CN101864440B

CN101864440B - 根特异启动子与抗病基因chi培育抗青枯病烟草的方法

Info

Publication number: CN101864440B
Application number: CN2010102274879A
Authority: CN
Inventors: 庄伟建; 陈顺辉; 蔡铁城; 闫利明; 潘建箐; 陈华; 兰岚
Original assignee: INSTITUTE OF TOBACCO AGRICULTURAL SCIENCES FUJIAN TOBACCO MONOPOLY ADMINISTRATION; Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Institute of Tobacco Agricultural Sciences, Fujian Tobacco Monopoly Administration; Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2010-07-15
Filing date: 2010-07-15
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2030-07-15
Also published as: CN101864440A

Abstract

本发明提供了一种根特异启动子与抗病基因CHI培育抗青枯病烟草的方法，包括CHI基因的克隆、抗青枯病CHI基因烟草植株表达载体的构建、抗烟草青枯病CHI基因材料的培育以及抗病转基因植株的筛选鉴定。获得的转CHI基因烟草品系，其抗性明显高于受体品种翠碧一号及非转基因后代。目前对转CHI基因烟草进行根、茎接种鉴定，表明了转基因烟草具有高抗烟草青枯病的能力。将烟草根特异启动子NtR12与抗病基因CHI结合在一起构建的植物表达载体，遗传转化得到的转基因烟草，CHI基因不在烟草叶片表达，符合分子安全育种的有效基因工程手段。

Description

根特异启动子与抗病基因CHI培育抗青枯病烟草的方法

技术领域

本发明涉及一种运用基因工程技术培育烟草安全抗青枯病种质材料的方法，更具体地涉及了一种利用烟草根特异启动子携带抗病基因CHI培育烟草抗青枯病新品系的方法，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

烟草作为一种特殊的经济作物，本年给国家带来了巨大的收入，烟草种植过程中容易受到病虫害的危害，我国南方烟草种植过程中由于受高温、高湿的影响，容易感染烟草青枯病，因此青枯病成为南方烟草种植的主要病害之一。经过多年的努力生产实践，还为找出合理有效解决青枯病的有效手段，加上对青枯病的防治，目前也没有特效药，因此每年因青枯病的危害而给烟草种植带来了巨大的损失。

随着植物基因工程的迅猛发展，为烟草分子育种提供了有利的基础，通过导入青枯菌抗性基因，以提高作物对青枯菌的抗性。目前抗青枯病基因仅在拟南芥有报导，拟南芥基因组中存在着决定青枯菌抗性的基因RRS1一S和隐性基因RRSIR，它们编码的蛋白除了长度上的差异，其结构高度同源，都具有TIR—NBS—LRR结构域，对青枯菌有较强的抗性（黄真池 2008）。转AtMYB30基因烟草通过增强超敏反应，提高了对包括青枯菌在内的多种细菌病原体的抗性（Vailleau F 2002）。几丁质酶基因在植物抗真菌性病害中发挥着重要作用，1991年首次将菜豆几丁质酶基因转入烟草，获得几丁质酶的高效表达，对立枯病菌（Rhizoctonia solani）产生抗性（Broglie K，et al.1991），此后将不同来源的几丁质酶基因转化烟草，转基因烟株获得了对炭疽病（时焦和Cooper J I，2002）、白粉病与立枯丝核菌（王关林和方宏筠，2002）、黑胫病菌(Phytophthora parasitica var．nicotianae)与赤星病菌(Alternaria alternata)（罗小英等，2005）等真菌性病害的抗性。它可以降解病原真菌细胞壁中的几丁质破坏细胞新物质的沉积致使病原体死亡，而且产生的细胞壁碎片具有诱导作用，从而刺激寄主植物的抗病反应。

随着转基因技术的发展，转基因安全性得到了全所谓有的关注，科研工作者通过不同的技术手段在解决转基因安全性上也取得了一些进展，近年来在多基因转基因技术、叶绿体转基因技术、无选择标记技术、基因删除技术等安全转基因技术方法方面也有了一些重要的成就。利用特异启动子来解决转基因安全性也同样得到了关注，通过特异的启动子，让基因在特定的时间、特定的部位表达。是解决转基因安全性的另一个有效手段。

本发明就是针对以上背景技术，通过从烟草基因组中克隆烟草根特异表达启动子，烟草几丁质酶基因，将目的启动子与目的基因连接在载体上，构建植物表达载体，建立以抗生素为筛选剂的转基因遗传体系，以及快速、高效的转基因检测技术和接种抗病鉴定，大幅度的提高烟草抗青枯病能力，为解决烟草安全抗青枯病品种的培养奠定了良好的技术基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用烟草根特异启动子携带抗病基因CHI培育抗青枯病烟草新品系的方法。所解决的技术问题是一种利用转基因技术安全有效的解决烟草青枯病的方法。

本发明的利用烟草根特异启动子携带抗病基因CHI培育抗青枯病烟草新品系的方法，包括烟草根特异启动子的克隆，抗病基因CHI的克隆，抗烟草青枯病表达载体的构建，培育抗青枯病转基因烟草，以及接种转基因烟草青枯菌进行材料的筛选鉴定。

通过烟草本身基因组中核苷酸序列的重新整合，利用生物技术来解决转基因安全性问题。具体地说是烟草基因组中克隆烟草几丁质酶基因与烟草根特异启动子，构建植物表达载体，通过农杆菌叶盘法的侵染，将目的载体转化到烟草翠碧一号中，培育转基因烟草植株，对转基因烟草阳性植株进行接种青枯菌进行鉴定，筛选高抗烟草青枯病的转基因烟草新材料。

其中：

1. 所述根特异启动子为烟草根特异启动子NtR12，所述启动子具有如SEQ ID No.3所示的碱基序列烟草NRT12根特异启动子如SEQ ID No.3所示的碱基序列；

2. 所述CHI基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列；所述CHI核苷酸序列对应的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；

3. 构建含有烟草根特异启动子驱动抗病基因表达的植物载体pSC1300-NRT12-CHI，其中基础载体指的是pCAMBIA1300，启动子是NRT12, 基因是烟草几丁质酶基因CHI。

4. 利用农杆菌介导叶盘法转化烟草获得转基因烟草植株。

本发明利用生物技术手段，安全、有效培育转基因烟草抗青枯病种质新材料，通过对烟草本身基因组序列进行克隆，得到烟草根特异启动子，以及烟草几丁质酶基因，让根特异启动子携带抗病基因只在烟草根部表达，来有效的抑制青枯病在烟草种植过程中的蔓延以及给烟叶产量、品质带来的影响。本方法通过对烟草根特异启动子的克隆、烟草抗病基因CHI的克隆，将两段序列结合在一起，构建由根特异启动子驱使抗病基因表达的植物表达载体，以及通过组培培育转基因烟草植株，对烟草接种青枯菌进行抗性鉴定。

根据上述培育获得烟草特异启动子驱动抗病基因CHI的转基因材料，通过对转基因烟草进行青枯菌接种鉴定，已获得一批高抗烟草青枯病的转CHI基因烟草的新材料。

本发明的载体是将根据烟草以报导的几丁质酶序列合成引物，克隆CHI基因，将基因与本实验室所克隆的烟草根特异启动子相结合构建植物表达载体，运用于烟草分子育种上，提高分子育种的安全性。其克隆的烟草几丁质酶基因全长有965个核苷酸序列，该序列编码322个氨基酸，与Shinshi, H.,等人发表的CHI基因的氨基酸序列有4个差异，同源性为98%。BioXM2.2软件推导出其蛋白质分子量为34.39 KDa，等电点为8.06。融合GST标签后蛋白分子量为61.36 KDa。

同源克隆得到的烟草NRT12根特异启动子全长956bp，NtR12启动子AT占64.6%，GC占35.8%。AT丰富序列的低复杂度有利于DNA双链结构的解螺旋，提高基因的转录效率。启动子存在GC盒，因为GC盒一般位于TATA-box和CAAT-box的上游，所以猜测这个基因启动子序列是完整的启动子。

本发明转基因烟草新材料具有以下优点：将烟草根特异启动子运用于烟草分子育种上，提高了转基因安全性，由根特异启动子携带光谱抗病基因在烟草根和茎部表达，对烟草青枯病有较强的抵抗能力甚至达到免疫功能。通过对转基因烟草进行接种青枯菌进行抗性鉴定，得到了高抗烟草青枯病的转基因新材料，为培养高抗烟草青枯病的转基因植株奠定了有利的基础。

说明书附图

图1为烟草P12根特异启动子携带抗病基因CHI的载体构建。

图2 为转CHI基因烟草组DNA检测；

图3 为转基因烟草植株PCR分子检测；

图4 为转基因烟草接种青枯菌抗性检测；其中a为转基因植株，b为对照。

具体实施方式

为了进一步更详细地阐明本发明，以下结合实施例加以说明。

【实施例1】烟草基因组DNA的提取以及烟草根特异启动子、抗病基因的克隆

取烟草叶片0.3g左右的冻存组织，液氮研成粉末。加入500ul裂解缓冲液（10mmol Tris-Cl pH8.0；0.1mol EDTA pH8.0；0.5% SDS；20ug/ml RNase A），50℃水浴3-5hr。加入500ul平衡酚，振荡混匀后，于4℃ 12000g离心15min，取上层水相。反复抽提一次。加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），振荡混匀后，于4℃ 12000g离心10min；取上层水相，加入2倍体积的冰预冷的无水乙醇，置-20℃ 20min。以吸头小心挑取云絮状物转入另一Ep管中，以70%乙醇洗涤1-2次。待沉淀风干后，加入100ulTE溶液溶解，置-20℃保存。

利用同源克隆法，合成两条引物P12-BamHⅠ-F:5’-GCAAGCTTCAAGATC

AAAATTTTGA-3；P1-HindⅢ’-R: 5’-GTGGATCCAGTAGTACAATTCATTGTGC

TTTATATTT-3’，同时在引物上设计限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ的识别序列，通过扩增PCR，从烟草基因组中扩增克隆到根特异启动子NRT12。

通过GENBANK已经公布的CHI基因序列，设计两条引物CHIF-1-SmaI 5’- ATATCCCGGGGCCACCATGAGGCTTTGTAAATTCAC-3’CHIR-990-SacI 5’-C

GGCGAGCTCTTAATTTCCAAAAGACCTCTGGT -3’克隆得到烟草几丁质酶基因，所克隆的烟草几丁质酶基因全长有965个核苷酸序列，该序列编码322个氨基酸，与Shinshi,H.,等人发表的CHI基因的氨基酸序列有4个差异，同源性为98%。

【实施例2】烟草NRT12根特异启动子携带抗病基因CHI的载体构建

用限制性内切酶PSTⅠ、EcoRⅠ双酶切载体PSPROK和载体PCAMBIA1300，并将回收到的目的片段进行纯化，用T4连接酶过夜连接，转化到大肠杆菌DH5α菌株，涂板后，倒置放在37℃过夜培养后挑起单菌落，用试剂盒提取质粒，用PSTⅠ、EcoRⅠ双酶切鉴定，获得的重组的载体命名为Psc1300。

利用BamHⅠ、HindⅢ双酶切载体Psc1300以及NRT12启动子，回收目的片段，用T4连接酶16℃过夜连接，用大肠杆菌DH5α菌株转化，涂板后，倒置放在37℃过夜培养后挑起单菌落，用试剂盒提取质粒，用BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定，获得的重组的载体命名为Psc1300- NRT12。

分别用SmaI、SacⅠ单酶切载体Psc1300-P12和胶回收目的基因CHI，并同时回收酶切产物，用T4连接酶16℃过夜连接，转化到大肠杆菌DH5α菌株，涂板后，倒置放在37℃过夜培养后挑起单菌落，进行PCR鉴定，挑单个阳性重组菌于Kan含量为50mg.L-1的LB培养基中37℃振荡过夜培养，用试剂盒提取质粒，命名为Psc1300- NRT12-CHI。

【实施例3】烟草的遗传转化

1. 烟草无菌苗的获得以及根瘤农杆菌侵染液的制备

往1.5毫升的离心管中放入大概200粒左右的CB—1烟草种子，用70%的酒精进行消毒1分钟，在超净工作台上用事先准备好的无菌水清洗三次用0.1%的升汞进行消毒10-15分钟无菌水再次清洗5次，将处理好的无菌种子种植在1/2MS培养基上。

从YEB固体平板上挑取含有重组质粒的单菌落，接种到含有Rif 和Km的液体培养基中，28℃ 250rpm 培养过夜；取1ml过夜培养的菌液接种到30ml含有相应抗生素（或无任何抗生素）的YEB液体培养基中继续振荡培养，至O.D.600 =0.6-0.8，4000rpm， 4℃离心10min，弃上清；沉淀用20ml MS液体培养基（MS大量+ MS微量+20 g/l蔗糖，pH=5.8）重新悬浮备用。分光光度计测得此时菌液的O.D.600 在0.3-0.6左右。

2. 根瘤农杆菌介导的烟草遗传转化

外植体制备：取事先培养的无菌苗嫩叶，剪切成0.5×0.5cm大小。叶盘法转化：将处理好的外植体投入制备好的菌液中，浸泡侵染5mi后，用含有Cef 500mg/L的无菌水冲洗3-5次后，接种于共培养基中于28℃暗培养；2天后转入含有Cef 500mg/L,Hyg 10mg/L的叶片芽诱导培养基上筛选培养，控制温度为25-28℃、光强为2000lex、每天光照时间为12-14hr。等叶芽长至1cm大hr，转入生根培养基。待基部伸出大量根系、上部生长至3～4cm的幼苗转至盛有无菌沙土的培养盒内，炼苗后转入温室培养。诱导培养基：培养基+0.1mg/L NAA+ 1mg/L 6-BA，共培养培养基：MS培养基+0.1mg/L NAA+ 1mg/L 6-BA，诱导筛选培养基：MS培养基+0.1mg/L NAA+1mg/L 6-BA+10mg/L Hyg +500mg/L Cef，生根培养基：MS培养基5mg/L Hyg +500mg/L Cef。

【实施例6】转基因烟草的PCR、抗性检测

1.采用CTAB法快速提取烟草基因组DNA，叶片粉末取0.1g，加入600-700ul CTAB（100 mM Tris·Cl, pH 8.0 ，20 mM EDTA, pH 8.0，1.4 M NaCl），65℃水浴15min-30min，加入相同体积的氯仿：异戊醇，剧烈震动1min，10,000rpm.离心10min，取上清液到新的离心管中，加入相同体积的异丙醇（预冷）10,000rpm.离心10min，用70%酒精清洗两次。并烘干用30-50ul H2O溶解，并加入小量的RNAase，检测DNA如图2所示，取1-3ul用于PCR检测，检测的结果如图3所示，转基因植株中含有目的启动子、抗病基因及终止子的整个表达单元元件。目的条带刚好符合引物所扩增的条带。

2. 将实验室保存的青枯菌种划板，挑取单克隆于SPA培养基过夜培养，取1ml菌液于新的SPA培养基培养，5个小时后，检测浓度，OD=0.5的时候，取出菌液离心，收集菌体，用等量的无菌水悬浮。用一毫升容量的注射器吸取重悬的菌液接种于转基因植株上，以同期生长的CB-1作为对照。转基因烟草植株对青枯菌有一定的抵抗能力，个别转CHI基因烟草植株达到免疫能力如图4所示，转基因植株在受青枯菌诱导的情况下，对青枯菌有较强的免疫能力，能起到抑制青枯菌的能力，同时证实了CHI基因能对细菌性病害有一定的抑制能力，证实了CHI基因并非只对真菌性病害抑制作用。

<110> 福建农林大学

<120>根特异启动子与抗病基因CHI培育抗青枯病烟草的方法

<160> 3

<210> 1

<211> 969

<212> DNA

<213> 烟草（Nicotiana tabacum）

<220>

<223> CHI基因

<400> 1

atgaggcttt gtaaattcac agctctctct tctctactat tttctctcct actgctttct 60

gcctcggcag aacaatgtgg ttcccaggcc ggaggtgcgc gttgtctctc gggtctctgc 120

tgcagcaaat ttggttggtg tggtaacacc aatgactact gtggccctgg caattgccag 180

agccagtgcc ctggtggtcc cacacctaca ccccccaccc cacccggtgg tggggacctc 240

ggcagtatca tctcaagttc catgtttgat cagatgctta agcatcgcaa cgataatgca 300

tgccaaggaa agggattcta cagttacaat gcctttatca atgctgctcg gtcttttcct 360

ggctttggta ccagtggcga taccactgcc cgtaaaagag aaatcgcggc tttctttgct 420

caaacctccc atgaaactac tggaggatgg gcaacagcac cagatggtcc atatgcatgg 480

ggttattgct ggcttagaga acaaggtaac cccggcgact actgtacccc aagtggtcag 540

tggccttgtg ctcctggtcg aaaatatttc ggacgaggcc ccatccaaat ttcacacaac 600

tataactacg ggccttgtgg aagagccata ggagtggacc tgctaaacaa tcctgattta 660

gtggccacag atccagtcat ctcatttaag tcagctctct ggttctggat gactactcaa 720

tcaccaaaac cttcttgcca cgatgtcatc atcggaagat ggcagccatc agctggtgat 780

cgcgcagcca atcgcctccc tggatttggc gtcatcacaa acatcatcaa tggtggcttg 840

gaatgtggtc gtggcactga ctcaagggtc caggatcgca ttgggtttta caggaggtat 900

tgcagtattc ttggagttag tcctggtgac aatctggatt gcggcaacca gaggtctttg 960

gaaattgac 969

<210> 2

<211> 322

<212> PRT

<213> 烟草（Nicotiana tabacum）

<400> 2

Met Arg Leu Cys Lys Phe Thr Ala Leu Ser Ser Leu Leu Phe Ser Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ser Ala Ser Ala Glu Gln Cys Gly Ser Gln Ala Gly Gly

20 25 30

Ala Arg Cys Leu Ser Gly Leu Cys Cys Ser Lys Phe Gly Trp Cys Gly

35 40 45

Asn Thr Asn Asp Tyr Cys Gly Pro Gly Asn Cys Gln Ser Gln Cys Pro

50 55 60

Gly Gly Pro Thr Pro Thr Pro Pro Thr Pro Pro Gly Gly Gly Asp Leu

65 70 75 80

Gly Ser Ile Ile Ser Ser Ser Met Phe Asp Gln Met Leu Lys His Arg

85 90 95

Asn Asp Asn Ala Cys Gln Gly Lys Gly Phe Tyr Ser Tyr Asn Ala Phe

100 105 110

Ile Asn Ala Ala Arg Ser Phe Pro Gly Phe Gly Thr Ser Gly Asp Thr

115 120 125

Thr Ala Arg Lys Arg Glu Ile Ala Ala Phe Phe Ala Gln Thr Ser His

130 135 140

Glu Thr Thr Gly Gly Trp Ala Thr Ala Pro Asp Gly Pro Tyr Ala Trp

145 150 155 160

Gly Tyr Cys Trp Leu Arg Glu Gln Gly Asn Pro Gly Asp Tyr Cys Thr

165 170 175

Pro Ser Gly Gln Trp Pro Cys Ala Pro Gly Arg Lys Tyr Phe Gly Arg

180 185 190

Gly Pro Ile Gln Ile Ser His Asn Tyr Asn Tyr Gly Pro Cys Gly Arg

195 200 205

Ala Ile Gly Val Asp Leu Leu Asn Asn Pro Asp Leu Val Ala Thr Asp

210 215 220

Pro Val Ile Ser Phe Lys Ser Ala Leu Trp Phe Trp Met Thr Thr Gln

225 230 235 240

Ser Pro Lys Pro Ser Cys His Asp Val Ile Ile Gly Arg Trp Gln Pro

245 250 255

Ser Ala Gly Asp Arg Ala Ala Asn Arg Leu Pro Gly Phe Gly Val Ile

260 265 270

Thr Asn Ile Ile Asn Gly Gly Leu Glu Cys Gly Arg Gly Thr Asp Ser

275 280 285

Arg Val Gln Asp Arg Ile Gly Phe Tyr Arg Arg Tyr Cys Ser Ile Leu

290 295 300

Gly Val Ser Pro Gly Asp Asn Leu Asp Cys Gly Asn Gln Arg Ser Leu

305 310 315 320

Glu Ile

<210> 3

<211> 956

<212> DNA

<213> 烟草（Nicotiana tabacum）

<220>

<223> 根特异启动子

<400> 3

tcttttgctg tcgagatttg gtcgacggcc cgggctgcaa ttccagtata atataccggt 60

ccagcataaa atactgtcca atctccagta tattgtactg aaactttccg cgtgttggag 120

ttccagcata atatgctgga agttcttacg catgtgcacc gatctccagt atattatgtt 180

ggaactttcc gtgttgcagc aaaatagtgg ctatttttca atgacttcgc aaacgctgac 240

tatttttgat aaatccgaaa actgattagc ccgtgctatt tttaagaaac aaaagtgaat 300

taaattggaa ttataggtgc tggcccaatg gtctaagctc tccccacacc cgcttgctgc 360

atttttagag tgatatcaaa cacaaatcgt aagatgagga tatgttttgc ctttgggtat 420

cctatgtcag gactcaggac caacaccaat aatttatttc tccgtacgac caagataaat 480

ataaataatt ttaaggagga aagcacgccg gacacctctc aatatgcgaa cctattgttt 540

tttggtccgt tctaaaaaga ataattcctt tttaaatttg ataacaattt aacttcaact 600

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gacttgttta ggaccacaaa ttccaaaagt gtttatttta ttttttctta aactccgtgc 720

acagtcaaac atgttcacat aaattgaaac cggagggatt actacttatt aggaatatta 780

aaaaaaataa aaaaaataca gagagatggc acgagaaaaa aactgcatgt aatttcactg 840

atttatcatg agatgataag atgataaggg tcatttcaaa ctctatataa aggaccaaaa 900

aacacatcaa agttacgtac caaaaaaaaa tagagtaaca taaacatatc aacaac 956

Claims

1.一种利用烟草根特异启动子携带抗病基因CHI培育抗青枯病烟草新品系的方法，其特征在于：包括烟草根特异启动子的克隆，抗病基因CHI的克隆，抗烟草青枯病表达载体的构建，培育抗青枯病转基因烟草，以及接种转基因烟草青枯菌进行材料的筛选鉴定；

所述CHI基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列；所述CHI核苷酸序列对应的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的利用烟草根特异启动子携带抗病基因CHI培育抗青枯病烟草新品系的方法，其特征在于：所述根特异启动子为烟草根特异启动子NtR12，所述启动子如SEQ ID No.3所示的碱基序列。

3.根据权利要求1所述的利用烟草根特异启动子携带抗病基因CHI培育抗青枯病烟草新品系的方法，其特征在于：利用农杆菌介导法获得抗青枯病转基因烟草。