴别出很少的IEL，并且SBG处理的小鼠与对照之间在IEL数量上没有显示出差异。在SBG处理的小鼠中，每一切片中CD3posIEL的数量为12.4[5.0-21.0]，相比之下Ctr组中为12.3[6.5-21.5](平均值和[范围])。
接下来，我们研究了口服SBG给药对肠上皮粘膜效应物部位的影响。在用SBG处理的小鼠中，远端结肠中增殖的上皮细胞的数量明显高于我们在对照动物中观察到的数量(图12)。在SBG组中，每个隐窝的Ki67pos细胞的中间数量比Ctr组高37％(P＜0.01)。另外，在SBG组中，增殖区的中间大小比对照大25％(P＜0.001)。
4.3结论：
该实施例清楚地表明，SBG给药影响重要的粘膜诱导部位PP和MLN。PP和MLN在诱导和保持口服耐受和对肠微生物群的全身忽略中起重要作用。
本文首次证实，口服给予的SBG刺激GALT和上皮，它们分别为粘膜免疫系统的诱导部位和效应物部位。证实了口服给予可溶性β-葡聚糖对GALT(PP和MLN)大小有影响。尽管是推测，但是似乎负载β-葡聚糖的细胞自肠上皮迁移至GALT可能是观察到的MLN和PP扩展的原因。
已经通过流式细胞仪表征了MLN和PP中CD4pos和CD8posT细胞和CD19POS B细胞即主要的淋巴细胞群的相对含量，并且在SBG处理的小鼠与对照之间没有发现显著差异。我们没有观察到与口服给予SBG相应的Dectin-1表达的改变。口服SBG给药没有改变结肠中杯状细胞的数量和分布。
在此我们报告，口服给予时，SBG增加了结肠中增殖的上皮细胞的数量以及增殖区的大小。本文给出的数据表明，实验性结肠炎中SBG的保护性作用部分是由于对上皮增殖以及因此可以想象地对上皮屏障恢复和功能的刺激作用。因此，我们报告，口服β-葡聚糖给药刺激肠上皮增殖。
我们证实，源自酿酒酵母的水溶性β-葡聚糖SBG的口服给药刺激了PP和MLN的形成和/或扩展。此外，SBG刺激了粘膜上皮细胞的增殖，这表明SBG还影响肠屏障功能。数据表明β-葡聚糖部分通过影响粘膜免疫系统增强了宿主保护。刺激作用可能在免疫应答的粘膜诱导部位以及免疫防御的效应物部位两者处都受到介导。

Claims (21)

1.源自酵母的具有β-(1，3)-主链的葡聚糖，所述β-(1，3)-主链具有一个或多个与其相连的β-(1，3)-侧链，所述葡聚糖用于治疗或预防动物的炎症性肠疾病和异常肠功能的相关疾病。
2.如权利要求1所述的葡聚糖，其中所述酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
3.如权利要求1或2所述的葡聚糖，其中所述葡聚糖至少部分分离自其它细胞壁组分。
4.如权利要求1-3中任一项所述的葡聚糖，其中所述葡聚糖具有与其天然存在的结构相比改变的化学结构。
5.如权利要求1-4中任一项所述的葡聚糖，其中所述葡聚糖未被化学基团衍生化。
6.如权利要求1-5中任一项所述的葡聚糖，其中所述葡聚糖基本上不含重复的β-(1，6)-连接的葡糖基单元。
7.如权利要求1-6中任一项所述的葡聚糖，其中所述葡聚糖为颗粒形式。
8.如权利要求1-6中任一项所述的葡聚糖，其中所述葡聚糖是可溶性的。
9.如权利要求7所述的葡聚糖，其中所述葡聚糖的分子量为150kDa-300kDa。
10.如权利要求8所述的葡聚糖，其中所述葡聚糖的分子量为约6kDa至30kDa。
11.如权利要求1-10中任一项所述的葡聚糖，其中所述葡聚糖为口服给药。
12.如权利要求11所述的葡聚糖，其中所述葡聚糖的给药剂量为0.1mg每kg体重每天至500mg每kg体重每天。
13.源自菊科(Asteraceae)的粕，其用于治疗或预防动物的炎症性肠疾病和异常肠功能的相关疾病。
14.源自菊科(Asteraceae)的蛋白，其用于治疗或预防动物的炎症性肠疾病和异常肠功能的相关疾病。
15.如权利要求13所述的粕或如权利要求14所述的蛋白，其中所述菊科(Asteraceae)来自向日葵属(Helianthus)。
16.如权利要求15所述的粕或蛋白，其中所述菊科为向日葵(Helianthus annus).
17.如权利要求1-12中任一项所述的葡聚糖，如权利要求13、15和16中任一项所述的粕或如权利要求14-16中任一项所述的蛋白，其中所述炎症性肠疾病是溃疡性结肠炎或克罗恩病。
18.如权利要求1-12中任一项所述的葡聚糖，如权利要求13、15和16中任一项所述的粕或如权利要求14-16中任一项所述的蛋白，其中所述异常肠功能的相关疾病选自便秘、腹泻、大便失禁以及手术引起的状况和疾病。
19.治疗动物的炎症性肠疾病和异常肠功能的相关疾病的方法，其包括对所述动物给予治疗有效量的前述权利要求中任一项所述的葡聚糖、粕或蛋白。
20.试剂盒或给药装置，所述试剂盒或给药装置包括前述权利要求中任一项所述的葡聚糖、粕或蛋白和信息材料，所述信息材料描述对人或其它动物给予所述葡聚糖、粕或蛋白。
21.产品，其包含(a)前述权利要求中任一项所述的葡聚糖、粕或蛋白和(b)用于治疗炎症性肠疾病和异常肠功能的相关疾病的第二活性剂，作为同时、单独或相继用于治疗炎症性肠疾病和异常肠功能的相关疾病的组合制剂。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103347901A (zh) * 2010-11-29 2013-10-09 生物科技药物学会 葡聚糖组合物
CN103347899A (zh) * 2010-11-29 2013-10-09 生物科技药物学会 葡聚糖凝胶
CN103347900A (zh) * 2010-11-29 2013-10-09 生物科技药物学会 葡聚糖
CN108430479A (zh) * 2015-10-28 2018-08-21 凯敏工业公司 β-1,3-葡聚糖用于调节免疫功能和治疗肠道炎症的用途
CN110917207A (zh) * 2019-10-10 2020-03-27 浙江立恩生物科技有限公司 用于预防和治疗炎症性肠病的生物多糖及其应用
CN114391511A (zh) * 2021-12-25 2022-04-26 遂宁市中心医院 一种dss诱导炎症性肠病易患性动物模型的造模方法
CN115053864A (zh) * 2022-06-24 2022-09-16 内蒙古大学 一种构建绵羊肠炎动物模型的方法及其应用

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5320965B2 (ja) * 2008-10-09 2013-10-23 ダイソー株式会社 β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを用いた消化管粘膜保護剤または下痢抑制剤
WO2012012146A2 (en) * 2010-06-30 2012-01-26 The Regents Of The University Of Colorado Compositions and methods to modulate progression and onset of inflammatory bowel disease
TWI459949B (zh) * 2010-07-16 2014-11-11 Univ Fu Jen Catholic β-葡聚糖（β-glucan）用於製備抑制免疫球蛋白A不正常上升之藥物的用途
AU2013203451B8 (en) * 2010-11-29 2015-10-29 Biotec BetaGlucans AS Glucan Gels
JP5928774B2 (ja) * 2011-11-01 2016-06-01 株式会社大阪ソーダ β−１，３−グルカンを含む過敏性腸症候群の下痢抑制剤、腹痛改善剤、及び大腸における痛覚過敏改善剤
JP6372890B2 (ja) * 2013-03-08 2018-08-15 学校法人東京理科大学 乳酸菌増殖促進剤、制御性ｔ細胞増加剤、乳酸菌増殖促進方法、制御性ｔ細胞を増加させる方法、制御性ｔ細胞増加効果の評価方法、および乳酸菌増殖促進効果の評価方法
GB201602410D0 (en) * 2016-02-10 2016-03-23 Tate & Lyle Ingredients Methods for improving the gastrointestinal tolerance of food and beverage products comprising sweet, low-digestible carbohydrates
WO2017180760A1 (en) * 2016-04-12 2017-10-19 Kemin Industries, Inc. Methods to facilitate the solubilization of beta-1,3-glucan and enhance immune function and other related uses
US10940162B2 (en) * 2016-11-08 2021-03-09 PT. Sahabat Lingkungan Hidup Use of polysaccharide for treating ST-elevation myocardial infarction and diseases of the digestion system
KR20210013564A (ko) * 2018-04-24 2021-02-04 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 경구용 효모 베타-글루칸을 이용한 저 면역원성 항원-특이적 백신의 면역원성 향상 방법
CN110338268A (zh) * 2019-08-19 2019-10-18 上海昱仪网络科技有限公司 一种为宠物粮食提供综合保健功能的复合添加物
WO2022207721A1 (en) * 2021-03-30 2022-10-06 Dupont Nutrition Biosciences Aps Compositions and methods for treating and preventing gastrointestinal inflammation

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998026787A1 (en) * 1996-12-19 1998-06-25 The University Of New South Wales Prebiotics and probiotics

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61146192A (ja) * 1984-12-17 1986-07-03 Satoshi Shinohara フラクトオリゴ糖とβ―１．３―１．６グルカンを主成分とする飲食物の製造方法
US5622939A (en) * 1992-08-21 1997-04-22 Alpha-Beta Technology, Inc. Glucan preparation
CA2040374C (en) * 1990-07-06 1998-06-16 Gunnar Rorstad Process for enhancing the resistance of aquatic animals to disease
DK0664671T3 (da) * 1993-08-06 2003-01-06 Biotec Pharmacon Asa Dyrefoder omfattende gærglucan
US6046323A (en) * 1997-07-29 2000-04-04 The Collaborative Group, Ltd. Conformations of PPG-glucan
EP1894566A1 (en) * 1998-03-12 2008-03-05 Mars, Incorporated Products containing polyphenol(s) and L-arginine to stimulate nitric oxide production
NL1011529C2 (nl) * 1999-03-11 2000-09-12 Eijsselsteijn Danny Van Middel ter onderdrukking en preventie van de kwaadaardige groei van kankercellen.
CN100391439C (zh) * 2001-04-27 2008-06-04 味之素株式会社 免疫增强剂
WO2002098433A1 (fr) * 2001-06-01 2002-12-12 Ajinomoto Co., Inc. Medicaments pour les maladies intestinales
GB0114419D0 (en) * 2001-06-13 2001-08-08 Mars Uk Ltd Health food
KR20030087383A (ko) * 2002-05-08 2003-11-14 강상모 효모벽 추출물의 베타-글루칸을 이용한 건강증진 방법
US20050272694A1 (en) * 2003-03-07 2005-12-08 Aureo Co., Ltd Composition containing beta-glucan and constipation-relieving drug, immunopotentiatior, and skin moistening agent using the composition
JP4054697B2 (ja) * 2003-03-07 2008-02-27 株式会社アウレオ 便秘改善剤
US20050058671A1 (en) * 2003-05-09 2005-03-17 Bedding Peter M.J. Dietary supplement and method for treating digestive system-related disorders
KR100419191B1 (ko) * 2003-06-23 2004-02-19 주식회사 엔바이오테크놀러지 독감 인플루엔자 바이러스 및 전염성 위장염 코로나바이러스 억제 활성을 갖는 효모변이주 아이에스2 유래수용성 글루칸 올리고머를 함유하는 조성물
RU2259781C1 (ru) * 2004-03-11 2005-09-10 Открытое акционерное общество "Черкизовский мясоперерабатывающий завод" Минсельхозпрода РФ Корм для телят
US20060205679A1 (en) * 2004-10-22 2006-09-14 Azaya Therapeutics, Inc. Topical and oral formulations of cardiac glycosides for treating skin diseases
EP2248430A3 (en) * 2005-02-15 2011-01-12 Barry R. Goldin A food containing a probiotic and an isolated beta-glucan and methods of use thereof
AU2006330421B2 (en) * 2005-12-29 2011-03-24 Hill's Pet Nutrition, Inc. Method for modifying gut flora in animals
WO2007084661A2 (en) * 2006-01-17 2007-07-26 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998026787A1 (en) * 1996-12-19 1998-06-25 The University Of New South Wales Prebiotics and probiotics

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103347901A (zh) * 2010-11-29 2013-10-09 生物科技药物学会 葡聚糖组合物
CN103347899A (zh) * 2010-11-29 2013-10-09 生物科技药物学会 葡聚糖凝胶
CN103347900A (zh) * 2010-11-29 2013-10-09 生物科技药物学会 葡聚糖
CN103347900B (zh) * 2010-11-29 2016-06-01 生物科技药物学会 葡聚糖
CN103347899B (zh) * 2010-11-29 2016-08-17 生物科技药物学会 葡聚糖凝胶
CN108430479A (zh) * 2015-10-28 2018-08-21 凯敏工业公司 β-1,3-葡聚糖用于调节免疫功能和治疗肠道炎症的用途
CN116440154A (zh) * 2015-10-28 2023-07-18 凯敏工业公司 用于调节免疫功能和治疗肠道炎症的组合物
US11744847B2 (en) 2015-10-28 2023-09-05 Kemin Industries, Inc. Use of beta-1,3-glucan for modulating immune function and treating intestinal inflammation
CN110917207A (zh) * 2019-10-10 2020-03-27 浙江立恩生物科技有限公司 用于预防和治疗炎症性肠病的生物多糖及其应用
CN114391511A (zh) * 2021-12-25 2022-04-26 遂宁市中心医院 一种dss诱导炎症性肠病易患性动物模型的造模方法
CN114391511B (zh) * 2021-12-25 2022-09-23 遂宁市中心医院 一种dss诱导炎症性肠病易患性动物模型的造模方法
CN115053864A (zh) * 2022-06-24 2022-09-16 内蒙古大学 一种构建绵羊肠炎动物模型的方法及其应用

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