CN101868180A - 成像粒子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含金属原子的粒子、制备所述粒子的方法以及使用所述粒子的方法。具体说，所述粒子可用来使生物组织成像或递送生物活性剂。

Description

成像粒子
政府权利
本发明的研究至少部分得到美国国家卫生研究院赛特曼癌症纳米技术中心(National Institutes of Health Siteman Center of Cancer NanotechnologyExcellence)的支持，资助号U54CA119342。因此，美国政府可拥有本发明的某些权利。
相关申请交叉参考
本申请要求2007年10月19日提交的美国临时申请第60/981192号和2007年10月9日提交的美国临时申请第60/978678号的优先权，这些临时申请的完整内容均通过参考并入本文。
技术领域
本发明涉及包含金属和金属化合物的粒子，以及使用这种粒子对生物组织成像的方法。
背景技术
常称作治疗诊断试剂的非侵入性分子成像和靶向药物递送系统经过发展，能够改进检测、促进患者风险分层和位点特异性治疗。本领域需要开发治疗诊断试剂，使之可用于广泛的成像技术，如X射线成像、CT成像、光谱CT成像(K-缘成像)、超声成像、磁共振成像、正电子发射断层成像、光学和光声断层成像。
光谱CT成像
常规CT利用X射线产生在检对象的X射线吸收断层图像，涉及的主要物理吸收效应是所谓的光电效应和康普顿效应。这两种效应均依赖于元素的原子序数、质量密度和能量。生物组织主要由多种低原子序数元素混合而成，只有钙的原子序数和密度稍微大一点。因此，CT的对比度主要由空气、软组织和骨(或其他钙化物)之间的较大对比度决定。不同类型的软组织仅显示有限的对比度，此对比度通常与密度差直接相关。CT对比剂基于具有高原子序数的重元素，如碘。早期人们曾试图利用吸收对能量的依赖性改善CT的对比度，虽然技术上是成功的，但临场价值有限。这些所谓的双能技术利用两个主要吸收效应之间的元素依赖性差异提供额外的对比度。
双能CT测量技术仅具有低的能量分辨率。利用具有良好光谱分辨率的先进检测器技术，可以克服此限制。这种检测器基于能区分能量的光子计数器件。与常规检测器仅测量整个X射线光束损失的能量不同，它检测的是每个光子及其能量。光谱CT能将CT的吸收对比度提高到其物理极限。尽管好于常规CT，但光谱CT的临床价值增加有限，因为生物组织的元素组成在X射线吸收上没有很大差异。
但是，当光谱CT与K缘成像组合使用，则此种情况将大为改观。光电吸收在某些能量处包含一些强共振效应。若X射线光子包含的能量足以激发K层电子，则吸收将急剧增加。K缘能量取决于元素的原子序数。钆、金或铋的K缘处于CT的X射线能带内。这些元素的光谱印记(spectral footprint)与光谱CT检测器技术结合，可提供独特的成像特征。利用光子计数检测器的高能量分辨率和恰当的数学处理方法，可完整分离K缘材料与其余元素的衰减。光谱CT K缘成像可视为两种同步识别技术，其中一种仅对K缘材料敏感，另一种仅仅是常规CT。两种成像任务(组合在单次实际扫描中)提供各自独立的像。K缘图像仅显示K缘材料，与仅显示同位素的PET或SPECT成像类似。另一个图像显示的是常规CT图像，只是不反映K缘材料。业已证明，K缘图像传递了K缘材料浓度的定量信息。
光声断层成像
光声断层成像是基于不同类型的组织对电磁波的吸收不同的非电离成像方式。此成像技术受到生物医学工程师的关注，用于非侵入性成像。光声断层成像(PAT)是一种材料分析技术，其原理是在包围在测光声源的表面上，利用超声扫描检测器获得测量结果，然后根据测量结果重建内部光声源分布。物体吸收外加脉冲电磁(EM)波辐射，温度小幅升高，导致其发生热膨胀，从而在其内部产生PA源。这种技术在生物医学领域具有很大应用前景，因为它结合了超声分辨率和EM吸收对比度两方面的优点。PAT也称光学声学断层照相(OAT)或热声断层照相(TAT)，术语“热声”强调了PA发生过程中的热膨胀机制。OAT特别指光诱导的PAT，而TAT用来表示射频诱导的PAT。
心肌梗死
在全球范围内，不管是男性还是女性，心肌梗死都是位居前列的死亡诱因。在美国，每年有多达200,000-300,000人来不及医治就死去。每年约有130万非致命性心肌梗死病例见诸报告，年发病率约为十万分之六百。令人吃惊的是，每年有300,000左右的美国人心脏病发作后，还没到医院就死亡。心肌梗死的原因大致是冠状动脉斑块破裂，对供血造成血栓性梗塞。
由于Benson和Constantinides的早期工作，人们已经公认动脉粥样硬化斑块破裂后形成的严重血栓是不稳定的心绞痛、心肌梗死、暂时性缺血发作和中风的病源。尽管在检测和医治严重颈动脉和冠状动脉狭窄方面已经取得了许多进展，但是血栓栓塞的最普遍的病源依然是仅50％-60％的残留狭窄的血管内存在的易损斑块破裂。要灵敏地检测和区分中度狭窄的血管中易损和稳定的动脉粥样硬化斑块，血管造影术无论采用何种模式，其作用仍然有限。管腔成像提供的动脉内腔病理信息非常少，为保护患病血管的管腔尺寸而进行的补偿性动脉再造进一步掩盖了动脉粥样硬化斑块负担的严重性。
为检测易损斑块，基于血管内超声弹性成像、放射性核素成像和热成像的许多方法涌现出来，但磁共振成像(MRI)成为非侵入性可视化颈动脉血栓的特别灵敏的方式。遗憾的是，在心动周期里，冠状动脉管系统分布很广，使常规MR冠状动脉血管造影法变得复杂，目前对不稳定斑块内膜微裂纹中的微血栓进行MR分子成像是行不通的。
多层CT已经成为非侵入性冠状动脉血管造影(CTA)的特殊形式。当前的16层和64层扫描仪可在25毫秒或更短的时间内产生对比度增强的血管造影照片，最终要开发出的多达256层的扫描仪将能在一个心搏周期内获取完整信息。尽管像MRA一样，CTA在排除严重冠状动脉疾病方面是最佳的，但人们希望，经改进的血管细节的分辨率能够同时实现更快的数据获取速度以及部分体积稀释和运动伪影造成的模糊的下降。然而，作为动脉粥样硬化成熟斑块和老化冠状动脉管的突出特征，冠状动脉钙依旧给管腔测评带来困难，特别是在可疑区。此外，快速多层成像检测不到内膜微裂纹，衰减CT对比剂即便适应血栓特征，也不易解析管壁上的沉积钙。因此，本领域需要改进的成像剂。
附图说明
图1是具有200nm标称直径和金属原子内核的粒子的示意图。
图2是具有160nm标称直径和金纳米粒子内核的粒子的示意图。该粒子的ζ值约为-30mV。
图3是制备本发明含钆、金和铋的粒子的示意图，其中：(a)反胶团的形成；(b-c)水溶性Gd3+-DTPA或的反转和包封(2-3nm)；(d)用植物油悬浮；(e)有机可溶性Gd-己二酮或辛硫醇封端的AuNP(5nm)；(f)磷脂(任选使用DOPE-COCCH)的配制；(g)抗纤维蛋白抗体/多肽偶联；(h)Cu(I)催化“点击化学(Click Chemistry)”交联；(i)油酸/新癸酸、水合肼；(j)三阶段提纯；(k)用聚山梨醇酯悬浮；(1)磷脂(任选使用DOPE-COCCH)；微流体化。
图4(A)呈现了纤维蛋白凝块的光谱CT断面(上图)和梯度图(下图)，所述纤维蛋白凝块以对照样(a，e)和铋纳米胶体(BiNC)复制样(b-d，f-h)为靶体(标尺：10mm)。(B)是整合的纤维蛋白凝块轴向断面上的铋分布：根据100mm处扫描仪空间分辨率计算结合的铋层厚度，重构图中三维像素尺寸：(100mm)3，铋层厚度：1-2三维像素；铋表面密度根据垂直于表面层的积分计算，对应于100mm层厚上平均3.5质量％的铋。
图5呈现了具有铋覆层的最低能量间隔(energy bin)图像(a)和(b)，以及以铋为基础的光谱CT图像(c)和(d)，它们都属于人颈动脉样本，这些样本分别用对照纳米胶体和铋纳米胶体(BiNC)培养；注意对照样品(a)和(c)中完全没有Bi。
图6呈现了接触罗丹明标记的BiNC的CEA样本的冷冻断面，其中(A)具有纤维蛋白抗体靶，(C)没有纤维蛋白抗体靶，(B和D)用DAPI核染色剂进行复染色(蓝色)。相邻断面的免疫染色表明管腔表面(对应于BiNC罗丹明信号)和斑块内存在纤维蛋白，其中BiNC纳米粒子不可穿透。
图7是脂质包封的磁性氧化物粒子的示意图。
图8显示了脂质包封的磁性氧化物粒子的流体动力学直径。
图9显示了脂质包封的磁性氧化物粒子的ζ电势。
图10显示了脂质包封的磁性氧化物粒子的悬浮体中聚集体的粒度分布和粒度的透射电镜图。
图11显示了脂质包封的磁性氧化物粒子的磁性测量结果，使用的是振动样品磁力计。可忽略不计的矫顽力值和剩磁值(ir/is 8100％＝0.36％)表明，所述纳米粒子具有超顺磁性，这是活体应用所需要的。
图12显示了由脂质包封的磁性氧化物粒子制得的典型疏水性药物(烟曲霉素)的溶出研究结果。
图13显示了靶向富纤维蛋白凝块(箭头所示)的脂质包封的磁性氧化物粒子的磁共振(MR)T1和T2性质。未经处理的对照凝块看的不是很清楚。经处理的凝块在T1和T2加权图像上检测。
图14显示了靶向富纤维蛋白凝块的脂质包封的磁性氧化物粒子的磁共振(MR)T1和T2性质。靶向纤维蛋白凝块后，该试剂增强了高分辨率(0.3x0.3x1.2mm3)T1-w TSE成像信号(b)(SNR＝26)；而未结合试剂的对照凝块(a)的SNR＝10，类似于周围的盐溶液。分辨率较低的梯度回波成像还表明，结合试剂(对照凝块上没有)增强了T1-w(c)，但对T2-w图像的增强具有更长的TE(d)，表明特征信号消失(融入许多相邻三维像素)。(e)如使用体外动脉粥样硬化颈动脉所显示的，这些更大的纤维蛋白特异性超顺磁粒子可以亮反差高度灵敏地检测破裂斑块中的微血栓。
图15显示了利用本发明粒子的磁共振成像研究结果。多重回声-自旋回声获取的信息表明T2效应随浓度和回声时间的增加而增强(即T2加权)。
图16显示了在764nm激光处，全血的A形线信号与悬浮体中金纳米胶体的光声断层成像信号的对比。
发明详述
本发明提供了可用于生物组织成像的粒子。一般而言，所述粒子包含形成于内核上的外层。较佳的是，所述内核可包含至少1个金属原子，且可包含1,000,000个或更多金属原子。
I.本发明粒子
在一些实施方式中，本发明粒子的标称直径可小于约450nm。在其他实施方式中，所述粒子的标称直径可大于约450nm(例如口服用)。在若干实施方式中，所述粒子的标称直径可小于约400nm。在其他实施方式中，所述粒子的标称直径可小于约350nm。在某些实施方式中，所述粒子的标称直径可处于约100nm与约400nm之间。在另一些实施方式中，所述粒子的标称直径可小于约100nm，例如小于90nm，小于80nm，小于70nm，小于60nm，或小于50nm。在一个实施方式中，所述粒子的标称直径可处于约150nm与约350nm之间。在另一个实施方式中，所述粒子的标称直径可处于约200nm与约300nm之间。在某些实施方式中，粒子尺寸会约束试剂向血管的生物分布，通过排除血管外迁移提高靶向特异性。例如，若相同靶标既位于血管内，又位于血管外，则将粒子约束在血管中将减少或避免粒子接触血管外靶标。一般而言，粒子为球形。
(a)内核
本发明的每个粒子都具有内核，所述内核一般由金属原子和油或类油物质组成。一般而言，内核是液体。此外，内核通常是柔软、无孔的。然而，在金属浓度较高时，内核可具有高粘度和高金属密度。内核可以是溶液、混合物或悬浮体。在一个实施方式中，内核可以是溶液。在另一个实施方式中，内核可以是混合物。在又一个实施方式中，内核可以是悬浮体。悬浮体的一个非限制性粒子是胶体。
i.金属原子
在示例性实施方式中，所述粒子的金属原子基本上位于粒子的内核内。然而，在一些实施方式中，可构想金属原子也可位于外层表面上、外层内或者内核或外层的任意组合。例如，金属原子可包含外层的部分脂质头部，或者可包封在外层的亲水性隔室内。在一个实施方式中，金属原子同时位于粒子内核内，又位于外层表面上。
一般地，粒子内核包含至少1个金属原子。在一个实施方式中，内核包含至少2个金属原子，但少于101个金属原子。在另一个实施方式中，内核包含至少100个金属原子，但少于1001个金属原子。在又一个实施方式中，内核包含至少1000个金属原子，但少于100001个金属原子。在又一个实施方式中，内核包含至少100000个金属原子。在一些实施方式中，内核包含至少150000个、至少200000个、至少250000个、至少300000个或至少350000个金属原子。在其他实施方式中，内核包含至少400000个、至少450000个、至少500000个、至少550000个、至少600000个、至少650000个、至少700000个、至少750000个、至少800000个、至少850000个、至少900000个、至少950000个或至少1000000个金属原子。在某些实施方式中，内核包含多于约1000000个金属原子。在另一个实施方式中，内核包含至少足够的金属原子，以便成为有效的MRI、CT、光谱CT、超声、PAT或NIR/光成像剂。在另一个实施方式中，内核为可检测对比度-噪声比(CNR)提供足够的金属。
所述金属原子一般可选自原子序数为20或以上的金属原子。例如，在某些实施方式中，金属原子可以是钙原子、钪原子、钛原子、钒原子、铬原子、锰原子、铁原子、钴原子、镍原子、铜原子、锌原子、镓原子、锗原子、砷原子、硒原子、溴原子、氪原子、铷原子、锶原子、钇原子、锆原子、铌原子、钼原子、锝原子、钌原子、铑原子、钯原子、银原子、镉原子、铟原子、锡原子、锑原子、碲原子、碘原子、氙原子、铯原子、钡原子、镧原子、铪原子、钽原子、钨原子、铼原子、锇原子、铱原子、铂原子、金原子、汞原子、铊原子、铅原子、铋原子、钫原子、镭原子、锕原子、铈原子、镨原子、钕原子、钷原子、钐原子、铕原子、钆原子、铽原子、镝原子、钬原子、铒原子、铥原子、镱原子、镥原子、钍原子、镤原子、铀原子、镎原子、钚原子、镅原子、锔原子、锫原子、锎原子、锿原子、镄原子、钔原子、锘原子或铹原子。在一些实施方式中，所述金属原子可选自原子序数大于20的碱金属原子。在其他实施方式中，所述金属原子可选自原子序数大于20的碱土金属原子。在一个实施方式中，所述金属原子可选自镧系金属。在另一个实施方式中，所述金属原子可选自锕系金属。在再一个实施方式中，所述金属原子可选自过渡金属。在又一个实施方式中，所述金属原子可选自贫金属(poor metal)。在其他实施方式中，所述金属原子可选自金原子、铋原子、钽原子和钆原子。
包含粒子内核的金属原子可以是金属离子。在一些实施方式中，所述金属原子可以是+1、+2或+3氧化态形式。例如，非限制性例子包括Ba2+、Bi3+、Cs+、Ca2+、Cr2+、Cr3+、Cr6+、Co2+、Co3+、Cu+、Cu2+、Cu3+、Ga3+、Gd3+、Au+、Au3+、Fe2+、Fe3+、pb2+、pb4+、Mn2+、Mn3+、Mn4+、Mn7+、Hg2+、Ni2+、Ni3+、Ag+、Sr2+、Sn2+、Sn4+和Zn2+。所述金属离子可包含金属络合物、化合物或螯合物。例如，所述金属原子可包含与二乙三胺五乙酸(DTPA)或庚二酸1，4-丁二酯(TMHD)、2，4-戊二酮、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)、乙二醇-O，O’-二(2-氨基乙基)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)、N-(2-羟乙基)乙二胺-N，N’，N’-三乙酸三钠盐(HEDTA)和氨三乙酸(NTA)的络合物、螯合物或化合物。这些金属络合物、化合物或螯合物可溶于有机溶剂或溶于水。
如上所详述的，在一些实施方式中，金属原子可包含金属化合物。例如，在某些实施方式中，内核可包含多个金属化合物。金属化合物的非限制性例子可包括金属氧化物、金属硫化物、金属磷酸盐、金属碳酸盐和金属铬酸盐。其他例子可包括有机-金属(即有机金属)化合物、有机包覆的金属化合物或尖晶石(spinel)。在一个实施方式中，有机金属化合物的非限制性例子可包括聚山梨酸金属化合物、脂肪酸金属化合物、表面活性剂金属化合物、脂族酸金属化合物、芳族疏水金属化合物或其组合。在另一个实施方式中，有机包覆的金属化合物的非限制性例子可包括脂肪酸金属化合物、表面活性剂金属化合物、金属聚合物化合物(包括合成、天然和半合成聚合物)、脂族金属化合物、芳族疏水性金属化合物或其组合。
在一个实施方式中，金属原子可包含金属氧化物。例如，金属氧化物的非限制性例子可包括氧化铁、氧化锰、氧化钴、氧化铋、氧化金或氧化钆。其他例子可包括磁铁矿、磁赤铁矿或其组合。在某些实施方式中，金属氧化物可具有化学式MFe2O4，其中M选自Fe、Mn、Co、Ni、Mg、Au、Cu、Zn、Ba、Sr、Pt、T1、Ti或其组合。在多个实施方式中，金属氧化物具有磁性。在若干实施方式中，内核可同时包含金属化合物和本文所述的附加金属。例如，内核可包含金属化合物和诸如碘、钆、铋或金的附加金属。一般而言，本发明的金属化合物的直径在约1nm与约50nm之间。例如，金属氧化物的直径约为1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50nm。
粒子的内核可包含有机可溶性和/或水溶性金属络合物。在某些实施方式中，内核可包含钆的有机可溶性络合物，如戊二酮-钆(III)。在其他实施方式中，内核可包含铋的有机可溶性络合物，如新癸酸铋。在一些实施方式中，内核可包含金的有机可溶性络合物，如辛硫醇包覆的金。
在其他实施方式中，内核可包含金属的有机金属络合物。例如，内核可包含2-乙基己酸金。在其他实施方式中，内核可包含钆的有机金属络合物，如2-乙基己酸钆。
本领域的技术人员不难明白，金属的选择部分取决于所用成像方法。此外，成像方法的选择可决定金属原子(或包含金属原子的化合物)的尺寸和金属氧化态。在用于光谱CT的优选实施方式中，金属原子可选自原子序数为53(即碘)至83(即铋)的金属，并采用CT的X射线能带中的K-缘。在用于MR的优选实施方式中，金属原子可具有磁性(例如顺磁性或超顺磁性)。在用于光学或PAT成像的优选实施方式中，金属原子可具有NIR或发光性质。在用于超声成像的优选实施方式中，金属原子可具有声(即声音)衰减、吸收或散射性质。在用于核成像的优选实施方式中，金属原子可发射放射性粒子，如发射α粒子、β粒子、γ射线或正电子。在某些实施方式中，发射放射性粒子的金属可人工产生或天然存在。
ii.反胶团(inverted micelle)
水溶性金属络合物可以包封在反胶团内，以这种试剂形式引入内核。一般而言，反胶团通过在聚合物上共价接枝疏水性烷基形成，这样形成的是两亲聚合物。聚合物可以是直链、支化、高度支化、枝状或星形聚合物。一般地，聚合物的浓度至少为10-6M。聚合物支化程度越低，反胶团包封率越小。在一个示例性实施方式中，聚合物是高度支化的。一般而言，高度支化是指支化率超过60％的聚合物。合适的聚合物的非限制性例子包括高度支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和脱乙酰壳多糖。例如，可采用具有19、232或581个重复单元的第2-6代树枝状聚合物、星形聚合物或高度支化的聚乙烯亚胺。
适合接枝到聚合物上的疏水性烷基的非限制性例子包括10，12-二十五烷二酸、十六烷基十八酸、胆烷酸、亚油酸或棕榈酸。由两亲聚合物制备反胶团的方法和将金属络合物包封在反胶团内的方法在实施例中有更详细的描述。简而言之，当疏水性聚合物在有机溶剂中涡旋时，它就形成尺寸约为5-20nm的反胶团。在一些实施方式中，反胶团的尺寸约为5-100nm。在其他实施方式中，反胶团的尺寸约为5-50nm。在另一些实施方式中，反胶团的尺寸约为5-25nm。在优选的实施方式中，反胶团的尺寸约为5-15nm。
反胶团也可包含客体化合物。这些化合物可以是成像剂/跟踪剂，或者其他所需分子。例如，客体化合物的非限制性例子可包括FITC、荧光素钠、甲基橙、GD3+-DTPA、Mn(III)-氯化原卟啉、p-SCN-Bz-DOTA、纳米大小的金胶体或阿霉素。一般而言，与上面列出的客体化合物具有相当的分子量和C长度的药物、染料、螯合物或其他分子也可构成反胶团的客体化合物。
iii.油或油状物质
除金属外，所述粒子的内核还可包含油或油状物质。一般而言，油或油状物质应该对成像对象无毒。合适的天然油的非限制性例子可包括花生油、橄榄油、植物油、红花油、杏仁油、茴香油、月桂油、黑胡椒油、玫瑰木油、红木、香菜油、小豆蔻油、鼠李皮、蓖麻油、香柏叶油、金钟柏油、芹菜籽油、桂皮油、香茅油、丁香油、鱼肝油、柯拜巴脂油、芫荽油、玉米油、棉籽油、孜然芹油、莳萝油、桉树油、小茴香油、冷杉叶油、蒜油、姜油、圆柚油、刺柏油、薰衣草油、N.F.、柠檬油、柠檬香草油、酸橙油、橘皮油、橄榄油、橙油、牛至油、玫瑰草油、花生油、薄荷油、橙叶油、玫瑰油、迷迭香油、鼠尾草油、麻油、豆油和留兰香油。在其他实施方式中，所述油或油状物质可以是合成的。非限制性例子可包括脱水山梨糖醇，如聚氧乙烯脱水聚山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇倍半油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯或聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯。在某些实施方式中，所述油或油状物质可以是半合成的。在各种实施方式中，所述油或油状物质可以是溴化油，如溴化植物油、聚山梨醇酯、司盘(Spans)、长链或中链甘油三酯脂质、长链或中链混合甘油单酯和二酯、表面活性剂、混合表面活性剂、亲水性表面活性剂、聚氧乙基化/聚乙二醇化油、聚氧35蓖麻油、PEG-15-羟基硬脂酸酯、Solutol、中链甘油、PEG酯、Labrasol、吐温80、吐温20、蔗糖酯、蔗糖单月桂酯、生育酚酯或维生素E。
在某些实施方式中，所述粒子的内核包含下面表A所列油或油状物质与金属的组合。对于包含反胶团的内核，所用油或油状物质可部分根据所用疏水性烷基选择。换句话说，油或油状物质可部分根据两亲聚合物疏水尾部存在的不饱和度选择。例如，一般地，花生油可用于棕榈酸酯接枝的聚合物，而红花油可用于亚油酸酯接枝的聚合物。
表A：用于内核的某些金属和油的组合
  金属   油或油状物质
  钆   花生油
  金   花生油
  铋   花生油
  钆   橄榄油
  金   橄榄油
  铋   橄榄油
  金属   油或油状物质
  钆   植物油
  金   植物油
  铋   植物油
  钆   红花油
  金   红花油
  铋   红花油
  钆   聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯
  金   聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯
  铋   聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯
  钆   聚氧乙烯脱水山梨糖醇倍半油酸酯
  金   聚氧乙烯脱水山梨糖醇倍半油酸酯
  铋   聚氧乙烯脱水山梨糖醇倍半油酸酯
  钆   聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯
  金   聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯
  铋   聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯
  钆   聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯
  金   聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯
  铋   聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯
  钆   聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯
  金   聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯
  金属   油或油状物质
  铋   聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯
(b)外层
所述粒子一般包含两亲材料，也可包含一种或多种表面活性剂、一种或多种靶向剂、一种或多种生物活性剂、一种或多种成像/跟踪剂或其任意组合。
i.两亲材料
本发明粒子包含由两亲材料组成的外层。本文所用术语“两亲材料”指同时具有疏水性和亲水性部分的材料，如脂质材料或两亲聚合物。两亲材料可以是天然、合成或半合成材料。本文所用“天然”是指可在自然界找到的材料；“合成”是指可在实验室环境中产生的材料；“半合成”是指在实验室环境中改变过的天然材料。在一个实施方式中，两亲材料是脂质材料。例如，外层可以是单脂质层，或者可包括多片层脂质层。脂质材料在本文中取其最广的含义，包括但不限于衍生的、天然的或合成的磷脂、脂肪酸、胆固醇、溶血脂质(lysolipid)、脂质、鞘磷脂、生育酚、糖脂、硬脂胺、心磷脂、缩醛磷脂、含醚或酯连接脂肪酸的脂质、聚合脂质、脂蛋白、糖脂类、衍生的表面活性剂、药物功能化脂质、靶向配体功能化脂质、偶联对比剂的脂质、脂质聚合物、表面活性剂或其组合。外层还可包括脂质偶联的聚乙二醇(PEG)。
此外，外层可包含表面活性剂。各种市售阴离子型、阳离子型和非离子型表面活性剂均可采用，包括吐温、司盘、曲通(Tritons)等。在一些实施方式中，优选的表面活性剂有磷脂和胆固醇。也可采用其他已知的表面活性剂添加剂，如PLURONIC F-68
Figure GPA00001141254000121
HAMPOSYL L30[美国新罕布什尔州纳什瓦市W.R.格雷斯公司(W.R.Grace Co.，Nashua，N.H.)]、十二烷基硫酸钠、Aerosol 413[美国新泽西州韦恩市美国氨基氰公司(AmericanCyanamid Co.，Wayne，N.J.)]、Aerosol 200(美国氨基氰公司)、LIPOPROTEOLLCO
Figure GPA00001141254000123
[美国新泽西州曼莫斯市罗地亚公司(Rhodia Inc.，Manmmoth，N.J.)]、STANDAPOL SH 135[美国新泽西州迪内克市亨克尔公司(HenkelCorp.，Teaneck，N.J.)]、FIZUL 10-127
Figure GPA00001141254000125
[美国新泽西州艾伍帕克市菲英特克公司(Finetex Inc.，Elmwood Park，N.J.)]、CYCLOPOL SBFA 30
Figure GPA00001141254000126
[美国佛罗里达州迈阿密市赛克罗化学公司(Cyclo Chemicals Corp.，Miami，FL)]。此外，可采用两亲物质，如以如下商品名销售的物质：DERIPHAT 170
Figure GPA00001141254000131
(亨克尔公司)、LONZAINE JS
Figure GPA00001141254000132
[龙扎公司(Lonza，Inc.)]、NIRNOL C2N-SF[美国新泽西州代顿市米兰诺化学公司(Miranol Chemical Co.，Inc.，Dayton，N.J.)]、AMPHOTERGE W2
Figure GPA00001141254000134
(龙扎公司)和AMPHOTERGE 2WAS
Figure GPA00001141254000135
(龙扎公司)。此外，可采用非离子型表面活性剂，如以如下商品名销售的表面活性剂：PLURONIC F-68[美国密歇根州怀恩多特市巴斯夫怀恩多特公司(BASF Wyandotte，Wyandotte，Mich.)]、PLURONIC F-127(巴斯夫怀恩多特公司)、BRIJ 35
Figure GPA00001141254000138
[美国特拉华州威尔明顿市ICI美国公司(ICI Americas；Wilmington，Del.)]、TRITON X-100[美国宾夕法尼亚州费城罗门哈斯公司(Rohm and Haas Co.，Philadelphia，Pa.)]、BRIJ 52
Figure GPA000011412540001310
(ICI美国公司)、SPAN20
Figure GPA000011412540001311
(ICI美国公司)、GENEROL 122ES
Figure GPA000011412540001312
(亨克尔公司)、TRITON N42
Figure GPA000011412540001313
(罗门哈斯公司)、TRITON N-101
Figure GPA000011412540001314
(罗门哈斯公司)、TRITON X-405
Figure GPA000011412540001315
(罗门哈斯公司)、TWEEN 80
Figure GPA000011412540001316
(ICI美国公司)、TWEEN 85
Figure GPA000011412540001317
(ICI美国公司)、BRIJ 56
Figure GPA000011412540001318
(ICI美国公司)等。此外，表面活性剂可包括但不限于1，2-二棕榈酰基-sn甘油-3-磷酸乙醇胺-N-4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酰胺、胺-PEG2000-磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、阿拉伯树胶、胆固醇、二乙醇胺、甘油单硬脂酸酯、羊毛脂醇、卵磷脂(包括蛋黄卵磷脂)、单甘油酯和二甘油酯、单乙醇胺、油酸、油醇、泊洛沙姆、花生油、棕榈酸、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧35蓖麻油、聚氧10油基醚、聚氧20十六醇十八醇醚、聚氧40硬脂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、丙二醇二乙酯、丙二醇单硬脂酸酯、月桂基硫酸钠、硬脂酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、硬脂酸、三乙醇胺和乳化蜡。上述表面活性剂可单独或组合使用，以帮助稳定所述粒子。
此外，可用的悬浮剂和/或增粘剂包括但不限于：阿拉伯胶、琼脂、褐藻酸、单硬脂酸铝、斑脱土、岩浆、卡波姆934P、羧甲基纤维素、钙和钠及钠12(calcium and sodium and sodium 12)、角叉菜胶、纤维素、糊精、凝胶、瓜尔胶、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硅酸镁铝、甲基纤维素、胶质、聚环氧乙烷、聚乙烯醇、聚维酮、丙二醇藻酸酯、二氧化硅、藻酸钠、黄芪胶和黄原胶。
在某些实施方式中，相对于总体积，外层材料(不包括水)约占低于1％至约10％。在优选的实施方式中，相对于总体积，外层材料约占2％。
在另一个实施方式中，两亲材料是两亲聚合物。在一些实施方式中，两亲材料可同时包含亲水性和疏水性嵌段。例如，亲水性嵌段可以是聚丙烯酸。在某些实施方式中，疏水性嵌段可以是聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯或聚异戊二烯。本发明的两亲聚合物还可包含0-50％一种或多种乙烯基或亚乙烯基单芳族单体作为聚合单元。合适的乙烯基或亚乙烯基单芳族单体可包括苯乙烯以及芳环上被一个或多个(C1-C4)烷基、羟基、氯原子或溴原子取代的苯乙烯。若存在乙烯基或亚乙烯基单芳族单体，则其优选为苯乙烯、α-甲基苯乙烯或氯代苯乙烯。本发明的聚合物还可任选包含0-50％一种或多种其他可共聚单体作为聚合单元。合适的可共聚单体可包括例如丁二烯、丙烯腈、乙烯、醋酸乙烯酯、(甲基)丙烯酸羟烷基酯、(甲基)丙烯酸(C5-C20)烷基酯、聚(氧化烯烃)二(甲基)丙烯酸酯、烯键式不饱和(C3-C6)羧酸酰胺、在氮原子上被一个或两个(C1-C4)烷基取代的烯键式不饱和(C3-C6)羧酸酰胺、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、N羟甲基(甲基)丙烯酰胺、丙烯酰胺的季铵盐、氯化(3-丙烯酰胺基丙基)三甲基铵、氯化(3-甲基丙烯酰胺丙基)三甲基铵、(甲基)丙烯酸酯的季铵盐[如(甲基)丙烯酸2-(N，N，N-三甲基铵)乙酯]、(甲基)丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯、N，N-二甲基-N-甲基丙烯酰基乙基-N-(3-磺丙基)铵甜菜碱和N，N-二甲基-N-丙烯酰胺基丙基-N-(3-磺丙基)铵甜菜碱。其他合适的可共聚单体可包括例如2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸、2-甲基丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸、3-甲基丙烯酰胺基-2-羟基丙磺酸、烯丙基磺酸、甲基烯丙基磺酸、烯丙氧基苯磺酸、甲基烯丙氧基苯磺酸、2-羟基-3-(2-丙烯氧基)丙磺酸、2-甲基-2-丙烯-1-磺酸、苯乙烯磺酸、乙烯基磺酸、丙烯酸3-磺丙酯、甲基丙烯酸3-磺丙酯、磺甲基丙烯酰胺和磺甲基甲基丙烯酰胺。
在多个实施方式中，外层两亲材料可交联，以稳定粒子。交联可提高粒子的稳定性和完整性，有利于内核保留在粒子中。在一些实施方式中，粒子可在外层表面交联。在其他实施方式中，粒子可在外层内部交联。交联可以是化学交联或光化学交联。简而言之，合适的交联剂与外层的一个或多个活性基团反应。交联剂可以是同型双官能团或杂双官能团。合适的化学交联剂可包括戊二醛、二羧酸间隔剂或二羧酸活性酯。此外，外层可使用双联剂(bis-linker)胺/酸，通过碳二亚胺偶联技术进行化学交联。或者，粒子可利用点击化学技术进行交联。在其他实施方式中，可利用碳二亚胺偶联化学技术、酰化、活性酯偶联或烷基化使外层交联。在一个示例性实施方式中，交联是碳二亚胺介导的。在一些实施方式中，在4.0-6.0pH范围内，用高度水溶性碳二亚胺EDC[也称EDAC或EDCI，盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺]活化羧基，以偶联伯胺，产生酰胺键。为提高偶联效率，EDC可与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或磺基NHS联用。本领域的技术人员不难明白，合适的交联剂可以也必然随粒子的组成及目标用途而变化。
除了两亲材料和表面活性剂外，外层也可包括靶向剂、生物活性剂、成像/跟踪剂或其组合。这种组合与脂质材料一起在本文中称作外层组分共混物。
ii.靶向剂
在一些实施方式中，粒子外层还可包含靶向剂，使得包含靶向剂的粒子可被递送到所需位点并富集。携靶粒子可在其外层包含广泛的靶向剂，包括但不限于单独或组合携带的抗体、抗体片段、蛋白质、多肽、碳水化合物、脂质、小分子、多糖、核酸、适体(aptamer)、肽模拟物(peptidomimetic)、其他模拟物和药物。此外，靶向剂可包括微生物，如噬菌体或病毒。靶向剂还可以是上述各种物质经改造后的类似物或衍生物。靶向剂可用于使粒子特异性结合到细胞表位(epitope)和受体上，可直接或间接连接到粒子上。
靶向剂直接偶联到粒子上是指制备靶向剂-粒子复合物，其中靶向剂通过离子、静电、疏水或其他非共价途径吸附到粒子表面上(例如酰化抗体，或互补核酸序列之间的杂交)，或者化学连接到表面上，即通过共价键连接到脂质表面组分上，或者本身作为膜组分掺入脂质表面活性剂膜中(例如由脂质衍生为肽模拟剂)。
间接偶联是指粒子与靶向剂在活体内分两步或更多步形成复合物。间接偶联利用化学连接系统将粒子紧密且特异性地附连于靶细胞或组织表面。间接靶向系统的一个非限制性例子是亲和素-生物素。
亲和素-生物素相互作用系统是有用的非共价靶向系统，它们已被引入许多生物和分析系统，并被选用于活体应用。亲和素对生物素具有高亲和性(10-15M)，有利于在生理条件下快速而稳定地结合。视制剂情况，利用此方法的靶定系统(targeted system)分两步或三步给予。一般地，先给予诸如单克隆抗体这样的生物素化配体并“预靶定(pretargeted)”到独特的分子表位上。接着，给予亲和素，亲和素结合到“预靶定”配体的生物素部分。最后，加入生物素化粒子，使之结合到亲和素上余下未被占据的生物素结合位上，从而形成生物素化配体-亲和素-粒子“夹心”结构。亲和素-生物素方法可避免表面抗体存在引发的单核吞噬细胞系统(MPS)过早地加速清除靶定粒子。此外，具有四个独立生物素结合位点的亲和素放大了信号，提高了检测灵敏度。
视靶向剂的性质和粒子表面的组成，靶向剂可通过许多方法化学结合到粒子表面上。靶向剂与蛋白质粒子的直接化学偶联常利用表面内固有的许多氨基(例如赖氨酸)。或者，可在表面中引入官能化活性化学基团，如吡啶基二硫代丙酸酯、马来酰亚胺或醛，作为化学“钩子”，用于靶向剂在粒子形成后的偶联。另一种常用的后处理方法是在加入靶向剂之前，用碳二亚胺活化表面羧基。
共价连接方案的选择主要取决于靶向剂的化学性质。例如，单克隆抗体及其他大蛋白质在剧烈的处理条件下会变性，而碳水化合物、短肽、适体、药物或肽模拟物在这些条件下往往保持不变。
为了确保靶向剂结合的高整体性，并使靶定粒子的亲和性最大，可在活化表面官能团与靶向剂之间插入柔性间隔臂，例如聚乙二醇、氨基酸、长链或短链烃、糖(例如聚右旋糖)、核酸、适体或简单己酸酯桥。这样延长的距离可以是2nm或更长，可最大程度减少粒子表面相互作用对靶向剂结合的干扰。
可用“打底材料(primer material)”将靶向剂固定在脂质材料内。“打底材料”是引入粒子的任何与表面活性剂相容的化合物以化学偶联或吸附特异性结合剂或靶向剂，即引入外层的任何组分或衍生组分，可以化学方式用于形成粒子与靶向配体或靶向配体组分(若其有亚单元的话)之间的共价键。靶向剂可利用本领域已知的方法，通过偶联剂共价结合到“打底材料”上。一种类型的偶联剂可以使用碳二亚胺，如盐酸1-乙基-3-(3-N，N-二甲基氨基丙基)碳二亚胺或1-环己基-3-(2-吗啉基乙基)碳二亚胺甲基-p-甲苯磺酸。打底材料可以是胺-PEG2000-磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、N-己酰胺磷脂酰乙醇胺、N-十二烷基胺磷脂酰乙醇胺、磷脂酰硫乙醇、1，2-二酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(4-p-马来酰亚胺苯基)丁酰胺、N-琥珀酰基-磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰基-磷脂酰乙醇胺、N-十二烷基-磷脂酰乙醇胺、N-生物素基-磷脂酰乙醇胺、N-生物素基己酰基-磷脂酰乙醇胺和磷脂酰乙二醇。其他合适的偶联剂可包括醛偶联剂，它们要么具有烯键式不饱和性，如丙烯醛、异丁烯醛或2-丁烯醛，要么具有多个醛基，如戊二醛、丙二醛或丁二醛。其他偶联剂可包括盐酸2-亚氨基硫烷和双官能N-羟基琥珀酰亚胺酯，如辛二酸二琥珀酰亚胺、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯、二[2-(琥珀酰亚胺基氧基羰基)乙基]砜、二琥珀酰亚胺基丙酸酯和乙二醇二(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)。杂双官能试剂的非限制性例子可包括N-(5-叠氮基-2-硝基苯甲酸基)琥珀酰亚胺、p-叠氮基溴苯、p-叠氮基苯甲酰甲醛、4-氟-3-硝基叠氮基苯、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯、m-马来酰亚胺基苯甲酰基N-羟基琥珀酰亚胺酯、甲基-4-叠氮基苯甲酰甲醛、4-氟-3-硝基叠氮基苯、盐酸N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯、2-偶氮基-3，3，3-三氟丙酸p-硝基苯酯、N-琥珀酰亚胺基-6-(4’-偶氮基-2’-硝基苯氨基)己酸酯、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯、(4-叠氮基苯基二硫)丙酸N-琥珀酰亚胺酯、3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯和N-(4-叠氮基苯基硫代)酞酰胺。同型双官能试剂的非限制性例子可包括1，5-二氟-2，4-二硝基苯、4，4’-二氟-3，3’-二硝基苯砜、4，4’-二异氰硫基-2，2’-二磺酸芪、p-亚苯基二异硫氰酸酯、羰基二(L-蛋氨酸p-硝基苯酯)、4，4’-二硫代叠氮基联苯(4，4′-dithiobisphenylazide)、赤藻糖醇二碳酸酯以及双官能酰亚胺酯，如盐酸己二酰亚胺二甲酯、辛二酰亚胺二甲酯、盐酸3，3’-二硫代二丙酰亚胺二甲酯等。特异性结合物通过共价方式结合到“打底材料”上可利用上述试剂通过公知的常规反应进行，例如在中性pH和低于25℃的温度下，在水溶液中进行1小时至过夜。
iii.生物活性剂
可在本发明粒子的外层引入生物活性剂[例如药物、治疗化合物、基因材料、金属(如放射性同位素)、蛋白质、肽、碳水化合物、脂质、甾体、核酸基材料或其衍生物、类似物或其组合]，其形式为本源物，或者利用疏水基团或带电基团形成衍生物以促使其进入粒子中或吸附到粒子上。这种生物活性剂可以是水溶性的或疏水性的。一般而言，生物活性剂可处于外层表面，也可嵌入外层。在某些实施方式中，生物活性剂可位于粒子内核中。生物活性剂的非限制性例子可包括与免疫相关的试剂、甲状腺剂、呼吸产品、抗肿瘤试剂、抗蠕虫剂、抗疟剂、有丝分裂抑制剂、激素、抗原生动物剂、抗结核剂、心血管产品、血液产品、生物应答调节剂、抗真菌剂、维生素、肽、抗过敏剂、抗凝剂、血液循环药、代谢增强剂、抗病毒剂、抗心绞痛剂、抗生素、消炎剂、抗风湿剂、麻醉剂、强心苷、神经肌肉阻断剂、镇静剂、局部麻醉剂、全身麻醉剂或放射性原子或离子。生物活性剂的非限制性例子列于下表B。此外，本发明粒子可包括两种或更多种、三种或更多种或者四种或更多种生物活性剂。
表B：生物活性剂的非限制性例子
  生物活性剂   非限制性例子
  与免疫相关的试剂   免疫血清、抗毒素、抗蛇毒素、细菌疫苗、病毒疫苗、狂犬病预防产品
  甲状腺剂   碘产品和抗甲状腺剂
  呼吸产品   黄嘌呤衍生物、茶碱和氨茶碱
  抗肿瘤试剂   铂化合物(例如螺铂、顺铂和卡铂)、甲氨嘌呤、氟尿嘧啶、阿霉素、丝裂霉素、安丝菌素、博来霉素、胞嘧啶阿拉伯糖苷、阿糖腺嘌呤、巯基聚赖氨酸、长春新碱、白消安、瘤可宁、美法仑(例如PAM、L-PAM或苯丙氨酸氮芥)、巯嘌呤、米托坦、盐酸甲苄肼、更生霉素(放线菌素D)、盐酸道诺霉素、盐酸亚德里亚霉素、紫杉醇和其他紫杉类、雷
  帕霉素、手霉素A、TNP-470、普卡霉素(光神霉素)、氨鲁米特、雌氮芥磷酸钠、氟他胺、醋酸亮脯利特、醋酸甲地孕酮、枸橼酸他莫昔芬、睾内酯、曲洛司坦、安丫啶(m-AMSA)、天冬氨酶(L-天冬氨酶)、欧文氏天冬氨酶、干扰素α-2a、干扰素α-2b、替尼泊苷、硫酸长春碱(VLB)、硫酸长春新碱、硫酸博来霉素、羟基脲、甲苄肼和氮烯唑胺
  抗蠕虫剂   双羟萘酸噻嘧啶、哌嗪、四氯乙烯、噻苯咪唑、氯硝柳胺
  抗疟剂   氯喹、阿莫地喹、抗叶酸药、百乐君(氯胍)、甲氟喹、奎宁、卤泛群、菁蒿素及其衍生物、伯氨喹、强力霉素、四环素和氯林可霉素
  生物活性剂   非限制性例子
  有丝分裂抑制剂   依托泊苷、秋水仙碱和长春生物碱
  激素   雄性激素、孕酮、雌激素和抗雌激素、生长激素、促黑素、雌二醇、二丙酸氯地米松、倍他米松、醋酸倍他米松和倍他米松磷酸钠、维他米松(vetamethasone)磷酸氢二钠、维他米松磷酸钠、醋酸可的松、地塞米松、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、氟尼缩松、氢可的松、醋酸氢可的松、环戊丙酸氢可的松、氢可的松磷酸钠、氢可的松琥珀酸钠、甲强龙、醋酸甲强龙、甲强龙琥珀酸钠、醋酸帕拉米松、泼尼松龙、醋酸泼尼松龙、泼尼松龙磷酸钠、泼尼松龙叔丁乙酯、泼尼松、曲安西龙、醋酸曲安西龙、曲安奈德、曲安西龙双醋酸酯、己曲安奈德、醋酸氟氢可的松、后叶催产素、加压素、胰高血糖素及其衍生物
  抗原生动物剂   氯喹、羟基氯喹、甲硝哒唑、奎宁和亚锑酸甲葡胺
  抗结核剂   对氨基水杨酸、异烟肼、硫酸卷须霉素、环丝氨酸、盐酸乙胺丁醇、乙硫异烟胺、吡嗪酰胺、利福平和硫酸链霉素
  心血管产品   螯合剂和汞利尿剂以及强心苷
  血液产品   肠外铁、血精素、血卟啉及其衍生物
  生物应答调节剂   胞壁酰二肽、胞壁酰三肽、微生物细胞壁组分、淋巴因子(例如细菌内毒素如脂多糖，巨噬细胞活化因子)、细菌亚单元(如分枝细菌、棒状菌)、合成二肽N-乙酰基-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺
  抗真菌剂   酮康唑、制霉菌素、灰黄霉素、氟胞嘧啶(5-fc)、霉康唑、两性霉素B、蓖麻毒素、环孢菌素和β-内酰胺抗生素(例如磺胺泽新)
  维生素   壬酸氰钴胺素(cyanocobalamin neinoic acid)、类维生素A及其衍生物如维生素A棕榈酸酯和α生育酚
  肽   超氧化锰岐化酶；酶如碱性磷酸酶
  生物活性剂   非限制性例子
  抗过敏剂  氨来呫诺(Amelexanox)
  抗凝剂  苯丙香豆醇和肝磷脂
  血液循环药  心得安
  代谢增强剂  谷胱甘肽
  抗病毒剂  无环鸟苷、金刚胺、叠氮胸苷(AZT、DDI、磷甲酸或齐多夫定)、三唑核苷和一水合阿糖腺苷(阿糖腺苷，ara-A)
  抗心绞痛剂  地尔硫卓、硝苯地平、维拉帕米、赤藓醇四硝酸酯、二硝酸异山梨醇酯、硝化甘油(三硝酸甘油酯)和四硝酸季戊四醇酯
  抗生素  氨苯砜、氯霉素、新霉素、氯氨苄青霉素、头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢拉定、红霉素、氯林可霉素、林肯霉素、阿莫西林、安比西林、巴卡西林、羧苄青霉素、双氯青霉素、环青霉素、吡可西林(picloxacillin)、海他西林、新青霉素、萘夫西林、苯唑西林、青霉素(包括青霉素G和青霉素V)、替卡西林、利福平、氨基糖苷和四环素
  消炎剂  二氟尼柳、布洛芬、吲哚美辛、甲氯灭酸盐、甲氯灭酸、萘普生、羟基保泰松、苯基保泰松、吡罗昔康、舒林酸、托美汀、阿司匹林和水杨酸盐
  抗风湿剂  阿达木单抗、咪唑硫嘌呤、氯喹和羟基氯喹(抗疟剂)、环孢霉素(环孢霉素A)、D-青霉胺、依那西普、金盐(金硫丁二钠、金诺芬)、因福利美、来氟米特、甲氨蝶呤、二甲胺四环素(一种四环素类抗生素)、柳氮磺吡啶
  麻醉剂  鸦片樟脑酊、鸦片制剂、可待因、海洛因、美沙酮、吗啡和鸦片
  强心苷  去乙酰毛花苷、洋地黄毒苷、地高辛、毛地黄苷和洋地黄
  生物活性剂   非限制性例子
  神经肌肉阻断剂  甲磺酸阿曲库铵、三碘季铵酚、己芴溴铵、碘二甲箭毒、泮库溴铵、琥珀酰氯化胆碱(氯琥珀胆碱)、氯化筒箭毒碱和维库溴铵
  镇静剂(安眠药)  异戊巴比妥、异戊巴比妥钠、阿普比妥、布塔巴比妥钠、水合氯醛、氯乙基戊烯炔醇、炔己蚁胺、盐酸氟胺安定、苯乙哌啶酮、盐酸甲氧异丁嗪、甲乙哌酮、盐酸咪达唑仑仲醛、戊巴比妥、戊巴比妥钠、苯巴比妥、苯巴比妥钠、司可巴比妥钠、他布酮、羟基安定和三唑仑
  局部麻醉剂  盐酸丁哌卡因、盐酸氯普鲁卡因、盐酸依替卡因、盐酸利多卡因、盐酸马比佛卡因、盐酸普鲁卡因和盐酸丁卡因
  全身麻醉剂  氟哌利多、依托咪酯、含氟哌利多的枸橼酸芬太尼、盐酸克他命、烯丙炔巴比妥钠和硫喷妥钠
  放射性粒子或离子  锶、碘、铼、钇和放射性药物，如放射性碘和磷产品
在一些实施方式中，生物活性剂也可以是靶向剂。例如，当结合到特异性表位上时，抗体、肽片段或生物活性配体模拟物可以是生物活性剂，如拮抗剂或激动剂。作为一个例子，研究表明，作用于新血管内皮细胞上αvβ3整联蛋白的抗体会短暂抑制实体瘤的生长和代谢。因此，在本发明的另一个实施方式中，靶向剂和生物活性剂可由同一组分构成，它既为粒子提供靶向作用，又为所需位点提供生物活性剂。
iv.其他成像/跟踪剂
本发明粒子的外层也可包括其他成像/跟踪剂。例如，外层可包括成像/跟踪剂，用于显微照相(例如荧光显微照相、共焦显微照相或电子显微照相)、磁共振成像、断层成像[如γ(SPECT/CT，平面)和正电子发射断层成像(PET/CT)]、射线成像或超声成像。成像/跟踪剂可原位、体内、离体和体外检测。显微成像/跟踪剂是本领域熟知的，可包括荧光分子，如FITC、罗丹明和Alexafluor青染料。类似地，磁共振成像分子、射线成像分子、近红外(NIR)和超声成像分子也是本领域熟知的，本领域的技术人员在考虑粒子的组成及其目标用途之后，可选择合适的成像分子。在某些实施方式中，外层也可包含放射金属的螯合剂，它们可用核成像方法如PET、SPECT和相关方法检测。
v.外层组分共混物
如上所述，外层组分共混物可包含脂质材料，并可任选包含一种或多种表面活性剂、一种或多种靶向剂、一种或多种成像/跟踪剂、一种或多种生物活性剂或其任意组合。
在一个实施方式中，外层组分共混物可包含约50摩尔％-约95摩尔％蛋黄卵磷脂、约0-约1摩尔％1，2-二棕榈酰基-sn甘油-3-磷酸乙醇胺-N-4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酰胺和/或胺-PEG2000-磷脂酰乙醇胺、约2摩尔％磷脂酰乙醇胺和约0-约20摩尔％胆固醇。在另一个实施方式中，外层组分共混物可包含约61摩尔％蛋黄卵磷脂、约1摩尔％生物素化-磷脂酰乙醇胺、约8摩尔％胆固醇和约30摩尔％钆-DTPA-BOA。在又一个实施方式中，外层组分共混物可包含约90摩尔％蛋黄卵磷脂、约1摩尔％生物素化-磷脂酰乙醇胺和约9摩尔％胆固醇。在再一个实施方式中，外层组分共混物可包含约89％蛋黄卵磷脂、约1摩尔％生物素化-磷脂酰乙醇胺和约10摩尔％胆固醇。
(c)制备粒子的方法
一般而言，本发明粒子可通过对外层组分与内核组分进行高剪切混合来制备。高剪切混合的非限制性例子可包括微流化、声波处理、匀浆化或相关混合。一般地，约15％-约25％(v/v)内核组分(例如油和有机可溶性和/或水溶性金属)与约1％-约4％(v/v)外层组分共混物、约0-约3％甘油以及余量的水(若存在的话)混合。对所得混合物进行掺混，然后微流化。粒度可利用本领域已知的方法测定，例如采用激光散射亚微米粒度分析仪。
在一个实施方式中，本发明粒子通过微流化钆-聚合物-油混合物(20％，v/v)、外层组分共混物(2.0％，w/v)、甘油(1.7％，w/v)和余量的水来制备。在另一个实施方式中，本发明粒子通过微流化新癸酸铋-油混合物(20％，v/v)、外层组分共混物(2.0％，w/v)、甘油(1.7％，w/v)和余量的水来制备。在又一个实施方式中，本发明粒子通过微流化胶体金纳米粒子-聚合物-油混合物(20％，v/v)、外层组分共混物(2.0％，w/v)、甘油(1.7％，w/v)和余量的水来制备。在再一个实施方式中，本发明粒子通过微流化疏水性包覆金-油混合物(20％，v/v)、外层组分共混物(2.0％，w/v)、甘油(1.7％，w/v)和余量的水来制备。
如实施例所示，微流化方法是本领域熟知的。
(d)粒子性质
粒子的尺寸和形状可以变化，只要不背离本发明的范围即可。例如，粒子可以是球形的、规则形状的、不规则形状的或其组合。一般地，它们的尺寸可按流体动力学直径测量。粒子的特征尺寸可通过例如光散射实验估测。
一般地，当用于成像时，所述粒子可提供有用的对比度-噪声比(CNR)。在一些实施方式中，为实现最小CNR为3，粒子最小可提供约30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50μM金属/三维像素。
在一些实施方式中，本发明粒子在去离子水中可具有约-10mV至约-60mV的ζ电势。例如，本发明粒子可具有约-10、-11、-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20、-21、-22、-23、-24、-25、-26、-27、-28、-29、-30、-31、-32、-33、-34或-35mV的ζ电势。
II.粒子组合物
一般地，本发明粒子配制成体内使用的组合物。在示例性实施方式中，所述组合物配制成胃肠外应用。组合物所用粒子的尺寸随粒子的组成变化，例如随所用金属变化。在一个实施方式中，这种组合物中可有70％或以上的粒子具有小于约450nm的流体动力学直径。在另一个实施方式中，这种组合物中可有75％、80％、85％或90％或以上的粒子具有小于约450nm的流体动力学直径。在某些实施方式中，这种组合物中可有70％、75％、80％、85％、90％或95％或以上的粒子具有约150nm-约350nm的流体动力学直径。在其他实施方式中，这种组合物中70％、75％、80％、85％、90％或95％或以上的粒子的尺寸可使其能被纳入血管系统中。
由许多粒子组成的组合物可以是溶液、混合物或悬浮体。在一个实施方式中，所述组合物可以是溶液。在另一个实施方式中，所述组合物可以是混合物。在另一个实施方式中，所述组合物可以是悬浮体。悬浮体的非限制性例子是胶体。
在一些实施方式中，所述组合物可以是胶体。一般而言，胶体是精细粒子的悬浮体，这些粒子不容易从悬浮体中沉降下来。胶体可通过微流化方法形成，如上面I(d)部分所述。
可将本发明的粒子组合物给予目标对象，以便能够对生物组织进行成像和/或治疗。合适的目标对象包括但不限于哺乳动物、两栖动物、爬行动物、鸟类、鱼类和昆虫。哺乳动物的非限制性例子包括人、非人灵长类和啮齿类。
所述组合物经配制后，可利用多种不同的方法给予目标对象，以递送成像所需的有效剂量。这种组合物一般可以剂量单位制剂的形式经肠胃外、腹膜内、血管内或肺内给予，所述单位制剂包含所需的药学上可接受的常规无毒载剂、辅剂、赋形剂和输运剂。本文所用术语肠胃外包括局部、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、囊内、子宫内、耳内、鼻内、眼睛、眼内、肺内、口腔、咽内、直肠、尿道内或经尿道、子宫内、叶鞘内或胸骨内注射或灌注。此外，术语肠胃外包括喷雾或气溶胶给予技术。在一个实施方式中，所述组合物可以推注给予。在优选实施方式中，所述组合物可经静脉内给予。有关药物组合物制剂的讨论参见例如Hoover，John E.的《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)[宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing Co.，Easton，Pa.)(1975)]以及Liberman，H.A.和Lachman，L.编著的《药物剂型》(Pharmaceutical Dosage Forms)[纽约州纽约的MD出版公司(Marcel Decker，New York，N.Y.)(1980)]。
根据已知技术，利用合适的分散剂或湿润剂以及悬浮剂，可配制注射用制剂，例如注射用无菌水性或油性悬浮体。注射用无菌制剂也可以是在可肠胃外使用的无毒稀释剂或溶剂中配制的注射用无菌溶液或悬浮体。可以采用的可接受的输运剂和溶剂有水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。此外，常用无菌非挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为此，可采用任何温和的非挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，在配制注射剂时，可采用脂肪酸，如油酸。可以使用二甲基乙酰胺、表面活性剂(包括离子型和非离子型洗涤剂)和聚乙二醇。也可使用溶剂和湿润剂的混合物，如上面所讨论的。出于成像目的，用于肠胃外给予的制剂可以是生物相容性溶液或悬浮体的形式。其他辅剂和给予模式在药学领域是广为人知的。
本领域的技术人员将认识到，为成像而给予目标对象的组合物的量和浓度部分取决于目标对象和要成像的组织。确定最佳用量的方法是本领域已知的，更多细节可参见实施例。
III.成像生物组织
本发明的组合物可用于对生物组织成像。所述成像可原位、体内、离体或体外进行。适合结合本发明的组合物使用的成像技术可包括：CT成像、光谱CT成像(K缘成像)、射频成像、核成像(例如PET)、近红外成像(NIR)、光学成像、超声成像、磁共振(MR)成像(包括核磁共振)、光声断层(PAT)成像、声光成像、X射线成像及其组合。较佳的是，本发明粒子可以多模态成像方式使用。此外，本发明粒子既可用于稳态采集信息，也可用于初通采集(first pass acquisition)。在一个实施方式中，本发明粒子既可用于T1成像，也可用于T2成像。本发明粒子可同时用于成像和递送生物活性剂，可单独用于成像，或者单独用于递送生物活性剂。
一般而言，目标生物组织图像的获取方法包括给予目标对象包含上面第II部分所述许多粒子的组合物，为获取信号而对目标对象进行扫描，以及根据获取的信号处理数据，形成目标对象的图像。为获取信号而进行扫描和为形成图像而处理数据的方法是本领域已知的。在一个实施方式中，所述方法可进一步包括由扫描获取的信号产生与目标对象相关的数据而不是图像。在另一个实施方式中，所述方法进一步包括处理数据和产生的图像，用于作出与目标对象相关的解释。
在获取目标生物组织的光谱CT图像的实施方式中，所述方法包括给予目标对象如上面第II部分所述的组合物，为获取信号而对目标对象进行光谱CT扫描，以及处理扫描得到的数据，形成目标对象的光谱CT图像。类似地，获取目标生物组织的MRI图像的方法包括给予目标对象如上面第II部分所述的组合物，对目标对象进行MRI扫描，以及处理扫描得到的数据，形成MR图像。类似地，获取目标生物组织的PAT或INR光学图像的方法包括给予目标对象如上面第I1部分所述的组合物，对目标对象进行PAT或光学扫描，以及处理扫描得到的数据，形成图像。
在某些实施方式中，图像利用光学显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、共焦显微镜或声学原子力显微镜获取。
本文所用组织可指细胞、器官、肿瘤或与细胞、器官或肿瘤相关的材料，如血块。合适的组织可包括但不限于心脏、肺、脑、眼睛、胃、脾、骨骼、胰腺、胆囊、肾、肝、肠、皮肤、子宫、膀胱、眼睛、淋巴结、血管以及血液和淋巴成分。血液成分的非限制性例子有微血栓。在一些实施方式中，本发明粒子可用于血管再生成像。在其他实施方式中，本发明粒子可用于对生物组织进行容积成像。例如，本发明粒子可在血管、膀胱、肠或其他体腔中用于容积成像。在某些实施方式中，生物组织可包含粒子所指向的生物标记。例如，在一些实施方式中，生物标记可包含微血栓、血液、血管、淋巴管或血管外导管的成分。
组织或生物标记可与病理或疾病相关。例如，组织或生物标记可与肿瘤、心血管疾病、皮肤病、泌尿生殖疾病、肺病、肌肉骨骼疾病、肠胃病、神经病、血液病、内分泌病、感官疾病、炎症或风湿病相关。
无论成像类型如何，包含在粒子中的金属应适合选定的成像类型。例如，对于CT成像，金属应选自在CT的X射线能带内有K缘的金属。此外，金属在粒子中的含量可随要用的成像方法变化。例如，参见下表C。
  成像方法   金属原子数
  CT成像   约300000-约1000000之间。在示例性实施方式中，大于500000
  成像方法   金属原子数
  光谱CT成像   约300000-约1000000个原子之间，在示例性实施方式中，大于500000
  近红外(NIR)   约1-约1000000个原子之间
  光学或光声   约1-约1000000个原子之间
  超声   约1-约1000000个原子之间
  磁共振(MR)成像   约100000个原子
以下实施例用于阐述本发明的优选实施方式。本领域的技术人员应理解，以下实施例中披露的技术代表了本发明人发现能很好地实施本发明的技术。不过，本领域的技术人员在参考本发明内容的基础上应理解，可对已披露的具体实施方式作出许多改变，改变后仍能获得相同或相近的结果，而不背离本发明的精神和范围，因此，本文所述或附图所示的所有内容均应视为示例性的，而非限制性的。
实施例
以下实施例阐明了本发明的各种实施方式。
实施例1钆粒子的合成和表征
钆基粒子的合成
制备了标称流体动力学直径在180-250nm之间的原型粒子，每个结合粒子(bound particle)中金属原子的有效加载量(payload为300000-500000个钆原子。这些粒子包含高度支化的两亲阳离子型聚合物，它通过非共价键络合到DTPA-钆螯合物上，形成大小约为10nm的反胶团。这些反胶团悬浮在油中，形成均匀的透明混合物，用脂质表面活性剂微流化后，产生本发明的粒子。表面活性剂混合物通常由磷脂酰胆碱、含或不含用于偶联配体的聚乙二醇间隔剂的磷脂酰乙醇胺以及用于寻靶和荧光成像的其他脂质偶联物组成。为进一步提高两亲钆反胶团提供的金属加载量，可将有机可溶的钆加入油基质[例如可用戊二酮-钆(III)]。
更具体地，通过共价方式在高度支化、树枝状或星形聚合物(例如聚乙烯亚胺)上接枝疏水性烷基(例如2-十六烷基十八酸、10，12-二十五烷二酸、胆烷酸、亚油酸或棕榈酸)。用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)活化脂肪酸，然后加入高度支化的聚合物，使自由伯胺基的官能化程度超过50％。例如，在典型是实验程序中，将10，12-二十五烷二酸(0.5克，0.0013摩尔，0.6当量33％可用自由伯胺官能团)溶解在5ml无水氯仿[阿尔德里奇化学品公司(Aldrich Chemicals)]中。在室温下，在10分钟的时间里向此溶液中滴加甲碘化1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺(EDCI，阿尔德里奇化学品公司，0.5克，0.0017摩尔，1.3当量羧基官能团)。室温下搅拌此混合物20分钟。溶液产生颜色，证实该体系中形成了活化羧基阴离子。加入聚乙烯亚胺[支化，Mw＝10kDa，阿尔法伊泽公司(Alfa Aesar)，0.1克，33％可用自由伯胺官能团有60％发生靶官能化]在2ml无水氯仿中的溶液。室温下搅拌2小时后，溶液由黑色变为苍白色。在室温下搅拌混合物过夜。减压蒸发溶剂，通过反复用乙醚沉淀，提纯经疏水改性的聚合物。聚合物通常贮存在+4℃，可稳定存在＞6个月。
这些疏水聚合物经涡流搅拌后，在有机溶剂中形成大小为7-15nm的反胶团结构。更具体地，接枝了二十五烷二酸的聚乙烯亚胺形成浓度范围为(10-6-10-5M)的氯仿溶液，然后轻柔涡流搅拌约1分钟。疏水链立即自己朝向有机介质，从而形成具有亲水内核的反胶团。反胶团的大小通常为7-15nm。为避免胶团簇集，利用动态光散射法观察溶液态粒子尺寸，监控有机溶剂中聚合物溶液的浓度。
通过轻柔反向混合(1∶1v/v)，将客体化合物(例如FITC、甲基橙、Gd3+-DTPA、纳米级金胶体)包封在反胶团中。在典型的相转移实验中，水溶性Gd3+-DTPA水溶液(50mg，4ml)与无水氯仿(5ml)中的反胶团溶液混合，温和地反向混合几分钟。静置并相分离之后，回收含聚合物反胶团的有机相，用硫酸钠柱干燥，通过涡流搅拌与植物油混合(～1∶1v/v)。在典型的实验程序中，包封钆的反胶团的氯仿溶液通过涡流搅拌与花生油混合(～1∶1v/v)。利用标准旋转蒸发技术减压蒸发油中的有机溶剂。为提高钆的有效加载量，在微流化之前，可在植物油中预加不同量的有机可溶的戊二酮-钆(III)的氯仿溶液(0.1gm，阿尔德里奇公司)。若需要，戊二酮-钆(III)可单独使用，不存在聚合物反胶团。在观察到沉降现象之前，金属悬浮油可稳定存在数月。此外，为提高钆的有效加载量，也可在微流化之前，在植物油中预加不同量的疏水改性氧化钆纳米粒子的氯仿溶液。若需要，它们可单独使用，不存在聚合物反胶团。
通过微流化钆-聚合物-油混合物(20％，v/v)、外层组分共混物(2.0％，w/v)、甘油(1/7％，w/v)和余量的水，制得最终的粒子。外层组分共混物可包含约50-70摩尔％高纯蛋黄卵磷脂[阿凡提极性脂质公司(Avanti PolarLipids，Inc)]、用于偶联的约0-1摩尔％1，2-二棕榈酰基-sn甘油-3-磷酸乙醇胺-N-4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酰胺(MPB-PE，阿凡提极性脂质公司)和/或胺-PEG2000-磷脂酰乙醇胺(胺-PE，阿凡提极性脂质公司)、约2摩尔％磷脂酰乙醇胺(PE)和约0-20摩尔％胆固醇。更具体地，在典型的实验程序中，外层组分共混物可包含61摩尔％高纯蛋黄卵磷脂(阿凡提极性脂质公司)、1摩尔％生物素化-磷脂酰乙醇胺(BiotinPE)和8摩尔％胆固醇以及30摩尔％钆-DTPA-BOA。表面活性剂组分溶解在氯仿/甲醇中，减压蒸发，在50℃真空炉中干燥过夜，然后通过声波处理分散到水中。剧烈掺混混合物数分钟，然后用S110Microfluidics流化仪[微流公司(Microfluidics)]在20000PSI下连续处理4分钟。利用激光散射亚微米粒度分析仪[马尔文仪器公司(MalvernInstruments)]，在37℃重复三次测定粒度，得到的标称粒度为270±20nm。电泳光散射实验测得的电势值约为-38mV。
在一些实验中，对粒子进行改性，使其包含荧光脂质偶联标记，如与磷脂酰乙醇胺络合的罗丹明(阿凡提极性脂质公司)或Alexafluor青染料[因维特罗钦公司(Invitrogen)]。非靶定粒子(nontargeted particle)可类似地制备，不同之处是用卵磷脂代替配体-脂质偶联物。
参见图3，该图是制备本发明包封金属的纳米胶体的示意图。
钆基粒子的表征
为保证质量而进行的在线分析包括1H NMR、FT-IR和MALDI-MS光谱法，用于测量和控制对聚合物进行的疏水改性程度。利用模型发色化合物，通过UV-VIS和FT-IR观察相转移步阶，以证实水溶性客体进入聚合物反胶团。为避免胶团簇集，利用动态光散射法观察溶液态粒子尺寸，监控有机溶剂中聚合物溶液的浓度。
利用Brookhaven ZetaPlus或Malvern Zetasizer光散射粒度分析仪表征最后得到的脂质包封粒子的粒度和表面电势，典型结果为：粒度是190-250nm，多分散度约为0.12-0.2，ζ电势值在-20mV与-50mV之间。利用ICP-MS[美国加利福尼亚州波迪克特公司(Bodycote，CA)]或中子活化分析(MURR，美国密苏里州哥伦比亚市密苏里大学)测量钆的总含量。根据标称粒子体积和油-聚乙烯亚胺-Ga-DTPA混合物的体积估算粒子数。靶向剂浓度[F(ab)或肽]这样计算：从所加化合物总量中减去渗析前用HPLC测定的赋形剂中未偶联配体的浓度，其差值除以每毫升中的粒子数。所有分析方法都重复进行三次。
实施例2铋粒子的合成和表征
按照类似于实施例2所详述的方案，制备了标称流体动力学直径在200-350nm之间的原型粒子，每个结合粒子中铋金属原子的有效加载量为500000-1000000个铋原子。(参见图1)这些粒子包含铋有机金属螯合物(例如新癸酸铋)，它们悬浮在脱水山梨糖醇倍半油酸酯中，用脂质表面活性剂微流化，产生本发明的粒子。表面活性剂混合物通常由磷脂酰胆碱、含或不含用于偶联配体的聚乙二醇间隔剂的磷脂酰乙醇胺以及用于寻靶和荧光成像的其他脂质偶联物组成。
通过微流化新癸酸铋-油混合物(20％，v/v)、外层组分共混物(2.0％，w/v)、甘油(1/7％，w/v)和余量的水，制得最终的粒子。外层组分共混物可包含约50-70摩尔％高纯蛋黄卵磷脂(阿凡提极性脂质公司)、用于偶联的约0-1摩尔％1，2-二棕榈酰基-sn甘油-3-磷酸乙醇胺-N-4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酰胺(MPB-PE，阿凡提极性脂质公司)和/或胺-PEG2000-磷脂酰乙醇胺(胺-PE，阿凡提极性脂质公司)、约2摩尔％磷脂酰乙醇胺(PE)和约0-20摩尔％胆固醇。例如，在典型的实验程序中，外层组分共混物可包含90摩尔％高纯蛋黄卵磷脂(阿凡提极性脂质公司)、1摩尔％生物素化-磷脂酰乙醇胺(BiotinPE)和9摩尔％胆固醇。表面活性剂组分溶解在氯仿/甲醇中，减压蒸发，在50℃真空炉中干燥过夜，然后通过声波处理分散到水中。剧烈掺混混合物数分钟，然后用S110Microfluidics流化仪(微流公司)在20000PSI下连续处理4分钟。利用激光散射亚微米粒度分析仪(马尔文仪器公司)，在37℃重复三次测定粒度，得到的标称粒度为270±20nm。电泳光散射实验测得的电势值约为-20mV。
实施例3金粒子的合成和表征
按照类似于实施例3所详述的方案，制备了标称流体动力学直径在200-250nm之间的原型粒子，每个结合粒子中金金属原子的有效加载量为500000-1000000个金原子。(参见图1)这些粒子包含金有机金属螯合物(例如2-乙基己酸金)，它们悬浮在脱水山梨糖醇倍半油酸酯中，用脂质表面活性剂微流化，产生本发明的粒子。表面活性剂混合物通常由磷脂酰胆碱、含或不含用于偶联配体的聚乙二醇间隔剂的磷脂酰乙醇胺以及用于寻靶和荧光成像的其他脂质偶联物组成。
通过微流化新癸酸铋-油混合物(20％，v/v)、外层组分共混物(2.0％，w/v)、甘油(1/7％，w/v)和余量的水，制得最终的粒子。外层组分共混物可包含约50-70摩尔％高纯蛋黄卵磷脂(阿凡提极性脂质公司)、用于偶联的约0-1摩尔％1，2-二棕榈酰基-sn甘油-3-磷酸乙醇胺-N-4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酰胺(MPB-PE，阿凡提极性脂质公司)和/或胺-PEG2000-磷脂酰乙醇胺(胺-PE，阿凡提极性脂质公司)、约2摩尔％磷脂酰乙醇胺(PE)和约0-20摩尔％胆固醇。例如，在典型的实验程序中，外层组分共混物可包含90摩尔％高纯蛋黄卵磷脂(阿凡提极性脂质公司)、1摩尔％生物素化-磷脂酰乙醇胺(BiotinPE)和9摩尔％胆固醇。表面活性剂组分溶解在氯仿/甲醇中，减压蒸发，在50℃真空炉中干燥过夜，然后通过声波处理分散到水中。剧烈掺混混合物数分钟，然后用S110Microfluidics流化仪(微流公司)在20000PSI下连续处理4分钟。利用激光散射亚微米粒度分析仪(马尔文仪器公司)，在37℃重复三次测定粒度，得到的标称粒度为270±20nm。电泳光散射实验测得的电势值约为-20mV。
在一些实验中，对纳米粒子进行改性，使其包含荧光脂质偶联标记，如与磷脂酰乙醇胺络合的罗丹明(阿凡提极性脂质公司)或Alexafluor青染料(因维特罗钦公司)。非靶定粒子可类似地制备，不同之处是用卵磷脂代替配体-脂质偶联物。
可用类似于实施例1中的方法表征粒子。
按照类似于实施例2所详述的方案，也制备了生物素化铋纳米胶体(BiNC)，具体是将新癸酸铋(阿尔德里奇公司)悬浮在脱水山梨糖醇倍半油酸酯(阿尔德里奇公司)中，然后剧烈涡流搅拌至均匀。铋聚山梨醇酯混合物(20％，v/v)与表面活性剂共混物(2.0％，v/v)、甘油(1.7％，w/v)和水(77.3％，w/v)合并。表面活性剂共混物包含高纯蛋黄卵磷脂(90摩尔％，阿凡提极性脂质公司)、胆固醇(8摩尔％，阿尔德里奇公司)、生物素化-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(2摩尔％，阿凡提极性脂质公司)。按照相同程序制备对照纳米胶体，不同之处是不用金属。利用10000Da MWCO纤维素膜对水渗析纳米粒子，然后通过0.45μm Acrodisc Syringe过滤器。铋纳米胶体的标称粒度为210±9nm；多分散度和ζ电势分别为0.17±0.02和-22±7mV[布鲁克海文仪器公司(Brookhaven Instrument Co.)]。经ICP OES测定，20％胶体悬浮体中标称铋含量为200μg/ml。
光谱CT原型扫描仪和数据处理方法先前已见诸有关成像模型(imagingphantom)的报告18，25。通过模拟确定用90.8keV的K缘能量检测铋的最优参数：在CdTe检测器阵列的全部1024个像素上，管压设定为130～kVp，六个可调能量阈值为25.0、48.0、55.0、85.0、91.0、110.0keV。扫描仪在高放大率下工作；在100x100x100mm3的各向同性栅格上重构图像。以10mA/切片(mAs per slice)扫描血块模型(clot phantom)；人颈动脉样品是7.5mA/切片。衰减分解为光效应、康普顿效应和铋。
血块模型由加了柠檬酸钠抗凝血剂的新鲜血液(9∶1，vol/vol)制成，具体是在塑料管模(plastic tube mold)中将血浆和100mmol/l氯化钙(3∶1，vol/vol)与5U凝血酶[西格玛-阿尔德里奇公司(Sigma-Aldrich，Inc.)]混合，5-0缝线(suture)从塑料管模中穿过，以得到悬浮体。血浆在室温凝固。从模具中取出血块，然后在37℃，各自用150μg生物素化抗纤维蛋白单克隆抗体(NIB1H10)培养2小时，所述单克隆抗体在10ml PBS中，含1％结晶BSA[西格玛化学公司(Sigma Chemical Co)]。然后，用过量的亲和素(50μg/ml PBS)孵育经洗涤和抗体处理过的血块30分钟，洗涤，再用生物素化铋纳米胶体(30μL/mL PBS)孵育30分钟，然后再次洗涤。按类似方法，用对照纳米胶体(30μL/mL PBS)处理对照血块。
使用SAS[美国北卡罗来纳州凯瑞市SAS公司(SAS，Inc，Cary，NC)]提供的ANOVA程序分析光谱CT铋浓度数据，采用p＜0.05的统计显著性阈值。
在密封聚苯乙烯试管(75mm)中，将负载在缝线上的富纤维蛋白血块悬浮在磷酸盐缓冲盐水中(PBS，pH 7.4)。采用特征清楚的生物素化纤维蛋白特异性单克隆抗体(NIB5F3)，借助典型的亲和素-生物素相互作用，将生物素化铋纳米胶体(BiNC)和对照纳米胶体(即不含金属)定位到纤维蛋白血块上。图4给出了靶定纤维蛋白血块样品横断面的第一批光谱CT图像(上排)及其后面的3D最大强度投影重构图(下排)。用靶定非金属纳米粒子处理的对照血块(上排最左边)几乎没有对比度可言，而BiNC的结合为血块表面提供了优异的轮廓并增强了信号。纳米粒子的标称尺寸(250nm)可阻止它们深度穿透纤维蛋白丝的密织网络。
结合到血块表面的铋层厚1-2个三维像素(100μmx100μmx100μm)。层厚为100μm时，铋在表面层中的平均密度为3.5质量％。对于三个独立合成的BiNC，每个血块中铋的总质量经计算分别为91±0.3、136±0.8和107±0.3mg，而对照样中为0。基于每个断面的BiNC浓度的详细数据见图4C。
实施例4将铋粒子靶向到生理样品里的纤维蛋白中
对于用实施例3所述BiNC粒子进行纤维蛋白靶向的生理实例，利用取自有症状的患者的人颈动脉内膜切除(CEA)样本。
人颈动脉样品
在有症状的患者术后，获取人颈动脉内膜切除样品，冷冻直至处理。解冻后，用无菌盐水洗涤颈动脉以除去残血。在4℃的温度下，用125mg生物素化抗纤维蛋白单克隆抗体(NIB 1H10)培养颈动脉过夜，然后在37℃用125mg亲和素处理1小时，再在37℃用100ml选定的生物素化纳米粒子处理1小时，完成结合过程。所有样品在每个培养步骤之后，用无菌盐水洗涤三次，以除去任何未结合的反应物。在最后一个培养步骤之后，将颈动脉样本浸没在琼脂糖中，以备运送和成像。
结果
用纤维蛋白特异性BiNC或者对照纳米胶体靶定的CEA样本用光谱CT成像后的结果示于图5。从斑块钙引起的X射线的充分衰减(4.0keV)，很容易发现和确定用靶定金属胶体(90.8keV)处理过的破裂颈动脉斑块中纤维蛋白小沉积物的衰减增大(图“b”“d”)。相反，在对照样中只检测到钙沉积物(图“a”“c”)。如这些能量下的CT所常见的，虽然可以看到钙和铋的特征，但衰减较差的软组织细节丢失。若最近胸痛的患者被送入急诊室后，经积极诊断发现冠状动脉中新生的血栓，则可直接决定进行冠状动脉插管，从而省去了当前要住院筛查(例如压力测试)所需的医药费，也避免了相应的风险。
实施例5纤维蛋白靶向铋粒子的显微分析
利用显微方法研究了将实施例3所述BiNC粒子特异性靶向到人颈动脉内膜切除样本上的纤维蛋白的情况。
组织学研究
将人颈动脉内膜切除样本解冻，然后依次在抗纤维蛋白单克隆抗体(NIB 1H10)、亲和素和生物素化罗丹明BiNC中培养。用相同方式处理对照CEA，但是不用抗纤维蛋白抗体。每步之间除去未结合的反应物。将组织浸入O.C.T.培养基[费什尔科学公司(Fisher Scientific)]，低温切片(8μm)，相邻切片用DAPI复染色，以拍摄荧光显微图，或者利用常规技术和Vectastain ABC试剂盒[美国加利福尼亚州柏林盖姆市维克多实验室(VectorLaboratories，Burlingame，CA)]，用抗纤维蛋白抗体(1H10)进行免疫染色。用Olympus BX61进行显微成像，进行光显微成像时使用Color View II照相机，进行荧光成像时使用F-View Il B&W CCD照相机，用MicroSuite生物套装软件进行显微镜控制和图像处理[美国宾夕法尼亚州央谷市奥林巴斯美国公司(Olympus America，Inc.，Center Valley，PA)]。
结果
CEA样本的冷冻切片接触罗丹明标记的BiNC(图6)，一种情况是进行纤维蛋白抗体寻靶并利用DAPI核染色法进行复染色(蓝色)(图“a”)，另一种情况是不进行这些处理(图“b”)，结果表明，红色BiNC与沿CEA组织管腔方向层叠的纤维蛋白发生配体特异性结合(图6)。未靶定BiNC不附着到对照颈动脉样本上。相邻切片的免疫染色表明纤维蛋白存在于管腔表面上(对应于BiNC罗丹明信号)，还存在于斑块内，此处BiNC纳米粒子不能穿透。这些结果表明，由结合纤维蛋白的BiNC得到的光谱CT信号反映管腔内存在高度危险的血栓，而管腔外没有大量存在其他的纤维蛋白源，如斑块内出血。
实施例6靶定铋粒子的合成和表征
开发了“软”金属纳米胶体K缘试剂，它们可移向血管内血栓中的靶位(图7，未标记图)。这些粒子提供了靶定K缘材料的位置和浓度，这些参数可叠加到多切片CT的常规解剖图上。为说明此概念，利用体外技术测评这样靶定的光谱CT对比剂。
实施例7金纳米胶体自水溶性金纳米粒子的合成和表征
进一步研究了水溶性客体通过反胶团包容体(container)的独特相变现象，以制备本发明的金包封粒子。制备了标称流体动力学直径在180-250nm之间的原型粒子，每个结合粒子中金纳米粒子的有效加载量为100000-500000个金(AuNP)纳米粒子。(参见图2)这些纳米粒子包含两亲聚合物，所述两亲聚合物与
Figure GPA00001141254000351
[纯胶体公司(Pure Colloids，Inc.)，金纳米粒子的大小约为3-4nm的水性胶状分散体]非共价络合，形成包封金的反胶团。这些反胶团悬浮在油中，用脂质表面活性剂微流化，产生本发明的粒子。为提高金的有效加载量，可在微流化之前，在植物油中预加不同量的疏水包覆的金纳米粒子的甲苯溶液。表面活性剂混合物通常由磷脂酰胆碱、含或不含用于偶联配体的聚乙二醇间隔剂的磷脂酰乙醇胺以及用于寻靶和荧光成像的其他脂质偶联物组成。
更具体地，通过共价方式在高度支化或树枝状聚合物上接枝疏水性烷基(例如10，12-二十五烷二酸、十六烷基十八酸、胆烷酸、亚油酸等)。用EDAC活化脂肪酸，然后加入聚合物，使自由伯胺基的官能化程度超过50％。涡流搅拌后，这些疏水性聚合物在有机溶剂中形成大小为10-15nm的反胶团结构。
通过轻柔反向混合(1∶1v/v)，将金纳米粒子的胶状水性悬浮体包封在反胶团中。在典型的相转移实验中，
Figure GPA00001141254000352
溶液[纯胶体公司，3-4nm胶状金粒子(5×4ml)]与无水氯仿(5ml)中的反胶团溶液混合，温和地反向混合几分钟。肉眼观察金纳米粒子从水相到有机相的转移。回收含聚合物反胶团的有机相，用硫酸钠柱干燥，通过涡流搅拌与油混合(～1∶1v/v)。在典型的实验程序中，包封在反胶团中的
Figure GPA00001141254000353
的氯仿溶液通过涡流搅拌与油(例如花生油；4.5ml)混合(～1∶1v/v)。利用标准旋转蒸发技术减压蒸发油中的有机溶剂。在观察到沉降现象之前，金属悬浮油可稳定存在数月。
此外，为提高金的有效加载量，可在微流化之前，在油中预加不同量的辛硫醇包覆的金纳米粒子[西格玛-阿尔德里奇公司，2-4nm粒度，2％(w/v)甲苯溶液]。有机可溶的金粒子也可按照文献方法在实验室中制备[Lala等，Langmuir，17(12)，37663768，2001]。简而言之，在水中合成了金粒子，然后用辛硫醇分子封端，使之借助与α-环糊精分子复合而具有水溶性。然后，通过涡流搅拌α-CD-封端的-ODT-稳定的金粒子和氯仿的两相混合物，将水溶性金纳米粒子转移到氯仿中。
通过微流化金纳米粒子-聚合物-油混合物(20％，v/v)、外层组分共混物(2.0％，w/v)、甘油(1/7％，w/v)和余量的水，制得最终的粒子。外层组分共混物可包含约50-70摩尔％高纯蛋黄卵磷脂(阿凡提极性脂质公司)、用于偶联的约0-1摩尔％1，2-二棕榈酰基-sn甘油-3-磷酸乙醇胺-N-4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酰胺(MPB-PE，阿凡提极性脂质公司)和/或胺-PEG2000-磷脂酰乙醇胺(胺-PE，阿凡提极性脂质公司)、约2摩尔％磷脂酰乙醇胺(PE)和约0-20摩尔％胆固醇。例如，在典型的实验程序中，外层组分共混物可包含89摩尔％高纯蛋黄卵磷脂(阿凡提极性脂质公司)、1摩尔％生物素化-磷脂酰乙醇胺(BiotinPE)和10摩尔％胆固醇。表面活性剂组分溶解在氯仿/甲醇中，减压蒸发，在50℃真空炉中干燥过夜，然后通过声波处理分散到水中。剧烈掺混混合物数分钟，然后用S110Microfluidics流化仪(微流公司)在20000PSI下连续处理4分钟。利用激光散射亚微米粒度分析仪(马尔文仪器公司)，在37℃重复三次测定粒度，得到的标称粒度为170nm。电泳光散射实验测得的电势值约为-30mV。
在一些实验中，对纳米粒子进行改性，使其包含荧光脂质偶联标记，如与磷脂酰乙醇胺络合的罗丹明(阿凡提极性脂质公司)或Alexafluor青染料(因维特罗钦公司)。非靶定粒子可类似地制备，不同之处是用卵磷脂代替配体-脂质偶联物。
可用与实施例1类似的方法表征粒子。
实施例8用血块模型说明和优化用于光谱CT对比度的纤维蛋白结合粒子
利用纤维蛋白血块模型在体外评价上面开发的粒子的对比度可检测性，其中粒子通过生物素-亲和素相互作用靶向到表面上。得到可接受的光谱CT对比度后，将最好的样本与抗纤维蛋白f(ab)片段或纤维蛋白结合肽偶联，包括已公开的EPIX纤维蛋白特异性顺磁性螯合物的肽骨架(WescottCR等，PCT WO 0I/09188A1，2001)。抗纤维蛋白配体的表面浓度可以变化，配体偶联粒子的解离特性按下文所述方法测定。
光谱CT对比度的测评
对粒子在1μM-100μM的经验浓度范围内的一系列稀释液进行初始测评。在塑料安瓿中制备粒子，如同前面在实施例1中表征钆DTPA那样，用光谱CT进行成像和定量分析。用ICP-MS或中子活化对每种类型的粒子进行定量金属分析。因为预计样品内可变性较低并且稀释范围是20倍递增(tWo decade dilution range)，我们估计每种粒子浓度组合重复取4份，则可检测的对比度差异将达20％，此时在0.05的α水平上置信度(power)达80％。利用一般线性模型，可以计算和比较信号变化-粒子浓度的回归曲线斜率(美国北卡罗来纳州凯瑞市SAS公司)。
接下来，利用加过柠檬酸盐并与500mM氯化钙和凝血酶(3U/μl)混合的人血浆，产生非细胞纤维蛋白血块模型。每个血块都是这样形成的：将此混合物(400μl)迅速分配到硝化纤维膜基材上，让该混合物凝固2分钟。然后，将血块样品浸泡在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。依次用过量的生物素化抗纤维蛋白抗体处理血块，在PBS中洗涤，与过量亲和素接触，在PBS中洗涤，然后用粒子的生物素靶定形式、生物素化粒子的非钆类似物或者粒子的非靶定形式进行培养。成像前洗涤纤维蛋白血块，以最大程度减少粒子的非特异性附着。光谱CT图像和光子量化将在不同三维像素大小和X射线功率上进行。
为进一步表征优选粒子的检测灵敏度，依次用上述生物素化抗纤维蛋白抗体和亲和素处理非细胞血块模型，但分别接触不同比例的包含和不含内包钆的生物素化粒子：1∶0，1∶1，1∶10，1∶100。由于该方法的变异系数为20％，血块对比度的最小变化为30％，所以可估计8个重复样品/处理将在0.05的α水平上提供80％的置信度。先前的经验表明，以小很多的可变性获得大很多的变化是可能的。
抗纤维蛋白靶向分子
利用常规方法由杂种瘤制备和提纯抗纤维蛋白单克隆抗体(NIB l H10，NIB 5F3)18 37。利用F(ab)配制试剂盒[美国伊利诺伊州洛克福特市皮尔斯公司(Pierce，Rockford，IL)]产生和分离抗纤维蛋白F(ab)片段。简而言之，将IgG渗析到20mM磷酸盐/10mM EDTA缓冲液(pH 7.0)中，浓缩至20mg/ml，然后用固定木瓜蛋白酶消化。利用蛋白质A柱从Fc片段和未消化的IgG蛋白提纯溶解的F(ab)’。利用G25-150柱和去氧磷酸盐缓冲液(pH 6.7)从过量半胱氨酸提纯F(ab)片段。利用常规SDS-PAGE程序确证馏分为何物。利用非特异性猪IgG[美国密苏里州西格玛公司(Sigma，MO)]得到类似的纳米胶体，用它制备具有随机特异性的对照配体。将F(ab)馏分聚集起来，并与MPB-PE衍生的纳米胶体合并[1-2mg F(ab)/ml纳米胶体]。将混合物调节至pH 6.7，在氮气保护下密封，在连续轻轻搅拌下，使之在室温下反应过夜。随后，利用300000MWCO Spectra/Por DispoDialyzer[美国加利福尼亚州拉古纳西尔公司(Laguna Hills，CA)]，将该混合物对10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)进行渗析，除去未偶联F(ab)片段。最终的纳米胶体在氮气下装瓶，使用前在4℃下贮存。可利用对照不相关IgG F(ab)片段，通过上述方法制备非特异性对照纳米胶体。
为评价抗纤维蛋白IgG及其F(ab)片段的生物活性而进行的ELISA分析，得到了完整抗纤维蛋白IgG代用品和切下的F(ab)片段在冻干前后的生物活性与不同纤维蛋白原底物之间的变化关系。此外，利用50或250mM海藻糖作为防冻剂和膨松剂，可以保持冻干F(ab)的偶联完整性(couplingintegrity)。我们已经发现，采用聚乙二醇2000链，每个纳米粒子(250nm)约有25个F(ab)或IgG配体发生偶联是最佳的，此时效率较高(＞80％)，产生多价程度高的靶向系统。若采用小肽或模拟物和酰胺键连接形式，偶联效率保守地说也超过90％，每个粒子的配体数约大10倍。
除抗纤维蛋白抗体外，还要研究肽作为潜在导向配体的情况：EPIX-9。EPIX-9(PCT WO 01/09188A)是利用噬菌体展示技术(DYAX公司)发现的纤维蛋白特异性肽家族，对于人纤维蛋白和纤维蛋白原，它分别具有2.6μmKd和190μm Kd。赖氨酸作为第一氨基酸加入，它在侧链上具有正交保护基4，4-二甲基-2，6-二氧亚环己-1-基(ivDde)。采用标准Fmoc固相肽合成(SPPS)方法进行链增长反应之后，用2％肼在DMF中的溶液处理，有选择地脱去ivDde基的保护。在HBTU[六氟磷酸(2-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基铵]、DIPEA和DMF存在下，加入偶联基团6-Boc-HNA(6-Boc-肼烟碱酸)，然后同时脱去半胱氨酸的保护，并形成二硫键，使肽环化。从树脂上裂解肽，通过用三氟乙酸(TFA)、H2O和三异丙基硅烷(TIS)处理，除去剩余的侧链保护基。最终的肽用HPLC提纯，用MS表征，并在海藻糖中冻干备用。后面偶联到粒子上的过程类似于前文所述抗纤维蛋白F(ab)的程序。
纤维蛋白的解离常数
对用靶向分子以不同密度进行共价改性的粒子进行纤维蛋白结合表征。制备在包含约15mM柠檬酸盐的TBS(50mM Tris，150mM NaCl，pH 7.4)中的纤维蛋白原溶液(10mg/ml，2倍于纤维蛋白的预期浓度)，并制备在TBS中的含凝血酶(2U/ml)、20mM CaCl2和5mMε-氨基己酸的第二溶液。在96孔板的孔中，按1∶1(共计100μl)的比例混合纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液。板干燥过夜。在1μM与200μM之间，以24种浓度加入肽或粒子偶联物(后者浓度基于粒子)，盖上盖子，在37℃培养2小时。用移液管移出每个孔中的上清液，用HPLC/ELSD测量肽的浓度，用金属含量法测量粒子的浓度；两种浓度均与已知标准比较。从初始浓度中减去游离肽或粒子的浓度，即可算得结合肽或粒子的浓度。画出结合肽或粒子相对于游离肽或粒子的图，可估计Kd和结合肽的饱和浓度。将曲线拟合为方程[结合]＝N×[游离]/Kd+[游离]，其中N为结合位的浓度，Kd为解离常数，即Ka的倒数。N除以分析得到的纤维蛋白浓度(通常是15μM)，可估算每个纤维蛋白分子的结合位数目。
由于纤维蛋白原是纤维蛋白靶向的潜在竞争者，所以也可测出在生理浓度的纤维蛋白原存在下的结合亲和力。在PPACK(D-phe-pro-arg-氯甲基酮)存在下，加入最高达400mg/dl的不同浓度的游离纤维蛋白原，以消除凝血酶的活性。如上文所述测量游离的和结合的肽或粒子，计算表观Kd。所有实验重复进行三次，给出平均值和平均值的标准偏差。
实施例1-8的参考文献
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实施例9制备磁性粒子
此实施例详细描述了制备磁性粒子的方法(参见图7)。在本实施例中，悬浮有氧化铁的植物油基质为20％(v/v)，表面活性剂为2％(w/v)。悬浮油可由1％-4％(w/v)经疏水包覆的有机可溶的氧化铁(在本实施例中为2％)构成。经疏水包覆的氧化铁(氧化铁包覆物)是用脂肪酸(例如油酸)或其他疏水结构实现的，当将其溶解在有机溶剂中并与油预混合时，将导致氧化铁以胶状形式停留和悬浮。通过例如旋转蒸发除去溶剂，然后例如在真空下于50℃干燥2-3小时。在本实施例中，2％表面活性剂共混物包含L-α-磷脂酰胆碱、胆固醇、DPPE和磷脂偶联靶向配体(例如生物素化-DPPE等)，将它们溶解在氯仿中(若需要获得均匀溶液，可加入少量甲醇)。利用旋转蒸发仪，在最高45℃的温度下于真空下蒸发氯仿，然后在40℃真空干燥箱内保持过夜。
装有脂质膜的试管或烧瓶用超纯去离子水(0.2mM过滤)进行2分钟探针声波处理(Branson Sonifier超声探针)，直至完成脂质的再悬浮。这些物质与余下部分的水和甘油在50ml离心管中合并，进行声波处理，直至得到均匀的胶体溶液。将这些物质转移到微流化仪中，在16000-20000psi的压力下，在冷浴中用冰水匀浆化4分钟。处理之后，将纳米胶体转移到30毫升消过毒的血清瓶中，在氮气下密封，存放在冰箱内。
利用碳二亚胺偶联方法，用双联剂胺/酸对表面进行化学交联处理。粒子膜可任选暴露于254nm的UV辐射，利用脂质膜中的β胡萝卜素进行光交联，以提高粒子的稳定性和完整性，并且更好地将氧化铁保留在油核内。
磁性氧化铁核包含磁铁矿或磁赤铁矿或其混合物的多晶磁性氧化铁核。磁性铁核中还可加入其他金属，以提高磁场强度。包含在多晶磁性氧化铁粒子中的胶体核优选具有1-50nm的尺寸。纳米胶体粒子的平均粒度优选为100-300nm。氧化铁粒子的疏水包衣可以是任何有机可溶的包衣。每个胶体粒子的表面和脂质包封物都可根据需要用不同的导向配体和药物特制。
下表D显示了氧化铁粒子在交联之前(4-5天)和交联之后(2个月)的稳定性。
表D
Figure GPA00001141254000421
实施例10动态光散射测量
利用布鲁克海文仪器公司的ζ粒度仪-ζ电势分析仪，通过动态和电泳光散射技术计算胶状团聚体的流体力学直径和ζ电势。纳米胶体的流体力学直径和ζ电势分别在130至300nm和-23mv至-40mV的范围内(参见图8和图9)。
实施例11铁浓度的估算
利用感应耦合等离子体-质谱测量液体样品中的铁浓度，结果发现铁浓度是1000-3500mg/g之间的任何数值。
实施例12透射电镜
通过透射电镜测量悬浮体中的粒度分布和团聚体的尺寸(图10)。胶状粒子的透射电镜图表明，胶状粒子具有球状性质，每个粒子的核由多个氧化铁粒子构成。胶状粒子的平均粒度可以是10nm-2μm、优选100-300nm之间的任何数值。
实施例13磁性测量
利用振动样品磁强计测量乳液的磁性(图11)。将样品放在沿X轴具有连续变化的均匀磁场的磁体内部，单位为奥斯特(Oersted)。振动磁性样品引起磁通量变化，而磁通量变化又产生感应电压，该感应电压正比于样品在Y轴上的磁矩，单位为电磁单位(EMU)。饱和磁矩为9.331E-4电磁单位，而剩磁(外加磁场为0时的样品磁矩)为3.4E-6电磁单位。要将样品磁矩从饱和向下反转为0，需要1.519奥斯特的矫顽外磁场强度。矫顽磁性值和残余磁化强度值可忽略不计(Ir/Is*100％＝0.36％)，表明粒子具有超顺磁效应，这是体内应用所要求的。
实施例14药物释放实验动力学
此实施例描述典型疏水药物烟曲霉素的溶出研究结果。结果表明，加载的氧化铁纳米胶体在3天后释放的烟曲霉素药物不到1％。这说明粒子表面或粒子核内的药物加载效率达98％-99％。此实验显示，药物能够充分保留在循环中，直至发生清除或靶向。缓慢扩散或粒子裂解会在局部释放药物。相比于全身给予等效药物水平，受制循环、所给剂量预期下降以及针对病理的粒子靶向浓度的提高均有助于提高效能，同时降低毒性。此外，成像组合可用于测评药物是否以足够的治疗剂量到达目的部位，以及根据所递送的药物剂量估计能达到的响应等级。
实施例15磁共振成像
利用100％-1％的系列粒子稀释液，以及包括Look-Locker(反转恢复)和多回波梯度回波技术在内的MR采集技术，测量纳米胶体的MR T1和T2性质(参见图13和14)。为测评T1和T2加权图像的信号，将官能化粒子定位到血块表面，其中生物素和抗体在体外定位到悬浮于盐水中的富纤维蛋白血栓上(n＝7)；一个血块用作未经处理的参照样。血块成像在1.5T进行，采用作ROI分析的高分辨率(0.3×0.3×1.2mm3)3D T1-加权涡轮自旋回波序列，以及作肉眼检查的T1和T2*加权低分辨率(1×1×5mm3)梯度回波成像。
在高浓度溶液中，T2*效应占主导地位，产生氧化铁粒子常见的暗淡扭曲像。当结合于富纤维蛋白血块的外表面时，纳米胶体将增加T1加权成像的亮度(SNR＝26)；而未接收粒子的对照血块很难与周围的盐水区分(SNR＝10)。结合粒子在T2加权图像上产生特征性“膨胀”效应，而对照血块没有。对类似的脂质包封的乳胶粒子应用药物动力学参数和模型，这种供典型体内施用的纳米胶体粒子的系统浓度预计在注射时小于1％的稀释浓度，此浓度在20分钟将降为约0.03％，这表明，尽管粒子被约束在血管内，但注射之后，背景水平很快变得可忽略不计，只剩下结合粒子还看得见。此外，此粒子的T1和T2双对比特征使得造影前基线图像的拍摄可以省去。
这些数据表明，在系统给予和靶向定位之后，要立即检测循环系统中的特异性细胞表面标记，如纤维蛋白和整联蛋白，此新型纳米胶体粒子是有应用潜力的。此外，由于既有更大的粒度，又能够快速成像，所以本发明的粒子不会混淆T1w对比度源和血管外巨噬细胞的吞噬作用，而目前几乎所有的氧化铁基粒子都会发生这种混淆。网状内皮组织会快速清除粒子。此外，纤维蛋白特异性超顺磁性纳米胶体可以高灵敏度和亮对比度检测破裂斑块中的微血栓。高MR灵敏度和短T1加权脉冲序列的成像速度优势结合起来，甚至可以克服心脏运动对MR冠状动脉分子成像造成的障碍。
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Figure GPA00001141254000451
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Claims (68)

1.一种包含形成于内核上的外层的粒子，其特征在于：
a.内核包含至少一种金属原子和油或油状物质，所述金属原子选自原子序数为18或更大的金属原子；以及
b.外层包含两亲材料。
2.如权利要求1所述粒子，其特征在于，所述金属原子包含有机金属化合物或有机包覆的金属化合物。
3.如权利要求1所述粒子，其特征在于，所述外层还包含至少一种金属原子。
4.如权利要求1所述粒子，其特征在于，所述粒子包含至少2个但少于100个金属原子。
5.如权利要求1所述粒子，其特征在于，所述粒子包含至少100个但少于100个金属原子。
6.如权利要求1所述粒子，其特征在于，所述粒子包含至少1000个但少于100000个金属原子。
7.如权利要求1所述粒子，其特征在于，所述粒子包含至少100000个但少于1000000个金属原子。
8.如权利要求1所述粒子，其特征在于，所述粒子包含至少300000个金属原子。
9.如权利要求1所述粒子，其特征在于，所述粒子包含至少400000个金属原子。
10.如权利要求1所述粒子，其特征在于，所述金属选自在CT的X射线能带内具有K缘的金属。
11.如权利要求1所述粒子，其特征在于，所述金属选自：碘、金、铋、钛、钨、钽、铯和钆。
12.如权利要求1所述粒子，其特征在于，所述金属原子包含选自金属氧化物、金属硫化物、金属磷酸盐、金属碳酸盐、金属铬酸盐及其组合的金属化合物。
13.如权利要求1所述粒子，其特征在于，所述金属原子选自顺磁性或超顺磁性金属。
14.如权利要求13所述粒子，其特征在于，所述金属选自：铁、锰、钴和钆。
15.如权利要求12所述粒子，其特征在于，所述金属氧化物选自：磁铁矿、磁赤铁矿及其组合。
16.如权利要求12所述粒子，其特征在于，所述金属氧化物具有式MFe2O4，其中M选自Fe、Mn、Co、Ni、Mg、Au、Cu、Zn、Ba、Sr、Pt、Tl、Ti及其组合。
17.如权利要求1所述粒子，其特征在于，所述金属选自具有光学、近红外或光声性质的金属。
18.如权利要求17所述粒子，其特征在于，所述金属选自金、镍、钴、锰和镁。
19.如权利要求17所述粒子，其特征在于，所述金属是混合金属氧化物或尖晶石。
20.如权利要求19所述粒子，其特征在于，所述混合金属氧化物或尖晶石选自：氧化金、氧化镍、氧化镁、氧化锰和氧化钴。
21.如权利要求1所述粒子，其特征在于，所述金属具有声散射性质。
22.如权利要求21所述粒子，其特征在于，所述金属选自：金、铋、钛、钨、钆和钽。
23.如权利要求21所述粒子，其特征在于，所述金属是混合金属氧化物或尖晶石。
24.如权利要求23所述粒子，其特征在于，所述混合金属氧化物或尖晶石选自：氧化金、氧化镍、氧化镁、氧化锰和氧化钴。
25.如权利要求1所述粒子，其特征在于，所述金属选自具有放射性粒子发射性质的金属。
26.如权利要求25所述粒子，其特征在于，所述放射性粒子发射选自：α粒子、β粒子、γ射线或正电子发射。
27.如权利要求25所述粒子，其特征在于，所述金属包含天然存在或人工产生的放射性同位素。
28.如权利要求1所述粒子，其特征在于，所述粒子的标称粒径小于100nm。
29.如权利要求1所述粒子，其特征在于，所述粒子的标称粒径大于100nm而小于500nm。
30.如权利要求1所述粒子，其特征在于，所述外层还包含一种或多种选自表面活性剂、生物活性剂、靶向剂和成像剂的分子。
31.如权利要求30所述粒子，其特征在于，所述外层包含选自天然材料、合成材料、半合成材料及其组合的两亲材料。
32.如权利要求31所述粒子，其特征在于，所述天然两亲材料选自：脂质和表面活性剂。
33.如权利要求31所述粒子，其特征在于，所述合成两亲材料选自：脂质、表面活性剂和聚合物。
34.如权利要求31所述粒子，其特征在于，所述半合成两亲材料选自：脂质、表面活性剂或聚合物。
35.如权利要求30所述粒子，其特征在于，所述生物活性剂选自：脂质、蛋白质、类固醇、肽、碳水化合物、核酸、金属或其衍生物、类似物和组合。
36.如权利要求26所述粒子，其特征在于，所述生物活性剂是化学化合物。
37.如权利要求30所述粒子，其特征在于，所述靶向剂选自：噬菌体、病毒、肽、蛋白质、核酸、小分子、碳水化合物、脂质及其模拟物、组合、工程改造类似物或衍生物。
38.如权利要求30所述粒子，其特征在于，所述成像剂选自：可体内、原位、离体和体外检测的试剂。
39.如权利要求38所述粒子，其特征在于，所述成像剂选自：可通过光学成像、近红外成像、NMR成像、MRI成像、X射线成像、CT成像、K缘成像、超声成像、光声成像、声光成像、微波成像、核成像及其组合进行检测的试剂。
40.如权利要求1所述粒子，其特征在于，所述内核金属包含至少一种选自反胶团、有机金属化合物、疏水包覆金属粒子及其组合的结构。
41.如权利要求40所述粒子，其特征在于，所述反胶团包含两亲聚合物和金属。
42.如权利要求40所述粒子，其特征在于，所述有机金属化合物选自：聚山梨醇酯、脂肪酸、表面活性剂、脂族和芳族疏水性化合物及其组合。
43.如权利要求40所述粒子，其特征在于，所述疏水包覆金属粒子选自：脂肪酸、表面活性剂、天然和合成聚合物、脂族和芳族疏水性化合物及其组合。
44.如权利要求40所述粒子，其特征在于，所述内核由多个反胶团组成。
45.如权利要求44所述粒子，其特征在于，所述多个反胶团基本上包含粒子所含的所有金属原子。
46.如权利要求40所述粒子，其特征在于，所述内核由多种金属化合物组成。
47.如权利要求1所述粒子，其特征在于，所述油或油状物质选自：天然的油或油状物质、合成的油或油状物质及其组合。
48.一种制备粒子的方法，所述粒子包含形成于内核上的外层，其中，所述粒子包含至少一种金属原子，所述金属原子选自原子序数为18或更大的金属原子；所述内核包含基本上所有的金属原子和油或油状物质；所述外层包含两亲材料，所述方法包括：
a.制备内核，其包含至少一种金属原子在油或油状物质中的悬浮体；以及
b.在内核上形成外层。
49.如权利要求48所述方法，其特征在于，所述内核悬浮体通过高剪切混合形成。
50.如权利要求49所述方法，其特征在于，所述内核悬浮体包含多个反胶团。
51.如权利要求48所述方法，其特征在于，所述外层通过高剪切混合在内核上形成。
52.如权利要求48所述方法，其特征在于，所述金属选自在CT的X射线能带内具有K缘的金属。
53.如权利要求48所述方法，其特征在于，所述金属选自具有顺磁性或超顺磁性的金属。
54.如权利要求48所述方法，其特征在于，所述金属选自具有光学或近红外性质的金属。
55.如权利要求48所述方法，其特征在于，所述外层还包含一种或多种选自两亲物、生物活性剂、靶向剂和成像/跟踪剂的试剂。
56.如权利要求48所述方法，其特征在于，所述油或油状物质选自：天然油、合成油及其组合。
57.一种获取对象生物组织图像的方法，所述方法包括：
a.给予包含多个权利要求1所述粒子的组合物；
b.在对象上进行信号采集扫描；以及
c.处理由信号采集获得的数据，产生数据后形成目标对象的图像。
58.如权利要求57所述方法，它还包括对数据和图像进行后处理以形成解释。
59.如权利要求57所述方法，其特征在于，所述图像是光谱CT图像，所述粒子包含在CT的X射线能带内具有K缘的金属。
60.如权利要求57所述方法，其特征在于，所述图像是MR图像，所述粒子包含具有顺磁性或超顺磁性的金属。
61.如权利要求57所述方法，其特征在于，所述图像是光学或PAT图像，所述粒子包含具有光学或近红外性质的金属。
62.如权利要求57所述方法，其特征在于，所述图像是利用光学显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、共焦显微镜、声原子力显微镜得到的。
63.如权利要求57所述方法，其特征在于，所述图像可在体内、原位、离体或体外检测。
64.如权利要求57所述方法，其特征在于，所述生物组织包含生物标记。
65.如权利要求57所述方法，其特征在于，所述生物标记包含组织组分，所述组织选自微血栓、血液、血管和淋巴管。
66.如权利要求65所述方法，其特征在于，所述血管/淋巴管涉及一种或多种病理，所述病理选自肿瘤病理、心血管病理、皮肤病理、泌尿生殖器病理、肺部病理、肌肉骨骼病理、胃肠病理、神经病理、血液病理、内分泌病理、感官病理、炎症病理和风湿病理。
67.如权利要求65所述方法，其特征在于，所述生物标记包含血管外组织的组分。
68.如权利要求67所述方法，其特征在于，所述血管外组织涉及一种或多种病理，所述病理选自肿瘤病理、心血管病理、皮肤病理、泌尿生殖器病理、肺部病理、肌肉骨骼病理、胃肠病理、神经病理、血液病理、内分泌病理、感官病理、炎症病理和风湿病理。
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