CN101873853A - 在治疗淀粉样变性中的化合物及其用途 - Google Patents

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CN101873853A CN200880118475A CN200880118475A CN101873853A CN 101873853 A CN101873853 A CN 101873853A CN 200880118475 A CN200880118475 A CN 200880118475A CN 200880118475 A CN200880118475 A CN 200880118475A CN 101873853 A CN101873853 A CN 101873853A
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Abstract

用于稳定运甲状腺素蛋白四聚体形式的试剂，所述试剂包含通式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、酯或前体药物，其中：每个Y独立为直接键(direct bond)或-CH2-；每个X独立为-NH-、-O-、-S-、-CH2-、-NR-、-CO-、-CONH-、-CONR-、-C＝N-O-、-NHCO-、-NRCO-、-O-N＝C-、-SO-、-SO2-或直接键，其中R1、R2、R3和R4各自独立为F、Cl、Br、I、CF3、OCF3、R′、OR′、NR′R′、SOR′或SO2R′，其中R和R′各自独立为C1-C3烷基，所述烷基为任选被一个或多个卤原子取代的直链或支链或环状烷基；而m、n、p和q各自独立为0-4，其中m+n+p+q＞0；且其中连接基(linker)为7-13个碳原子的直链或支链，其中一个或多个碳原子任选被杂原子代替，其中所述链为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子、或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基。

Description

在治疗淀粉样变性中的化合物及其用途
本发明涉及用于稳定运甲状腺素蛋白四聚体形式的化合物、用于治疗或预防淀粉样变性的化合物、包含这种化合物的试剂和药物。
通过引用结合
本申请要求2007年9月25日提交的美国临时专利申请0718718.0的优先权。
以上引用的申请和本文中引用的各文献(“申请引用文献”)和各申请引用文献中引用或参考的各文献以及本文和结合到本文中的所有文献中提到的所有产品的厂商说明书或用法指南在此都通过引用结合于本文中；而且通过引用结合到本文中的文献中的技术可用于本发明的实施。
应注意本公开内容中术语如“包含”、“含有”等可具有其通常意义，例如它们可指“包含”、“包括”等。术语如“基本由....组成”具有其通常意义，例如它们允许包含不损害本发明新颖性或基本特征的其它成分或步骤；即它们不包含损害本发明新颖性或基本特征的其它未例举的成分或步骤，且它们不包含现有技术如本文中引用或通过引用结合于本文中的本领域文献的成分或步骤，特别是当该文献的目标是定义相对现有技术如相对本文中引用或通过引用结合于本文中的文献可授予专利的，如具有新颖性、非显而易见性、创造性的实施方案时。而术语“由.....组成”具有其通常意义，即这些术语是封闭式的。
通过以下详细的说明书公开这些和其它实施方案或使之显然并包含它们。
发明背景
淀粉样变性是由不溶的异常原纤维在细胞外沉积引起的一种严重疾病(Pepys，2006)。内脏、血管和结缔组织有沉积物的系统性淀粉样变性通常是致命的，在发达国家导致约千分之一的死亡率。约25种不同的无关人类蛋白在体内形成淀粉样蛋白原纤维。淀粉样蛋白在以下情况下沉积：(i)持续接触正常或浓度增加的正常、潜在淀粉样蛋白时；(ii)由于后天疾病而产生异常的淀粉样蛋白时；或(iii)基因突变编码促淀粉样变变体蛋白时。原纤维形成是由原纤维前体蛋白自然折叠(native fold)的稳定性下降导致的，从而在生理条件下其聚集了部分未折叠的中间状态，所述中间状态作为具有特有病症的β片状交联(cross-βsheet)核结构的稳定淀粉样蛋白原纤维聚集(Sunde等，1997)。
野生型运甲状腺素蛋白，即转运甲状腺激素和视黄醇结合蛋白的正常血浆蛋白，本身是淀粉样蛋白并在所有年纪超过80岁的人内形成临床意义不确定的微小淀粉样沉积物。心脏内也能产生大块沉积物，导致致命的老年人心脏运甲状腺素蛋白淀粉样变性。野生型运甲状腺素蛋白的固有淀粉样蛋白形成被报道的编码运甲状腺素蛋白序列中单一残基取代基的超过80种不同点突变显著增加(Saraiva，2002)。这些突变引起常染色体显性成年型遗传淀粉样变性，这是一种影响全球大约10,000患者的普遍致命疾病。通常临床表现为家族性淀粉样变性多发性神经病，主要为外周和自主神经病，但也通常严重牵连心脏、肾和眼。该病症通常在致病基因被传染给渊源者的后代后显示，从而确保这种破坏性极大的疾病的持续。淀粉样蛋白形成突变出现在各种族群体中，但是最普遍的V30M集中在三个地理源：葡萄牙北部、瑞典北部和日本部分地区。英国和爱尔兰的常见淀粉样蛋白形成变体为T60A。主要影响心脏的运甲状腺素蛋白淀粉样变性与V122I变体特别有关，所述变体在白种人中非常罕见但是4％的美国黑人(130万)携带这种变体，包括13,000人对这种突变是纯合子的(Jacobson，1997)。它是在人数上仅次于镰刀细胞血红蛋白的第二常见致病突变。心脏运甲状腺素蛋白淀粉样变性表现为由于限制性心肌病而渐进性的、最终导致致命的心脏衰竭，其很少受到怀疑且通常被误诊为冠心病。
肝移植为一些运甲状腺素蛋白淀粉样变性患者提供了有效治疗。运甲状腺素蛋白通过肝细胞和脉络丛合成。肝移植除去了血浆中的促淀粉样变蛋白变体运甲状腺素蛋白源并用野生型运甲状腺素蛋白代替它，然而，仅少数患者能获得该手术。供体肝严重短缺且运甲状腺素蛋白淀粉样变性的诊断对于获得最佳结果而言通常太迟。带有不是V30M突变的患者在移植后能快速形成渐进性心脏淀粉样变性。具有大量心脏淀粉状蛋白的患者中，心脏移植是一个可能的选择，但是大多数太老且不是稀少的供体器官的合格接受者。此外，肝移植不会通过脉络丛影响变体促淀粉样变性运甲状腺素蛋白的形成和运甲状腺素蛋白淀粉样变性在眼中的沉积，且软脑膜因而能发展，尽管变体运甲状腺素蛋白从该循环中消失。
鉴于移植疗法的局限性，人们对治疗药物方法进行了研究。天然运甲状腺素蛋白分子是明确鉴定的且是分子量为55,044Da的同源四聚体，而质量为13,761的非共价联合原体各自包含127个具有β-三明治折叠的残基。这种天然四聚体结合单一视黄醇结合蛋白分子并包含两个相同的负协同L-甲状腺素(T4)结合袋。通过运甲状腺素蛋白形成淀粉样原纤维包括所述四聚体的解离(dissociation)、原体的部分展开且接着聚集成淀粉样β片状交联核(cross-βcore)结构。
WO03/013508教导了一种治疗药物方法，所述专利描述了包含能被运甲状腺素蛋白结合的配体，它们通过连接基共价连接。这些试剂的目的是在待治疗患者体内的分离的运甲状腺素蛋白四聚体之间形成复合物。该方法依赖于被身体识别为异常的并被迅速地从循环中清理出来的这些复合物。这样，促淀粉样变蛋白不再作为淀粉体沉积源利用。
另一种潜在治疗运甲状腺素蛋白淀粉样变性的方法被鉴定为小分子配体，所述配体特异性结合在甲状腺激素结合袋中以稳定天然运甲状腺素蛋白四聚结构并从而防止解离成导致原纤维蛋白聚集的二聚体和原体。该方法已在例如WO2004/05635中描述，其中描述了一批联苯基和苯并噁唑化合物，包括2-(3，5-二氯苯基)苯并[d]噁唑-6-羧酸(6)。在学术文献中，体外研究已经表明：二芳基胺化合物对运甲状腺素蛋白中的结合袋具有亲和力且能使四聚体稳定。Oza等(2002)描述了这种类型的各种化合物的结构。在该论文中，对结合的“向前模式(forward mode)”和“逆向模式(reverse mode)”进行了区分。Oza等特别关注双氯酚酸类似物(1)，所述双氯酚酸类似物具有带氯取代基的环和带有羧酸酯基的第二环。所述双氯酚酸类似物，2-(3，5-二氯苯氨基)苯甲酸(2)和双氯酚酸本身都以“逆向模式”与带羧酸酯的环结合，所述环占据运甲状腺素蛋白结合袋的内部结合空穴。Wiseman等(2005)也显示了以逆向模式结合的化合物(2)。Green等(2003)描述了运甲状腺素蛋白的各种二价抑制剂，所述抑制剂包含通过连接基连接在一起的配体对。当通过运甲状腺素蛋白四聚体结合时，各配体位于结合袋中而各连接基位于贯穿运甲状腺素蛋白四聚体的中心通道上。因此，连接基共价结合到用于结合到结合袋内部结合空穴的芳香基团上。尽管作者发现了这些二价抑制剂稳定了由解离的原体重组的四聚运甲状腺素蛋白，但是这些抑制剂通常在标准运甲状腺素蛋白原纤维形成分析中非常弱，这表明它们根本不通过天然四聚运甲状腺素蛋白结合。这些结果表明：通过二价化合物使运甲状腺素蛋白稳定化的方法在运甲状腺素蛋白淀粉样变性治疗或预防中将不会成功。
发明概述
本发明旨在提供相对现有技术中所述的化合物而言性能提高的试剂或化合物，所述试剂或化合物特别适用于治疗或预防运甲状腺素蛋白淀粉样变性。
因此，在第一方面，提供用于稳定运甲状腺素蛋白四聚体的试剂，所述试剂包含通式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、酯或前体药物：
Figure GPA00001142749800041
其中：
每个Y独立为直接键(direct bond)或-CH2-；
每个X独立为-NH-、-O-、-S-、-CH2-、-NR-、-CO-、-CONH-、-CONR-、-C＝N-O-、-NHCO-、-NRCO-、-O-N＝C-、-SO-、-SO2-或直接键，
R1、R2、R3和R4各自独立为F、Cl、Br、I、CF3、OCF3、R′、OR′、NR′R′、SOR′或SO2R′，
其中R和R′各自独立为C1-C3烷基，所述烷基为任选被一个或多个卤原子取代的直链或支链或环状烷基；
且m、n、p和q各自独立为0-4，其中m+n+p+q＞0；
且其中连接基(linker)为7-13个碳原子的直链或支链，如C7-C13烷基、C7-C13烯基、C7-C13炔基，或所述连接基的一个或多个碳原子任选用杂原子如N、O或S代替，其中所述链为未取代的或被一个或多个基团包括卤素、O或N原子，或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基取代。
本发明还包括其任何立体异构体、对映体或几何异构体和它们的混合物。
本专利申请包括附录权利要求书中，上述取代基具有以下意义：
卤素原子指氟、氯、溴或碘。
烷基或其部分(除非另有定义)可为直链或支链。
本文中所用的术语“C1-C3烷基”是指由1-3个碳原子组成的直链或支链或环状碳链，所述“C1-C3烷基”可任选被一个或多个卤原子取代。
本文中所用的术语“C2-C3烯基”是指由2-3个碳原子组成的链，所述“C2-C3烯基”包含一个双键，所述双键可位于各不饱和基的任一位置并可任选被一个或多个卤素原子取代。
本文中所用的术语“C2-C3炔基”是指由2-3个碳原子组成的链，所述“C2-C3烯基”包含一个三键，所述三键可位于各不饱和基的任一位置并可任选被一个或多个卤素原子取代。
本文中所用的术语“C1-C3烷氧基”是指由1-3个碳原子组成的直链或支链或环状碳链，所述“C1-C3烷氧基”通过氧原子与另一基团连接。
本文中所用的术语“C7-C13烷基”是指由7-13个碳原子组成的饱和直链或支链烃饱和链。
本文中所用的术语是指由7-13个碳原子组成的未支化或支化的非环状碳链，所述“C7-C13烯基”包含至少一个双键，所述双键可位于各不饱和基的任一位置。
本文中所用的术语“C7-C13炔基”是指由7-13个碳原子组成的未支化或支化的非环状碳链，所述“C7-C13炔基”包含至少一个三键，所述三键可位于各不饱和基的任一位置。
当C7-C13烷基、C7-C13烯基或C7-C13炔基包含一个或多个杂原子时，所述杂原子可排列在所述链的任一位置或所述链的末端从而它们将所述链连接到苯基，且所述链可为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子，或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基。
本发明一个实施方案中，所述杂原子没有排列在所述连接基链的末端。
本发明另一实施方案中，所述杂原子为氧。
第二方面提供用于稳定运甲状腺素蛋白四聚体形式的试剂，所述试剂包含通式(I)的化合物或其药物学上可接受的盐、酯或前体药物，其中：
每个Y为直接键；
每个X独立为-NH-、-NR-、-CO-、-CONH-、-CONR-、-NHCO-、-NRCO-或直接键，
R1、R2、R3和R4各自独立为F、Cl、CF3、OCF3、R′、OR′、NR′R′、SOR′或SO2R′，其中R和R′各自独立为C1-C3烷基，所述烷基为任选被一个或多个卤原子取代的直链或支链或环状烷基；
而m、n、p和q各自独立为0-4，其中m+n+p+q＞0；
且其中连接基为7-13个碳原子的直链或支链，如C7-C13烷基、C7-C13烯基、C7-C13炔基，或所述连接基的一个或多个碳原子任选用杂原子如N、O或S代替，其中所述链为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子，或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基或C2-C3炔基。
业已惊人地发现：本发明化合物有效地稳定了四聚运甲状腺素蛋白分子。所述化合物被天然四聚运甲状腺素蛋白高亲合力和期望地快速特异性结合并显著地同时占据两配体结合袋。在溶剂pH、离子强度和组合物的生理条件下，所述化合物非常快速地被分离的纯运甲状腺素蛋白和整个血浆中的运甲状腺素蛋白结合，并将甲状腺激素从其在运甲状腺素蛋白中的结合袋中替换出来。所述化合物结合使得各配体占据一个结合袋而连接基贯穿运甲状腺素蛋白分子的核心。这种结合显著地稳定了运甲状腺素蛋白的四聚组合体和天然折叠并防止导致淀粉样原纤维形成的解离和错折叠。此外，所述化合物通过整个血浆中天然运甲状腺素蛋白以这种方式的结合意味着作为药物它们比与现有技术中的化合物优越许多。
因为m+n+p+q＞0，本发明试剂的至少一个苯环一定被选自R1、R2、R3和R4的取代基取代。
优选取代在连接到连接基上的至少一个苯环(即带有R2和R3的那些)上进行，从而优选m＝q＝0。
优选n＝p＞0从而这些环都具有相同数量的取代基。更优选n＝p＝2从而连接到连接基的苯环是双取代的，最优选相对X间位双取代。
优选取代基R2和R3各自独立为I、Br、Cl或F，最优选Cl。业已惊人发现：与现有技术的教导相反，带有R2和R3的环占据运甲状腺素蛋白结合袋的内部结合空穴。根据这个定位(orientation)，lis位于贯穿运甲状腺素蛋白四聚体的中心通道内。
内部结合空穴包括残基Serl 17、Thrl 18和Thrl 19，其可与取代基R2和R3通过范德华力相互作用。所述内部结合空穴的其它细节在下面描述。
优选X为NH或-CONH-，尽管如上所述可使用其它桥接原子或基团。还优选Y为直接键。
连接基为7-13个碳原子的直链或支链，如C7-C13烷基、C7-C13烯基、C7-C13炔基，或所述连接基的一个或多个碳原子可任选被杂原子如N、O或S代替，其中所述链为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子，或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基。所述连接基用于将所述的两个配体连接在一起从而各配体位于运甲状腺素蛋白四聚体的结合袋内而连接基穿过中心通道。从而，连接基的链长必须合适以结合两个配体从而稳定运甲状腺素蛋白四聚体形式。太短的连接基不能实现该稳定化，因为该配体不能结合。太长的连接基可能仅能将一个配体结合到一个结合袋。本申请中观察到13原子的链长不如9个原子的链长，因为9个原子的链长允许所述两个配体更好地容纳于它们各自的结合袋中。
所述连接基可包含烃链，所述烃链通过杂原子任选附着到各配体上。
另一方面，所述连接基可包含8-12个原子的链长，如C8-C12烷基、C8-C12烯基、C8-C12炔基，或其一个或多个碳原子可任选被杂原子如N、O或S代替，其中所述链为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基。
另一方面，所述连接基可包含9-11个原子的链长，如C9-C11烷基、C9-C11烯基、C9-C11炔基，或其一个或多个碳原子可任选被杂原子如N、O或S代替，其中所述链为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基。
另一方面，所述连接基可包含7个原子的链长，如C7烷基、C7烯基、C7炔基，或其一个或多个碳原子可任选被杂原子如N、O或S代替，其中所述链为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基。
另一方面，所述连接基可包含8个原子的链长，如C8烷基、C8烯基、C8炔基，或其一个或多个碳原子可任选被杂原子如N、O或S代替，其中所述链为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基。
另一方面，所述连接基可包含9个原子的链长，如C9烷基、C9烯基、C9炔基，或其一个或多个碳原子可任选被杂原子如N、O或S代替，其中所述链为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基。
另一方面，所述连接基可包含10个原子的链长，如C10烷基、C10烯基、C10炔基，或其一个或多个碳原子可任选被杂原子如N、O或S代替，其中所述链为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基。
另一方面，所述连接基可包含11个原子的链长，如C11烷基、C11烯基、C11炔基，或其一个或多个碳原子可任选被杂原子如N、O或S代替，其中所述链为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基。
另一方面，所述连接基可包含12个原子的链长，如C12烷基、C12烯基、C12炔基，或其一个或多个碳原子可任选被杂原子如N、O或S代替，其中所述链为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基。
另一方面，所述连接基可包含13个原子的链长，如C13烷基、C13烯基、C13炔基，或其一个或多个碳原子可任选被杂原子如N、O或S代替，其中所述链为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基。
另一方面，所述连接基包含-O-(CH2)r-O-，其中r为5-11的整数，例如7-11，且所述连接基的一个或多个CH2基可任选被杂原子如N、O或S或一个或多个双键或三键代替，其中连接基为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基。
另一方面，所述连接基包含-O-(CH2)r-O-，其中r为5-11的整数，例如7-11。
另一方面提供用于稳定运甲状腺素蛋白四聚体的试剂，所述试剂包含通式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、酯或前体药物，其中：
每个Y为直接键；
每个X独立为-NH-、-NR-、-CONH-、-CONR-、-NHCO-、-NRCO-或直接键，
R1、R2、R3和R4各自独立为F、Cl、CF3、OCF3、R′或OR′，
其中R和R′各自独立为C1-C3烷基，所述烷基为任选被一个或多个卤原子取代的直链或支链或环状烷基；
而m、n、p和q各自独立为0-4，其中m+n+p+q＞0；
且其中连接基包含-O-(CH2)r-O-，其中r为5-11的整数，例如7-11，且所述连接基的一个或多个CH2基任选被杂原子如N、O或S或一个或多个双键或三键代替，且其中所述连接基为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子，或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基或C2-C3炔基。
另一方面提供用于稳定运甲状腺素蛋白四聚体的试剂，所述试剂包含通式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、酯或前体药物，其中：
每个Y为直接键；
每个X独立为-NH-、-NR-、-CONH-、-CONR-、-NHCO-、-NRCO-或直接键，
R1、R2、R3和R4各自独立为F、Cl、CF3、OCF3、R′或OR′，
其中R和R′各自独立为C1-C3烷基，所述烷基为任选被一个或多个卤原子取代的直链或支链或环状烷基；
而m、n、p和q各自独立为0-4，其中m+n+p+q＞0；
且其中连接基包含-O-(CH2)r-O-，其中r为5-11的整数，例如7-11，且其中所述连接基为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子，或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基。
本发明更优选的一个方面提供用于稳定运甲状腺素蛋白四聚体的试剂，所述试剂包含通式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、酯或前体药物，其中：
每个Y为直接键；
每个X独立为-NH-，
R1、R2、R3和R4各自独立为F或Cl，
而m、n、p和q各自独立为0-4，其中m＝q＝0，n＝p＝2从而连接到连接基的苯环为双取代的，最优选相对X为间位双取代的，且其中所述连接基包含-O-(CH2)r-O-，其中r为5-11的整数，例如7-11，其中所述链为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子，或OH、C1-C3烷氧基、C1-C3烷基、C2-C3烯基或C2-C3炔基。
另一方面，所述连接基包含-O-(CH2)r-O-，其中r为5，而所述连接基的一个或多个CH2基可任选被杂原子如N、O或S或一个或多个双键或三键代替，且其中所述连接基为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子，或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基。
另一方面，所述连接基包含-O-(CH2)r-O-，其中r为6，而所述连接基的一个或多个CH2基可任选被杂原子如N、O或S或一个或多个双键或三键代替，且其中所述连接基为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子，或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基。
另一方面，所述连接基包含-O-(CH2)r-O-，其中r为7，而所述连接基的一个或多个CH2基可任选被杂原子如N、O或S或一个或多个双键或三键代替，且其中所述连接基为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子，或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基。
另一方面，所述连接基包含-O-(CH2)r-O-，其中r为8，而所述连接基的一个或多个CH2基可任选被杂原子如N、O或S或一个或多个双键或三键代替，且其中所述连接基为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子，或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基。
另一方面，所述连接基包含-O-(CH2)r-O-，其中r为9，而所述连接基的一个或多个CH2基可任选被杂原子如N、O或S或一个或多个双键或三键代替，且其中所述连接基为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子，或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基。
另一方面，所述连接基包含-O-(CH2)r-O-，其中r为10，而所述连接基的一个或多个CH2基可任选被杂原子如N、O或S或一个或多个双键或三键代替，且其中所述连接基为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子，或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基。
另一方面，所述连接基包含-O-(CH2)r-O-，其中r为11，而所述连接基的一个或多个CH2基可任选被杂原子如N、O或S或一个或多个双键或三键代替，且其中所述连接基为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子，或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基。
根据本发明的试剂可为同型二价(homobivalent)化合物或异型二价(heterobivalent)化合物。
根据本发明的优选试剂包括化合物4ajml5和mds84或其药学上可接受的盐、酯或前体药物。本发明还提供药剂的制备方法。
Figure GPA00001142749800111
制备式(I)的N-连接化合物的基本途径可用以上方案进行示例。
关键组成部分可用带有O-保护的苯酚的官能化的苯胺(其可为用R2n代表的绕着芳香环被不同取代，还可为R3p)进行示例。以上方案中，采用了苄基，但是也可使用其它O-保护基如叔丁基二甲基甲硅烷基或甲氧基甲基。这种苯胺材料可通过钯催化偶联来偶联到卤代芳烃(其可为用R1m代表的绕着芳香环被不同取代，还可为R4q)以提供N-连接的联芳基衍生物。这些材料可为O-脱保护的以提供作为手柄的苯酚从而能连接不同连接基团。一系列不同连接基可通过用二卤化合物(表示为X-R-X，其中R如上所述为5-11个原子链长而X为卤素)的O-烷基化连接以提供式(I)的药剂，其中所述连接基包含-O-(CH2)r-O-，其中r为5-11的整数，例如7-11，而所述连接基的一个或多个CH2基可任选被杂原子如N、O或S或一个或多个双键或三键代替，且其中所述连接基为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子，或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基。连接的二酯的进一步酯水解提供了式(I)化合物。其它X-连接的联芳基衍生物(如上针对式(I)化合物所述)的合成可通过众所周知的合成方法实现。包含一个或多个双键或三键的连接基可按照本领域技术人员已知的方法通过市场上可购买到的烯烃或炔烃组分如三甲基硅乙炔的烷基化及随后的卤化获得。连接基的其它连接方式，如通过碳直接连接到苯环可通过但不局限于O-三氟甲烷磺酸苯酯衍生物与式X-R-X的二卤代化合物(其中R为7-13个原子的链长)的金属催化交联反应实现。异型二价材料的制备也可通过这种方法的改进方法实现，其中联苯基单元逐步连接到式X-R-X的二卤代化合物上。包含杂原子如N、O或S并任选被包括卤素、O或N原子，或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基的一个或多个基团取代的连接基可通过本领域技术人员已知的方法制备，所述方法包括但不局限于Mitsunobu反应、标准酰胺或酯形成方法、还原氨化、烷基化和酰化反应、烯烃歧化。
本发明另一方面，式(I)药剂的制备方法可通过使式Ⅱa和Ⅱb的两个分子偶联以获得式(I)化合物来实现。取代基R′和R″代表不同链长的连接基部分以在本领域中已知的偶联条件下提供如上所述包含7-13个原子的链的连接基。L′和L″可代表能参与那些偶联反应的官能团，其包括但不局限于-COOH、-NH2、-OH、卤素、-COCl、-SO2Cl、-COO(C1-C3)烷基、-OCO(C1-C3)烷基、NH(C1-C3)烷基、-OSO2-(CrC3)烷基、-三(C1-C3)烷基甲硅烷基和CN。
Figure GPA00001142749800121
本发明另一方面提供用于治疗或预防运甲状腺素蛋白淀粉样变性，特别是系统性运甲状腺素蛋白淀粉样变性的如本文所述的试剂。
还提供了治疗或预防患者运甲状腺素蛋白淀粉样变性的方法，所述方法包括将治疗有效量的如本文中所述的试剂给药给需要这种治疗的患者。
根据本发明可治疗的淀粉样变性类型包括老年心脏运甲状腺素蛋白淀粉样变性、常染色体显性成人发作性遗传性运甲状腺素蛋白淀粉样变性、运甲状腺素蛋白型家族性淀粉样多发性神经病及与运甲状腺素蛋白错折叠相关的其它病症。可结合所述试剂的运甲状腺素蛋白为野生型运甲状腺素蛋白或变体形式，包括具有单一残基取代V30M、T60A、V122I的运甲状腺素蛋白或已报道导致运甲状腺素蛋白淀粉样变性的其它超过80种不同运甲状腺素蛋白变体的任何一种。
可配制药物组合物，所述药物组合物包含任选结合药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂(包括其组合)的本发明试剂或其药学上可接受的盐、酯或前体药物。术语“药学上可接受的盐”是指就药用盐形成而言，其阴离子或阳离子在本领域中已知并被接受的盐。例如酸加成盐可通过将试剂溶液与药学上可接受的无毒酸的溶液混合来制备，所述无毒酸包括但不局限于盐酸、草酸、富马酸、马来酸、丁二酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸。如果所述试剂带有羧基，本发明还考虑其盐，优选其无毒的药学上可接受的盐，其包括但不局限于其钠盐、钾盐、钙盐和季铵盐。
治疗用的可接受载体或稀释剂在药物领域是众所周知的且已在例如Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明登氏制药科学)，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编辑，1985)中描述。药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可考虑预期给药路径和标准药物实践进行选择。所述药物组合物可包含任何合适粘合剂、润滑剂、悬浮剂、涂层剂、溶解剂作为载体、赋形剂或稀释剂，或者，除了载体、赋形剂或稀释剂以外，所述药物组合物可包含任何合适粘合剂、润滑剂、悬浮剂、涂层剂、溶解剂。
所述药物组合物中可含有防腐剂、稳定剂、染料甚至芳香剂。还可使用抗氧剂和悬浮剂。
所述药物组合物可为包含所述试剂或其衍生物的前体药物，其仅在被接受者代谢时才变得有活性。这种药物组合物的组分的确切性质和量可通过经验确定并部分依赖于所述组合物的给药路径。如果合适，本发明药物组合物可以栓剂或阴道栓剂通过吸入给药；以洗剂、溶液、膏剂、油膏剂或粉剂通过使用皮肤贴片局部(包括眼部)给药；以包含赋形剂如淀粉或乳糖的片剂、单独或与赋形剂混合的胶囊剂或丸剂、包含芳香剂或着色剂的酏剂、溶液或悬浮液口服给药，或者它们可通过肠胃外例如静脉内、肌肉内、皮下或动脉内注射给药。
就制备固体组合物如片剂而言，将主要活性成分与药物载体如常规制片成分如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶及其它药物稀释剂如水混合以制备包含试剂或其无毒的药学上可接受的盐的均匀混合物的固体预制组合物。其中可结合有本发明组合物以进行口服给药或注射给药的液体形式包括含有食用油如棉花籽油、芝麻油、椰子油和花生油及酏剂和类似药物载体的含水乳剂。用于含水悬浮液的合适分散剂或悬浮剂包括合成和天然树胶如黄芪胶、阿拉伯树胶、褐藻胶、右旋糖苷、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和明胶。
就肠胃外给药而言，所述组合物以无菌水溶液形式使用最佳，所述水溶液可包含其它物质，例如足够的盐或单糖从而使得该溶液与血液等张。就口腔给药或舌下给药而言，所述组合物可以片剂或菱形含片形式给药，所述片剂或含片可以常规方式制备。
为了方便使用，本发明给药优选口服给药，但这将取决于实际药物及其生物利用率。
本发明化合物的使用旨在用配体药物来饱和体内所有循环和其它可溶的运甲状腺素蛋白分子。因此所需的药物剂量是提供每天产生的每mol运甲状腺素蛋白至少1mol药物的剂量。70kg的正常健康者内运甲状腺素蛋白的日产量为9.5-13μmol/天(Robbins J.，2002)。在所有与急性期响应和营养失调有关的炎症、感染和组织损伤疾病中运甲状腺素蛋白的产生不会上调而合成不会减少。就分子量为700Da摩尔的化合物而言，与运甲状腺素蛋白日产量等值对应6.65-9.1mg/天。如果药物在口服或肠胃外给药后的生物利用率为100％，那么该剂量范围本身会是必需的最小量。如果药物通过口服给药，然后，例如仅10％生物利用率，最小日剂量会～70-100mg。根据药物的实际亲和力、药物动力学和药效学，剂量可能需要多达每天1g以上。
药学上可接受的盐包括碱或酸的盐，所述碱或酸可为有机或无机的。无机碱的盐包括碱金属盐、碱土金属盐和铵盐。有机碱包括嘧啶、三甲胺、三乙胺和乙醇胺。无机酸包括乙酸、硫酸、硝酸和磷酸。有机酸包括可为碱性或酸性的氨基酸、甲酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、富马酸和草酸。
药物组合物的精确剂型及其剂量还可能取决于待治疗患者，包括体重、给药路径和疾病状况。这些可由熟练的医师按常规确定。
下面将参考附图对本发明进行进一步详细描述，仅作为示例，其中：
图1显示了单独的及与4ajml5和mds84复合的运甲状腺素蛋白的尺寸排阻色谱图；
图2显示了(A)加入4ajml5后渐进性progressive)运甲状腺素蛋白荧光猝灭；(B)4ajml5和T4诱导猝灭比较和插入(a)在运甲状腺素蛋白存在下的4ajml5的荧光；
图3显示了(A)用4ajml5孵育的运甲状腺素蛋白免疫沉淀的SDS-PAGE分析结果，和(B)在全血清中用4ajml5替代运甲状腺素蛋白中的T4；
图4显示了在各种运甲状腺素蛋白配体存在下的运甲状腺素蛋白聚集体形成；
图5显示了通过运甲状腺素蛋白结合mds84的等温滴定热量测定；
图6显示了在4ajml5存在和不存在下运甲状腺素蛋白的沉降速度变化；
图7显示了在4ajml5存在和不存在下用15N和13C及单独用15N合成标记的运甲状腺素蛋白混合物的质谱；
图8显示了用15N和13C及单独用15N合成标记的L55P变体运甲状腺素蛋白混合物的质谱；
图9、10和11显示了用15N和13C及单独用15N合成标记的L55P变体运甲状腺素蛋白和不同摩尔比的mds84的混合物的质谱；
图12、13和14显示了用15N和13C及单独用15N合成标记的L55P变体运甲状腺素蛋白和不同摩尔比的Fx-1006A的混合物的质谱；
图15显示了单独的运甲状腺素蛋白及与配体mds84和Fx-1006A的质谱；
图16显示了配体解离过程中运甲状腺素蛋白四聚体的质谱；
图17显示了配体从V30M运甲状腺素蛋白解离的质谱；
图18显示了结合到运甲状腺素蛋白四聚体的L-甲状腺素；
图19显示了通过运甲状腺素蛋白四聚体中部结合的4ajml 5；
图20显示了通过运甲状腺素蛋白四聚体中部结合的mds84；和
图21显示了带有结合的mds84的运甲状腺素蛋白内部结合空穴的详图。
发明详述
1.野生型运甲状腺素蛋白
1.1纯化
天然四聚运甲状腺素蛋白如之前已经描述的从分馏的人血浆中提纯(Malpeli，1996)，或者从市场上购买(Scipac Ltd，Sittingbourne，Kent，UK)，或通过重组技术采用同位素标记法制备以进行亚基交换研究。
1.2质谱分析
在Quattro II型三重四极杆质谱仪上以阳离子或阴离子电喷雾模式进行质谱分析。将样品以10-100pmol/μl溶解于乙腈∶水∶甲酸(1∶1∶0.01v/v/v)或乙腈∶水(1∶1v/v)中以分别进行阳离子或阴离子质谱分析。采用N2作为雾化气将样品以10-20μl/min导入离子源中。采用Masslynx 4.0重现光谱。分离的运甲状腺素蛋白的阳离子电喷雾质谱(ESMS)分析显示了通过如下表示的许多主要组分：MAv 13715.2±0.2(10C→10G)，13732.3±1.0(10C→10dHA)，13777.0±2.1(13M→3M-O)，13791.9+2.8(10C-S.SH)，13841.3±0.2(10C-S.SO3H)，13880.2+0，7(10C-S.Cys)。少量组分也包含在“天然”运甲状腺素蛋白(13760.5)，10C-S.Cys.GIy(13939.7)和10C-S-GSH(14066.3)中。这些结果与报道值一致。
1.3凝胶过滤
用PBS或150mM碳酸氢铵(pH7.6)将天然运甲状腺素蛋白从在AKTAExplorer系统上运行的Superdex 200(30×1.0cm)柱洗提出来，其作为UV吸收峰(A280/A330：～30-50∶1)(图1)的Ve＝14.4ml。通常看到在12.5ml洗提的少量(＜5％)较高分子量组分。
1.4放射性碘标记
用123I将从血清中提纯的分离天然野生型运甲状腺素蛋白氧化碘化(Reay，1982)。比活度为0.44MBq/pmol。
1.5脱盐和缓冲液更换
按照使用说明书使用Biospin P6柱(BioRad)。为了进行缓冲液更换，用合适的缓冲液离心洗涤该柱四次。
2.药物和配体的合成
2.1溶剂与试剂
在三苯甲烷存在下在干氮气氛中从氢化铝锂和氢化钙中蒸馏出THF；从氢化钙中蒸馏出DCM；从氢化钙蒸馏出三乙胺并用氢氧化钾储存。在氢气气氛下进行的反应通过膨胀气球保持。将KH2PO4(85g)和NaOH(14.5g)溶解于蒸馏水(950mL)中制备pH为7.0的缓冲剂。所有其它试剂和溶剂按照供应时的状况使用而无需提前纯化。
2.2色谱
在Merck 60F254硅胶涂布的玻璃板上进行薄层色谱(TLC)并通过UV光或通过钼酸铵铈或高锰酸钾着色进行目测。采用Merck Kieselgel(230-400目)进行快速层析。
2.3核磁共振谱
在Bruker Avance 400(1H：400MHz和13C：100MHz)或Bruker AvanceCryo 500(1H：500MHz和13C：125MHz)上记录NMR光谱。化学位移用ppm表示并以残余非氘化溶剂峰为基准，并按照如下报告根据外观而不是阐明)：化学位移δ/ppm(质子数，多重性，偶合常数J/Hz，归属)[br，宽；s，单峰；d，双重峰；t，三重峰；q，四重峰；qui，五重峰；sept，七重峰；m，多重峰]。2.4 2，2′-(4，4′-(十一烷-1，11-二基二(氧基))二(3，5-二氯-4，1-亚苯基))双(亚胺基(azanediyl))二苯甲酸(4ajml5)和2，2′-(4，4′-(庚烷-1，7-二基二(氧基))二(3，5-二氯-4，1-亚苯基))双(亚胺基)二苯甲酸(mds84)的合成
2.4.1反应流程
Figure GPA00001142749800171
2.4.2  2-(苄氧基)-1，3-二氯-5-硝基苯
Figure GPA00001142749800172
向2，5-二氯-3-硝基苯酚(5g，24mmol)和碳酸钾(13.3g，96mmol)在丙酮(30mL)的搅拌溶液中加入苄基溴(17.25mL，144mmol)。将混合物加热到75，保持12h，然后使之冷却到室温，再倒入冰水(100mL)中。混合物经氯仿(200mL)萃取，并用盐水(100mL)洗涤，合并的有机层经过干燥(MgSO4)、过滤并真空浓缩。残留物通过柱层析法(9∶1，己烷/二氯甲烷)纯化，得到白色固体状2-(苄氧基)-1，3-二氯-5-硝基苯(99％产率)。
2.4.3  4-(苄氧基)-3，5-二氯苯胺
Figure GPA00001142749800173
向2-(苄氧基)-1，3-二氯-5-硝基苯(5.8g，19mmol)在乙醇(80mL)中的搅拌溶液中加入氯化锡(Ⅱ)(22g，98mmol)并将所得悬浮液加热到70。1h后，使混合物冷却到室温并用乙酸乙酯稀释(200mL)。将混合物倒入盐水(100mL)中并将所得乳液与酒石酸钾钠溶液(200mL)一起搅拌。混合物经乙酸乙酯萃取，合并的有机层经过干燥(MgSO4)、过滤并真空浓缩，得到4-(苄氧基)-3，5-二氯苯胺，该产物直接用于下一步骤而无需纯化。
2.4.4  2-(4-(苄氧基)-3，5-二氯苯氨基)苯甲酸甲酯
Figure GPA00001142749800181
向4-(苄氧基)-3，5-二氯苯胺(5.27g[前一步骤的粗产物]，19mmol)在甲苯中的搅拌溶液中加入碳酸铯(5.98g，19mmol)。加入rαc-BINAP(0.6g，7.5mol％)和2-溴苯甲酸甲酯(1.84ml，13mmol)。加入乙酸钯(II)(0.147g，5mol％)并将混合物加热到100。12h后，使混合物冷却到室温，用乙酸乙酯(100mL)稀释并用pH为7的缓冲溶液(50mL)洗涤，然后用乙酸乙酯(100mL)萃取。合并的有机层经过干燥(MgSO4)、过滤并真空浓缩，得到残留物，其通过柱层析法(3∶1，石油醚/二氯甲烷)纯化，得到白色固体状2-(4-(苄氧基)-3，5-二氯苯氨基)苯甲酸甲酯(94％产率)。
2.4.5  2-(3，5-二氯-4-羟基苯氨基)苯甲酸甲酯
Figure GPA00001142749800182
向2-(4-(苄氧基)-3，5-二氯苯氨基)苯甲酸甲酯(0.520g，1.3mmol)在THF(15mL)的脱氧搅拌溶液中小心地加入钯碳(10％重量Pd的10％质量(10％by massof 10％by wt Pd)，50mg)。所得混合物经过抽真空并用氢气吹洗，如此循环三次，然后在氢气气氛下搅拌。3h后，反应物用氮气吹洗、经CeliteTM(洗提液：THF)过滤并真空浓缩，得到白色固体状2-(3，5-二氯-4-羟基苯氨基)苯甲酸甲酯，其可直接使用而无需进一步纯化。
2.4.6  2，2′-(4，4′-(庚-1，7-二基二(氧基))双(3，5-二氯-4，1-亚苯基))双(亚胺基)二苯甲酸二甲酯
Figure GPA00001142749800191
向2-(3，5-二氯-4-羟基苯氨基)苯甲酸甲酯(0.426g，1.4mmol)和碳酸钾(1.4g，10.1mmol)在丙酮(3mL)中的搅拌溶液中加入二溴庚烷(0.088mL，0.54mmol)并将混合物加热到60℃。12h后，使混合物冷却并用二氯甲烷(50mL)稀释，用pH为7的缓冲溶液(50mL)洗涤。合并的有机层经过干燥(MgSO4)、过滤并真空浓缩，得到残留物，其通过柱层析法(1∶1，石油醚/二氯甲烷)纯化，得到白色固体状2，2′-(4，4′-(庚烷-1，7-二基二(氧基))双(3，5-二氯-4，1-亚苯基))双亚胺基)二苯甲酸二甲酯(277mg，72％产率)。
2.4.7  2，2′-(4，4′-(十一烷-1，11-二基二(氧基))双(3，5-二氯-4，1-亚苯基))双(亚胺基)二苯甲酸二甲酯
Figure GPA00001142749800192
向2-(3，5-二氯-4-羟基苯氨基)苯甲酸甲酯(440mg，1.41mmol)、碳酸钾(0.390g，2.82mmol)和四-N-丁基碘化铵(5mg)在丙酮(3mL)中的搅拌溶液中加入二溴十一烷(0.133mL，0.56mmol)并将混合物加热到60。12h后，使混合物冷却，用二氯甲烷(50mL)稀释并用pH为7的缓冲溶液(50mL)洗涤。合并的有机层经过干燥(MgSO4)、过滤并真空浓缩，得到残留物，其通过柱层析法(1∶1，石油醚/二氯甲烷)纯化，得到白色固体状2，2′-(4，4′-(十一烷-1，11-二基二(氧基))双(3，5-二氯-4，1-亚苯基))双(亚胺基)二苯甲酸二甲酯(408mg，94％产率)。2.4.82，2′-(4，4′-(庚烷-1，7-二基二(氧基))双(3，5-二氯-4，1-亚苯基))双(亚胺基)二苯甲酸(mds84)
Figure GPA00001142749800193
向2，2′-(4，4′-(庚烷-1，7-二基二(氧基))双(3，5-二氯-4，1-亚苯基))双(亚胺基)二苯甲酸二甲酯(50mg)在THF中的搅拌溶液中加入甲醇(1mL)和水(1mL)。加入氢氧化锂(25mg)，在室温下搅拌混合物14小时，然后浓缩到约2mL。通过加入3M HCl溶液将溶液的pH调节到2，用氯仿(50mL)萃取。有机层经过干燥(MgSO4)、过滤并真空浓缩，得到非晶形固体状2，2′-(4，4′-(庚烷-1，7-二基二(氧基))双(3，5-二氯-4，1-亚苯基))双(亚胺基)二苯甲酸(48mg，定量产率)。δH(400MHz，(CD3)2CO)：8.03(2H，dd，J 8.0，1.3，H-3)，7.43-7.47(2H，m，H-5)，7.28-7.34(6H，m，H-10，H-4)，6.84-6.88(2H，m，H-ó)，4.04(4H，at，J 6.4，H-14)，1.85-1.89(4H，m，H-15)，1.58-1.65(4H，m，H-16)，1.28-1.31(2H，m，H-17).2.4.92，2′-(4，4′-(十一烷-1，11-二基二(氧基))双(3，5-二氯-4，1-亚苯基))双(亚胺基)二苯甲酸(4ajml5)
Figure GPA00001142749800201
向2，2′-(4，4′-(十一烷-1，11-二基二(氧基))双(3，5-二氯-4，1-亚苯基))双(亚胺基)二苯甲酸二甲酯(400mg，0.51mmol)在THF中的搅拌溶液中加入甲醇(1mL)和水(1mL)。加入氢氧化锂(100mg)，在室温下搅拌混合物14小时，然后浓缩到约2mL。通过加入3M HCl溶液将溶液的pH调节到2，用氯仿(100mL)萃取。有机层经过干燥(MgSO4)、过滤并真空浓缩，得到非晶形固体状2，2′-(4，4′-(庚烷-1，7-二基二(氧基))双(3，5-二氯-4，1-亚苯基))双(亚胺基)二苯甲酸(372mg，96％产率)。
δH(500MHz，CDCl3)：7.92(2H，dd，J 8，1.6，H-3)，7.27-7.31(2H，m，H-5)，7.25(4H，s，H-10)，7.11-7.13(2H，m，H-6)，6.70-6.74(2H，m，H-4)，3.91(4H，a-t，J 6.6，H-14)，1.73-1.79(4H，m，H-15)，1.42-1.45(4H，m，H-16)，1.25-1.30(10H，m，H-17，H-18，H-19).
2-(3，5-二氯苯基)苯并[d]噁唑-6-羧酸(FoIdRx Pharmaceuticals，Inc.，300Technology Square，Cambridge MA 02139，USA，化合物Fx-1006A，CA：594839-88-0)的合成已在WO 2004/056315；Razavi等人2003；Razavi等人2005中公开。
3.运甲状腺素蛋白的配体结合
3.1.运甲状腺素蛋白与4ajml5和mds84的复合体的凝胶过滤
3.1.1.通过运甲状腺素蛋白结合4ajml5和mds84
将1μl(5.3nmol)4ajml5在DMSO中的浓(5.3mM)溶液加入3.8nmol运甲状腺素蛋白/100μl PBS(配体1.4倍摩尔过量)中并在室温下孵育30min。在Superdex 200上进行色谱分析，其中运甲状腺素蛋白-4ajml5复合体在14.4ml处洗脱，A280/A330比(～5∶1)减少，与结合相符。采用运甲状腺素蛋白和4ajml5在挥发性碳酸氢铵缓冲剂中进行色谱分析时得到了类似结果。当mds84(2nmol)首先干燥成管子，然后重悬浮于5μl DMSO中，再加入蛋白溶液时也得到类似结果。在进一步实验中，将2纳摩尔天然野生型运甲状腺素蛋白(Scipac)在55μlPBS中孵育1h，用1μl DMSO(对照)或1μl mds84或4ajml5在DMSO中的4mM溶液。在PBS中Superdex 200柱(30×1cm)上以0.5ml/min的流速对样品进行色谱分析，收集到0.5ml馏分(图1)。相对于单独的运甲状腺素蛋白，运甲状腺素蛋白与mds84或4ajml5的复合体显示出类似的A280图谱，在14.4ml洗脱的主要组分在330nm的吸收增加(A280/A330比：～4.6)，表明存在结合的配体。测定了各种情况下的主要组分的全UV光谱且与运甲状腺素蛋白∶配体比为-1∶0.9相符。除了显示运甲状腺素蛋白与这些配体的一摩尔对一摩尔相互作用(mole for mole interaction)外，这些结果还重要地表明运甲状腺素蛋白-配体复合体在凝胶过滤过程中经100倍体积溶剂交换后是稳定的，从复合体上解离出来的配体可忽略不计。
3.2.荧光淬灭
3.2.1.通过运甲状腺素蛋白结合4ajml5和mds84
在20℃下通过用Perkin Elmer LS55荧光仪和1cm路径长度标准石英比色皿监测在280nm激发的300-500nm反射范围内的固有荧光对配体4ajml5或mds84与运甲状腺素蛋白之间的相互作用进行研究。用在0-2μM范围内浓度不断提高的各配体滴定在PBS中的1μM运甲状腺素蛋白(pH为7.4)实现色氨酸的淬灭(图2A)。用甲状腺素(T4)滴定后，运甲状腺素蛋白仍然展示60％固有荧光，但用任一种新配体后其减少到仅40％(图2C)。同时，在结合到蛋白后，在400-600范围内监测在340nm激发(特异性4ajml5的激发波长)的4ajml5的荧光变化。在这些条件中，光谱聚集突出了在483nm的等色点(图2B)。采用mds84获得了相同结果(未显示)。在运甲状腺素蛋白存在和不存在下的4ajml5滴定结果支持了其中两结合部位同时被回文结构的palindromic)配体占据的模式。
图2A显示了在280nm激发后运甲状腺素蛋白和4ajml5的固有荧光。图2B显示了在340nm激发后运甲状腺素蛋白和4ajml5的发射光谱。各种情况下，将浓度不断提高的配体(0-2μM)加到1μM蛋白中。图2B中的箭头指出了蛋白配体复合体形成时在483nm处产生的等色点。图2C显示了以荧光的％淬灭与配体浓度作图得到的4ajml5和T4的浓度不断提高时运甲状腺素蛋白滴定曲线。百分淬灭表示ΔF/Fo，其中F0为加入配体之前的荧光强度而ΔF为给定配体浓度下的荧光减少。
3.2.2运甲状腺素蛋白结合4ajml5的动力学的停流分析
采用路径长度为1.5mm的比色皿，用连接到荧光检测系统(Claix，France)的Bio-Logic SFM-300停流仪对运甲状腺素蛋白结合4ajml5的动力学进行评价。激发波长为280nm并采用截止滤波器测量波长大于320nm的发射。20℃下，在10μM 4ajml5存在下在含5％DMSO、最终蛋白浓度为2μM的PBS(pH为7.4)中进行试验。动力学图谱(kinetic trace)与时间常数为2.17s(±0.02s)的单指数函数拟合非常好。因此，在生理pH条件下运甲状腺素蛋白非常迅速地结合4ajml5，仅在11秒后就达到淬灭反应平台。
3.2.3.替代分离的运甲状腺素蛋白和全血清中的T4
3.2.3.1纯运甲状腺素蛋白的定量研究
通过之前已经描述的方法定量分析4ajml5或mds84与T4竞争运甲状腺素蛋白结合(Almeida等人，1997；Saraiva等人，1988)。还用Fx-1006A比较它们的功效。简言之，在4下用痕量125I-T4和浓度不断提高(0-10μM)的抑制剂将在0.1M三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0.1M NaCl和0.001M EDTA缓冲液(pH为8.0)中的125nM运甲状腺素蛋白溶液孵育整夜。采用Bio-Gel P6-DG柱(Bio-Rad)通过凝胶过滤层析法将被运甲状腺素蛋白结合的125I-T4与未结合的T4分离开。将结合百分率对应抑制剂浓度的对数作图，确定IC50(减少通过运甲状腺素蛋白结合T4的50％时的配体浓度)(表1)。
表1对被从血浆中分离的野生型运甲状腺素蛋白结合T4而言的4ajml5和mds84的IC50值
  配体   IC50(μM)
  T4   0.2±0.02
  4ajml5   0.2±0.07
  mds84   0.15±0.025
  Fx-1006A   0.59
3.2.3.2.血清中的定量研究
通过在不同摩尔浓度的4ajml5或mds84存在下用125I-T4进行血清孵育，然后测量在用抗运甲状腺素蛋白抗体获得的免疫沉淀物中的放射性来研究从与野生型运甲状腺素蛋白同型的个体和与各种淀粉样蛋白运甲状腺素蛋白基因突变异型的对象的全血清中的运甲状腺素蛋白中的T4置换。简言之，用1μl125I-T4(比放射性活度为1250μCi/μg；浓度为320μCi/ml；Perkin Elmer)、1μl摩尔浓度不同的4ajml5或mds84和33μl 0.1M三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0.1MNaCl、0.001M EDTA(pH为8.0)将5μl血清在4下孵育过夜。采用装载有40μl孵育混合物的Bio-Gel P6-DG柱(Bio-Rad，Hercules，CA，U.S.A.)，通过凝胶过滤层析法将结合到运甲状腺素蛋白的125I-T4与未结合的T4分离。用10μl多克隆抗运甲状腺素蛋白抗体(DAKO)和3％w/v PEG 6000在4℃下将结合T4的洗脱蛋白孵育12h。免疫沉淀物经离心回收、用0.1M Tris、0.1M NaCl(pH为8.0)洗涤两次，然后计数。通过特异性电免疫测定上清液中的运甲状腺素蛋白来确认完全免疫沉淀并通过SDS 15％同质PAGE(GE Healthcare)(图3A)对小球进行分析。测定的4ajml5的IC50值(平均值，SDμM)为：野生型运甲状腺素蛋白，27.0，4.9；运甲状腺素蛋白Ile 122，29.43，4.8；运甲状腺素蛋白Ala60，26.5，7.2；运甲状腺素蛋白Tyr77，26.2，3.1；运甲状腺素蛋白Met30，61.6，1.6(图3B)。就mds84而言，血清中野生型运甲状腺素蛋白的IC50为11.88，1.37。血清中有野生型运甲状腺素蛋白的Fx-1006A的IC50平均值为15.0μM。
图3A显示了用含125I-T4和4ajml5的血清孵育后对运甲状腺素蛋白免疫沉淀物的SDS同质15％PAGE分析结果(第1泳道，分离的运甲状腺素蛋白；第2-13泳道，4ajml5浓度不断提高(0，0.069，0.129，0.259，0.5，1.03，2.07，4.15，8.3，16.6，33.2和332μM)的免疫沉淀物)。通过天然琼脂糖凝胶电泳分离这些样品的上清液并转移到硝酸纤维素膜上以通过自动射线照相术进行检测。第1泳道显示了用125I-T4预孵育的对照天然运甲状腺素蛋白；第2-13泳道仅显示了对应带有结合的125I-T4的甲状腺素结合球蛋白(TBG)的谱带(band)。图3B显示了通过4ajml5从带有野生型运甲状腺素蛋白和各种促淀粉样变蛋白变体的杂合载体的全血清中的运甲状腺素蛋白的T4置换出来。
3.2.3.3.在运甲状腺素蛋白配体存在下从T4结合蛋白将T4置换出来
通过琼脂糖凝胶电泳(Jeppson等，1979)在125I-T4和浓度不断提高的配体存在下对全血清中T4结合蛋白上运甲状腺素蛋白配体的分布进行评价。电泳后，通过毛细管扩散将蛋白转移到硝酸纤维素膜上并进行感光成像(Typhoon8600；Molecular Diagnostics，Amersham Biosciences)。清楚显示了已知的两种T4结合蛋白，运甲状腺素蛋白和甲状腺素结合球蛋白(TBG)，而白蛋白结合作为放射性污点显示在它们之间。对自动放射显影照片的光密度分析清楚地表明：与抑制运甲状腺素蛋白结合相比，4ajml5的浓度不断提高没有影响通过TBG进行的T4与TBG结合。
3.3其它体外结合研究
3.3.1野生型运甲状腺素蛋白
从混合的正常人血浆分离的、用于这些试验中的已纯化的野生型运甲状腺素蛋白(液体和冻干的)来自Scipac，(Sittingboume，Kent，UK)。在用吸收系数E1％1cm＝14.0校正320nm的光散射后通过280nm处的吸收率确定蛋白浓度。在还原的变性条件下，用Brilliant blue R350染色的SDS同质15％PAGE(Amersham Biosciences，UK)中，尽管在～36和～55kDa处存在对应二聚体和抗SDS四聚体的较小谱带，在重负载凝胶中观察作为单一主要～15kDa谱带转移的运甲状腺素蛋白制剂(单体)。纳升电喷雾离子化质谱确认了在变性条件下存在正常和半胱氨酰化运甲状腺素蛋白单体(Terazaki等，1998)，和温和脱溶剂条件下存在溶剂结合的运甲状腺素蛋白四聚体(Nettleton等，1998)。
3.3.2通过4ajtnl5抑制运甲状腺素蛋白聚集
在中试中，在酸性pH值下在37孵育天后，野生型运甲状腺素蛋白(3.6μM)形成运甲状腺素蛋白聚集体(Colon andKelly，1992)。然后比较4ajml5与其它运甲状腺素蛋白配体化合物作为运甲状腺素蛋白聚集体形成抑制剂的功效。简言之，将在含有0.1％NaN3(PBS-az)的PBS缓冲液(pH为7.4)(Sigma-Aldrich，Poole，UK)中的运甲状腺素蛋白(495μl，7.2μM四聚体)的等分样品在4ajml5的等分样品(5μl，0.72mM)或对照化合物(双氯酚酸、二氟尼柳、氟芬那酸和L-甲状腺素[T4])/DMSO(均来自Sigma-Aldrich)或单独的DMSO中重复预孵育三次。37℃下保持30min后，将pH调节到pH为4.4(用pH为4.0的0.2M乙酸钠缓冲液)，在37下将～1ml混合物不搅拌孵育3天。然后在仪器空白实验(instrument blanking)(PBS-乙酸酯-DMSO)后，在UV-Vis型扫描式分光光度计(DU650；Beckman-Coulter UK Ltd，High Wycombe，Bucks)中，在21下测定各样品在280、320、400和600nm的吸光率，结果表示为百分浊度(图4)和百分浊度抑制率(表2)，标准化为无抑制剂的运甲状腺素蛋白的A400nm值(White和Kelly，2001)。
在400nm没有属于运甲状腺素蛋白或分析中使用浓度的任何单独测试的抑制剂的可感知吸收。在4ajml5存在下，运甲状腺素蛋白聚集体形成显著减少，其可能是通过四聚体的稳定和阻止其解离成单体。对照抑制剂(NSAID，T4)得到了与其他人报道的这类试验的结果一致的结果(Miroy等，1996；Miller等，2004)。
采用相同的方法对mds84和4ajml5作为野生型运甲状腺素蛋白和最有攻击性聚集的运甲状腺素蛋白变体L55P聚集抑制剂的活性进行重复评价三次，两种蛋白都是3.6μM，各配体是其一倍(3.6μM)或3倍(10.8μM)。在pH为4.4的条件下对野生型运甲状腺素蛋白进行研究，而在pH为5.0的条件下对L55P进行研究。还与化合物Fx-1006A和T4对比抑制活性。平均值和标准偏差显示于表2和图4中，其中摩尔比为1∶1的结果用交叉的平行线画出阴影(crosshatched)显示，摩尔比为3∶1用空白条(open bar)显示。
表2运甲状腺素蛋白聚集(与单独DMSO对照的百分比)
Figure GPA00001142749800251
通过加入等量的mds84(3.6μM)几乎完全抑制了野生型运甲状腺素蛋白聚集而T4和Fx-1006仅在加入3倍(10.8μM)时产生相同的抑制水平。之前已经报道T4的抑制效果在三倍摩尔过量时达到最大，在此浓度下T4结合到运甲状腺素蛋白四聚体的两配体结合袋中(Miroy等，1996)。
L55P变体运甲状腺素蛋白在pH为5.0条件下的聚集类似地通过mds84得到抑制，mds84也在摩尔等量和三倍摩尔过量时均比T4或Fx-1006A更有效。在采用野生型TTR和L55P进行的测试中，4ajml5得到的结果(未显示)与采用mds84得到的结果相同。
3.3.3运甲状腺素蛋白-mds84配体结合的等温滴定热量测定(ITC)
通过等温滴定热量测定仪(VP-ITC，MicroCal LLC，Milton Keynes，UK)直接测定运甲状腺素蛋白-mds84配体结合的热动力学参数。首先向最终浓度为0.029mM四聚体的运甲状腺素蛋白中注入1μl浓度为0.348mM的mds84，间隔240秒后，连续进行35次8μl注射。稀释剂为含2％(v/v)DMSO的Tris-NaCl(pH为8.0)。以310rpm搅拌样品皿并将皿内容物保持在37℃。在体积转换校正和相对注入配体与运甲状腺素蛋白四聚体的摩尔比作图后，对原温谱图(图5，上图)的积分得到结合等温线(图5，下图)，在ORIGIN v7.0(MicroCalLLC)中通过非线性最小二次方分析发现其与单组相同部位的模型拟合最好(通过χ2分析确定)。这些结果得到：解离常数(Kd：Ka的倒数)为0.505μM，焓(ΔH)＝-7.95kcal/mol和化学计量(n)＝0.8(～1∶1)。由于4ajml5的溶解有限，不能采用4ajml5进行该分析。
3.3.4运甲状腺素蛋白-4ajml5配体结合的差示扫描量热分析(DSC)
由于4ajml5太不可溶而不能通过ITC进行分析，采用在4ajml5(0.2mM)存在和不存在下进行初步差示扫描量热试验(DSC)(VP-DSC MicroCal LLC；0.02mM运甲状腺素蛋白四聚体，温度范围：25-100℃，扫描速率：1.5/min，样品皿压力：～28psi)来代替。稀释剂为含有2％DMSO的PBS(pH为7.4)。单独运甲状腺素蛋白的热变性温度中间点(Tm)为99.5，但在4ajml5存在下提高到103.6，显示出配体结合和随后蛋白的显著稳定化。进一步的研究中，在配体是蛋白的5倍摩尔过量的条件下对mds84和Fx-1006A对野生型和L55P变体运甲状腺素蛋白的Tm的影响进行了对比。在mds84存在下，野生型运甲状腺素蛋白的Tm提高了6.2，从单独运甲状腺素蛋白的101.3提高到有配体的107.5。Fx-10006A导致了小许多的Tm提高，为4.6，从100.3到104.9。L55P变体运甲状腺素蛋白的熔融温度比野生型运甲状腺素蛋白低，但是mds84将其Tm提高了5.9，从94.3提高到983，相比之下，采用Fx-1006A的Tm提高小许多，为3.7，从94.6提高到98.3。这些结果表明：对野生型和变体运甲状腺素蛋白而言，mds84是比Fx-0006A更有效的稳定剂。
4.通过4ajml5稳定天然四聚运甲状腺素蛋白
4.1.分析超速离心
20下在装备有An50Ti转子的Beckman XL-I型仪器(其中同时记录吸光率(在280nm处记录)和干涉扫描)上进行沉降速度和平衡分析离心试验。通过在不流动运甲状腺素蛋白聚集-抑制分析(Petrassi等，2000)条件下在配体(3.6μM)存在下将所述蛋白(3.6μM)孵育72h在pH为4.4的条件下进行沉降分析。在相同条件下也将以聚集抑制浓度10.8μM溶解在DMSO中的T4(Miroy等，1996)和单独的DMSO与所述蛋白一起孵育，并作为对照样进行分析。在溶液柱高度为12mm的两区池以42,000rpm转子速度在8h后取得沉降速度数据。采用SEDFIT软件(Schuck，2005)将吸收率值作为沉降系数c(s)的连续分布进行建模(Schuck，2000)。在与沉降速度分析所用条件相同的条件下，采用在转子速度为17,000rpm的AnTi 50转子且柱高为2mm的六区池对结合到配体的运甲状腺素蛋白进行沉降平衡测定直到达到平衡，如以5h为间隔测到的运转完美覆盖所示。实验末期以42,000rpm进行最后运转以确定用于曲线拟合的背景水平。采用作为Origin Version 4.1(Microcal Inc.)的插件提供的Beckman软件进行数据分析，对于它来说，从氨基酸序列计算的微分比容为0.7353ml/g(Perkins，1986)。采用SEDNTERP程序计算缓冲液密度和粘度(Laue等，1992)。采用沉降速度和平衡分析超速离心试验来评价在通常解离四聚体并使得所得单体能错装配的条件(72h，37，pH＝4.4)下4ajml5对运甲状腺素蛋白四聚体结构的影响。在这些条件下，结合4ajml5的运甲状腺素蛋白仍为四聚体并作为一种物质沉降(图6)，其沉降系数为3.7S，与运甲状腺素蛋白结合到其天然配体的沉降系数相当(Miroy等，1996)。在溶剂DMSO存在下进行的对比试验中检测到多种物质(图6中插图)。在配体存在下进行的运甲状腺素蛋白沉降平衡分析完全与质量为55,784±107.87Da的单种物质一致，与结合有4ajml5的四聚野生型运甲状腺素蛋白的计算分子量(55794Da)吻合良好。
图6显示了复合体运甲状腺素蛋白-4ajml5在上述条件下的沉降速度c(s)分布，在对应四聚体预期S值的3.7S处显示了一个单峰。在相同试验条件且不存在4ajml5的条件下，运甲状腺素蛋白作为S值分别对应原体(a)、四聚体(b)和更高分子物质(c)的多种物质(插图)沉降。
4.2亚基交换的质谱分析
如之前已经描述的用同位素[15N]和[15N，13C]对重组野生型、L55P和V30M运甲状腺素蛋白变体进行生物合成标记(Keetch CA等，2005)。在分析前，立即采用Micro Biospin柱(Bio-Rad，UK)将所述蛋白缓冲液交换成20mM乙酸铵(pH为7.0)。通过在DMSO中的2倍摩尔过量的4ajml5或作为对照物的单独的2.5％DMSO存在下孵育[15N]和[15N，13C]标记的蛋白的等摩尔溶液(4.4μM)将运甲状腺素蛋白的亚基组分作为时间的函数监测。由于已知低温下亚基交换加快，在室温和4下各实验重复进行三次。在QToF2仪上进行纳流量ESMS(Waters/Micromass UK，Ltd.)，所述QToF2仪经过改进以进行高质量操作(Sobott等，(2002))并采用碘化铯(100mg/ml)进行外部校正。如所述将各溶液(1.5μl)从室内制备的金涂布的硼硅酸盐毛细管电喷雾(Nettleton EJ等，1998)。为了保持所述运甲状腺素蛋白四聚体内的非共价相互作用，采用了如下的MS参数：毛细管电压1.6kV，样品椎孔电压160V，萃取椎孔电压20V，离子转移台压力7.0×10-3mbar，四极杆分析器压力9.5×10-4mbar和ToF分析器压力1.7×10-6mbar。采用MassLynx软件(Waters/Micromass UK，Ltd.)进行数据处理并通过最小光滑而不进行背景减法来表示。如图7中所示的野生型运甲状腺素蛋白亚基交换表明：4ajml5配体阻止在天然条件下和以生物相关时标发生的所有亚基交换(Scheider F等，2001)。采用变体V30M和L55P也观察到了相同的效果(数据未显示)。
图7显示了在DMSO(A)和2倍过量配体(B)、4×[15N]单体的四聚体S、4×[13C，15N]单体的四聚体D存在下在非解离MS条件下取得的[15N]和[13C，3N]野生型运甲状腺素蛋白(4.4μM)的质谱图。两天后在室温和4℃记录的对照样品的质谱显示了明显的亚基交换和在4ajml5存在下7天后完全没有交换。在解离质谱条件下也取得了带配体的野生型运甲状腺素蛋白的各谱图，证实所述配体完全结合到运甲状腺素蛋白(未显示)。
在进一步实验中对比了mds84和Fx-1006A抑制L55P变体运甲状腺素蛋白中亚基交换的能力。此最稳定的运甲状腺素蛋白变体快速地进行自发且大量的亚基交换，如图8所示。图9-11显示了mds84摩尔比降低对亚基交换抑制的影响。图12-14显示了相同分析中Fx-1006A摩尔比降低的影响。图15表明：在这里显示的摩尔比下，各配体完全吸收到带四聚运甲状腺素蛋白分子的复合体中。显然每摩尔运甲状腺素蛋白结合一摩尔mds84且这种结合完全抑制了所有亚基交换。在较低mds84摩尔比下，发生一些交换，但结合mds84的运甲状腺素蛋白分子仍然完全是稳定的。相比之下，通过Fx-1006A进行完全稳定化需要每摩尔运甲状腺素蛋白结合两摩尔配体，在较低摩尔比下，稳定化明显有效性减弱。
4.3. 4ajml5从野生型和促淀粉样变蛋白变体运甲状腺素蛋白解离的质谱分析
在诱导配体从野生型运甲状腺素蛋白和促淀粉样变蛋白变体V30M和L55P运甲状腺素蛋白逐渐解离的椎孔电压不断提高的条件下取得ESMS谱图。随着椎孔电压提高，四聚体峰中的分裂变得明显，配体开始解离时对应apo(单独蛋白)和holo(蛋白+配体)运甲状腺素蛋白。配体解离的开始和/或apo运甲状腺素蛋白峰的高度表明4ajml5的相对结合亲和力为野生型运甲状腺素蛋白＜V30M运甲状腺素蛋白＜L55P运甲状腺素蛋白。实际上，仅在比野生型更高的碰撞能时观察到4ajml5从L55P运甲状腺素蛋白解离(图8)。
图16显示了[15N]L55P运甲状腺素蛋白和[15N，13C]野生型运甲状腺素蛋白在2倍过量4ajml5中的等摩尔溶液(4.4μM)的质谱。图16A显示了配体解离过程中运甲状腺素蛋白四聚体图谱。图谱β中，观察到4ajml5开始从野生型四聚体解离出来(a)而没有观察到配体从L55P运甲状腺素蛋白解离出来。谱图γ中，从野生型运甲状腺素蛋白解离随着碰撞能提高而发展，但是直到谱图δ，其中约50％的野生型为apo，观察到配体从L55P运甲状腺素蛋白解离出来(a)。图16B显示了谱图δ的四聚体部分的靠拢，VA＝apo L55P，VH＝holo L55P，WA＝apo野生型，WH＝holo野生型)。
在相同能量水平配体开始从V30M运甲状腺素蛋白解离出来但是对应apoV30M运甲状腺素蛋白的峰高度比野生型低(图17)。由于这两种物质具有非常类似的氨基酸序列(和因此在MS电离过程中充电类似)，它们能相互作为内标。因此，apo V30M的峰高比apo WT低，表明apo V30M的比例比apo WT低。较高能量水平时，apo V30M一直比apo WT低，当配体完全从WT解离出来时，一部分holo V30M仍然存在。这些结果清楚地表明：较不稳定的促淀粉样变蛋白变体运甲状腺素蛋白四聚体比野生型更强地结合4ajml5。
图17显示了[15N]V30M运甲状腺素蛋白和[15N，13C]野生型运甲状腺素蛋白在2倍过量配体中的等摩尔溶液(4.4μM)的质谱。A中，各种充电状态下，在4ajml5开始解离时(图谱β)，对应apo V30M运甲状腺素蛋白的峰高比野生型(分别标记成a和a)低。高能量水平时(γ)，配体完全从野生型解离出来而一部分holoV30M(h)仍然存在。B中，谱图β的四聚体部分的靠拢表明：apo V30M的峰高平均为～45％，而野生型的峰高为接近75％。VA：apo变体(V30M)，VH：holo变体(V30M)，WA：apo野生型，WH：holo野生型。
5.X-射线结晶分析
在Blake及其合作者(1978)在确定运甲状腺素蛋白的3D结构的创造性工作后，Protein Data Bank(蛋白数据库)现在包含大量的相关结构。这些包括采用基于实验室的X-射线源和同步辐射确定的淀粉样变性有关的变体蛋白和一系列配体复合体的结构。Cody及其合作者(Neumann等，2005)已经确定一些带有结合的甲状腺素的结构、运甲状腺素蛋白的天然配体和类似物，并强调与电子密度图解释相关的问题和当配体位于晶体对称轴上时这些复合体的提炼。一些保藏在数据库中的其它蛋白-配体复合物还未高清晰确定且图谱翻译可能过多地依赖于其它结构。我们已对运甲状腺素蛋白-配体复合物进行了一些高清晰结构分析，有时重复早前的工作，那些工作提供了文献中无法得到的关于配体结合部位特征以及它如何可能成为结合亲合性高的药物的靶标的关键观点。5.13，5，3′，5′-四碘-L-甲状腺原氨酸(L-甲状腺素，T4)
采用悬滴法在室温下两周内生长出带有结合的L-甲状腺素(T4)的运甲状腺素蛋白晶体。各滴含有2μl的24mg/ml运甲状腺素蛋白、1μl的30mM T4/50％二甲亚砜(DMSO)和3μl由50mM乙酸钠缓冲液(pH为4.0)、100mM NaCl和25％聚乙二醇550单甲醚(PEG 550MME)组成的适当溶液。在欧洲同步辐射源(European Synchrotron Radiation Source，ESRF)的光束线ID14.2上100K处收集数据并用Mosflm(Leslie，1992)、CCP4suite的程序(CCP4，1994)和SHELX(Sheldrick和Schneider，1997)处理。结构确定的统计数据显示于下表3中。
T4是血液中发现的主要甲状腺激素形式但仅10-15％由运甲状腺素蛋白携带(Hamilton等，2001)。目前国际蛋白数据库中有7种结合到各种运甲状腺素蛋白的T4结构，其中IETB结构(
Figure GPA00001142749800301
分辨率)代表保藏至今的T4和天然人类运甲状腺素蛋白的最高分辨结构(Hamilton等，1993)，尽管已经报道了单独的天然运甲状腺素蛋白和药物复合物的更多新近的高分辨结构，包括显示出逆向模式结合的二溴苯并噁唑复合物(Johnson等，2008)。我们已揭示细胞大小为(
Figure GPA00001142749800302
90°x90°x90°，P21212)的运甲状腺素蛋白-T4复合物结构到
Figure GPA00001142749800303
的明显更高的分辨率。这种结构能更详细地分析并定义各运甲状腺素蛋白亚基上三个卤素结合袋，其中高清晰数据能更精确地定义T4分子所具有的多种构象。图18显示了a)显示出四个单体和两个L-甲状腺素分子位置的运甲状腺素蛋白四聚体，和b)显示出三对卤素结合袋(内、中、外)位置和结晶学2重(crystallographic 2-fold)(虚线)的运甲状腺素蛋白四聚体。
这种空间群的配体结合部位(对目前已揭示的大多数运甲状腺素蛋白普遍)横跨二重对称轴。从而，T4的两个方向可构建到密度中。在两个方向上，T4以正向结合而碘朝着蛋白中心，处理了一些其它低分辨率结构中看到的模糊不清状态(Muziol等，2001)。此外，高质量图能让我们准确地确定运甲状腺素蛋白结合部位内卤原子对可达到的三个不同位置，在新配体开发和优化中提供了关键指导。这些观察超出了目前已公开文献的范围(Johnson等，2005)。
5.2 4ajml5
采用悬滴法在室温下两周内生长出带有结合的4ajml5的运甲状腺素蛋白。各滴含有1μl的10mg/ml运甲状腺素蛋白、1μl浆液，其在含有60％DMSO的10mM乙酸钠(pH为6.0)缓冲液中含有约10mM 4ajml5，和2μl由70mM乙酸钠缓冲液(pH为4.0)、100mM NaCl和25％PEG 550MME组成的适当溶液。在ESRF的光束线ID14.2上100K处收集数据并用Mosflm(Leslie，1992)、CCP4suite的程序(CCP4，1994)和SHELX(Sheldrick and Schneider，1997)处理。结构确定的统计数据显示于下表3中。
二价配体4ajml5由在3位和5位的氯取代基的联芳基胺化合物形成，其通过各头基上的氧与11个碳原子的连接基交联。已报道这种化合物的头基被运甲状腺素蛋白四聚体牢固地结合，其氯取代环朝着所述蛋白的外部(Oza等，2002)。这种方向的选择也可来源于T4结合的观察，其中外部卤原子占据了特定部位而内部卤原子分布在两位置之间。使运甲状腺素蛋白与4ajml5化合物共结晶并收集数据。该晶体与运甲状腺素蛋白和T4的复合物处在相同的空间群中。然而，发现该配体的电子密度是模糊的。根据我们对运甲状腺素蛋白-T4复合物结构的研究，我们能确定：4ajml5在四个方向结合，两个是与以前一样的对称轴，但另外两个取决于该化合物在内部和外部卤袋之间的往复运动。跟预料相反，似乎4ajml5穿过运甲状腺素蛋白四聚体中间结合，其中各头基在与文献中已报道的方向相反的方向结合。图19显示了证明内部和外部卤素原子袋之间滑移效应的4ajml5的两个方向。卤素显示为大球。由于各运甲状腺素蛋白分子的两个配体结合部位之间的距离为仅而连接基的中心11个碳原子链为约
Figure GPA00001142749800312
各4ajml5分子可仅与占据内部卤素原子结合袋的一个头基结合，而第二个被迫进入外部卤素原子结合袋。根据这个观察并结合表明4ajml5被运甲状腺素蛋白高亲合力结合的生理数据，我们设计了一种新型配体，定名为mds84，其具有相同的头基但连接基短些，仅含7个碳原子。
5.3 mds84
采用悬滴法在室温下两周内生长出带有结合的mds84的运甲状腺素蛋白晶体。各滴由如下组成：3μl浆液，其在含有60％DMSO的10mM乙酸钠缓冲液(pH为6.0)中含有约15mg/ml运甲状腺素蛋白和25mM mds84；和由70mM乙酸钠缓冲液(pH为4.5)、100mM NaCl和25％PEG 550MME组成的3μl适当溶液。在ESRF的光束线ID14.2上100K处收集数据并用Mosflm(Leslie，1992)、CCP4suite的程序(CCP4，1994)和SHELX(Sheldrick and Schneider，1997)处理。结构确定的统计数据显示于下表3中。
在格勒诺布尔ESRF收集的与较短的7个碳原子连接的回文联芳基化合物mds84复合的运甲状腺素蛋白晶体的分辨率为
Figure GPA00001142749800313
的数据证实：其穿过运甲状腺素蛋白四聚体中间结合。更短的连接基链长使各头基能占据内部更高亲合力的卤素原子结合袋。图20显示1,0x sigma形成的显示出两个对称相关的mds84分子的2Fo-Fc密度。看到内部卤素原子结合袋中的氯取代环和7个碳原子连接基的清晰密度。生物物理测量表明该化合物被运甲状腺素蛋白四聚体牢固地结合。
4ajml5和mds84的氯取代基朝着运甲状腺素蛋白原体(参考原体)的G和H线凸出而结合袋被相邻的肽主链和侧链原子限定。最靠近的接触通过H线进行。该线与局部对称轴相关原体的H′线形成反向平行β折叠以组成晶体的不对称单元。不到的范德华相互作用主要通过Serll 7、Thrl 18和Thrl 19的主链原子实现。氯的封闭通过一系列更远的原子完成。相邻晶体对称相关亚基的G线的Leul 10侧链夹着氯取代芳香环但原子Cβ和Cδ2″位于参考原体氯原子的
Figure GPA00001142749800322
内。连接基原子和邻氨基苯甲酸环通过Leul7(A线)、Lysl5(A线)、Vall 21(H线)、Ala 108(G线)及其晶体对称体的侧链封闭。酸性基靠近两个Lysl5残基的末端侧链氨基。限定结合mds84的运甲状腺素蛋白复合物中的氯原子袋的相邻物显示于图21中。
表3结合到测试化合物的运甲状腺素蛋白晶体的结构确定统计数据
Figure GPA00001142749800323
  (外壳)
  R因子   21.3   21.9   17.5
  R自由   25.9   24.5   20.7
选定化合物的结构式
Figure GPA00001142749800331
双氯芬酸
Figure GPA00001142749800332
2-(3，5-二氯苯氨基)苯甲酸
Figure GPA00001142749800333
4ajml5
mds84
Figure GPA00001142749800341
甲状腺素
Fx-1006A
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Claims (19)

1.用于稳定运甲状腺素蛋白四聚体形式的试剂，所述试剂包含通式(I)的化合物或其药物学上可接受的盐、酯或前体药物：
Figure FPA00001142749700011
其中：
每个Y独立为直接键(direct bond)或-CH2-；
每个X独立为-NH-、-O-、-S-、-CH2-、-NR-、-CO-、-CONH-、-CONR-、-C＝N-O-、-NHCO-、-NRCO-、-O-N＝C-、-SO-、-SO2-或直接键，其中：R1、R2、R3和R4各自独立为F、Cl、Br、I、CF3、OCF3、R′、OR′、NR′R′、SOR′或SO2R′，
其中R和R′各自独立为C1-C3烷基，所述C1-C3烷基为任选被一个或多个卤原子取代的直链或支链或环状烷基；
m、n、p和q各自独立为0-4，其中m+n+p+q＞0；
且其中连接基为7-13个碳原子的直链或支链，其中一个或多个碳原子任选被杂原子代替，其中所述链为未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括卤素、O或N原子、或OH、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基或C1-C3烷氧基。
2.根据权利要求1所述的试剂，其中m＝q＝0。
3.根据权利要求1或2所述的试剂，其中n＝p＞0。
4.根据权利要求3所述的试剂，其中n＝p＝2。
5.根据权利要求4所述的试剂，其中带有R2和R3的环是各自相对X间位二取代的。
6.根据以上任一项权利要求所述的试剂，其中R2和R3各自独立为I、Br、Cl、F。
7.根据权利要求6所述的试剂，其中R2和R3各自为Cl。
8.根据以上任一项权利要求所述的试剂，其中X为NH。
9.根据以上任一项权利要求所述的试剂，其中Y为直接键。
10.根据权利要求1所述的试剂，其中所述连接基为-O-(CH2)r-O-，其中r为5-11的整数。
11.根据以上任一项权利要求所述的试剂，所述试剂包含同型二价化合物。
12.根据权利要求1所述的试剂，所述试剂为下式化合物或其药学上可接受的盐或酯：
Figure FPA00001142749700021
13.根据权利要求1所述的试剂，所述试剂为下式化合物或其药学上可接受的盐或酯：
Figure FPA00001142749700022
14.用于治疗或预防运甲状腺素蛋白淀粉样变性的以上任一项权利要求所述的试剂。
15.根据权利要求14所述的试剂，其中所述运甲状腺素蛋白淀粉样变性包括系统性运甲状腺素蛋白淀粉样变性。
16.根据权利要求1-13中任一项所述的试剂在制备用于治疗或预防运甲状腺素蛋白淀粉样变性的药物中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述运甲状腺素蛋白淀粉样变性包括系统性运甲状腺素蛋白淀粉样变性。
18.药物组合物，所述药物组合物包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体混合的权利要求1所述的试剂。
19.一种稳定有此需要的患者中运甲状腺素蛋白四聚体形式的方法，所述方法包括将治疗量的权利要求1所述的试剂或权利要求18所述的药物组合物给药于所述患者。
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