CN101875682B

CN101875682B - 人参皂苷元20(R)-甲氧基-达玛烷-3β,12β,25-三醇及其制备方法和医药用途

Info

Publication number: CN101875682B
Application number: CN201010107476.7A
Authority: CN
Inventors: 赵骏铭; 赵余庆; 关健
Original assignee: XINZHONG MODERN MEDICAL CO Ltd LIAONING CITY
Current assignee: XINZHONG MODERN MEDICAL CO Ltd LIAONING CITY
Priority date: 2010-02-09
Filing date: 2010-02-09
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2030-02-09
Also published as: CN101875682A

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一个新的人参皂苷元及其制备方法和医药用途，具体涉及其在制备抗肿瘤药物中的用途。该化合物的名称为20(R)-甲氧基-达玛烷-3β，12β，25-三醇[20(R)-methoxyl-dammarane-3β，12β，25-triol(简称20RMDT)]。20RMDT经研究证明具有显著的抗肿瘤作用。在MCF-7，HepG2，Du145，Colon205，A549，HL-60六种细胞系中测定了20RMDT的细胞毒性。结果表明，20RMDT对6种细胞有很强的抑制人肿瘤细胞生长的作用。20RMDT的IC50s低于20(R)-25-OH-PPD和原人参二醇PPD。其总有效剂量为1-100mg/kg/d。其可以和药学上可接受的一种或多种载体结合制成20RMDT的药物组合物或制剂，主要应用于恶性肿瘤的防治。

Description

人参皂苷元20(R)-甲氧基-达玛烷-3β,12β,25-三醇及其制备方法和医药用途

技术领域：

本发明属于医药技术领域，涉及一个新的人参皂苷元及其制备方法和医药用途，具体涉及其在制备抗肿瘤药物中的用途

背景技术：

人参皂苷是人参的主要活性成份，近来的研究表明，人参皂苷经体内或体外代谢产生的次级皂苷表现出很好的肿瘤细胞毒活性，如人参皂苷Rg₃、Rh₂、人参皂苷CK等，它们能诱导肿瘤细胞分化，抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞调亡等，在肿瘤治疗和预防方面具有很高的药用价值。其中已经上市的抗肿瘤药物有参一胶囊(人参皂苷-Rg₃)，正在用于临床实验研究的抗肿瘤药物有人参皂苷-Rh₂和人参皂苷-C-K。

为了在人参皂苷系列物中寻找高效低毒的新型抗肿瘤药物，由天然皂苷转化而来的次级皂苷、苷元或二者的衍生物成为研究的重点。研究结果也表明次级皂苷、苷元或二者的衍生物是天然人参皂苷发挥其药效的原型。

人参皂苷元20(R)-甲氧基-达玛烷-3β，12β，25-三醇[20(R)-methoxyl-dammarane-3β，12β，25-triol(简称20RMDT)]是PPD的衍生物，具有较好的抗肿瘤作用，如上化合物及其制备方法和它们的新型抗肿瘤制剂在现有技术中并未见有报道，因此具有较好的开发前景。

发明内容：

本发明所解决的技术问题是提供一个新的人参皂苷元及其制备方法和医药用途，具体涉及其在制备抗肿瘤药物中的用途。

本发明所述的化合物为20(R)-甲氧基-达玛烷-3β，12β，25-三醇[20(R)-methoxyl-dammarane-3β，12β，25-triol(简称20RMDT)]。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明所述的化合物的结构如下：

本发明所述化合物可以通过如下方法制备：

A、硅胶层析法：用低级醇提取、大孔吸附树脂纯化后的人参总皂苷，经有机溶剂萃取、硅胶柱层析及反相硅胶柱层析分离后得到；

B、酸水解法：人参总皂苷溶解于低级醇中在超声条件下进行酸水解，然后将溶液处理至中性，有机溶剂萃取及硅胶柱层析分离得到；

C、碱水解法：人参总皂苷溶解于低级醇溶液中，用碱金属氢氧化物作为水解试剂进行碱水解，经过酸中和、有机溶剂萃取及硅胶柱层析分离后得到；

D、化学合成方法

E、采用核磁共振光谱法对所得20RMDT进行结构鉴定。

所述的酸水解法包括：

酸水解法I：人参总皂苷溶解于低级醇中在超声条件下进行酸水解，然后经过碱金属氢氧化物中和，有机溶剂萃取及硅胶柱层析分离后得到；

酸水解法II：人参总皂苷溶解于低级醇中在超声条件下进行酸水解，然后加水沉淀，水洗至中性的沉淀经硅胶柱层析分离后得到；

所述的人参总皂苷，是指来自五加科人参属具有达玛烷四环三萜结构骨架的所有植物的根、茎、叶、花(蕾)、果实(浆)、种子中及绞股蓝中含有的皂苷类化合物。

所说的低级醇为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇；有机溶剂为石油醚、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、氯仿、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇之一种或其中2-3种任意比例的混合物；所说的碱金属氢氧化物包括钠、钾和钙的氢氧化物，碱金属氢氧化物的浓度为0.02-9％W/V。

人参总皂苷的水解在酸性水溶液和有机溶剂中在超声条件下进行；其中人参总皂苷的用量10-800g/L；低级醇为甲醇，浓度为1-95％V/V；

酸为盐酸、硫酸、高氯酸、磷酸、草酸、冰乙酸、甲酸，浓度为0.2-9mol/L和它们的饱和酸；

超声条件：频率：20-70kHz；功率：2.4-6KW；时间：1-120分钟；水温：15-100℃；

水解后的反应液用氢氧化钠或氢氧化钾中和，使用浓度为0.2-9mol/L；

萃取用的有机溶剂为石油醚、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、氯仿、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇；

柱层析用硅胶粒度为100-400目；

水解温度为：4-100℃，时间1min-5d。

所述的化学合成方法包括：

化学合成方法I：20RMDT是采用20(R)-达玛烷-3β，12β，20，25-四醇(简称20(R)-25-OH-PPD)在碱催化下与碘甲烷/无水四氢呋喃溶剂中进行甲基化反应而得；

(a)将1-100份20(R)-25-OH-PPD、1-1200份卤代烃、1-1200份碱性催化剂，溶于无水有机溶剂中，20-100℃搅拌回流下反应1-24h后，将生成的沉淀趁热过滤收集滤液；滤液减压蒸干的粗品；

选取的卤代烃试剂为CH₃X，其中X＝F、Cl、Br、I；

选取的无水有机溶剂是THF或DMF；

选取的碱性催化剂为Ag₂O、NaH、NaOH、NaH；

(b)将步骤a制得的粗品经硅胶柱色谱，用石油醚∶丙酮或石油醚∶乙酸乙酯系统从10∶1依次到1∶1梯度洗脱，得到所述结构的20位氧烃基取代物；

其合成路线为：

a：无水有机溶剂；碱性催化剂

b：CH₃X X：卤素

R：CH₃

化学合成方法II：20RMDT是采用20(R)-25-OH-PPD在碱催化下与硫酸二甲酯/无水丙酮溶剂中反应而得；

(a)将1-100份20(R)-25-OH-PPD、1-1200份硫酸二甲酯、1-1200份碱性催化剂，溶于无水有机溶剂中，20-100℃搅拌回流下反应1-24h后，将生成的沉淀趁热过滤收集滤液；滤液减压蒸干的粗品；

选取的碱性催化剂为Ag₂O、NaH、NaOH、NaH；

选取的无水有机溶剂是THF、DMF或丙酮；

其合成路线为：

a：无水有机溶剂；碱性催化剂

b：硫酸二甲酯

化学合成方法III：20RMDT是采用20(R)-25-OH-PPD在碱催化和相转移催化剂下与碳酸二甲酯/无水四氢呋喃溶剂中反应而得；

(a)将1-100份20(R)-25-OH-PPD、1-1200份DMC或DEC、1-1200碱性催化剂、1-1200份相转移催化剂溶于DMF或THF中，70-150℃搅拌回流下反应3-12h；

选取的碱性催化剂为K₂CO₃、KOH、KHCO₃、CsCO₃；

选取的相转移催化剂为(Et)₄NBr、(Bu)₄NBr、(Octyl)₄NBr、(Bu)₄NOH、Ph₃(CH₂CH₂OH)PCl、CHBG-HCl^c、(Bu)₄PCl；

(b)将步骤a制得的反应液用盐酸水溶液(Ph＝1)和MTBE或乙酸乙酯液液萃取，有机相得到烷基取代粗品化合物；

(c)步骤b得到的粗品经硅胶柱色谱，用石油醚∶丙酮或石油醚∶乙酸乙酯系统从10∶1依次到1∶1梯度洗脱，得到所述结构的20位氧烃基取代物；

其合成路线为：

a：无水有机溶剂；碱性催化剂；相转移催化剂

b：DEC或DMC

R：CH₃

本发明所提供的新型抗肿瘤制剂中，以20RMDT为有效成分，其总有效剂量为1-100mg/kg/d。

本发明所提供的新型抗肿瘤制剂中，20RMDT可与任何法定药用配合剂和赋形剂制成各种药用剂型的制剂。

本发明所提供的新型抗肿瘤制剂中，20RMDT可与目前市场上的任何化疗药、生物制剂，包括激素类、烷化剂类、铂类、抗代谢类、拓扑异构酶抑制剂类、抗微丝微管类、诱导分化类、抗肿瘤生长类、提高机体免疫类及其他药物，制备成复方制剂。

本发明所提供的新型抗肿瘤制剂中，制剂剂型为口服、注射或局部用药剂型。

本发明所提供的新型抗肿瘤制剂中，口服剂型包括片剂、粉剂、悬浊液、乳浊液、胶囊、颗粒剂、糖衣片、药丸、液体、糖浆和柠檬水剂等。

本发明所提供的新型抗肿瘤制剂中，注射剂型包括水剂、冻干粉针、静脉乳剂、多相质脂体制剂、静脉微乳剂、悬浊液等。

本发明所提供的新型抗肿瘤制剂中，局部用药剂型包括软膏、固体、悬浊液、水剂、粉剂、糊剂、栓剂、气溶胶、泥敷剂、涂抹剂、灌肠剂和乳剂等。

20RMDT具有显著的抗肿瘤作用，并可被制成用于不同癌症治疗的任何药用及保健品剂型，主要应用于恶性肿瘤的防治，具有广阔的应用前景。研究证明，20RMDT对体内外肿瘤细胞的抑制作用均优于PPD和人参皂苷-Rg₃。

附图说明：

图1 20(R)-甲氧基-达玛烷-3β，12β，25-三醇的氢谱图

图2 20(R)-甲氧基-达玛烷-3β，12β，25-三醇的碳谱图

图3 20(R)-甲氧基-达玛烷-3β，12β，25-三醇的红外光谱图

图4 20(r)-甲氧基-达玛烷-3β，12β，25-三醇的质谱图

具体实施方式：

以下通过实施例进一步描述本发明，但这些实施例仅是说明本发明，而不应理解为对本发明范围的任何限制。

(1)20RMDT制备实施方式：

实施例1：氢氧化钠水解法制备20RMDT

称取三七总皂苷10g，加入1000ml氢氧化钠(浓度为2.5mol/L)和甲醇后加热回流水解24h，用2.5mol/L盐酸中和反应液，减压回收甲醇，用乙酸乙酯萃取反应液，萃取液经水洗、无水硫酸钠干燥、蒸干后经硅胶柱层析分离，用正己烷∶乙酸乙酯(5∶1-1∶1)梯度洗脱得125个流分，流分25-45经TLC检查后合并，丙酮重结晶后得20RMDT。20R-甲氧基-达玛烷-3β，12β，25-三醇理化数据：白色结晶，[α]_D ²⁰+7.0(c 0.1，MeOH)；IR vmax3301，2961，1467，1385，1262，1168，1084，1037，802cm^-1；¹H NMR(pyridine-d₅，300MHz)数据：0.8(1H，m，5-CH)，0.89(3H，S，19-CH3)，0.87(3H，S，30-CH3)，1.00(3H，S，29-CH3)，1.04(3H，S，18-CH3)，1.16(3H，S，21-CH3)，1.23(3H，S，28-CH3)，1.41(6H，S，26-CH3，27-CH3)，1.48(2H，m，24-CH2)，1.50(2H，m，23-CH2)，1.51(1H，m，9-CH)，1.83(1H，m，13-CH)，2.35(1H，m，17-CH)，3.16(3H，S，20-OCH3)，3.43(1H，m，3-CH)，3.78(1H，m，12-CH).¹³C NMR(pyridine-d5，75MHz)数据：39.1(C-1)，28.2(C-2)，78.0(C-3)，40.1(C-4)，56.4(C-5)，18.8(C-6)，35.2(C-7)，V39.6(C-8)，49.7(C-9)，37.4(C-10)，31.3(C-11)，69.5(C-12)，48.4(C-13)，51.8(C-14)，31.4(C-15)，26.3(C-16)，50.3(C-17)，16.4(C-18)，16.5(C-19)，80.3(C-20)，17.8(C-21)，36.6(C-22)，18.8(C-23)，45.0(C-24)，70.5(C-25)，30.2(C-26)，30.1(C-27)，28.7(C-28)，15.9(C-29)，17.4(C-30)，48.9(OCH3-20)；positive-mode ESIMS m/z 515[M+Na]⁺，493[M+H]⁺；HRESIMS m/z 515.4066[M+Na]⁺(calcd for C₃₁H₅₆O₄Na，515.4076).

实施例2：盐酸水解法制备得到20RMDT

称取三七叶总皂苷10g，加入1000ml盐酸(浓度为2.5mol/L)和甲醇后进行超声水解反应。超声条件：频率：50kHz；功率：3KW；时间：30 分钟；在温度40℃水解12h，用2.5mol/L氢氧化钠中和反应液，减压回收甲醇，用乙酸乙酯萃取反应液，萃取液经水洗、无水硫酸钠干燥、蒸干后经硅胶柱层析分离、氯仿∶丙酮(8∶1-1∶1)梯度洗脱得118个流分，流分22-36经乙酸乙酯重结晶后得20RMDT。

实施例3：硫酸水解法制备20RMDT

称取人参总皂苷10g，溶于1000ml硫酸浓度为3.0mol/L、浓度为80％的甲醇水溶液中超声，超声条件：频率：50kHz；功率：3KW；时间：60分钟；在温度40℃水解8h，然后加水沉淀，水洗至中性的沉淀经硅胶柱层析分离，氯仿∶甲醇(20∶1-5∶1)梯度洗脱得97个流分，流分15-30经乙酸乙酯重结晶后得20RMDT。

实施例4：化学合成方法I半合成制备20RMDT

0.60g20(R)-25-OH-PPD加入40ml THF溶解，搅拌下加入0.36g氢化钠(60％)。氢化钠全部溶解后加入1.03ml碘甲烷(达玛烷-3β，12β，20，25-四醇∶氢化钠∶碘甲烷＝1∶12∶12摩尔比)，加热至85～95℃，磁力搅拌，回流3小时。将生成的沉淀趁热过滤收集滤液，滤液减压蒸干得粗品。

粗品经硅胶柱色谱，用石油醚∶丙酮或石油醚∶乙酸乙酯系统梯度洗脱(从10∶1依次到1∶1洗脱)，得20RMDT(收率约38％)。

实施例5：化学合成方法I半合成制备20RMDT

0.60g20(R)-25-OH-PPD加入40ml THF溶解，搅拌下加入0.36g氢化钠(60％)。氢化钠全部溶解后加入1.03ml碘甲烷(达玛烷-3β，12β，20，25-四醇∶氢化钠∶碘甲烷＝1∶12∶12摩尔比)，加热至70℃，磁力搅拌，回流3小时。将生成的沉淀趁热过滤收集滤液，滤液减压蒸干得粗品。

粗品经硅胶柱色谱，用石油醚∶丙酮或石油醚∶乙酸乙酯系统梯度洗脱(从10∶1依次到1∶1洗脱)，得20RMDT(收率约25％)。

实施例6：化学合成方法I半合成制备20RMDT

0.60g20(R)-25-OH-PPD加入40ml THF溶解，搅拌下加入0.36g氢化钠(60％)。氢化钠全部溶解后加入0.51ml碘甲烷(达玛烷-3β，12β，20，25-四醇∶氢化钠∶碘甲烷＝1∶12∶6摩尔比)，加热至90℃，磁力搅拌，回流3小时。将生成的沉淀趁热过滤收集滤液，滤液减压蒸干得粗品。

粗品经硅胶柱色谱，用石油醚∶丙酮或石油醚∶乙酸乙酯系统梯度洗脱(从10∶1依次到1∶1洗脱)，得20RMDT(收率约26％)。

实施例7：化学合成方法II半合成制备20RMDT

0.60g20(R)-25-OH-PPD加入40ml THF溶解，搅拌下加入0.18g氢化钠(60％)。氢化钠全部溶解后加入0.72ml硫酸二甲酯(达玛烷-3β，12β，20，25-四醇∶氢化钠∶硫酸二甲酯＝1∶6∶6摩尔比)，加热至90℃，磁力搅拌，回流2.5-3小时。将生成的沉淀趁热过滤收集滤液，滤液减压蒸干得粗品。

粗品经硅胶柱色谱，用石油醚∶丙酮或石油醚∶乙酸乙酯系统梯度洗脱(从10∶1依次到1∶1洗脱)，得20RMDT(收率约22％)

实施例8：化学合成方法II半合成制备20RMDT

0.60g20(R)-25-OH-PPD加入40ml THF溶解，搅拌下加入0.36g氢化钠(60％)。氢化钠全部溶解后加入1.44ml硫酸二甲酯(达玛烷-3β，12β，20，25-四醇∶氢化钠∶硫酸二甲酯＝1∶12∶12摩尔比)，加热至90-100℃，磁力搅拌，回流3-4h。将生成的沉淀趁热过滤收集滤液，滤液减压蒸干得粗品。

粗品经硅胶柱色谱，用石油醚∶丙酮或石油醚∶乙酸乙酯系统梯度洗脱(从10∶1依次到1∶1洗脱)，得20RMDT(收率约26％)

实施例9：化学合成方法II半合成制备20RMDT

0.60g20(R)-25-OH-PPD加入40ml THF溶解，搅拌下加入0.36g氢化钠(60％)。氢化钠全部溶解后加入1.44ml硫酸二甲酯(达玛烷-3β，12β，20，25-四醇∶氢化钠∶硫酸二甲酯＝1∶12∶12摩尔比)，加热至80℃，磁力搅拌，回流3-4h。将生成的沉淀趁热过滤收集滤液，滤液减压蒸干得粗品。

粗品经硅胶柱色谱，用石油醚∶丙酮或石油醚∶乙酸乙酯系统梯度洗脱(从10∶1依次到1∶1洗脱)，得20RMDT(收率约23％)

实施例10：化学合成方法III半合成制备20RMDT

将20(R)-25-OH-PPD、DMC、碱性催化剂、份相转移催化剂按摩尔比1∶150∶3.75∶3投料，首先达玛烷-3β，12β，20，25-四醇溶于THF中，搅拌状态下加入K2CO3和(Et)4NBr，搅拌，再缓慢滴加DMC，93℃搅拌回流下反应5h。

反应完成后将上步骤制得的反应液用盐酸水溶液(Ph＝1)中和到中性，再用乙酸乙酯液液萃取，有机相得到烷基取代粗品化合物。

将上步骤得到的粗品经硅胶柱色谱，用石油醚∶丙酮或石油醚∶乙酸乙酯系统梯度洗脱(从10∶1依次到3∶1洗脱)，得到20RMDT。

实施例11：化学合成方法III半合成制备20RMDT

将20(R)-25-OH-PPD、DMC、碱性催化剂、份相转移催化剂按摩尔比1∶100∶3.75∶3投料，首先达玛烷-3β，12β，20，25-四醇溶于THF中，搅拌状态下加入K2CO3和(Et)4NBr，搅拌，再缓慢滴加DMC，98-100℃搅拌回流下反应5h。

实施例12：化学合成方法III半合成制备20RMDT

将20(R)-25-OH-PPD、DMC、碱性催化剂、份相转移催化剂按摩尔比1∶80∶5∶3投料，首先达玛烷-3β，12β，20，25-四醇溶于THF中，搅拌状态下加入K2CO3和(Et)4NBr，搅拌，再缓慢滴加DMC，93℃搅拌回流下反应9h。

(2)20RMDT以MCF，HepG2，Du 145，Colon205，A549和HL-60为靶点的细胞毒性试验。

以MCF，HepG2，Du145，Colon205，A549和HL-60作为细胞毒实验的靶点细胞。药物与细胞接触72h后，把10μL MTT(2.5mg/ml)溶液分别加到各细胞培养基中，在37℃，加湿室温，含5％CO2的条件下培养4h。在培养的最后出去培养媒介用100μL的DMSO(室温)代替。搅拌10分钟，在492nm测定吸光度生物作为一个Bio-Rad(model 550)计算50％抑制浓度(IC50)。

表 20RMDT的体外抗肿瘤活性

20RMDT，20(R)-PPD，20(R)-25-OH-PPD在6种细胞系(MCF-7，HepG2，Du145，Colon205，A549，HL-60)中测定了它们的细胞毒性。结果如上表所示，20RMDT对6种细胞有很强的细胞毒性。20RMDT的IC50s低于20(R)-25-OH-PPD(其IC50值比Rg₃低5-15倍)和原人参二醇PPD。

Claims

1.20(R)-甲氧基-达玛烷-3β,12β,25-三醇的制备方法，其特征在于，0.60g20(R) -25-OH-PPD加入40ml THF溶解，搅拌下加入0.36g60%的氢化钠，氢化钠全部溶解后加入1.03ml碘甲烷，达玛烷-3β,12β,20,25-四醇：氢化钠：碘甲烷=1：12：12 摩尔比，加热至85~95℃，磁力搅拌，回流3小时，将生成的沉淀趁热过滤收集滤液，滤液减压蒸干得粗品，粗品经硅胶柱色谱，用石油醚：丙酮或石油醚：乙酸乙酯系统梯度洗脱，从10：1依次到1：1洗脱，得20(R)-甲氧基-达玛烷-3β,12β,25-三醇，收率为38%。