CN101874798B - 白三烯a4水解酶与环氧合酶的双功能抑制剂及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及式(I)所示白三烯A4水解酶与环氧合酶的双功能抑制剂，含有该抑制剂的药学组合物，以及他们在制备用于治疗和预防受试者的由白三烯A4水解酶与环氧合酶介导的病况的药物中的用途，在制备用于治疗、预防或抑制受试者的炎症的药物中的用途，在制备用于抑制白三烯A4水解酶与环氧合酶酶活性的药物中的用途。其中，Ar代表：2-吡啶基、4-吡啶基、6-硝基-2-吡啶基、2-吡嗪基和相关六元含氮杂环，苯基、或者代表下式的基团(II)：
基团(II)中的P、Q分别位于苯环的2、3、4位的两个位置，可相同或不同，各自代表：氢、卤素、胺基、硝基、三氟甲基、甲磺酰基、单甲磺酰胺基、二甲磺酰胺基或者甲基磺酰胺基。
Description
技术领域：
本发明涉及一类白三烯A4水解酶与环氧合酶的双功能抑制剂。
背景技术：
炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应，常表现为肿胀、压痛、发红、酸痛等。当这种防御反应过度激活、失去控制之时，炎症因子就会攻击损伤人体自身组织，引发疾病，严重时可能危及生命。炎症的产生是一个多分子参与调控的复杂过程。因此，很多人认识到：在药物研发的前期应该考虑所选择的药物靶标在疾病整体网络中的作用，利用系统生物学的手段来进行药物研发。这个新的药物设计理念目前处于探索阶段。
发明人所在课题组从2004年开始探索如何针对复杂疾病的分子网络进行建模、动力学分析和给药方案预测。提出了针对疾病相关分子网络寻找最优控制方案的计算方法，和寻找分子网络由疾病状态向正常状态转变最优解决方案的计算方法MTOI。发明人利用MTOI研究了与人类炎症相关的花生四烯酸(AA)代谢网络，指出在该网络由疾病状态向正常状态转变中，有必要进行多个靶点的同时控制，而且作用的靶点数目越多，需要的给药量就越少，这类同时控制多个靶点的一种抑制剂，叫做多功能抑制剂。
花生四烯酸代谢网络是产生炎症因子的网络，该代谢网络中的磷脂酶A2(PLA2)、环氧合酶(COX)、5-脂氧酶(5-LOX)、白三烯A4水解酶(LTA4H)等，分别是抗炎药物设计的重点靶标，基于这些靶标设计得到的高选择性单靶标抑制剂已被广泛应用，其中一部分在临床中发挥出显著疗效。在AA代谢网络中，磷脂被PLA2水解释放出花生四烯酸，随后通过两条代谢路径：(一)通过COX的作用生成各种前列腺素(PGs)；(二)通过LOX的作用生成白三烯(LTs)、脂质过氧化物。研究表明，这两条通路间存在着相互影响，单一抑制一条通路将导致炎症因子通过另一条通路表达。设计同时作用于该网络中的两条通路中的多功能抑制剂可有以下优点：
一、同时抑制两条代谢途径产生的炎症因子白三烯和前列腺素，增加抗炎效果，避免了因一条代谢途径的抑制导致另一条代谢途径的激活的情况。
二、多功能抑制剂对单一酶的抑制效果较单功能抑制剂小，所引起的副作用也较小(例如双功能抑制剂达布菲隆，抑制效果与已上市药物吲哚美辛相当，已被证明不具有肠胃毒性)。
发明人还建议了系列调控该网络的方案，同时抑制LTA4H与COX是其中一种有效方法。迄今尚未有LTA4H/COX双功能抑制剂见诸于报道。
发明内容：
本发明的目的是提供白三烯A4水解酶与环氧合酶的双功能抑制剂，包括抑制剂的制备方法。
本发明的技术方案如下：
其中P、Q分别位于苯环的2、3、4位的两个位置，可相同或不同，各自代表：氢、卤素、胺基、硝基、三氟甲基、甲磺酰基、单甲磺酰胺基、二甲磺酰胺基或者甲基磺酰胺基。
或：
或：
制备方法：
通过常规有机合成得到了一系列苯氧基芳烃化合物作为白三烯A4水解酶与环氧合酶的双功能抑制剂，包括通式(I)所示的化合物：
其制备方法包括以下合成路线：
式中的Ar代表：2-吡啶基、4-吡啶基、6-硝基-2-吡啶基、2-吡嗪基、苯基、或者代表下式的基团(II)：
基团(II)中的P、Q分别位于苯环的2、3、4位的两个位置，可相同或不同，各自代表：氢、卤素、胺基、硝基、三氟甲基、甲磺酰基、单甲磺酰胺基、二甲磺酰胺基或者甲基磺酰胺基。
合成工作从对甲氧基苯酚或对苯二酚开始，分别与卤代芳烃等反应得到对羟基苯氧基取代芳烃PO2，不同的PO2与1-(2-氯乙基)-四氢吡咯盐酸盐在碱性条件下进行反应得到部分目标产物PKUMDL_AAD，还原含硝基的PKUMDL_AAD化合物的硝基可到含胺基的PKUMDL_AAD，再对含胺基的PKUMDL_AAD进行磺酰胺化，又得到含磺酰胺基PKUMDL_AAD化合物。
此合成路线所用的化学物质皆为市售的产品，进行反应时，所采用的操作方法和操作步骤以及反应条件和中间体等，都是依据本技术领域的普通技术人员熟知的有机合成方法设计，实施的，并公开于各实施例中。
本发明的合成方法具有以下突出特点：
1.原料易得，价格低廉。
2.实验简单，后处理相对容易。
3.实验周期短，易于放大量合成。
本发明合成了一类含苯氧乙基四氢吡咯的新型化合物。以该类化合物作为白三烯A4水解酶与环氧合酶的双功能抑制剂，其酶活测试和全血测试结果表明，一些新型化合物可同时抑制白三烯A4水解酶与环氧合酶。
酶活测试和全血测试结果还表明，本发明合成的含苯氧乙基四氢吡咯的大多数新型化合物对白三烯A4水解酶具有良好的抑制剂功能。因此，本发明的另一个目的是提供白三烯A4水解酶抑制剂，包括抑制剂的制备方法。
本发明化合物的可药用盐是指对于本领域技术人员而言显而易见的本发明化合物的盐，为无毒的并可有利地实现本发明化合物的药代动力学性质的盐，即提供有利的吸收，分布，代谢和排泄等药代动力学性质的那些化合物。同时考虑原料成本，吸湿性，稳定性，易结晶性，收率，散装药物流动性等实际因素。制备可药用盐时使用的酸或碱可使用常用的有机酸或无机酸和常用碱。
本发明的化合物可用于制备用于治疗和预防受试者的由白三烯A4水解酶与环氧合酶介导的病况的药学组合物中的用途。更特别地用于制备用于治疗、预防或抑制受试者的炎症的药学组合物中的用途，例如可用于治疗关节炎，类风湿性关节炎等的药学组合物中。本发明的化合物还可用于制备用于抑制白三烯A4水解酶与环氧合酶酶活性的药学组合物中的用途。所述药学组合物包括分散在可药用载体中的至少一种本发明化合物。本发明化合物在药学组合物中的量足以抑制白三烯A4水解酶与环氧合酶的活性。
本发明的合成方法制得的白三烯A4水解酶与环氧合酶的双功能抑制剂可以单独使用或者加入常规药用赋形剂制成片剂、栓剂、胶囊或注射液等使用。固体赋形剂的例子包括各种常用于丸剂和片剂的材料，如乳糖、淀粉、甲基纤维素等。液体口服赋形剂的例子包括乙醇、甘油、水等。
本发明的“治疗有效量”是指受试者对活性化合物或药物显示生物学应答或医学应答(包括被治疗的疾病或疾病症状的缓解)的量。本发明的“治疗有效量”可通过常规方法确定。对于特定患者所用的剂量根据病症严重程度，给药途径和患者体重等不同因素而不同。
具体实施方式：
以下实施例用于说明本发明，表示实践本发明的方法，其对本发明的范围无任何限制。本领域技术人员可能找到对于他们而言显而易见的实现本发明的其他方法，然而认为那些方法被包括在本发明的范围之内。
一般实验方法：
在核磁共振波谱仪Varian Mercury 400M(DMSO溶剂，TMS参比)上得到1H NMR光谱，数据列入表1.1。
表1.1目标化合物的核磁表征
在自动元素分析仪Elementar Vario EL上进行了元素分析，结果列入表1.2。
表1.2目标化合物的元素分析结果
在VG-ZAB-HS上得到质谱含磺酰基团目标化合物的质谱，结果列入表1.3。
表1.3代表化合物的高分辨质谱分析
| 编号 | 分子式 | 计算值([M+H]+) | 实验值([M+H]+) |
| PKUMDL_AAD_7 | C19H23NO4S | 362.1420 | 362.1415 |
| PKUMDL_AAD_8 | C19H23NO4S | 362.1420 | 362.1415 |
| PKUMDL_AAD_9 | C19H23NO4S | 362.1420 | 362.1418 |
| PKUMDL_AAD_22 | C20H26N2O6S2 | 455.1305 | 455.1304 |
| PKUMDL_AAD_23 | C20H26N2O6S2 | 455.1305 | 455.1306 |
| PKUMDL_AAD_24 | C19H24N2O4S | 377.1529 | 377.1528 |
| PKUMDL_AAD_25 | C20H26N2O4S | 391.1686 | 391.1685 |
实施例1 1-(2-(4-(2-硝基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯(PKUMDL_AAD_1)的合成
(1)1-(4-甲氧基苯氧基)-2-硝基苯(PO 1a)的合成
2.0g 4-甲氧基苯酚(16mmol)与1.0g(18mmol)无水氢氧化钾混合加热到150℃，搅拌10min。混合物熔化后，加入2.0g(13mmol)1-氯-2-硝基苯，升温到170℃继续搅拌2h(TLC监测)。反应物趁热倾入50ml 3％的氢氧化钾水溶液中，室温搅拌2h，冷却到4℃。过滤，水洗得到粗产品，用无水乙醇重结晶得到黄色晶体2.8g(90％)。1HNMR(DMSO)：7.93(1H，d)，7.44(1H，m)，7.26-6.90(6H，m)，3.82(3H，s)。
(2)4-(2-硝基苯氧基)苯酚(PO 2a)的合成
将0.5ml(6mmol)BBr3溶于20ml无水二氯甲烷中，冷却到0℃；将1.0g(4mmol)PO 1a溶于20ml无水二氯甲烷中，冷却到0℃，缓慢滴加冷却的BBr3的无水二氯甲烷溶液，滴加完毕后室温搅拌3h，倾入水中，用乙酸乙酯萃取，分液，有机层用饱和食盐水洗涤至中性，无水硫酸钠干燥，旋干后用闪柱纯化，得到黄色晶体0.87g(92％)。1HNMR(DMSO)：9.50(1H，s)，8.00(1H，d)，7.60(1H，m)，7.24(1H，m)，6.97-6.80(5H，m)。
(3)目标化合物PKUMDL_AAD_1的合成
将0.2g(0.87 mmol)PO 2a和0.32g(5.7mmol)无水氢氧化钾加入4ml DMF中，于80-90℃搅拌10min后，加入0.36g(2.1mmol)1-(2-氯乙基)四氢吡咯盐酸盐，100℃搅拌0.5h(TLC监测)。冷却至室温，反应液倾入水中，以乙酸乙酯萃取2次。有机层合并后用1M氢氧化钾溶液洗涤2次，水洗至中性。分液，油层以无水硫酸钠干燥，旋干后用闪柱纯化，得到黄色油状产物0.19g(68％)。
目标化合物PKUMDL_AAD_2～PKUMDL_AAD_18、PKUMDL_AAD_25、Ref-1，均用上述同样方法合成得到。
实施例2 2-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙氧基)苯氧基)苯胺(PKUMDL_AAD_19)的合成
将0.17g(0.52mmol)PKUMDL_AAD_1溶于2ml异丙醇中，加入0.008g Pd/C，加热到70℃，缓慢加入0.1ml 85％水合肼，继续回流1h。冷却至室温，反应液用0.2μm滤头过滤，旋干得到白色固体产物0.15g(97％)。
同法制得：PKUMDL_AAD_20，PKUMDL_AAD_21。
实施例3 N-甲磺酰基-N-(2-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙氧基)苯氧基)苯基)甲磺酰胺(PKUMDL_AAD_22)的合成
将0.15g(0.50mmol)PKUMDL_AAD_19溶于2.5ml干燥二氯甲烷中，加入1.5ml三乙胺，冷却至0℃。将0.14g(1.2mmol)甲磺酰氯溶于1.5ml干燥二氯甲烷中，冷却至0℃，缓慢滴加入上述溶液中。加完后0℃搅拌10min，再于室温搅拌30min，倾入水中，用乙酸乙酯萃取2次。合并的有机层用饱和食盐水洗涤2次，分液，油层以无水硫酸钠干燥，旋干后用闪柱纯化，得到黄色固体产物0.12g(53％)。
同法制得：PKUMDL_AAD_23。
实施例4 N-(4-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙氧基)苯氧基)苯基)甲磺酰胺(PKUMDL_AAD_24)的合成
将0.23g(0.78mmol)PKUMDL_AAD_21加入4ml水中，缓慢加入0.12g(1.0mmol)甲磺酰氯，室温搅拌2h。反应液用乙酸乙酯萃取2次，合并的有机相用饱和食盐水洗涤2次，分液，油层以无水硫酸钠干燥，旋干后用闪柱纯化，得到黄色固体产物0.20g(70％)。
实施例5 1-(2-(4-(2-三氟甲基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯(PKUMDL_AAD_13)的另一种合成
(1)4-(2-三氟甲基苯氧基)苯酚(PO 2m)的合成
向25ml NMP中加入0.4g(2.2mmol)1-氯-2-三氟甲基苯、1.22g(11.0mmol)对苯二酚、1.9g(14.8mmol)无水碳酸钾，0.16g(1.1mmol)溴化亚铜和0.4g(1.2mmol)TDA，氮气保护下于140℃搅拌8h(TLC监测)。冷却至室温，反应液以乙酸乙酯稀释，用饱和碳酸氢钾溶液洗涤5次，水洗2次。分液，油层以无水硫酸钠干燥，旋干后用闪柱纯化，得到微黄色晶体0.37g(67％)。1HNMR(DMSO)：9.56(1H，s)，7.54(1H，t)，7.41(1H，d)，7.21-7.18(2H，m)，7.07-7.01(4H，m)。
(2)目标化合物PKUMDL_AAD_13的合成
采用PKUMDL_AAD_1的方法制备。
25个化合物和参照化合物的名称如下：
PKUMDL_AAD_1：1-(2-(4-(2-硝基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯
PKUMDL_AAD_2：1-(2-(4-(3-硝基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯
PKUMDL_AAD_3：1-(2-(4-(4-硝基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯
PKUMDL_AAD_4：1-(2-(4-(2，4-二硝基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯
PKUMDL_AAD_5：2-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙基)苯氧基)吡啶
PKUMDL_AAD_6：4-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙基)苯氧基)吡啶
PKUMDL_AAD_7：1-(2-(4-(2-甲磺基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯
PKUMDL_AAD_8：1-(2-(4-(3-甲磺基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯
PKUMDL_AAD_9：1-(2-(4-(4-甲磺基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯
PKUMDL_AAD_10：1-(2-(4-(2-硝基-4-甲磺基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯
PKUMDL_AAD_11：2-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙基)苯氧基)吡嗪
PKUMDL_AAD_12：3-硝基-2-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙基)苯氧基)吡啶
PKUMDL_AAD_13：1-(2-(4-(2-三氟甲基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯
PKUMDL_AAD_14：1-(2-(4-(3-三氟甲基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯
PKUMDL_AAD_15：1-(2-(4-(4-三氟甲基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯
PKUMDL_AAD_16：1-(2-(4-(4-氟苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯
PKUMDL_AAD_17：1-(2-(4-(4-氯苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯
PKUMDL_AAD_18：1-(2-(4-(4-溴苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯
PKUMDL_AAD_19：2-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙氧基)苯氧基)苯胺
PKUMDL_AAD_20：3-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙氧基)苯氧基)苯胺
PKUMDL_AAD_21：4-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙氧基)苯氧基)苯胺
PKUMDL_AAD_22：N-甲磺酰基-N-(2-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙氧基)苯氧基)苯基)甲磺酰胺
PKUMDL_AAD_23：N-甲磺酰基-N-(3-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙氧基)苯氧基)苯基)甲磺酰胺
PKUMDL_AAD_24：N-(4-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙氧基)苯氧基)苯基)甲磺酰胺
PKUMDL_AAD_25：N-甲基-N-(2-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙氧基)苯氧基)苯基)甲磺酰胺
Ref-1：1-(2-(4-(苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯
Ref-2：4-硝基-2-苯氧基甲烷磺酰苯胺(尼美舒利)
实施例6LTA4H纯酶抑制活性测定
(1)溶液配置
EIABuffer：每10ml 10×浓缩液(#4)用90ml Mili-Q级超纯水稀释。注意浓缩液中的晶体或沉淀物需完全溶解。
Wash Buffer：用超纯水以1∶400的比例稀释浓缩液(#5)，并加入Tween-20至浓度为0.5ml/L。Tween-20需用注射器移取。
LTB4AChE Tracer：每100dtn的固体粉末(#2)用6ml EIABuffer溶解。4℃保存(切勿冰冻)，四周内使用。(1dtn是一个样品孔进行实验所需的试剂量，下同。)
LTB4Antiserum：每100dtn的固体粉末(#1)用6ml EIABuffer溶解。4℃保存，至少可稳定四周。
Ellman’s Reagent：每100dtn的固体粉末(#8)用20ml超纯水溶解。现用现配，避光保存，当天用完。20ml Ellman’s Reagent可够100孔进行实验。
(2)样品制备
底物：将购买的LTA4甲酯(leukotriene A4 methyl ester，5S-trans-5，6-oxido-7E，9E，11Z，14Z-eicosatetraenoic acid，methyl ester)在碱性条件下水解得到的LTA4碱性溶液，可直接稀释在水溶液中使用。
反应缓冲液：10mM NaH2PO4/Na2HPO4，pH 7.4，2～5mg/ml BSA。加入适量反应缓冲液，保证总反应体系为200μl。
待测化合物：溶于DMSO，一般加入10μl小分子溶液，DMSO终浓度为5％(v/v)，最高可加入达10％的DMSO。
酶：每1OD280的LTA4H稀释50倍，体系中加入20μl，反应体系中酶的终浓度约为19nM。
制备待测样品时，先将待测化合物、酶于反应缓冲液中在37℃预孵育10min，再加入底物反应10min。然后取10μl反应液用EIABuffer稀释100倍终止反应。
(3)标准样配置
取100μl LTB4Standard(#3)到一个干净的1.5ml管子，用900μl超纯水稀释，振荡至完全混匀，此时溶液中LTB4浓度为5ng/ml。然后按一定顺序稀释至EIABuffer中。
(4)实验步骤
实验时用96孔板。准备好所有的样品和试剂后，具体的实验流程如下。
在NSB孔中依次加入100μl EIABuffer和50μl LTB4Tracer；在B0孔中依次加入50μl EIABuffer、50μl LTB4Tracer和50μl LTB4Antiserum；在样品/标准样孔中依次加入50μl样品/标准样、50μl LTB4Tracer和50μl LTB4 Antiserum。然后盖上塑料封条，于4℃孵育过夜。取出孵育好的板，用Wash Buffer洗板5次后，于TA孔加入5μl LTB4 Tracer，再向所有孔中加入200μl Ellman’s Reagent，盖上塑料封条，温和振荡下室温孵育30～120min，在412nm波长下，用紫外可见酶标仪读取吸光度。
(5)数据处理
用％B/B0对LTB4的浓度作图，可得到标准曲线，在一定范围内，％B/B0和LTB4浓度的对数成线性关系。
实施例7COX纯酶抑制活性测定
(1)试剂配制
Buffer：每10ml 10×浓缩液用90ml Mili-Q级超纯水稀释。注意浓缩液中的晶体或沉淀物需完全溶解。4℃存放可稳定保存2个月。
Heme：Heme原液是溶于DMSO中的。每88μl Heme原液以1.912ml Buffer稀释。稀释液室温可稳定12h。
COX(1/2)：用Buffer稀释。稀释液于冰上可稳定1h。
待测化合物：溶于DMSO，一股加入10μl小分子溶液，DMSO终浓度为5％(v/v)，最高可加入达10％的DMSO。
Genapol X-100：以Buffer稀释，配成浓度为44mM溶液。
TMPD：取TMPD固体，以1MHCl配成1M的水溶液，避光保存。
AA底物：每100μl AA原液与100μl 0.1M的KOH溶液混合均匀，再以1.8ml Mili-Q级超纯水稀释，最后浓度为1.1mM。
(2)实验步骤
在140μl Buffer中依次加入10μl Heme、10μl COX、10μl抑制剂、10μlGenapol，孵育15min，加入20μl TMPD，之后加入20μl底物启动反应，在紫外酶标仪(Molecular Device公司SpectraMAX190型)上测定610nm处吸光值的动力学数据，取前36s的斜率作为反应速率进行拟合。
(3)数据处理
化合物抑制率计算公式：抑制率＝(V0-V)/V0×100％
其中V为该浓度下的水解速率，V0为不含抑制剂时的水解速率。
数据处理采用GrapPad5.0，对所得到的数据进行四参数拟合，采取以下公式：
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))
其中Y表示抑制率，X表示抑制剂浓度的对数，Bottom表示抑制剂下限与零抑制率的差值，Top表示抑制剂上限与100％抑制率的差值，HillSlope表示斜率。
表2化合物对于LTA4H、COX-1与COX-2纯酶的活性测定结果
实施例8人全血测试
(1)试剂配制
Heparin：Heparin为抗凝剂，购自百灵威公司，货号542858。根据需处理的血液量，事先将适量Heparin加入灭菌的PP管中，涂抹均匀，其在血液中的终浓度为10-20U.I/ml。
LPS：LPS购自Sigma-Aldrich公司，货号L4524。溶于PBS溶液中，配置成浓度为5mg/ml溶液，4℃保存。
A23187：A23187购自Sigma-Aldrich公司，货号L7522。溶于DMSO中，配置成浓度为12.5μM溶液，4℃保存。
抑制剂：溶于DMSO中。
其它溶液的配置以及PGE2、LTB4标准样配置同纯酶。
(2)实验步骤
实验步骤包括全血处理操作步骤和PGE2/LTB4测定步骤。
收集一星期内未服用NSAIDs的健康人的全血，以heparin抗凝，快速分装到1.5ml的pp管中，每管500μl，pp管中事先加好2μl抑制剂的DMSO溶液或者2μl DMSO作为V0，于37℃适度震荡孵育15min，再加入10μl LPS(或者PBS作为空白)，37℃继续孵育23h诱导COX-2的产生。然后再向血液中加入2μl A23187(或者DMSO作为空白)，于37℃适度震荡孵育15min，放到冰上停止反应，4℃离心(3200g)15min收集上层血浆，每管约能得到血浆200-250μl，进行下一步PGE2和LTB4含量的测定。如果不立刻使用血浆，应于-80℃保存。
EIA法测定PGE2和LTB4含量以及实验数据的处理同纯酶。
表3目标化合物全血活性测试结果
本发明涵盖25个未见报道的新化合物的合成与结构表征，这些化合物的体外酶活测试发现三个化合物可以同时抑制LTA4H和COX(PKUMDL_AAD_1COX-1IC50＝61.0μM，COX-2IC50＝7.7μM，LTA4H IC50＝0.68μM；PKUMDL_AAD_3COX-1IC50＝20.4μM，COX-2IC50＝35.3μM，LTA4H IC50＝0.37μM；PKUMDL_AAD_21COX-1IC50＝1.9μM，COX-2IC50＝36.3μM，LTA4H IC50＝0.32μM)；人全血实验中有五个化合物对于LTA4H和COX的抑制IC50达到微摩尔或亚微摩尔数量级(PKUMDL_AAD_1 COX-2IC50＝8.4μM，LTA4H IC50＝6.9μM；PKUMDL_AAD_2COX-2IC50＝13μM，LTA4H IC50＝1.4μM；PKUMDL_AAD_13COX-2IC50＝5.0μM，LTA4H IC50＝0.73μM；PKUMDL_AAD_17COX-2IC50＝22μM，LTA4H IC50＝0.73μM；PKUMDL_AAD_18COX-2IC50＝5.1μM，LTA4H IC50＝0.29μM)，其中PKUMDL_AAD_1在体外酶活测试和人全血实验中均表现出较强的抑制活性，而且符合COX-2/COX-1低毒副作用的活性比例要求，是潜在的LTA4H/COX双功能抑制剂。
由上述化合物的体外酶活测试发现17个化合物可以抑制LTA4H的活性(PKUMDL_AAD_1LTA4H IC50＝0.68μM；PKUMDL_AAD_2LTA4H IC50＝0.47μM；PKUMDL_AAD_3LTA4H IC50＝0.37μM；PKUMDL_AAD_5LTA4H IC50＝0.77μM；PKUMDL_AAD_6LTA4H IC50＝0.58μM；PKUMDL_AAD_11LTA4H IC50＝4.3μM；PKUMDL_AAD_12LTA4H IC50＝2.5μM； PKUMDL_AAD_13LTA4H IC50＝0.22μM；PKUMDL_AAD_14LTA4H IC50＝0.54μM；PKUMDL_AAD_15LTA4H IC50＝0.39μM；PKUMDL_AAD_16LTA4H IC50＝0.08μM；PKUMDL_AAD_17LTA4H IC50＝0.04μM；PKUMDL_AAD_18LTA4H IC50＝0.11μM；PKUMDL_AAD_19LTA4H IC50＝0.63μM；PKUMDL_AAD_20LTA4H IC50＝0.69μM；PKUMDL_AAD_21LTA4H IC50＝0.32μM；PKUMDL_AAD_24LTA4H IC50＝3.4μM)；人全血实验中有15个化合物对于LTA4H的抑制IC50达到微摩尔或亚微摩尔数量级(PKUMDL_AAD_1 LTA4H IC50＝6.9μM；PKUMDL_AAD_2LTA4H IC50＝1.4μM；PKUMDL_AAD_3 LTA4H IC50＝0.69μM；PKUMDL_AAD_5 LTA4H IC50＝0.18μM；PKUMDL_AAD_6 LTA4H IC50＝0.67μM；PKUMDL_AAD_12 LTA4H IC50＝34μM；PKUMDL_AAD_13 LTA4H IC50＝0.73μM；PKUMDL_AAD_15 LTA4H IC50＝2.0μM；PKUMDL_AAD_16LTA4H IC50＝0.99μM；PKUMDL_AAD_17LTA4H IC50＝0.73μM；PKUMDL_AAD_18LTA4H IC50＝0.29μM；PKUMDL_AAD_19LTA4H IC50＝0.11μM；PKUMDL_AAD_20LTA4H IC50＝0.97μM；PKUMDL_AAD_21LTA4H IC50＝0.029μM；PKUMDL_AAD_24LTA4H IC50＝2.1μM)。
Claims (6)
1.白三烯A4水解酶与环氧合酶的双功能抑制剂在制备用于治疗、预防或抑制受试者的炎症的药物中的用途，所述白三烯A4水解酶与环氧合酶的双功能抑制剂选自下式(I)所示的化合物：
或可药用盐，
其中
Ar代表：2-吡啶基、2-吡嗪基、苯基、或者代表下式的基团(II)：
基团(II)中的P、Q分别位于苯环的2、3、4位的两个位置，可相同或不同，各自代表：氢、氯、溴、胺基、硝基、三氟甲基。
2.权利要求1所述的用途，其中所述白三烯A4水解酶与环氧合酶的双功能抑制剂为以下中的一种：
1-(2-(4-(2-硝基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯；
1-(2-(4-(3-硝基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯；
1-(2-(4-(4-硝基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯；
2-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙基)苯氧基)吡嗪；
2-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙基)苯氧基)吡啶；
2-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙氧基)苯氧基)苯胺；
3-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙氧基)苯氧基)苯胺；
4-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙氧基)苯氧基)苯胺；
1-(2-(4-(4-氯苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯；
1-(2-(4-(4-溴苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯；
1-(2-(4-(4-三氟甲基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯；
1-(2-(4-(3-三氟甲基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯；
1-(2-(4-(2-三氟甲基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯。
3.下式(I)所示化合物，
或可药用盐，
其中
Ar代表：2-吡啶基、2-吡嗪基、苯基、或者代表下式的基团(II)：
基团(II)中的P、Q分别位于苯环的2、3、4位的两个位置，可相同或不同，各自代表：氢、氯、溴、胺基、硝基、三氟甲基。
4.权利要求3所述的化合物，其中式(I)所述化合物为以下中的一种：
1-(2-(4-(2-硝基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯；
1-(2-(4-(3-硝基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯；
1-(2-(4-(4-硝基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯；
2-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙基)苯氧基)吡嗪；
2-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙基)苯氧基)吡啶；
2-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙氧基)苯氧基)苯胺；
3-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙氧基)苯氧基)苯胺；
4-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙氧基)苯氧基)苯胺；
1-(2-(4-(4-氯苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯；
1-(2-(4-(4-溴苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯；
1-(2-(4-(4-三氟甲基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯；
1-(2-(4-(3-三氟甲基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯；
1-(2-(4-(2-三氟甲基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯。
5.包括治疗有效量的至少一种下式(I)所示化合物的药学组合物，
或可药用盐，
其中
Ar代表：2-吡啶基、2-吡嗪基、苯基、或者代表下式的基团(II)：
基团(II)中的P、Q分别位于苯环的2、3、4位的两个位置，可相同或不同，各自代表：氢、氯、溴、胺基、硝基、三氟甲基。
6.权利要求5所述的药学组合物，其中式(I)所述化合物为以下中的一种：
1-(2-(4-(2-硝基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯；
1-(2-(4-(3-硝基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯；
1-(2-(4-(4-硝基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯；
2-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙基)苯氧基)吡嗪；
2-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙基)苯氧基)吡啶；
2-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙氧基)苯氧基)苯胺；
3-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙氧基)苯氧基)苯胺；
4-(4-(2-(四氢吡咯-1-基)乙氧基)苯氧基)苯胺；
1-(2-(4-(4-氯苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯；
1-(2-(4-(4-溴苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯；
1-(2-(4-(4-三氟甲基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯；
1-(2-(4-(3-三氟甲基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯；
1-(2-(4-(2-三氟甲基苯氧基)苯氧基)乙基)-四氢吡咯。
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