CN114391511B - 一种dss诱导炎症性肠病易患性动物模型的造模方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物模型构建技术领域，提供了一种DSS诱导炎症性肠病易患性动物模型的造模方法，该方法包括以下步骤：选取妊娠母鼠，孕期及哺乳期间均给予母鼠高蛋白饮食并自由饮水，哺乳期间给予所产后代仔鼠纯母乳喂养，3周龄时断奶并给予后代仔鼠高蛋白饮食，自由饮水，喂养至8周龄，得到DSS诱导易患炎症性肠病动物模型。本发明可应用于饮食营养、肠道固有菌群及肠道炎症性疾病的相互影响及作用机制的基础医学科学研究中，为探究营养条件之于肠道固有菌群结构改变、炎症性肠病的发生发展的作用提供了论证条件。
Description
技术领域
本发明属于动物模型构建技术领域，具体而言，涉及一种DSS诱导炎症性肠病易患性动物模型的造模方法。
背景技术
炎症性肠病(inflammationbowel disease,IBD)是一种慢性、复发性、非特异性的炎症性肠道疾病，主要包括克罗恩病(Crohn’s disease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)两种疾病形式，此病在欧美国家多发，截至2015年，美国IBD患者数量己超过100万，欧洲超过250万，欧美等发达国家IBD发病率高达0.5％。近十年发现，亚洲、中东及南美等地区的新兴工业化国家IBD发病率也持续增加。由于新兴工业化国家发病率及人口总量急剧增长，预测至2025年，IBD患者总量将与西方国家人口总量相持平。IBD是消化道疾病中的难题之一，严重影响患者生活水平，将成为新的全球性负担。2018年临床肿瘤杂志出版的全球癌症发病率及病死率的统计中，结直肠癌病死率为6.1％，位居第四，而IBD患者中15％有发展为结肠直肠癌(CRC)的风险[Knowles SR，Keefer L，Wilding H，et al.Qualityof Life in Inflammatory Bowel Disease:A Systematic Review and Meta-analyses-Part II[J].Inflamm Bowel Dis，2018，24(5):966-976]，因此摸清IBD发病机制、阻断疾病发展成为肠道疾病研究中不可忽视的重要环节。
流行病学表明，IBD多发病于青壮年时期，致病因素尚不明确，目前普遍认为驱动IBD发病机制，导致肠内稳态崩溃的原因主要为先天性和适应性免疫应答的失调，即对共生微生物群落的免疫耐受性丧失和肠上皮完整性的破坏[Gon alves P，Araújo JR.A Cross-Talk Between Microbiota-Derived Short-Chain Fatty Acids and the HostMucosalImmune SystemRegulates Intestinal Homeostasis and Inflammatory BowelDisease[J].Inflamma Bowel Dis，2018，24(3):558-572]。但其确切病理机制仍未研究透彻。由此各种动物模型为揭示IBD的发病和进展发挥着重要的作用。1957年Kirsner首次引入了实验性结肠炎模型，成功在兔子身上诱导出结肠炎症。1993年，基于对免疫学和遗传学的理解，人们已经可以建立慢性炎症模型[Podolsky DK，Lobb R，KingN，etal.Attenuation of colitisin the cotton-top tamarin by anti-alpha 4integrinmonoclonal antibody[J].J Clin Invest，1993，92(1):372-380]。50多年来，研究人员尝试用小鼠、大鼠、兔、猴和绵羊等为研究对象，建立不同类型的动物模型，来研究人类IBD的病理机制。在众多的研究动物中，小鼠因其体积小、饲养便捷、更类似于人IBD的组织病理等优点成为最主要的动物研究模型。且在过去的20年中，涌现了数十种小鼠模型，其中几种因易获得、外显率、炎性程度和发病机制方面经过了充分验证[Mizoguchi A.Animal modelsofIBD:linkage to human disease[J].Curr Opin Pharmacol，2010，10(5):578-587]，成为目前最广泛使用的IBD模型。然而，虽然目前的IBD模型选择较多，但是各类动物模型在病理、组织学上与人类UC和CD相比仍存在一定差异。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种DSS诱导炎症性肠病易患性动物模型的造模方法，从而为IBD的研究和治疗提供更接近人类炎症性肠病易患性的动物模型。
为了实现上述技术目的，本发明人结合自己多年来的临床经验考虑到，与正常人相比，IBD患者肠道微生物多样性减少，肠道微生物结构紊乱，而生命早期的饮食环境是影响自身肠道微生物组成的主要因素之一，这必然与IBD的发病有关。因此，本发明构建了一个涉及孕母鼠及仔鼠的动物模型，以证明生命早期不同的饮食条件会导致后代仔鼠不同的肠道菌群结构，从而影响IBD的易感性。
具体地，本发明的技术方案包括：一种DSS诱导炎症性肠病易患性动物模型的造模方法，其包括以下步骤：选取妊娠母鼠，孕期及哺乳期间均给予母鼠高蛋白饮食并自由饮水，哺乳期间给予所产后代仔鼠纯母乳喂养，3周龄时断奶并给予后代仔鼠高蛋白饮食，自由饮水，喂养至8周龄，得到DSS诱导易患炎症性肠病动物模型，所述的高蛋白饮食中蛋白质含量为50-60％，碳水化合物含量为20-30％。
进一步优选地，如上所述DSS诱导炎症性肠病易患性动物模型的造模方法，其中所述的高蛋白饮食中蛋白质含量为57-60％，碳水化合物含量为25-30％。
进一步优选地，如上所述DSS诱导炎症性肠病易患性动物模型的造模方法，其中所述的蛋白质选自如下的一种或两种以上：酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白。
进一步优选地，如上所述DSS诱导炎症性肠病易患性动物模型的造模方法，其中所述的碳水化合物选自如下的一种或两种以上：淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、纤维素。
进一步优选地，如上所述DSS诱导炎症性肠病易患性动物模型的造模方法，其中所述高蛋白饮食的配方按照重量份计为：酪蛋白580-600份，淀粉63-72份，麦芽糊精65-73份、蔗糖93-108份，豆油65-75份，纤维素47-53份，矿物质32-37份，维生素8-12份，L-胱氨酸2.5-3.5份，胆碱2-3份，特丁基对苯二酚0.01-0.02份。
再进一步优选地，如上所述DSS诱导炎症性肠病易患性动物模型的造模方法，其中所述高蛋白饮食的配方按照重量份计为：酪蛋白592-594份，玉米淀粉67-68份，麦芽糊精69-70份、蔗糖99-101份，豆油69-70份，纤维素49-50份，矿物质34-35份，维生素9.5-10份，L-胱氨酸2.8-3.2份，胆碱2.3-2.6份，特丁基对苯二酚0.01-0.02份。
进一步优选地，如上所述DSS诱导炎症性肠病易患性动物模型的造模方法，其中的淀粉为玉米淀粉。
进一步优选地，如上所述DSS诱导炎症性肠病易患性动物模型的造模方法，其中妊娠母鼠为8-9周龄的SPF级C57BL/6妊娠小鼠。
进一步优选地，如上所述DSS诱导炎症性肠病易患性动物模型的造模方法，其中妊娠母鼠是将8周龄的SPF级C57BL/6雌雄小鼠合笼喂养并确认孕栓后所得。
进一步优选地，如上所述DSS诱导炎症性肠病易患性动物模型的造模方法，其中所述试验小鼠的饲养条件为：环境温度22～24℃，环境湿度40～70％。
与现有技术相比，本发明提供的DSS诱导炎症性肠病易患性动物模型的造模方法具有如下优点和进步性：
(1)本发明可应用于饮食营养、肠道固有菌群及肠道炎症性疾病的相互影响及作用机制的基础医学科学研究中，可为构建生命早期饮食模型提供新思路，也为探究营养条件之于肠道固有菌群结构改变、炎症性肠病(IBD)的发生发展的作用提供了论证条件。
(2)本发明论证了生命早期的饮食环境能改变后代仔鼠的菌群结构，也为特殊饮食导致IBD的作用机制和病理生理效应的进一步研究奠定了基础，同时为寻找IBD肠道有益菌群提供证据，也可一定程度上为IBD的治疗提供活力，促进临床的进步。
附图说明
图1：造模后各组后代仔鼠的DAI评分曲线图。与对照饮水小鼠相比，所有DSS饮水小鼠的DAI评分显著增加；与正常饮食MC.C.DSS组小鼠相比，MHF.HF.DSS组的DAI评分显著升高，MHP.HP.DSS组的DAI评分升高更为显著(*0.01<p<0.05，**
p<0.01)。
图2：持续高蛋白饮食组与正常对照饮食组的后代仔鼠结肠病理切片图；DSS造模后，两组小鼠结肠病理炎症指数较各自饮水对照组均升高；且与MC.C.DSS对照组相比，MHP.HP.DSS的结肠病理炎症指数显著升高。
图3：稀释曲线结果图。稀释曲线中有一个平台，表明样品的测序深度符合标准。
图4：各组小鼠肠道菌群的Alpha多样性(chao 1指数)差异图。3周龄时，MHP小鼠的α多样性显著低于MC对照组；8周龄时，与同龄期MC.C对照组小鼠相比，MHP.HP小鼠的α多样性显著降低(P<0.05)，且较断乳时MC组小鼠的α多样性降低更为显著。(参照MC组:*0.01<p<0.05，**p<0.01；参照MC.C组:#p<0.05)；
图5：各组主轴分析(PCOA)结果图。主轴分析(PCOA)将各组小鼠菌群结构的相似性或差异性可视化，MC组与MHF组、MC组与MHP组之间存在一定的可视化差异，而8周龄各组小鼠间差异不显著。
图6：各组小鼠肠道菌群的Beta多样性差异图；3周龄时，MHF组小鼠的β多样性较MC组显著降低，MHP组小鼠的β多样性较MC组有所降低(0.05<P<0.1)，但在8周龄后代仔鼠间β多样性没有显著差异。
图7：LEfSe进化分支图，红色节点(b.c.d.e.f.i所代表菌)表示在MC组富集，绿色节点(a.g h.j.k.l所代表菌)表示在MHP组富集。生命早期饮食MHP组后代仔鼠与MC对照组间存在菌群结构差异，对比MC组，MHP组的乳酸杆菌富集显著减低。
图8：LDA值分布柱状图(LDA>3.0)。生命早期饮食MHP组后代仔鼠与MC对照组间存在菌群结构差异，对比MC组，基于LDA的LEfSe分析发现MHP组在属水平上存在11种弱势差异菌，其中包括某些乳酸杆菌、毛螺旋杆菌相对丰度的减低。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。另外，实施例中未注明具体技术操作步骤或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可经市购获得的常规产品。
实施例1：
①模型构建：
选取标准8W龄的SPF级C57BL/6小鼠，雌雄各50只合笼喂养，确认孕栓后，将妊娠的母鼠随机等数量分为3组，分别为高脂饮食组(MHF)、高蛋白饮食组(MHP)和正常饮食组(MC)。母鼠孕期及哺乳期间，各组分别给予母鼠高脂饮食、高蛋白饮食和正常饮食(各饮食配方组成见表1)，后代仔鼠纯母乳喂养。后代仔鼠断奶后(3周时)，母鼠高脂饮食组的后代仔鼠再随机分2组，分别予以继续高脂饮食/恢复正常饮食(MHF.HF/MHF.C)；高蛋白饮食组后代仔鼠随机分2组分别予以继续高蛋白饮食/恢复正常饮食(MHP.HP/MHP.C)；母鼠正常饮食组的后代仔鼠持续正常饮食直至8周龄(MC.C)。最后，予以8周龄的仔鼠再随机分两组，分别予以DSS饮水诱导炎症及自由饮水对照，喂养至9周龄。
整个实验过程中的动物饲养环境温度22～24℃，环境湿度40～70％。记录各组出生后3周龄，8周龄及造模后9周龄3个时间点仔鼠的进食、粪便、体重及存活情况，每组随机抽取3只小鼠处死后留取结肠组织进行结肠病理形态、16sRNA菌群分析，各组9周龄小鼠行病理炎症评分及DAI评分。
病理炎症评分根据Dieleman等[Dieleman LA,Palmen M J,Akol H，etal.Chronic experimental colitis inducedby dextran sulphate sodium(DSS)ischaracterizedby Thland Th2cytokines.ClinExpImmunol，1998，114(3)：385—391.]组织学损伤评分标准：①炎症：无(0分)、轻(度1分)、重(度2分)；②病变深度：无(0分)、黏膜下层(1分)、肌层(2分)、浆膜层(3分)；③隐窝破坏：无(0分)、基底1/3隐窝被破坏(1分)、基底2/3隐窝被破坏(2分)、仅有完整表面上(皮3分)、全部隐窝和上皮被破坏(4分)；④病变范围：1％-25％(1分)、26％-50％(2分)、51％-75％(3分)、76％-100％(3分)。每个切片随机选取至少9个高倍视野(400倍)进行计分，取平均值作为结肠组织学损伤计分。
疾病活动指数(DAI)积分根据Hamamoto等[HamamotoN，MaemuraK，HirataI，eta1.Inhibition ofdextran sulphate sodium(DSS)-induced colitis in mice byintracolonically administered antibodies against adhesion molecules(endothelial leucocyte adhesion molecule-1(ELAM-1)or intercellular adhesionmolecule-1(ICAM-1).CIinExpImmunol，1999，117(3)：462—468.]标准：①体重下降百分率：体重不变(0分)、体重下降1％-5％(1分)、体重下降6％-10％(2分)、体重下降11％-15％(3分)、体重下降大于15％(4分)；②大便黏稠度：正常(0分)、松散大便(2分)、腹泻(4分)；③大便出血：正常(0分)、隐血阳性(2分)、显性出血(4分)三种情况进行综合评分，即DAI积分＝(体重指数+大便形状+出血情况)。
表1：三种饮食的主要配方
②结果分析：
断乳时，母鼠不同饮食的3组仔鼠间，其体重、结肠外观和长度无明显差异；继续生长至8周，5组后代仔鼠间，继续高脂饮食的仔鼠体重增加，继续高蛋白饮食的仔鼠体重减轻，组间差异具有显著性，各组结肠外观、长度无明显差异。断奶后持续高脂饮食的后代仔鼠的DAI评分相比对照组显著性升高，结肠炎症指数却无显著差异；持续高蛋白饮食的仔鼠DAI评分在断奶后显著升高(参见表2及图1)，结肠病理炎症指数亦显著升高(参见表3及图2)。
表2：DSS饮水后各组后代仔鼠的DAI积分均值变化
表3：造模各组小鼠的结肠病理炎症指数评分
菌群研究中，母鼠高蛋白饮食的3周龄断乳期仔鼠对比同龄期对照组，其物种数量及Alpha多样性显著性降低(P<0.05)；母鼠高蛋白饮食的8周龄后代仔鼠中，继续高蛋白饮食的仔鼠Alpha多样性显著性降低(P<0.05)，而恢复正常饮食组的Alpha多样性与同期对照组无显著差异(参见图3及图4)。生命早期予以母鼠高脂、高蛋白处理的断乳期仔鼠在Beta多样性上较正常饮食组减低(P1<0.05，P2＝0.07)，但8周龄小鼠间Beta多样性差异不显著(参见图5及图6)。母体高蛋白饮食的断乳期仔鼠与正常对照组在属的水平上存在12种弱势差异菌(乳酸杆菌属、毛螺旋杆菌属等)(参见图7及图8)。
③本模型的实验结论：
生命早期的母体高蛋白饮食可对后代小鼠肠道菌群的多样性产生负面调节，包括乳酸杆菌的减少，并有助于提高结肠炎的易患性。
特征为：①后代仔鼠的生命早期是从母鼠孕中起始，本发明开创性地通过干预母鼠孕期及哺乳期饮食的方式来干预仔鼠生命早期的饮食环境及营养状况；②本发明研究分析肠道固有菌群的改变而非粪便菌群，可更为合理地解释肠道菌群稳态的失衡及其产生的炎症易感性变化的效应。
技术价值为：①为有关涉及生命早期的饮食干预的科学实验提供模型参考。②论证生命早期的饮食环境能改变后代仔鼠的菌群结构，也为特殊饮食导致IBD的作用机制和病理生理效应的进一步研究奠定了基础。③为寻找IBD肠道有益菌群提供证据，也可一定程度上为IBD的治疗提供活力，促进临床的进步。
Claims (10)
1.一种葡聚糖硫酸钠诱导炎症性肠病动物模型的造模方法，其特征在于，其包括以下步骤：选取妊娠母鼠，孕期及哺乳期间均给予母鼠高蛋白饮食并自由饮水，哺乳期间给予所产后代仔鼠纯母乳喂养，3周龄时断奶并给予后代仔鼠高蛋白饮食，自由饮水，喂养至8周龄，以葡聚糖硫酸钠饮水诱导1周，得到葡聚糖硫酸钠诱导的炎症性肠病动物模型，所述的高蛋白饮食中蛋白质含量为50-60%，碳水化合物含量为20-30%。
2.根据权利要求1所述葡聚糖硫酸钠诱导炎症性肠病动物模型的造模方法，其特征在于，所述的高蛋白饮食中蛋白质含量为57-60%，碳水化合物含量为25-30%。
3.根据权利要求1所述葡聚糖硫酸钠诱导炎症性肠病动物模型的造模方法，其特征在于，所述的蛋白质选自如下的一种或两种以上：酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白。
4.根据权利要求1所述葡聚糖硫酸钠诱导炎症性肠病动物模型的造模方法，其特征在于，所述的碳水化合物选自如下的一种或两种以上：淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、纤维素。
5.根据权利要求1所述葡聚糖硫酸钠诱导炎症性肠病动物模型的造模方法，其特征在于，所述高蛋白饮食的配方按照重量份计为：酪蛋白580-600份，淀粉63-72份，麦芽糊精65-73份、蔗糖93-108份，豆油65-75份，纤维素47-53份，矿物质32-37份，维生素8-12份，L-胱氨酸2.5-3.5份，胆碱2-3份，特丁基对苯二酚0.01-0.02份。
6.根据权利要求3所述葡聚糖硫酸钠诱导炎症性肠病动物模型的造模方法，其特征在于，所述高蛋白饮食的配方按照重量份计为：酪蛋白592-594份，玉米淀粉67-68份，麦芽糊精69-70份、蔗糖99-101份，豆油69-70份，纤维素49-50份，矿物质34-35份，维生素9.5-10份，L-胱氨酸2.8-3.2份，胆碱2.3-2.6份，特丁基对苯二酚0.01-0.02份。
7.根据权利要求5所述葡聚糖硫酸钠诱导炎症性肠病动物模型的造模方法，其特征在于，所述的淀粉为玉米淀粉。
8.根据权利要求1所述葡聚糖硫酸钠诱导炎症性肠病动物模型的造模方法，其特征在于，所述妊娠母鼠为8-9周龄的SPF级C57BL/6妊娠小鼠。
9.根据权利要求8所述葡聚糖硫酸钠诱导炎症性肠病动物模型的造模方法，其特征在于，所述妊娠母鼠是将8周龄的SPF级C57BL/6雌雄小鼠合笼喂养并确认孕栓后所得。
10.根据权利要求1-9任一项所述葡聚糖硫酸钠诱导炎症性肠病动物模型的造模方法，其特征在于，所述妊娠母鼠的饲养条件为：环境温度22～24℃，环境湿度40～70%。
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