CN101870958B

CN101870958B - 一种类芽孢杆菌及其在环境工程中的应用

Info

Publication number: CN101870958B
Application number: CN2010101666469A
Authority: CN
Inventors: 谢玉清; 顾美英; 茆军; 唐琦勇
Original assignee: INSTITUTE OF MICROBIOLOGY XINJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: INSTITUTE OF MICROBIOLOGY XINJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2010-05-10
Filing date: 2010-05-10
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2030-05-10
Also published as: CN101870958A

Abstract

本发明公开一种类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.Y24-1)CGMCC No.3700及其产生的絮凝剂在去除废水中的悬浮物、染色剂和重金属方面的应用。该菌对Pb²⁺离子吸附率90.535％；Hg²⁺78.74％，对Cu²⁺、Co²⁺、Zn²⁺的吸附率分别为18.457％、15.853％和19.365％。将菌株进行发酵培养，取发酵液经离心，上清液加入1.5倍体积的无水乙醇，混匀后4℃下静置，析出的沉淀物离心，所得的沉淀物经乙醇洗涤、真空干燥制备获得，絮凝活性为81.7％-83.15％，可广泛应用在去除废水中的悬浮物、染色剂和重金属等方面具有广泛的应用。

Description

一种类芽孢杆菌及其在环境工程中的应用

技术领域

本发明属于微生物菌种资源应用环境工程的技术领域。具体说，涉及一种类芽孢杆菌新种及其应用环境工程的应用的技术领域。

背景技术

目前，在环境工程技术中，絮凝沉降法是应用广泛、成本较低的方法之一，而这一过程中的关键是选用和投加性能优良的絮凝剂。絮凝剂主要有三类。一是低分子无机盐类，如铝盐和铁盐等，用量较大，易造成二次污染，影响人体健康；二是合成高分子絮凝剂，絮凝速度快，效率高，但存在生物降解难，残留单体有毒等问题；三是天然有机高分子絮凝剂具有选择性强、无毒、价格便宜、易于降解、无二次污染和再生等优点，是目前絮凝剂研究的热点，但较弱的絮凝活性却限制了其进一步推广应用。

天然有机高分子絮凝剂由微生物产生，主要包括糖蛋白、粘多糖、纤维素和核糖等成分，每一株菌所产生的絮凝剂成分与特性均有所差异。

在自然界中，可产生多糖类黏性物质的微生物菌株较多，但由于研究水平与实验、生产应用技术的限制，目前仅有少数的几种物质在生物技术领域得到广泛应用。微生物资源是一种重要的生物资源。在理论上，一个新菌种的发现意味着新特性、新产物、新功能的发现，具有潜在的应用价值，微生物多糖等黏性物质产生菌即是如此，新功能与特性的多糖类物质的发现是适应现代工业多元化的需求。

微生物多糖类黏性物质具有多种特异性的生化特性与生理功能，可用做医药、保健品开发等，同时也可做为絮凝剂在环境工程应用，具有絮凝水体悬浮物、吸附重金属离子与色素类物质的功能，以及安全无毒、不污染环境的特性，是继无机和有机合成高分子絮凝剂后的第三代絮凝剂，成为生物工程领域生物技术研发的热点。

目前已发现可产生絮凝剂的微生物种类较多，涉及细菌、放线菌、真菌，如20世纪80年日本的仓根隆一郎筛选出红平红球菌(Rhodococcu.Erythropolis)S-1{王镇，王孔星等，几株絮凝剂产生菌的特性研究[J]，微生物学通报，1995，35(2)：121-129)}、Nocardia sp.WSH-A11(陈坚等.从诺卡氏菌制备的一种生物絮凝剂，ZL011080450.)、毛霉属菌4c-1(张蔚萍等，微生物絮凝剂产生菌的筛选及鉴定，环境与可持续发展，2009，3：13-14.)等。

微生物絮凝剂除可去除水体中的颗粒悬浮物外，还可以去除染料及重金属离子等物质，如微生物菌株M-127产生的絮凝剂对染料废水具有良好的脱色效果(杨劲峰，赵继红等.微生物絮凝剂用于染料废水脱色及其动力学研究，化工科技2009，3：16-19.)、菌株C1对次亚基兰溶液具有较好的脱色结果(吴涓，费文砚.微生物絮凝剂的絮凝特性及其脱色能力的研究.生物学杂志，2008，2：30-32，10.)、胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)产生的微生物絮凝剂对不同的重金属离子具有不同的去除效应(姚敏杰，连宾.微生物絮凝剂对高浓度重金属离子废水絮凝作用研究.环境科学与技术，2009，11：1-4.)等。

生物絮凝法去除的染料及重金属离子往往是有毒害的，对产生絮凝作用的菌株具危害性。同时，在环境中即使是痕量的残留对人也具有危害性，这一点逐步被人们所认识，有关微生物絮凝剂对有毒化合物及重金属的去除原理的研究也得到了深入。据相关报道，目前仅有日本筛选出红平红球菌(Rhodococcu.Erythropolis)所产的絮凝剂同时具备了水相悬浮物、多种染料与多种重金属离子的絮凝去除能力。

类芽孢杆菌属细菌由A sh于1993年从芽孢杆菌属中分出，由于能够形成具有较强抗逆能力的芽孢，是芽孢杆菌中具有较高应用潜力的菌种之一。近年来，国内外对于类芽孢杆菌各方面应用的报道日益增多。在植物病害防治方面，类芽孢杆菌属所产生的一些蛋白类物质如抗菌蛋白、肽类物质、胞外多糖、酶活性物质，具有抑制植物病原菌、诱导植物产生抗病性、产生促生长物质，固氮等作用[赵德立等.多粘类芽孢杆菌JW-725抗菌活性物质及其发酵条件的初步研究.植物保护，2006：32：47-50]；在环境污染治理方面，类芽孢杆菌属的一些菌种可产生高活性的絮凝物质[阮敏等.多粘类芽孢杆菌GA1所产絮凝剂的絮凝性能研究及机理探讨.环境科学，2007，28(10)：2336-2341]；此外还可降解微囊藻产生的微囊藻毒素[刘海燕等.微囊藻毒素降解菌S3的分子鉴定及其降解毒素的研究.环境科学学报，2007，27(7)：1145-1150]；高效降解油脂[刘婕等.一株高效油脂降解菌的分离鉴定及其性能研究.中国油脂，2010，35(1)：1145-1150]等。类芽孢杆菌属具有多种生物学特性与功能，是具有重大工业开发前景的一类微生物。随着研究的深入新的菌种及特性正逐步被发现及应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的微生物资源类芽孢杆菌新菌，可产生胞外多糖类黏性物，并从制备的絮凝剂具有絮凝固体悬浮物及吸附染色剂与重金属离子活性，具有较好的应用前景。

本发明通过一株从新疆沙漠沙土样本中筛选分离的多糖类黏性物产生菌，Y24-1获得生物絮凝剂产生菌及具有固体悬浮物及吸附染色剂与重金属离子活性的生物絮凝剂。

本发明具体提供了一株类芽孢杆菌Y24-1，经微生物分类学检测鉴定，确定为类芽孢杆菌属新种。目前，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期是2010年3月26日，保藏号是CGMCC No.3700。经微生物多相分类鉴定确定其为类芽孢杆菌新种，其生物学名称暂定为类芽孢杆菌(Paenibacillussp.Y24-1)，确定该菌建议的分类命名为Paenibacillus sp.。

本发明提供的菌株类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.Y24-1)CGMCCNo.3700，生长在察氏培养基上，采用察氏培养基NaNO₃ 3g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，蔗糖30g，H₂O 1000ml，加热溶解，分装后121℃灭菌20min，经培养菌体表面，菌落呈圆形、边缘整齐、凸起、粉红色、透明、黏稠不易挑取。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》及《常见细菌鉴定手册》对Y24-1菌株进行分类鉴定，结果显示其16S rRNA基因与类芽孢杆菌属(Peanibacillus)菌株最为相近，其最高相似性为95.1％。以BiologMicrostation系统的GP2测定卡进行测试，测定其反应阳性结果，判定为类芽孢杆菌属一新种，确定该菌建议的生物学命名为Paenibacillus sp.Y24-1。

本发明提供的菌株Y24-1，可在适合其增殖的固体培养基或液体培养基中进行增殖培养。利用常规固体斜面培养培养、低温保藏的方法，每次传代可保藏3个月以上；以干燥冷冻法制做的长期保藏菌种，可保藏1年以上；或是以液体石腊包埋法及甘油管进行长期保藏。菌株可通过紫外、⁶⁰Co、离子束、化学诱变剂等进行生物处理方法以提高其生物活性。

Y24-1菌株在不同的发酵培养基上絮凝活性有所不同。其中察氏培养基絮凝活性较高，在48h能达到82.7％的絮凝活性；而PDA培养基在24h絮凝活性达79.8％，且随着时间的推移，絮凝活性存在波动。

Y24-1菌株在PDA培养基中对5种重金属离子均有一定的吸附作用，其中对Pb²⁺离子的吸附效果最好，吸附率达90.535％；Hg²⁺其次，为78.74％，对Cu²⁺、Co²⁺、Zn²⁺的吸附率分别为18.457％、15.853％和19.365％。而在察氏培养基中对Zn²⁺吸附效果明显高于PDA，其它离子的去除效果不如PDA效果好。

Y24-1菌株对Pb²⁺和Co²⁺有较高的耐受性，而对Hg²⁺的耐受性较低。

进一步，本发明提供了类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.Y24-1)CGMCCNo.3700制备絮凝剂的制备方法，将菌株类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.Y24-1)CGMCC No.3700在PDA和察氏培养基中进行发酵培养48h，取100ml发酵液在6000rpm条件下离心10min，上清液加入1.5倍体积的无水乙醇，混匀后4℃下静置过夜，析出的沉淀物在6000rpm条件下离心30min，所得的沉淀物用70％的乙醇洗涤2～3次，真空干燥获得絮凝剂粗品。在PDA和察氏培养基中其产量分别为3.8g/L和14.7g/L。

Y24-1所产絮凝剂对碱性品红、溴甲基酚绿、曙红、亚甲基兰这几种色素具有一定的脱色效果，其中对曙红的脱色率为57.7％，表明Y24-1菌株所产生的絮凝剂可在某些染色剂废水处理方面应用。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果：

1、定向筛选到类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.Y24-1)CGMCC No.3700，可用常规的碳氮源进行发酵培养，筛选菌株对多种重金属离子及染色剂具有抗性，可直接在废水中进行培养吸附处理。

2、发酵产量高，发酵培养物可直接用作絮凝，絮凝活性最高可达79.8％～82.7％；对多种染色剂有一定的脱色效果，其中对曙红的脱色率为57.7％；重金属离子吸附方面，对Pb²⁺和Hg²⁺的吸附效果较好，分别为90.535％和78.74％。絮凝剂可广泛应用在去除废水中的悬浮物和在去除废水中的染色剂领域，同时制备的絮凝剂在去除废水中的重金属方面具有广泛的应用。

3、发酵培养温度接近室温，提取容易，生产工艺简单，生产成本低。

具体实施方式

以下是本发明提供的菌株仅在环境工程领域水相颗粒物絮凝、染色剂及重金属离子吸附方面的应用试验实例，本发明提供的菌株的应用领域与实施方法并不限定于此。

发明如无特别说明，在以下实施例中采用如下基础培养基。

PDA培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，加20g葡萄糖，121℃灭菌20min左右。

察氏培养基：NaNO₃ 3g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，蔗糖30g，H₂O 1000ml，加热溶解，分装后121℃灭菌20min。

实施例1：类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.Y24-1)CGMCC No.3700的培养、鉴定

通过从新疆沙漠沙土样本中分离筛选的类芽孢杆菌Y24-1，经微生物分类学检测鉴定，确定为类芽孢杆菌属新种。目前，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期是2010年3月26日，保藏号是CGMCC No.3700。经微生物多相分类鉴定确定其为类芽孢杆菌新种，生物学名称暂定为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.Y24-1)，确定该菌建议分类命名为Paenibacillus sp.。

本发明提供的菌株Paenibacillus sp.CGMCC No.3700，生长在察氏培养基上，采用察氏培养基NaNO₃ 3g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO₄·7H₂O0.01g，蔗糖30g，H₂O 1000ml，加热溶解，分装后121℃灭菌20min，经培养菌体表面，菌落呈圆形、边缘整齐、凸起、粉红色、透明、黏稠不易挑取。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》及《常见细菌鉴定手册》对Y24-1菌株进行分类鉴定，结果显示其16S rRNA基因与类芽孢杆菌属(Peanibacillus)菌株最为相近，其最高相似性为95.1％。以Biolog Microstation系统的GP2测定卡进行测试，其测定反应阳性结果如下表1所示，判定为类芽孢杆菌属一新种，确定该菌建议的生物学命名为Paenibacillus sp.Y24-1。

表1 Biolog Microstation System GN2检测卡测试结果

测试项	结果
		环糊精、糊精、甘露聚糖、吐温40、吐温80、醋酸、γ-羟基丁酸、α-酮戊二酸、丙酮酸、琥珀酰胺酸、琥珀酸、2-脱氧腺苷、肌苷、D-洛酮糖	阳性

实施例2：类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.Y24-1)CGMCC No.3700对重金属离子的耐受性

将Y24-1菌株分别接种于含不同浓度的Pb²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺的PDA固体培养基平板上，30℃恒温培养，检测其生长状况。其测定结果如表2所示。

表2 Y24-1菌株对不同重金属的耐受性实验(浓度单位mg/L)

	50	100	200	300	400	500	600	700	800	900	1000	1100	1200
														Pb²⁺	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Cu²⁺	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Co²⁺

+

Hg²⁺

+

-

Zn²⁺

+

-

注：+为生长，-为不生长

由表2结果可知Y24-1菌株对Pb²⁺和Co²⁺的最大耐受范围＞1200mg/L，Cu²⁺的最大耐受范围为100mg/L，Hg²⁺的最大耐受范围为50mg/L，Zn²⁺的最大耐受范围为900mg/L，说明Y24-1菌株对Pb²⁺和Co²⁺有较高的耐受性，而对Hg²⁺的耐受性较低。

实施例3：类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.Y24-1)CGMCC No.3700培养过程对重金属离子的吸附活性

在菌株的耐受性范围内，配制不同浓度的Pb²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺的PDA和察氏发酵培养基，其浓度分别为1000mg/L、100mg/L、800mg/L、50mg/L和700mg/L，接入Y24-1菌株于30℃、150r/min恒温振荡培养48小时，6000rpm离心5min，取上清液测定其不同重金属的含量，计算该菌对不同重金属的吸附能力。其吸附率计算公式为：r＝(B₀-B₁)/B₀×100％，该式中，B₀为不加菌液的培养基中重金属的浓度，B₁为加菌液培养后的重金属的浓度。结果如表3所示。

不同重金属离子的测定方法参照《EDTA及其同类化合物的分析应用》(蒲希比，R.著，赵亢臣译，地质出版社，1982)的方法进行。Pb²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Zn²⁺采用二甲酚橙显色法，Hg²⁺采用甲基百里香酚蓝显色法。

由表3结果可知不同培养基对重金属的吸附效果是不一样的。Y24-1菌株在PDA培养基中对5种重金属离子均有一定的吸附作用，其中对Pb²⁺离子的吸附效果最好，吸附率达90.535％；Hg²⁺其次，为78.74％，对Cu²⁺、Co²⁺、Zn²⁺的吸附率分别为18.457％、15.853％和19.365％。而在察氏培养基中对Zn²⁺吸附效果明显高于PDA，其它离子的去除效果不如PDA效果好。

实验结果也说明采用不同的培养基进行发酵培养，可以得到不同性质发酵产物，菌株可以用于高浓度重金属离子的生物处理。

表3 Y24-1菌株对不同重金属的吸附性实验

培养基	金属离子种类	Pb²⁺1000mg/L	Cu²⁺100mg/L	Hg²⁺50mg/L	Co²⁺800mg/L)	Zn²⁺700mg/L
							PDA	吸附率(％)	90.535	18.457	78.74	15.853	19.365
察氏	吸附率(％)	-	-	35.794	-	74.954

实施例4：类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.Y24-1)CGMCC No.3700发酵培养物对多种染色剂的吸附活性

将Y24-1菌株接种于PDA培养基中，30℃、150rpm恒温振荡培养48h。直接以发酵培养物进行染色剂的吸附性能测定。具体的测定方法：在10mL、0.05g/l的碱性品红、红色素(自制微生物红色素)、溴甲基酚绿、曙红、铬黑蓝、亚甲基兰溶液(以pH为7的缓冲溶液配制)中各加入10mL发酵培养物、2mL 1％CaCl₂溶液，振荡混匀后静置10min以上；分别在λ_540nm、λ_530nm、λ_620nm、λ_635nm、λ_510nm、λ_620nm处测定其吸光值，并以不加发酵培养物的色素溶液为空白对照，计算脱色率r＝(A₀-A₁)/A₀×100％，该式中，A₀为不加菌液的吸光度值，A₁为加菌液的吸光度值。结果如表4所示。

表4 Y24-1菌株对不同染色剂的吸附活性

染色剂	碱性品红	红色素	溴甲基酚绿	曙红	铬黑蓝	亚甲基兰
							脱色率(％)	31	-	27.2	57.7	-	43.3

由表4可知，Y24-1所产絮凝剂对碱性品红、溴甲基酚绿、曙红、亚甲基兰这几种色素具有一定的脱色效果，其中对曙红的脱色率为57.7％。

实施例5：类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.Y24-1)CGMCC No.3700发酵培养物对高岭土的絮凝活性

将Y24-1菌株分别接种于PDA、察氏培养基中，30℃、150rpm恒温振荡培养，每隔6h取样一次进行发酵培养物对高岭土的絮凝活性检测。

具体检测方法：取发酵培养物2mL，加入1g/L的高岭土溶液50mL中，静置处理5分钟以上，以λ_550nm光波进行检测其吸光度，其吸光值记作A；以空白发酵培养基为空白对照，其吸光值记作B；絮凝去除率(F)为：[(B-A)÷B×100％]。其测定结果如下表所示。

表5 Y24-1菌株在不同发酵培养基中的絮凝活性

培养基	培养时间(h)	12	18	24	36	42	48	60	66
										PDA	絮凝率(％)	19.3	50.8	79.8	66.3	70.4	72.7	59.9	67.6
察氏培养基	絮凝率(％)	12.8	59.2	74.8	75.9	75.9	82.7	77.0	71.4

表5所示，Y24-1菌株在不同的发酵培养基上絮凝活性有所不同。其中察氏培养基絮凝活性较高，在48h能达到82.7％的絮凝活性；而PDA培养基在24h絮凝活性达79.8％，且随着时间的推移，絮凝活性存在波动。

实施例6：类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.Y24-1)CGMCC No.3700制备絮凝剂的提取及提取物的絮凝活性

按实施例5所示的方法，对菌株Y24-1在PDA和察氏培养基中进行发酵培养48h，取100ml发酵液在6000rpm条件下离心10min，上清液加入1.5倍体积的无水乙醇，混匀后4℃下静置过夜，析出的沉淀物在6000rpm条件下离心30min，所得的沉淀物用70％的乙醇洗涤2～3次，真空干燥得絮凝剂粗品，称重并计算絮凝剂产率；将所制备的絮凝剂重新溶于100ml水中，配制成水溶液，按实施例5中所述方法进行絮凝活性的检测，同时检测发酵培养物絮凝活性，比较两者之间的差异。

表6 Y24-1菌株在不同培养基上絮凝剂的提取效果

培养基	产量(g/L)	提取前絮凝率(％)	提取后絮凝率(％)
				PDA	3.8	71.1	73.6
察氏培养基	14.7	82.6.	84.83

由表6可以看出在进行絮凝剂的制备过程中，不同的培养基所提取的物质具有不同的絮凝特性，且提取后该絮凝剂的有效成分基本保留且絮凝效果略有提高，所得的絮凝剂粗品也可直接用于废水絮凝处理。

通过上述实施例，可以充分说明本发明提供的定向筛选的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.Y24-1)CGMCC No.3700，可用常规的碳氮源进行发酵培养，筛选菌株对多种重金属离子及染色剂具有抗性，可直接在废水中进行培养吸附处理。通过发酵工艺制备，发酵培养温度接近室温，提取容易，生产工艺简单，生产成本低。同时发酵产量高，发酵培养物可直接用作絮凝，絮凝活性最高可达79.8％～82.7％；对多种染色剂有一定的脱色效果，其中对曙红的脱色率为57.7％；重金属离子吸附方面，对Pb²⁺和Hg²⁺的吸附效果较好，分别为90.535％和78.74％。絮凝剂可广泛应用在去除废水中的悬浮物和在去除废水中的染色剂领域，同时制备的絮凝剂在去除废水中的重金属方面具有广泛的应用。

Claims

1.一种类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)Y24-1 CGMCC No.3700。

2.如权利要求1所述的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)Y24-1 CGMCC No.3700制备絮凝剂的方法，其特征在于，将所述的菌株类芽孢杆菌(Paenihacillus sp.)Y24-1CGMCC No.3700在PDA和察氏培养基中进行发酵培养48h，取100ml发酵液在6000rpm条件下离心10min，上清液加入1.5倍体积的无水乙醇，混匀后4℃下静置过夜，析出的沉淀物在6000rpm条件下离心30min，所得的沉淀物用70％的乙醇洗涤2～3次，真空干燥制备获得絮凝剂。

3.如权利要求2所述类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)Y24-1CGMCC No.3700制备絮凝剂的方法产生的絮凝剂在去除废水悬浮物中的应用。