KR20120061836A - 알레르기 예방 및 치료용 프로바이오틱 유래의 비-생육가능성 물질 - Google Patents

Abstract

(a) 회분식 공정을 사용하여 LGG를 적합한 배양 배지 중에서 배양하는 단계; (b) 배양 단계 중 후기 대수기에서 배양물 상등액을 수확하는 단계; (c) 조성물을 수득하기 위해 배양물 상등액으로부터 액체 내용물을 제거하는 단계를 포함하는, 항알레르기성 (즉, 알레르기 예방 및/또는 치료학상 의미에서 항알레르기) 특성을 가진 비-생육가능한 프로바이오틱 조성물의 제조 방법을 개시한다. 단백질성 혼합물을 포함하며, 상기 방법에 의해 수득할 수 있는 조성물, 및 바람직하게는, 예비 엄마, 유아, 또는 아동을 표적 대상으로 하는 식이요법 제품에서 뿐만 아니라, 전문 의료용 식품에서의 적용을 위한 상기 조성물의 용도를 개시한다.

Description

알레르기 예방 및 치료용 프로바이오틱 유래의 비-생육가능성 물질{PROBIOTIC DERIVED NON-VIABLE MATERIAL FOR ALLERGY PREVENTION AND TREATMENT}

본 발명은 프로바이오틱 박테리아 균주 락토바실루스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 고르바 골딘(LGG)으로부터 비-생육가능한 생물학상 활성인 물질을 수확하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 상기 수확 방법에 의해 수득할 수 있는 항알레르기성 프로바이오틱 물질의 제조 방법, 및 상기 프로바이오틱 물질을 포함하는 식이요법 또는 영양 제품에 관한 것이다.

락토바실루스(Lactobacillus) GG (락토바실루스 G.G., 균주 ATCC 53103)는 천연적으로 인간 소화관에 존재하는 박테리아이다. 이는 많은 연구를 통해 일반적으로 건강에 도움이 되는 것으로 인정받은 박테리아이다. 이는 프로바이오틱으로서 널리 인정되고 있으며, 결과적으로는 다수의 영양 제품, 예를 들어, 유제품, 영양 보충제, 유아용 조제유 등에 혼입되고 있다.

현재 당업계에서 프로바이오틱이란 적절한 양으로 투여되었을 때에 숙주에 건강상 유익한 이점을 부여하는 살아있는 미생물로서 정의된다. 그러나, 이를 영양 제품 내로 혼입하게 되면 프로바이오틱의 살아있는 성질로 인해 그의 접종이 이루어질 수 있다. 이러한 접종은 특히 사용되는 프로바이오틱 균주의 유형, 제품을 받게 되는 개체의 건강 상태, 또는 그 둘 모두에 따라 그 규모가 달라질 수 있다. 또한, 살아있는 미생물을 제품 내로 혼입함에 있어 공정 기술면에서도 극복해야 할 난관들이 많이 존재한다. 이는 특히 장기간 사용 제품, 예를 들어, 분말 제품, 예를 들어, 유아용 조제유 내로 프로바이오틱을 혼입하고자 할 경우에 중요한 역할을 한다. 또한, 영양 제품 매트릭스의 복잡성이 증가함에 따라 접종 정도 또한 증가하게 된다.

특히, 임산부, 유아용 및 아동용 식이요법 제품과 관련하여 프로바이오틱 박테리아를 사용하는 것은 그 안전성 및 효능이 추가의 평가 대상이 된다. 안전성에 관한 구체적인 문제는 영양분 이용에 미칠 수 있는 효과, 항생제에 대한 내성 전달 배제, 및 장 집락형성, 면역 반응, 및 감염에 대한 단기 및 장기 효과와 관련된 것이다. 이러한 것이 프로바이오틱이 상기 제품에 사용될 수 없다는 것을 의미하는 것은 아니지만, 살아있거나, 또는 다른 생육가능한 박테리아를 사용하는 것이 실제로는 복잡성을 부가시킨다.

한편, 특히 유아용 및 아동용 식이요법 제품일 경우, 중요하게는 프로바이오틱의 유익한 효과가 요구된다. 또한, 소매 또는 병원 유통 체계를 통해 이용가능하며, 주변 온도에 노출되는 영양 제품 중의 생육가능한 박테리아의 안정성 및 생명력을 보장하는 것이 특히 도전 과제이다. 이와 관련하여 (공정처리된) 배양물 상등액을 적용함으로써 박테리아 제품을 사용하는 것이 상당한 이점을 제공할 것이다.

유아의 장내 미생물총은 성인의 것보다 발생이 훨씬 덜 이루어진 것으로 알려져 있다. 성인 인간의 미생물총은 거의 500여 종의, 10¹³개 초과의 미생물로 구성되어 있고, 그중 일부는 유해하고, 또 일부는 유익한 반면, 유아의 미생물총은 절대적인 수치로, 종의 다양성, 둘 모두를 가지고 상기 미생물의 분획만을 함유한다. 유아가 태어났을 때 장은 멸균 상태이지만, 그의 초기 환경인 출산길로부터, 및 그들이 섭취하는 것으로부터 장내 세균총을 얻게 된다. 장내 미생물총 군집이 신생아 초기에는 매우 불안정하기 때문에, 대개 유아 장내의 유해 박테리아와 유익한 박테리아 사이의 정교한 균형이 유지될 수 있도록 하는 것은 어려운 바, 면역계가 정상적으로 작용할 수 있는 능력은 감소하게 된다.

조제유 수유 유아의 장내 박테리아 종과 모유 수유 유아의 장내 박테리아 종 사이의 차이에 기인하여 조제유 수유 유아가 상기 균형을 유지하는 것은 특히 어렵다. 모유 수유 유아의 대변에는 주로 비피도박테리움(Bifidobacterium)이 함유되어 있으며, 그보다는 덜 공통된 기여자로서 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 락토바실루스가 존재한다. 대조적으로, 조제유 수유 유아의 미생물총은 그보다 더욱 다양한데, 비피도박테리움 및 박테로이데스(Bacteroides) 뿐만 아니라, 병원성이 보다 큰 종들, 스트렙토코커스, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 클로스트리디아(Clostridia)도 함유한다. 모유 수유 유아 및 조제유 수유 유아의 대변에 존재하는 다양한 비피도박테리움 종 또한 상이하다. 모유 수유 유아 및 조제유 수유 유아의 대변에 존재하는 세균총이 다른 원인으로서 여러 인자가 제안되고 있는데, 그 예로는 모유 중 단백질의 낮은 함량과 상이한 조성, 모유 중 인의 낮은 함량, 모유 중 존재하는 매우 다양한 올리고사카라이드, 및 모유 중 체액성 및 세포성 면역 작용의 수많은 매개인자를 포함한다 (문헌 [Agostoni, et al., Probiotic Bacteria in Dietetic Products for Infants: A Commentary by the ESPGHAN Committee on Nutrition, J. Pediatr. Gastro. Nutr. 38:365-374 (April 2004)]).

정상적인 장내 박테리아의 세균총 확립은 건강 및 질환에 중요한 영향을 미친다. 숙주 관점에서 장내 미생물상의 주된 작용은 병원성 유기체의 장내 집락형성을 막고, 잠재적으로 병원성인 미생물의 증식을 억제시켜 장관의 감염성 질환에 대한 천연적인 내성을 키우는 것이다. 프로바이오틱은 직접 항미생물성 화합물을 생산하거나, 또는 간접적으로는 단쇄 휘발성 지방산 합성을 통해 장내강의 pH를 변경하여 병원성 박테리아가 장세포에 결합하지 못하도록 방해함으로써 상기와 같은 효과를 발휘한다.

추가로, 정상 세균총은 위장관 면역을 자극시킬 수 있고, 점막 IgA 생산을 증진시킬 수 있으며, 항염증성 시토카인의 국소 생산을 자극시킬 수 있고, 알레르기성 염증의 특징이 되는 전염증성 시토카인의 생성을 감소시킬 수 있다. 음식 알레르기, 아토피 피부염, 및 아토피 1차 예방에서 프로바이오틱을 사용하는 것에 관하여 진행된 가장 관련성이 큰 연구 조사를 통해 프로바이오틱 요법은, 임상 증상 제어 및 국소 및 전신 염증성 마커의 감소에 의해 입증된 바, 알레르기성 염증을 완화시키는 것으로 밝혀졌다 (문헌 ([Miraglia del Giudice M, De Luca MG. The role of probiotics in the clinical management of food allergy and atopic dermatitis. J Clin Gastroenterol 2004;38(6 Suppl):S84-5]; [Prescott S, Bjorksten B, Probiotics for the prevention or treatment of allergic disease. J. Allergy Clin. Immunol. 2007;120:255-262])).

상기 내용을 참작하면, 일반적으로는 영양 제품, 식이요법 제품 및 특히 유아용 조제유에 프로바이오틱을 제공하는 것이 요구되고 있다는 것을 이해할 것이다. "유아용 조제유"라는 용어는 모유의 대체물로서 유아의 영양 요구량을 충족시켜 주는 조성물을 의미한다.

특히 유아용 조제유에 살아있거나, 또는 다른 생육가능한 박테리아를 혼입할 필요없이 프로바이오틱을 혼입하는 것이 요구되고 있다는 것 또한 이해할 것이다. 사실상, 이는 "비-생육가능한 프로바이오틱"으로 명명된다.

상기와 같은 비-생육가능한 프로바이오틱에 관한 연구가 진행 중에 있다. 그러나, 예를 들어, 논문 [Tao et al. (Am J. Physiol Cell Physiol. 290: C1018-C1030 (2006)]에서 언급된 바와 같이, 비록 프로바이오틱이 많은 질병의 과정을 개선시키는 것으로 보이지만, 그의 작용 기전에 대한 이해는 부족하다. 단지 최근에만 그의 작용을 지지하는 기전과 숙주 세포와의 상호작용에 대해 이해하려는 시도가 이루어졌다. 점액 생산 상향조절, 상피 장벽 기능 개선, IgA 생산 증가, 및 장 상피 상의 부착 부위에 대한 경쟁 증가 뿐만 아니라, 병원성 박테리아의 성장을 억제시키는 유기산, 암모니아, 과산화수소, 및 박테리오신의 생산을 비롯한, 가능성이 있는 많은 다른 기전들이 제안되었다. 이와 관련하여 타오(Tao) 등은 LGG로부터의 가용성 인자의 특정 효과에 관한 연구를 제시하였다. 특정의 생체활성은 LGG-CM 한외여과물의 저분자량 분획 (MW < 10 kDa) 중에 존재한다는 결론을 얻었다. US 2007/123460에서 유사하게 교시된 바 있다. 상기 문헌에서는, 특히 염증성 장 질환 (IBD) 치료에 살아있는 박테리아 대신 무박테리아성 프로바이오틱 유래 화합물, 및 특히 저분자량 분획 (MW < 10 kDa)을 사용하였다. 비-생육가능한 프로바이오틱을 다룬 다른 참고 문헌으로는 예를 들어, 일반적으로 박테리아의 항염증성 작용, 및 그로부터 유래된 분비형 생성물에 관한 것인 US 2004/208863, 및 락토바실루스 람노수스 종에 의해 생산된 펩티드의 항염증성 및 항알레르기성 성질에 관한 것인 US 7052896이 있다.

US 6,506,389에는 비병원성 미생물로부터 수득될 수 있는 단백질로서, 점막 결합 활성을 가지며, 분자량이 20-40 kD, 바람직하게는 20-30 kD인 단백질 또는 그의 등가성 폴리펩티드가 기술되어 있다. 상기 개시내용의 요지는 점막에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 및 폴리펩티드를 확인하는 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

항알레르기성 활성을 지원하는 비-생육가능한 프로바이오틱 물질을 LGG로부터 수득하기 위한 방법으로서 적절히 진행되는 간단한 발효 및 수확 방법을 제시한 문헌은 선행 기술에 없다.

추가로, 분비된 박테리아 생성물을 수확하는 것은 원치않는 성분들을 배양 배지에서 쉽게 제거할 수 없는 문제를 일으킨다. 이는 구체적으로는 상대적으로 취약한 대상체를 위한 영양 제품, 예를 들어, 유아용 조제유 또는 임상 영양제에 관한 것이다. 먼저 배양물 상등액으로부터 특정 성분을 단리시키고, 정제한 후에 영양 제품에 적용시킨다면 상기와 같은 문제는 발생하지 않을 것이다. 그러나, 보다 완전한 배양물 상등액을 이용하고자 하는 것이 요구된다. 이는 프로바이오틱 (즉, LGG)의 천연 작용을 보다 잘 반영하는 조성물을 제공하는 역할을 할 것이다. 그러나, 현재는 배양물 상등액 그 자체만을, 유아용 조제유 등에 특이적으로 사용되는 비-생육가능한 프로바이오틱 물질에 대한 기초로서 사용할 수는 없다. 따라서, 이러한 문제를 해결할 수 있는 방법을 제공하고자 하는 것이 요구되고 있다.

발명의 개요

상기 요구 사항들 중 하나 이상을 보다 잘 처리하기 위해, 한 측면에서 본 발명은 단백질성 혼합물을 포함하며, LGG 회분식 배양 공정 중 후기 대수기에서 배양물 상등액으로부터 수득할 수 있는, 알레르기성 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 LGG를 적합한 배양 배지 중에서 성장시키는 단계, LGG 군집 성장의 후기 대수기를 결정하는 단계, 및 상기 후기 대수기에서 배양물 상등액을 박테리아 배양물로부터 분리시키는 단계를 포함하는, 항알레르기성 활성을 가진 조성물을 LGG 배양 배지로부터 수확하는 방법에 있다.

추가 측면에서, 본 발명은 LGG 회분식 배양 공정 중 후기 대수기에서 배양물 상등액으로부터 수득할 수 있는 비-생육가능한 프로바이오틱 조성물을 포함하는 식이요법 제품 뿐만 아니라, 영양 제품 중 첨가제로서의 상기 조성물의 용도를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 LGG 회분식 배양 공정 중 후기 대수기에서 배양물 상등액으로부터 수득할 수 있는 비-생육가능한 프로바이오틱 조성물을 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 알레르기성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

도 1은 배양시 시간에 따른 LGG 군집의 증가를 보여주는 그래프를 나타낸 것이다: 여기서, 도 1a는 광학 밀도 (OD600) 뿐만 아니라, 배양 배지의 pH 변화와 관련하여 LGG 군집의 증가를 도시한 것이고, 도 1b는 플레이팅 기법에 의해 측정된 박테리아 계수를 나타낸 것이다;
도 2는 상이한 단계 (MJ1, MJ2, MJ3)의 LGG 배양 수확물에 대한 시토카인 IL-10의 생산을 나타낸 것이다;
도 3은 본 발명의 조성물을 시험하는 데 사용된 신생 마우스 모델에서의 생체내 오브알부민 (OVA) 감작에 대한 타임라인을 도시한 것이다 ;
도 4는 OVA 모델로 제작된 후, 생육가능한 LGG 및 LGG 상등액을 포함하는 상이한 조성물로 경구적으로 처리된 마우스의 폐 조직을 염색하여 나타낸 현미경 영상을 도시한 것이다;
도 5는 OVA 알레르기성 동물의 폐에서 알레르기성 세포 침윤을 보여주는 다이어그램을 나타낸 것으로서; LGG 및 LGG 상등액으로 처리된 마우스, 둘 모두의 폐 세척액 중에 존재하는 알레르기성 (호산성) 세포의 존재량은 감소하였음을 나타내고 있다.
도 6 (a-c)는 알레르기성 질환에서 염증 과정과 관련이 있는 3개의 상이한 시토카인에 대한 시험관내 반응을 보여주는 다이어그램을 나타낸 것으로서; 본 데이터는 LGG 상등액에 의한 억제 (IL-10) 시토카인 생산에 대한 우수한 자극을 보여주는 것이다.
도 7은 본 발명의 LGG 배양물 상등액을 출생 전후기에 투여하는 것에 관한 생체내 연구를 나타낸 개략도를 제시하는 것이다;
도 8은 본 발명의 LGG 배양물 상등액을 출생 전후기에 투여하였을 때, 폐 세척액 중에 존재하는 알레르기성 (호산성) 세포의 존재량이 감소하였다는 것을 통해 밝혀진, 알레르기성 반응에 대한 결과를 나타낸 것이다.

실시양태의 상세한 설명

본 발명은 넓은 의미에서 LGG 회분식 배양으로부터 항알레르기성 활성을 가진 배양물 상등액 ("폐(spent) 배지"로도 지칭될 수 있다)을 수확할 수 있다는 견해를 기초로 한다. 본 발명과 관련하여, "항알레르기성"이라는 용어는 "알레르기 예방 활성 뿐만 아니라, "항알레르기성 치료 활성"도 포함한다.

어떤 이론으로도 한정하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 (단백질을 포함하고, 가능하게는 (엑소)폴리사카라이드 물질을 포함하는) 성분들이 LGG 회분식 배양 중 후기 대수기 (또는 "지수기")에서 배양 배지 내로 유리되는 것으로 관찰된 바, 상기 활성은 이러한 성분들로 구성된 혼합물에 따른 결과일 수 있다고 판단하였다. 이하, 본 조성물은 "본 발명의 배양물 상등액"으로 지칭될 것이다.

LGG는 건강한 인간 장 세균총으로부터 단리된 프로바이오틱 균주이다. 이는 미국 특허 번호 제5,032,399호 (고르바 등) (이 특허는 그 전문이 본원에 포함된다)를 참고로 하여 그에 개시된 바 있다. LGG는 대부분의 항생제에 대해 내성을 띠며, 산 및 담즙의 존재하에서 안정하고, 인간 장관의 점막 세포에 결합력을 통해 부착된다. 이는 대부분의 개체에서는 1-3일 동안 생존하며, 대상체 중 30%에서는 최대 7일까지 생존한다. 그의 집락형성능 이외에도, LGG는 또한 점막 면역 반응에도 유리한 영향을 미친다. LGG는 수탁 번호 ATCC 53103 하에 기탁 기관인 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에 기탁되어 있다.

박테리아의 회분식 배양에서 인정되는 단계는 당업자에게 공지되어 있다. 이는 "유도기," "지수기" ("지수기" 또는 "대수기"), "정지기" 및 "사멸기" (또는 "지수 감소기")이다. 살아있는 박테리아가 존재하는 모든 단계에서 박테리아는 배지로부터의 영양분을 물질 대사시키고, 물질을 배양 배지로 분비한다 (영향을 미치고, 방출한다). 성장 단계 중 소정의 시점에서 분비된 물질로 구성된 조성물이 일반적으로 예측가능한 것은 아니다.

본 발명에서 분비된 물질은 후기 대수기로부터 수확된 것이다. 후기 대수기는 중기 대수기 이후의 시간에 존재하는 것이다 (중기 대수기는 대수기 기간의 중간 시점인 바, 이에 후기 대수기는 유도기와 정지기 사이 시간 중 후반기 시간으로서 언급될 수 있다). 특히, 본원에서 "후기 대수기"라는 용어는 LGG 회분식 배양 공정 중 유도기와 정지기 사이 시간 중 후반 ¼ 부분과 관련하여 사용된다. 바람직하게는, 본 발명에 따라, 배양물 상등액을 수확하는 것은 대수기 기간의 75% 내지 85%가 되는 시점에 이루어지며, 가장 바람직하게는 대수기 중 약 5/6가 경과된 시점에 이루어진다.

"배양" 또는 "배양하는"이라는 용어는 미생물을, 본 경우에는 LGG를 적합한 배지 상에서 또는 배지 중에서 증식시키는 것을 의미한다. 그러한 배양 배지는 다양한 종류의 것일 수 있고, 특히 당업계에서 통상적인 액체 브로쓰이다. 바람직한 브로쓰는 예를 들어, 일반적으로 락토바실리(lactobacilli) 배양을 위해 사용되는 MRS이다. MRS 브로쓰는 일반적으로, 락토바실리에 대해 특이적인 성장 인자로서 작용하는 것으로 알려져 있는 폴리소르베이트, 아세테이트, 마그네슘 및 망간 뿐만 아니라, 풍부한 영양 베이스를 포함한다. 전형적인 조성물은 카제인으로부터의 펩톤 10.0; 육류 추출물 8.0; 효모 추출물 4.0; D(+)-글루코스 20.0; 제2인산칼륨 2.0; 트윈^® 80 1.0; 트리암모늄 시트르산 2.0; 아세트산나트륨 5.0; 황산마그네슘 0.2; 황산망간 0.04 (g/ℓ로 표기된 양)를 포함한다.

본 발명의 배양물 상등액의 바람직한 용도는 유아용 조제유에 사용하는 것이다. 본 발명이 본원에서 충분히 활용될 수 있도록 하기 위해서는 LGG 배양으로부터 수확된 조성물이 상기 유아용 조제유 중에 (배양 배지 중에 존재할 수 있는) 원치않거나, 또는 합법적으로 허용되는 성분을 확실히 함유하지 않도록 하는 것이 바람직하다. MRS 브로쓰에 주로 존재하는 폴리소르베이트와 관련하여, 박테리아 배양용 배지는 예를 들어, (전형적으로는 예를 들어, 트윈® 80과 같이 트윈® 폴리소르베이트로서 이용가능한) 폴리에톡실화된 소르비탄 및 올레산에 기초한 유화용 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 이러한 계면활성제는 예를 들어, 아이스크림와 같은 식품에서 빈번하게 발견되고, 일반적으로는 안전하다고 인정받은 것이지만, 모든 관할권에서 바람직한 것으로 간주되는 것은 아니며, 심지어 상대적으로 취약한 대상체를 위한 영양 제품, 예를 들어, 유아용 조제유 또는 임상 영양제에 사용될 수 있다고 허용되는 것으로 간주되는 것도 아니다.

따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한 상기 언급된 폴리소르베이트가 소거된 것일 수 있는 배양 배지를 사용하는 것에 관한 것이다. 이를 위해 본 발명의 바람직한 배양 배지는 트윈 80을 포함하지 않으며, 올레산, 아마인유, 올리브유, 평지씨유, 해바라기유 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 오일 성분을 포함할 수 있다. 폴리소르베이트 계면활성제가 존재하지 않도록 본질적으로 또는 완전하게 소거된 경우에 오일 성분으로부터 충분한 이익을 얻을 수 있게 된다는 것을 이해할 것이다.

MRS 배지가 트윈 80은 포함하지 않으며, 상기 언급된 오일들 중 하나 이상의 것 이외에도, 펩톤 (전형적으로 10 g/L), 육류 추출물 (전형적으로 8 g/L), 효모 추출물 (전형적으로 4 g/L), D(+) 글루코스 (전형적으로 20 g/L), 제2인산칼륨 (전형적으로 2 g/L), 아세트산나트륨 3수화물 (전형적으로 5 g/L), 트리암모늄 시트르산 (전형적으로 2 g/L), 황산마그네슘 7수화물 (전형적으로 0.2 g/L) 및 황산망간 4수화물 (전형적으로 0.05 g/L)을 포함하는 것이 가장 바람직하다.

배양은 일반적으로 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는, 35℃ 내지 40℃, 및 가장 바람직하게는, 37℃의 온도에서 수행한다.

배양 기간 중 배양물 상등액을 수확하기 위한 바람직한 시점, 즉, 상기 언급한 후기 대수기 중의 바람직한 시점은 예를 들어, OD600 nm 및 글루코스 농도에 기초하여 결정될 수 있다. OD600은 600 nm에서의 광학 밀도를 언급하는 것으로서, 이는 배양 배지 중의 박테리아 농도와 직접적인 상관 관계가 있는 공지의 밀도 측정값이다.

상기 언급한 것 이외에도, LGG를 비롯한 락토바실리의 회분식 배양은 당업자가 이용가능한 통상의 일반 상식이라는 것에 주의하여야 한다. 따라서, 본원에서는 이러한 방법에 관한 추가 설명이 필요하지 않다.

본 발명의 조성물은 (예를 들어, 100 L보다 큰 발효기, 바람직하게는 약 200 L보다 큰 발효기에서의) 대규모 발효에 의해 생산되는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 배양물 상등액을 박테리아 배양물로부터 분리시키는 임의의 공지된 기법에 의해 수확할 수 있다. 그러한 기법은 당업계에 주지되어 있고, 그 예로는 원심분리, 여과, 침전 등을 포함한다.

상등액은 즉시 사용될 수 있거나, 또는 추후 사용을 위해 저장될 수 있다. 후자의 경우, 상등액은 일반적으로 냉장되거나, 냉동되거나, 동결건조될 것이다. 원하는 바에 따라, 상등액을 농축시키거나, 희석시킬 수 있다.

본 발명에 따라 수확된 조성물은 단백질성 조성물을 포함하는 것으로 간주된다. "단백질성"이라는 용어는 당업자에게 공지되어 있으며, 이는 펩티드, 단백질, 또는 아미노산 잔기를 포함하는 다른 화합물 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 가리키는 것이다.

화학 물질과 관련하여, 본 발명의 배양물 상등액으로 이루어진 조성물은 복수개의 다양한 분자량의 아미노산, 올리고펩티드 및 폴리펩티드, 및 단백질로 이루어진 혼합물인 것으로 간주된다. 조성물은 추가로 폴리사카라이드 구조물을 포함하는 것으로 간주된다.

당업계와는 다르게, 본 발명은 바람직하게는 전체, 즉, 미분획화 배양물 상등액에 관한 것이라는 점이 강조된다. 상기 언급된 후기 대수기에서의 적절한 수확 시점을 선택하는 것, 및 사실상 상등액의 모든 성분들을 보유하는 것이 그를 통해 얻은 놀라운 결과, 특히 항알레르기성 활성에 비추어 볼 때, 및 더욱 특히, 유아 및 신생아에서의 상기와 같은 활성에 비추어 볼 때, 및 출산 전후에 임신한 각 수유부에게 투여되었을 때에 얻게 되는 놀라운 결과에 기여하는 것으로 간주된다.

전체 배양물 상등액이란 보다 구체적으로는 실질적으로 저분자량의 성분, 일반적으로 6 kDa 미만의 성분은 배제시킨 것으로 정의될 수 있다. 이는 조성물이 바람직하게는 락트산 및/또는 락테이트 염을 포함하지 않는다는 사실에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 상등액은 락트산 및 락테이트 염 제거시에 수득되는 전형적인 상등액인 바, 그의 분자량은 6 kDa을 초과한다. 이는 일반적으로 여과 또는 칼럼 크로마토그래피를 포함한다. 사실상, 상기 여과의 보유액은 분자량 범위가 6 kDa을 초과한다는 것을 나타낸다 (다시 말해, 6 kDa 미만의 구성 성분은 여과를 통해 제거된다).

본 발명의 상등액으로 이루어진 조성물은 일반적으로 단백질성일 뿐만 아니라, 폴리사카라이드, 특히, 엑소폴리사카라이드 (LGG에 의해 생산되는 것과 같은 당 잔기로 구성된 고분자 중합체)를 포함할 것이다. 어떤 이론으로도 한정하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 예를 들어, 중기 대수기 또는 정지기와 같은 다른 단계로부터 수확된 조성물과 비교하였을 때, 상기 논의된 바와 같이 후기 대수기로부터 수확되었을 때의 단백질성 물질의 양과 탄수화물 물질의 양 사이의 비가 항알레르기성 성질에 기여한다고 판단하였다.

본 발명에 따라 수확된 배양물 상등액은 밝혀진 항알레르기성 활성으로부터 이익을 얻기 위해 다양한 방법으로 이용될 수 있다. 그러한 용도로는 일반적으로 본 발명의 조성물을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것과 같은 일부 형태를 포함할 것이다. 이와 관련하여, 배양물 상등액은 그 자체로서, 예를 들어, 경구 투여용 캡슐제, 또는 액체 영양 조성물, 예를 들어, 드링크제 내로 혼입될 수 있거나, 추가로 사용되기 전에 공정처리될 수 있다. 후자의 것이 바람직하다.

상기 공정처리로는 일반적으로 액체 연속상의 상등액으로부터 단백질성 조성물을 분리하는 것을 포함한다. 이는 바람직하게는 건조 방법에 의해, 예를 들어, 분무 건조 또는 냉동 건조 (동결건조)에 의해 수행된다. 분무 건조가 바람직하다. 분무 건조법의 바람직한 실시양태에서, 분무 건조 이전에 담체 물질, 예를 들어, 말토덱스트린 DE29가 첨가될 것이다. (LGG에 의해 생산되며, 폐 배양 배지 중에 존재하는) 락트산이 액체인 조건하에서도 또한 건식 분말로 생산될 수 있다는 점에서 유익한 것으로 판단된다.

본 발명의 조성물이 항알레르기성 (예방적 및/또는 치료적) 활성을 가진다는 것이 밝혀졌다. 항알레르기성 활성은 예를 들어, 알레르기성 감작 및 폐 염증을 앓는 새로 발생된 신생 마우스 모델에서 측정될 수 있다. 사실상, 상기 모델은 알레르기성 질환과 천식의 면역 병적 이상을 연구하는 데 뿐만 아니라, 항알레르기성 활성을 가진 화합물을 확인하는 데 널리 사용되는 소위 OVA 모델이라 하는 것의 적합화된 모델이다. 알레르기성 질환으로는 천식 (알레르기성일 수 있다), 아토피 습진 (이 또한 알레르기성일 수 있다), 음식 알레르기, 및 알레르기성 비염/결막염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물이 그의 유익한 항알레르기성 효과를 발휘할 수 있도록 하기 위해, 대상체, 바람직하게는 인간 대상체는 이를 섭취할 것이다. 특히, 바람직한 실시양태에서, 대상체는 임산부, 수유부, 신생아, 유아, 또는 아동이다. 상기에서 언급한 바와 같이, "비-생육가능한 프로바이오틱"으로 간주될 수 있는 물질을 사용함으로써 얻게 되는 이점은 대부분 유아용 식이요법 제품에 이익이 될 것이다. "유아"라는 용어는 생후 약 1세 미만의 인간을 의미한다.

대상체가 섭취하기 위해서는 본 발명의 조성물은 경구로 투여되어야 한다는 것을 이해할 것이다. 본 발명에 따른 조성물의 투여 형태는 중요하지 않다. 일부 실시양태에서, 조성물은 정제, 환제, 캡슐화, 캐플릿, 겔 캡, 캡슐제, 오일 드롭제, 또는 사쉐를 통해 대상체에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 당, 지방, 또는 폴리사카라이드에 캡슐화된다.

또 다른 실시양태에서, 조성물은 식품 또는 드링크 제품에 첨가되어 섭취될 수 있다. 식품 또는 드링크 제품은 아동용 영양 제품, 예를 들어, 2단계(follow-on) 조제유, 성장기 우유(growing up milk), 음류수, 우유, 요거트, 과일 쥬스, 과일계 드링크(fruit-based drink), 저작성 정제, 쿠키, 크래커, 또는 분유일 수 있다. 다른 실시양태에서, 제품은 유아용 영양 제품, 예를 들어, 유아용 조제유 또는 모유 강화제일 수 있다.

본 발명의 조성물은 개별 제형으로, 또는 영양 제품을 통해 첨가되든 첨가되지 않든, 이는 일반적으로 알레르기를 치료 또는 예방하는 데 유효한 양으로 투여될 것이다. 유효량은 바람직하게는 1일, 체중 1 kg당 살아있는 프로바이오틱 박테리아의 1x10⁴ 내지 약 1x10¹²개, 및 더욱 바람직하게는 10⁸-10⁹개의 세포 등가물과 등가인 양이다. 세포 등가물에 대한 역산정은 당업자의 지식 범위 내에 포함되어 있다.

본 발명의 조성물이 유아용 조제유를 통해 투여될 경우, 유아용 조제유은 영양학상 완전할 것일 수 있고, 적합한 유형 및 양의 지질, 탄수화물, 단백질, 비타민 및 미네랄을 함유할 수 있다. 지질 또는 지방의 양은 전형적으로 약 3 내지 약 7 g/100 kcal로 달라질 수 있다. 지질의 공급원은 당업계에 공지되어 있거나, 당업계에서 사용되는 임의의 것, 예를 들어, 식물성 오일, 예를 들어, 팜유, 대두유, 팜올레인, 코코넛 오일, 중쇄 트리글리세리드 오일, 고 올레산 해바라기유, 고 올레산 홍화유 등일 수 있다. 단백질의 양은 전형적으로 약 1 내지 약 5 g/100 kcal로 달라질 수 있다. 단백질 공급원은 당업계에 공지되어 있거나, 당업계에서 사용되는 임의의 것, 예를 들어, 탈지유, 유청 단백질, 카제인, 대두 단백질, (부분적으로 또는 완전) 가수분해 단백질, 아미노산 등일 수 있다. 탄수화물의 양은 전형적으로 약 8 내지 약 12 g/100 kcal로 달라질 수 있다. 탄수화물의 공급원은 당업계에 공지되어 있거나, 당업계에서 사용되는 임의의 것, 예를 들어, 락토스, 글루코스, 고형 옥수수 시럽, 말토덱스트린, 수크로스, 전분, 고형 쌀 시럽 등일 수 있다.

편의상, 상업적으로 이용가능한 출생전, 미숙아용, 유아용 및 아동용 영양 제품이 사용될 수 있다. 예를 들어, (메드 존슨 & 컴퍼니(Mead Johnson & Company: 미국 인디애나주 애번즈빌)로부터 입수가능한) 엑스펙타(Expecta)® 엔파밀(Enfamil)®, 엔파밀® 미숙아용 조제유, 락토프리(Lactofree)®, 뉴트라미젠(Nutramigen)®, 젠틀리스(Gentlease)®, 프리제스티밀(Pregestimil)®, 프로소비(ProSobee)®, 엔파키드(Enfakid)®, 엔파스쿨(Enfaschool)®, 엔파그로우(Enfagrow)®, 킨더칼(Kindercal)®이 적합한 수준의 본 발명의 조성물로 보충될 수 있고, 본 발명의 방법을 실시하는 데 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 생육가능한 프로바이오틱과 조합될 수 있다. 본 실시양태에서는 당업계에 알려져 있는 임의의 생육가능한 프로바이오틱이 의도하는 결과를 달성할 수 있다면, 이 또한 허용될 수 있다.

생육가능한 프로바이오틱이 본 발명의 조성물과 함께 조합되어 투여되는 경우, 생육가능한 프로바이오틱의 양은 1일, 체중 1 kg당 약 1*10⁴ 내지 1*10¹² 집락 형성 단위 (cfu) 사이에 상응하는 양일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 생육가능한 프로바이오틱은 1일, 체중 1 kg당 약 1*10⁶ 내지 1*10¹² cfu 사이의 양을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 생육가능한 프로바이오틱은 1일, 체중 1 kg당 약 1*10⁹ cfu를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 생육가능한 프로바이오틱은 1일, 체중 1 kg당 약 1*10¹⁰ cfu를 포함할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 프리바이오틱과 함께 조합될 수 있다. "프리바이오틱"이란 프로바이오틱의 성장 및/또는 활성을 자극하는 난소화성 식품 성분을 의미한다. 본 실시양태에서는 당업계에 알려져 있는 임의의 프리바이오틱이 원하는 결과를 달성할 수 있다면, 이 또한 허용될 것이다. 본 발명에 유용한 프리바이오틱으로는 락툴로스, 글루코-올리고사카라이드, 이눌린, 폴리덱스트로스, 갈락토-올리고사카라이드, 프럭토-올리고사카라이드, 이소말토-올리고사카라이드, 대두 올리고사카라이드, 락토수크로스, 크실로-올리고사카라이드, 및 젠티오-올리고사카라이드를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 유아용 조제유는 다른 활성제, 예를 들어, LCPUFA를 포함할 수 있다. 적합한 LCPUFA로는 α-리놀레산, γ-리놀레산, 리놀레산, 리놀렌산, 에이코사펜타엔산 (EPA), 아라키돈산 (ARA) 및/또는 도코사헥사엔 (DHA)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 DHA와 함께 조합되어 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 ARA와 함께 조합되어 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 DHA 및 ARA, 둘 모두와 함께 조합되어 투여된다. DHA, ARA, 또는 그의 조합물을 포함하는 상업적으로 이용가능한 유아용 조제유는 본 발명의 조성물로 보충될 수 있고, 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 유효 수준의 DHA 및 ARA를 함유하는 엔파밀® 리필(LIPIL)®이 상업적으로 이용가능하며, 이는 본 발명의 조성물로 보충될 수 있고, 본 발명에 사용될 수 있다. ARA를 포함할 경우, 본 발명의 한 실시양태에서, ARA의 유효량은 전형적으로 1일, 체중 1 kg당 약 5 mg/kg (체중)/일 내지 약 150 mg/kg (체중)/일이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 양은 약 10 mg/kg (체중)/일 내지 약 120 mg/kg (체중)/일로 달라질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 양은 약 15 mg/kg (체중)/일 내지 약 90 mg/kg (체중)/일로 달라질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 양은 약 20 mg/kg (체중)/일 내지 약 60 mg/kg (체중)/일로 달라질 수 있다. 유아용 조제유가 사용되는 경우, 유아용 조제유 중 DHA의 양은 약 5 mg/100 kcal 내지 약 80 mg/100 kcal로 달라질 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, DHA는 약 10 mg/100 kcal 내지 약 50 mg/100 kcal로 달라질 수 있고; 또 다른 실시양태에서, 약 15 mg/100 kcal 내지 약 20 mg/100 kcal로 달라질 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, DHA의 양은 약 17 mg/100 kcal이다. 유아용 조제유가 사용되는 경우, 유아용 조제유 중 ARA의 양은 약 10 mg/100 kcal 내지 약 100 mg/100 kcal로 달라질 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, ARA의 양은 약 15 mg/100 kcal 내지 약 70 mg/100 kcal로 달라질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, ARA의 양은 약 20 mg/100 kcal 내지 약 40 mg/100 kcal로 달라질 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, ARA의 양은 약 34 mg/100 kcal이다. 유아용 조제유가 사용되는 경우, 유아용 조제유는 당업계에 공지된 표준 기법을 사용하여 DHA 및 ARA를 함유하는 오일로 보충될 수 있다. 예를 들어, DHA 및 ARA는 등가량의, 보통 조제유에 존재하는 오일, 예를 들어, 고 올레산 해바라기유를 대신함으로써 조제유에 첨가될 수 있다. 또 다른 일례로서, DHA 및 ARA를 함유하는 오일은 등가량의, 보통 DHA 및 ARA를 함유하지 않는 조제유에 존재하는 전체 지방 혼화물 중의 나머지를 대신함으로써 조제유에 첨가될 수 있다. 사용될 경우, DHA 및 ARA의 공급원은 당업계에 공지되어 있거나, 당업계에서 사용되는 임의의 것, 예를 들어, 수산 유지, 어유, 단세포 유지, 난황 지질, 뇌 지질 등일 수 있다. 일부 실시양태에서, DHA 및 ARA는 단세포 마르텍(Martek) 오일인 DHASCO®, 또는 그의 변형물로부터 공급받을 수 있다. DHA 및 ARA는, LCPUFA의 나머지 부분의 공급원이 유아에게 어떤 실질적인 유해한 효과를 일으키지 않는 한, 천연 형태일 수 있다. 별법으로, DHA 및 ARA는 정제된 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, DHA 및 ARA의 공급원은 미국 특허 번호 제 5,374,567호; 제5,550,156호; 및 제5,397,591호 (상기 출원의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)에 교시된 바와 같이, 단세포 유지이다. 그러나, 본 발명은 오직 상기 오일만으로 한정하지는 않는다. 한 실시양태에서, EPA를 함유하는 LCPUFA 공급원은 본 발명의 조성물 중 적어도 하나와 함께 조합되어 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 실질적으로 EPA를 함유하지 않는 LCPUFA 공급원은 본 발명의 조성물 중 적어도 하나와 함께 조합되어 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 약 16 mg EPA/100 kcal 미만인 양을 함유하는 유아용 조제유는 본 발명의 조성물로 보충된다. 또 다른 실시양태에서, 약 10 mg EPA/100 kcal 미만인 양을 함유하는 유아용 조제유는 본 발명의 조성물로 보충된다. 또 다른 실시양태에서, 약 5 mg EPA/100 kcal 미만인 양을 함유하는 유아용 조제유는 본 발명의 조성물로 보충된다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 심지어 미량의 EPA도 함유하지 않는 본 발명의 조성물로 보충된 유아용 조제유를 포함한다. DHA 및/또는 ARA와 함께 조합된 본 발명의 조성물을 제공하는 것이 상기 제제를 함유하는 배합제의 항알레르기성 성질과 관련하여 상보적 또는 시너지 효과를 제공한다고 믿었다.

추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 식이요법 제품은 보통 인간 모유에 존재하는 하나 이상의 생체활성 물질, 예를 들어, 단백질 또는 폴리사카라이드를 포함한다.

본 발명의 조성물은 바람직하게는 알레르기 및/또는 그의 증상을 예방, 감소, 호전 또는 치료하기 위해 사용된다.

알레르기란 "보통은 용인되고, 일반적으로는 유해하지 않은 것으로 간주되는 물질에 대한 비정상적인 과민증"으로서 정의된다. 알레르기 증상의 범위는 콧물에서부터 아나필락시스 쇼크까지로 다양할 수 있다. 약 5천만명의 미국인들이 알레르기성 질환을 앓고 있으며, 이러한 질병의 발병률은 증가하고 있다.

알레르기성 반응과 연루된 2개의 기본 단계가 존재한다. 제1 단계는 알레르겐에 대한 즉시형 과민증 반응의 조기 단계 발생을 포함한다. 맨 처음 알레르겐이 면역계를 조우하게 될 때에는 어떤 알레르기성 반응도 일어나지 않는다. 대신, 면역계는 추후에 알레르겐을 대면하게 될 때를 위해 그 스스로를 준비시킨다. 제거세포인 대식세포, 및 소위 가지 세포라는 세포가 침입 알레르겐을 둘러싸고 이를 분해시킨다. 이어서, 상기 세포는 그의 세포벽 상에 알레르겐 단편을 체내 면역 반응의 주요 조정자인 T 림프구에게 제시한다. 이러한 인지 신호와 수개의 비-인지 신호 (예를 들어, 시토카인)가 천연 T 세포를 활성화시키고, T 세포가 T 세포 효과기 서브군집으로 분화될 수 있도록 지시한다. 알레르기성 캐스케이드에서 중요한 참가자는 Th-2 표현형 (TH-2)의 T 세포이다. TH-2형 T 세포는 인터루킨-4 (IL-4), IL-5 및 IL-13을 비롯한 수개의 시토카인의 분비를 특징으로 한다. 이어서, 시토카인 IL-4 및 IL-13은 B 림프구를 활성화시켜 특정 알레르겐에 대한 서브부류 E (IgE)의 항체를 생산하게 된다. 효과기 세포 (비만 세포 및 호염구) 표면 상의 특이적인 IgE 항체와 알레르겐의 상호작용을 통해 즉시형 과민증 반응의 조기 단계가 일어난다.

이러한 비만 세포의 활성화는 보통 알레르겐에 대한 2차 또는 추가 노출이 있은 후 수분 이내에 발생하게 된다. 감작 단계 동안 구성된, 비만 세포 상의 IgE 항체는 알레르겐을 인식하고, 침입자에 결합하게 된다. 일단 알레르겐에 수용체가 결합하게 되면, 비만 세포 중의 과립은 그 내용물을 방출한다. 이들 내용물, 또는 매개 인자는 전염증성 물질, 예를 들어, 히스타민, 혈소판 활성 인자, 프로스타글란딘, 시토카인 및 류코트리엔이다. 이러한 매개 인자가 실제로 알레르기 공격을 일으킨다. 히스타민이 점액 생산을 자극시키고, 발적, 팽윤, 및 염증을 유발한다. 프로스타글란딘은 기도를 수축시키고, 혈관을 확장시킨다.

알레르기성 면역 반응의 제2 단계는, 알레르겐 노출 후, 염증 세포, 예를 들어, 호산구가 기도 내로 침윤되는 것을 특징으로 한다. 감작과 염증 사이의 중요한 연관은, IgE 합성에 관여할 뿐만 아니라, 호산구 동원, 활성화 및 생존을 담당하는 매개 인자를 분비하는 T 세포에 의해 나타난다. 조직 비만 세포 및 이웃 세포는 순환 호염구, 호산구, 및 상기 조직으로 이주하고, 외래 물질과의 싸움에 도움을 주는 다른 세포에 신호를 전달하는 화학적 메신저 물질을 생산한다. 호산구는 스스로 염증을 일으키고, 조직 손상을 유발하며, 추가의 더 많은 면역 세포를 동원하는 화학 물질을 분비한다. 이러한 단계는 알레르겐에의 노출이 있은 후 수시간 내지 수일 사이에 언제든지 일어날 수 있으며, 수시간 및 심지어 수일 동안 지속될 수 있다.

호흡성 알레르기는 호흡기에 영향을 미치는 특별한 유형의 알레르기이다. 코에서부터 폐까지의 기도의 내층은 구조상 유사하고, 이는 자주 알레르기 과정에 의해 유사한 영향을 받는다. 따라서, 코 또는 부비강에 영향을 주는 알레르겐 또한 폐에 영향을 줄 수 있다.

예를 들어, 건초열로도 알려져 있는 알레르기성 비염은 대기 중 알레르겐에 대한 코 및 기도내 점막의 알레르기성 반응에 의해 유발된다. 알레르기성 비염의 증상으로는 주로 코, 목, 및 눈 가려움증, 및 과도한 재채기를 포함한다. 주로 코막힘 또는 콧물을 동반한다.

호흡기 중의 한 부위에 있는 알레르겐이 호흡기 중의 다른 부위에도 영향을 미칠 수 있기 때문에 비도내 비염은, 폐의 하부 기도에서 발생하는 더욱더 중증의 질병인 천식을 일으킬 수 있다. 천식은 기도 과다반응, 호흡 곤란, 숨을 내쉴때 쌕쌕거림, 마른 기침, 및 가슴이 죄어지는 느낌을 특징으로 한다. 반복된 알레르겐에의 노출이 기도에 염증성 반응을 일으켜 통상 만성 천식으로 알려진 바와 같은, 기도의 리모델링을 유발할 수 있다. 알레르기성 비염을 앓는 모든 사람에서 천식 증상이 발생하는 것은 아니지만, 상당수, 특히 재발성의 알레르기 치료를 받지 않은 사람에서는 폐 염증 변화가 나타나게 될 것이다. 실제로 알레르기성 비염을 앓는 사람 중 약 40%에서 완전히 진행된(full-blown) 천식이 발생하게 될 것이다.

알레르기성 비염을 동반하는 코 염증이 부비강이 도달하게 되면, 부비강 스스로 박테리아를 제거할 수 없는 부비강염, 또는 비부비강염이라 지칭되는 불쾌한 감염과 같은 결과가 발생할 수 있다. 증상으로는 코막힘, 콧물, 인후염, 열, 두통, 피로감 및 기침 뿐만 아니라, 이마, 볼 뒤쪽의 통증, 및 심지어는 치아 및 턱 통증을 포함한다.

호흡성 알레르기는 아동기의 가장 일반적인 질병 중 하나이다. 성인과 마찬가지로, 아동의 호흡성 알레르기도 알레르기성 비염 및 천식의 형태로 나타날 가능성이 크다.

알레르겐에 대한 조기 알레르기성 감작은 정상적인 면역 반응의 성숙 지연과 관련이 있는 것으로 보여지는 바, 호흡성 알레르기 예방은 특히 유아 및 어린 아동에서 중요하다. 추가로, 일반적으로는 알레르기성 감작이 아토피 질환 발생에서 제1 단계인 것으로 간주된다 (문헌 [Baena-Cagnani, Role of Food Allergy in Asthma in Childhood, Allergy. Clin. Immun. 1(2):145-149 (2001)]). 빈번하게는, 어릴 때 시작된 천식은 아토피와 관련이 있으며, 따라서, 조기 알레르기성 감작이 또한 지속성 천식에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다 (문헌 [Martinez, F., Development of Wheezing Disorders and Asthma in Preschool Children, Pediatr. 109:362-367 (2002)]).

알레르기성 감작과 천식 사이에는 강력한 상관 관계가 존재할 뿐만 아니라, 그러한 관련성은 연령에 의존하는 것으로 보인다. 생후 몇년간 알레르겐에 감작되는 아동은 거의 없지만, 상기 기간 동안 감작된 아동 중 대다수에서는 만년에 천식과 유사한 증상이 발생한다 (문헌 [Martinez, F., Viruses and Atopic Sensitization in the First Years of Life, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 162:S95-S99 (2000)]). 따라서, 조기 알레르겐 감작, 알레르기성 반응을 예방하고, 만년의 호흡성 알레르기를 예방하는 방법을 찾는 것이 중요하다.

건강 및 질환에 대한 많은 측면들이 유아기 동안에 뿐만 아니라, 임신 중에 결정된다는 것을 입증하는 증거가 증가하고 있다. 이는 특히, 출생시 면역 반응이 1차 감작 이벤트로서 자궁내 노출과 연루되어 있는 알레르기성 질환일 경우에 그러하다. 예를 들어, 알레르겐 특이 T 세포는 이미 출생시에 존재하고 있으며, 음식 알레르겐에 대한 조기 감작은 추후의 호흡성 알레르기 발생에 대한 예측 인자로서 확인된다 (문헌 [IHi, et al., The Natural Course of Atopic Dermatitis from Birth to Age 7 Years and the Association with Asthma, Clin. Exp. Allergy 27:28-35 (1997)]). 추가로, 폐 발생은 수정 후 매우 이른 시간에 시작되며, 출생 후 적어도 2 또는 3년간 계속된다. 따라서, 출생전 및 출생후, 둘 모두의 시간 동안 진행되는 기도 발생은 유아 및 아동에서의 호흡성 알레르기 발병기전에 있어 중요하다.

또한, 인간 태아는 임신 초기에 IgE를 생산하는 B 세포를 발생시키고, 다양한 출생전 감염에서 관찰되는, 잘 알려진 IgM 반응과 유사한 방식으로 적절한 항원 자극에 대한 반응에서 IgE 항체를 생산할 수 있는 것으로 밝혀진 바 있다 (문헌 [Weil, G., et al., Prenatal Allergic Sensitization to Helminth Antigens in Offspring of Parasite-Infected Mothers, J. Clin. Invest. 71:1124-1129 (1983)]). 이 또한 호흡성 알레르겐에 대한, 출생전 및 출생후, 둘 모두의 알레르기성 감작을 예방하는 것이 중요하다는 것을 설명한다.

호흡성 알레르기를 위한 전통적인 약물로는 항히스타민제, 국소 비내용 스테로이드제, 코막힘 완화제, 및 크로몰린액을 포함한다. 전통적인 약물에 대한 대안으로, 특정 유형의 알레르기를 치료할 수 있는 치료법으로서 프로바이오틱이 출현하였다. 살아있거나, 또는 생육가능한 프로바이오틱을 사용할 경우에 발생되는 상기 언급한 문제점들과 관련하여, 본 발명은 알레르기성 질환 및/또는 그의 증상을 예방, 감소, 호전 또는 치료하는 역할을 하는 제품에서 상기와 같은 프로바이오틱을 대체함에 있어 특히 유익하다. 이를 위해, 본 조성물은 실질적으로 본원에서 앞서 논의된 바와 같이, 바람직하게는 식이요법 또는 영양 제품을 통해, 더욱 바람직하게는, 출생전, 유아용 또는 아동용 조제유 또는 영양 조성물, 의료용 식품, 전문 의료용 식품 (즉, 한정된 의료 목적을 위해 표지된 식품), 가장 바람직하게는, 유아용 조제유, 임산부 또는 수유부용의 출생 전후 영양제를 통해 투여된다. 추가로, 본 발명은 또한 개선된 방식으로 프로바이오틱을 제공할 수 있다. 이를 위해, 본 발명에 따른 비-생육가능한 프로바이오틱 유래의 물질은 살아있는 프로바이오틱에 내재하는 상기와 같은 문제들은 일으키지 않으면서, 산업적 환경하에서 표준화된 재현가능한 방식으로 생산될 수 있다. 또한, 비-생육가능한 성질에 의해서, 특히 건식 분말로서 제공될 때에는 알레르기성 반응 또는 질환 예방 또는 치료용 영양 조성물에 적절히 혼입되고 제제화될 수 있다.

이하, 본 발명은 하기의 비제한적인 실시예와 첨부 도면을 참고로 하여 설명될 수 있다.

실시예 1

회분식 발효 공정에서, LGG를 생리학상 조건하에서 성장시켰다. 33% NaOH를 첨가하여 pH를 pH 6으로 일정하게 유지시키고, 온도는 37℃로 유지시켰다. 교반기 속도는 50 rpm이고, 헤드공간을 N₂로 플러싱하였다. 하기 배양 배지 (적합형 MRS 브로쓰)를 제공하였다 (표 1).

박테리아 성장은 도 1 (a) 및 (b)에 도시되어 있다.

도 1a에는 LGG 발효 동안의 pH, 적정된 NaOH (33%)의 양 (DM 염기 = 용량 모니터 염기) 및 OD600의 전개가 제시되어 있다. 도면에 기재된 기호 설명을 참조한다. pH 및 OD600 측정을 통해 발효기 내의 박테리아 성장을 측정할 수 있었다; 여기서, pH를 pH 6으로 일정하게 유지시키기 위해 NaOH를 첨가해야 하는 것은 락테이트 생산 (박테리아 대사 활성에 대한 척도)과 상관 관계가 있으며, OD600은 발효기 내의 박테리아 개수와 상관 관계가 있는 밀도 측정값이다.

도 1b에서, 수직축은 지수 눈금으로 표시된 배양 배지 중의 박테리아 계수를 나타낸다. 수평축은 시간을 나타낸다.

(도면에서 MJ1, MJ2, 및 MJ3으로 표시된) 3개의 시점에서 배양물 상등액 샘플을 채취하였다.

실시예 2

실시예 1과 유사하게, 변형된 배양 배지에 기초하여 LGG 배양을 수행하였다. 여기서, 트윈은 존재하지 않으며, 하기와 같이 오일을 첨가하였다:

(a) 1 g/kg, 2 g/kg 및 4 g/kg 농도의 올레산.

(b) 1 g/kg, 2 g/kg 및 4 g/kg 농도의 아마인유.

(c) 1 g/kg, 2 g/kg 및 4 g/kg 농도의 올리브유.

(d) 1 g/kg, 2 g/kg 및 4 g/kg 농도의 평지씨유.

(e) 1 g/kg, 2 g/kg 및 4 g/kg 농도의 해바라기유.

이들 시험 (a)-(e) 모두에서 트윈 함유 배지에서의 성장에 필적할만한 성공적인 LGG 성장이 이루어졌음이 관찰되었다. 이외에도, LGG는 놀랍게도 트윈, 또는 오일들 중 어느 것의 첨가없이도 성공적으로 배양되었다.

실시예 3

본 실시예에서는 당업계에서 허가받은 시험관내 모델에서 RAW 264 세포 (마우스 대식세포 세포주)를 사용하여 실시예 1에서 수득된 상등액을 항알레르기성 및 항염증성 활성에 대해 스크리닝하였다. RAW 세포 배양물에서는 다른 상등액 샘플 수확물과 비교하여, LGG 배양물의 MJ2 상등액 샘플 수확물과 함께 인큐베이션시킨 동안, 조절 시토카인 IL-10의 생산을 크게 증가시킨 것으로 나타났다. 도 2 참조.

실시예 4

오브알부민 (OVA) 감작 모델에서 실시예 1에서 수득된 배양물 상등액 MJ2와 생육가능한 LGG 박테리아 사이의 비교를 실시하였다. 당업계에서 완전히 허용되는 상기 생체내 모델은 보통 청년기 또는 성체 마우스에 적용된다. 본 실시예에서는 어릴 때의 알레르기에 관한 연구가 허용될 수 있도록 하기 위해 통상의 모델을 적합화시켰다.

따라서, 신생 Balb/C 마우스에게 LGG 또는 전체 LGG 배양물 상등액을 위내 투여를 통해 6주 동안 이틀에 한번씩 투여하였다. 동물을 42 및 56일째에 2회에 걸쳐 오브알부민 (OVA)에 대해 감작시킨 후, 61, 62, 및 63일째에 OVA-에어로졸에 대해 후속 접종 및 노출을 실시하였다. 상기 시간 스케줄은 도 3에 제시되어 있다. 실험용 기관지 천식의 파라미터는 폐 기능 분석, 조직학적 성질, 및 기관지폐포 세척 (BAL)에 의해 평가하였다. 전신 알레르기성 반응은 항체 수준 및 시토카인 반응에 의해 평가하였다. 후자는 기관지폐포 세척 (BAL) 뿐만 아니라, 재-자극을 받은 배출 림프절 세포 배양물에서 측정되었다.

생육가능한 LGG 뿐만 아니라, LGG 상등액, 둘 모두에 노출시킨 결과, 기도 염증 및 배상 세포 과다형성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 폐 조직 절편을 조직학적으로 염색시킨 결과 (도 4 참조), OVA 알레르기성 동물에서는 염증 세포 침윤 및 배상 세포 과다형성이 증가한 반면, LGG 또는 LGG 상등액으로 처리된 동물에서는 거의 정상적인 폐 구조 및 조직학적 성질이 나타났다. 도 4에서, "음성 대조군"은 접종되지도 않고, LGG 또는 LGG 상등액을 받지도 않은 것을 의미하고; "양성 대조군"은 OVA로 접종은 되었지만, LGG 또는 LGG 상등액을 받지 않은 것을 의미하고; "생육가능한 LGG"는 접종도 되고, 생육가능한 LGG도 받은 것을 의미하고; "LGG 상등액"은 접종도 되고, 본 발명의 LGG 상등액으로 처리된 것을 의미한다.

추가로, 침윤성 염증 세포 (호산구)의 존재에 대해 측정하였다. 도 5는 OVA 알레르기성 동물의 폐 중 증가된 호산구 침윤이 생육가능한 LGG 또는 LGG 상등액 처리를 통해 크게 감소하였음을 나타내고 있다. 도 5에서, 수직축은 알레르기성 세포의 증가율(%)을 나타낸다. 수평축에서는 하기 샘플을 나타낸다: "음성 대조군"은 접종되지도 않고, 어떤 처리도 되지 않은 것이고; "양성 대조군"은 OVA로 접종은 되었지만, 어떤 처리도 되지 않은 것이고; "LGG 전체"는 OVA로 접종된 후, 생육가능한 LGG로 처리된 것이고; "LGG 상등액"은 OVA로 접종된 후, 본 발명의 LGG 상등액으로 처리된 것이다.

실시예 5

본 실시예는 림프절로부터 단리된 세포의 시험관내 배양물에 대한 측정값 (상기 배양물을 공지의 측정 방식으로 수행하여 얻은 측정값)을 반영한다. OVA 알레르기성 마우스로부터의 재-자극을 받은 림프절 세포 배양물에서의 전형적인 Th2 시토카인 프로파일은 IL-5 반응 증가, 및 낮은 IL-10 및 IFN-γ 반응을 보였다. 전체 (생육가능한) LGG 또는 본 발명의 LGG 상등액으로 처리된 경우, 상기 배양물 중에서 IL-5 반응은 감소하고, IFN-γ 및 IL-10 생산이 강력한 자극을 받은 것으로 밝혀진 바와 같이, 항알레르기성 효과가 나타났다. 이는 도 6에 도시되어 있다.

실시예 6

본 실시예는 Balb/C 마우스 중 오브알부민 (OVA) 알레르기 모델에서 본 발명의 LGG 배양물 상등액을 출생 전후기에 투여하는 것에 관하여 나타낸다. 임산부 및 수유부는 이틀에 한번씩 위내 투여를 통해 LGG 상등액을 투여받았다. 그들의 자손들은 감작되었고, OVA로 접종시켰다. 본 시험에 대한 개략도는 도 7에 도시되어 있다.

실험용 기관지 천식의 파라미터는 폐 기능 분석, 조직학적 성질, 및 기관지폐포 세척 (BAL)에 의해 평가하였다. 전신 알레르기성 반응은 항체 수준 및 시토카인 반응에 의해 평가하였다. 후자는 BAL 뿐만 아니라, 배출 림프절 배양물, 둘 모두에서 측정되었다. 도 8은 LGG 상등액으로 처리된 동물에서 염증 세포 (호산구, 대식세포)의 침윤이 감소하였다는 것을 밝힌 결과를 부가 설명이 따로 필요없는 다이어그램을 통해 제시하고 있다.

Claims (13)

1. 단백질성 혼합물을 포함하며, LGG 회분식 배양 공정 중 후기 대수기에서 배양물 상등액으로부터 수득할 수 있는, 알레르기성 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 조성물.
2. 제1항에 있어서, (a) 회분식 공정을 사용하여 LGG를 적합한 배양 배지 중에서 배양하는 단계; (b) 배양 단계 중 후기 대수기에서 배양물 상등액을 수확하는 단계 (여기서, 상기 후기 대수기란 LGG 회분식 배양 공정 중 유도기와 정지기 사이 시간 중 후반기 시간에 관한 것으로 정의된다); (c) 임의로, 분자량이 6 kDa 초과인 성분을 보유하도록 상등액으로부터 저분자량의 성분을 제거하는 단계; (d) 조성물을 수득하기 위해 배양물 상등액으로부터 액체 내용물을 제거하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득할 수 있는, 알레르기성 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 후기 대수기가 LGG 회분식 배양 공정 중 유도기와 정지기 사이 시간 중 후반 ¼ 부분에 관한 것, 바람직하게는, 대수기 중 0.75-0.85 경과 시점으로 정의되는 것인 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, LGG 회분식 배양이, 트윈 80을 포함하지 않으며, 임의로 올레산, 아마인유, 올리브유, 평지씨유, 해바라기유, 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 오일 성분을 함유하는 배지 중에서 수행된 것인 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, LGG 회분식 배양이 중성 pH, 바람직하게는 pH 6에서, 생리학적 온도, 바람직하게는 37℃에서 수행된 것인 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 건조된 형태, 바람직하게는, 분무 건조 또는 냉동 건조된 형태의 조성물.
7. 제6항에 있어서, 제약상 허용되는 담체 물질, 예를 들어, 말토덱스트린 DE29가 상등액에 첨가된 후, 분무 건조된 것인 조성물.
8. 지질, 탄수화물, 단백질, 비타민 및 미네랄의 존재와 관련하여 영양학상 완전한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 추가로 포함하는 유아용 또는 아동용 조제유.
9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 식이요법 제품, 바람직하게는, 영양 제품, 또는 상기 제품, 바람직하게는, 영양 제품용 첨가제 형태인 조성물.
10. 제9항에 있어서, 식이요법 제품이 추가로 하나 이상의 다중불포화 지방산 (PUFA), 바람직하게는, 장쇄 다중불포화 지방산 (LC-PUFA), 예를 들어, 아라키돈산 (ARA) 또는 도코사헥사엔산 (DHA)을 포함하는 것인 조성물.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 식이요법 제품이 추가로 보통 인간 모유에 존재하는 하나 이상의 생체활성 성분, 예를 들어, 단백질 또는 폴리사카라이드를 포함하는 것인 조성물.
12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 식이요법 제품이 추가로 하나 이상의 프리바이오틱, 바람직하게는, 난소화성 올리고사카라이드, 난소화성 폴리사카라이드, 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프리바이오틱을 포함하는 것인 조성물.
13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 식이요법 제품이 출생전, 유아용 또는 아동용 조제유 또는 영양 조성물 또는 보충제, 의료용 식품, 또는 전문 의료용 식품인 것인 조성물.

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