CN101857883A - 一种龙脑的生物合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种龙脑的生物合成方法。该生物合成方法是从自然界中筛选分离获得可进行龙脑合成的微生物菌种，经发酵后收集细胞，以其为生物催化剂在有机溶剂-缓冲盐体系中进行龙脑酯的水解反应，经分离精制后可得到正龙脑含量75％以上的龙脑产品，与天然龙脑组成接近，是一种制备龙脑的新方法。
Description
技术领域
本发明属于生物化工领域，涉及一种龙脑的生物合成方法。
背景技术
龙脑(Borneol)又名冰片，化学名1，7，7-三甲基双环[2，2，1]庚-2-醇。羟基处于不同的空间位置会形成相应的立体异构体，内向构型(Endo-configuration)为正龙脑，外向构型(Exo-configuration)为异龙脑。在香料和化妆品工业上，正龙脑的香味优于异龙脑；在医药方面，二者均具有抗菌、止痛、抗生育等功能，但是异龙脑副作用大。
根据制备方法的不同，龙脑可分为天然龙脑和合成龙脑，两种产品均为正龙脑和异龙脑的混合物。天然龙脑是龙脑香科植物龙脑香树脂的加工品或树干及树枝经水蒸馏升华、冷却后所得的结晶，正龙脑含量可达到75％以上。由于天然植物资源稀缺，且龙脑含量偏低(百分之几左右)，因此天然龙脑生产成本高，不能满足市场需求。目前市售龙脑多为化学法合成而得。与天然龙脑相比，合成龙脑中异龙脑含量高出10％，即正龙脑含量仅为65％。这造成两种龙脑商品价格相差较大，高纯度的天然龙脑售价每吨近80万元，医药级合成龙脑仅6万元；Sigma商品目录中显示当龙脑中正龙脑含量增加至85％，100g售价为39美元。
文献报道的化学合成龙脑有无水草酸酯化-皂化二步法、氯乙酸法合成龙脑、苯氧乙酸酯化-水解法、α-蒎烯直接水合法等。以松节油为原料的无水草酸酯化-皂化二步法是目前国内外沿用的合成龙脑的主要方法。α-蒎烯与无水草酸在硼酐及醋酐的催化下进行酯化反应生成草酸龙脑酯，加苛性钠液皂化合成游离龙脑。此法反应剧烈放热，操作极为不便，生产安全性差，产品质量差，龙脑产品中异龙脑含量常高达30-40％。氯乙酸法是将传统的酯化剂更换为氯乙酸，但反应时间长，原料循环周期过长。苯氧乙酸酯化-水解法利用α-蒎烯与苯氧乙酸反应生成苯氧乙酸龙脑酯，然后水解生成龙脑。此法转化率低，工业应用难度大。α-蒎烯直接水合法是将酯化和皂化两步反应合二为一，即利用蒎烯在催化剂的作用下直接进行水合反应，可大大简化生产工艺，但是催化剂制备技术还需完善，工业应用有待继续研究。
近年来人们开始利用微生物或酶进行天然产物的生物催化合成或修饰。由于生物催化反应过程简单、条件温和、操作方便，副反应和副产物少、能得到单一立体构型的化合物而成为关注。通过生物法制备龙脑的报道不多：一些科技人员在研究生物转化蒎烯时，发现有龙脑生成；印度学者报道了一株能转化蒎烯生成龙脑和羧酸的绿脓杆菌；日本学者也发现某种绿脓杆菌能够利用α-松油醇转化为龙脑。但这些研究中所得到的转化液龙脑浓度很低，没有什么实际应用价值，因此这些年来进行工业化研究一直是个空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够克服现有技术缺陷的龙脑的生物合成方法，其产物的性状达到甚至优于天然龙脑。
本发明是这样实现的：
本发明所述的龙脑的生物合成方法，包括生物催化剂制备、酶促水解反应、生物催化剂分离、龙脑产品分离，其工艺过程如下：将菌株在发酵培养基中进行发酵，然后离心发酵液收集细胞作为生物催化剂；将制备好的生物催化剂加入到含乙酸龙脑酯的有机溶剂-缓冲盐混合液或缓冲盐溶液中，进行酶促水解反应；酶促水解反应结束后，用过滤的方法将生物催化剂分离出来重复使用；分离生物催化剂后，采用常规的分离方法将龙脑产品从反应液中与未反应的乙酸龙脑酯分离，得到龙脑产品。
以上所述的龙脑的生物合成方法，其生物催化剂制备所用的菌种为特氏克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)。该菌种可以从微生物中心购买，或者自己分离培养得到。
以上所述的龙脑的生物合成方法，其生物催化剂制备所用的发酵培养基主要成分包括玉米粉、蛋白胨、淀粉、蔗糖、葡萄糖、废糖蜜、马铃薯汁、牛肉膏、KH2PO4、MgSO4、NaCl、(NH4)2SO4中的一种或者多种的混合物，用量分别为：淀粉、玉米粉或蛋白胨5～20g/L，蔗糖、葡萄糖、废糖蜜或马铃薯汁5～20g/L，牛肉膏1.0～5.0g/L，KH2PO4 0.5～1.5g/L，MgSO40.05～0.5g/L，NaCl 0.2～2.0g/L，(NH4)2SO4 0.5～5.0g/L；生物催化剂制备的发酵条件为：25～50℃，pH5.5～9.0，转速100～400rpm，培养时间1～3天。
以上所述的龙脑的生物合成方法，其乙酸龙脑酯酶促水解反应中有机溶剂的体积含量为0～20％。
以上所述的龙脑的生物合成方法，其乙酸龙脑酯酶促水解反应中有机溶剂的体积含量为0～10％。
以上所述的龙脑的生物合成方法，其酶促水解反应中的有机溶剂选自石油醚、乙醇、乙酸乙酯或正己烷中的一种。
以上所述的龙脑的生物合成方法，其酶促水解反应在摇床中进行，摇床转速为50～300rpm，乙酸龙脑酯加入量为0.01～0.5M，反应的温度为20～35℃，时间为2～7天。
以上所述的龙脑的生物合成方法，其特征在于：酶促水解反应所用的缓冲盐可以是磷酸盐缓冲液或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
以上所述的龙脑的生物合成方法，其特征在于：酶促水解反应所用的缓冲盐pH为6.0～8.5
以上所述的龙脑的生物合成方法，其分离生物催化剂是用过滤的方法。
以上所述的龙脑的生物合成方法，其龙脑产品分离选用的分离方法包括：萃取、蒸馏、重结晶、干燥或其他常规分离方法。
本发明的优点：
1.本发明与现有技术相比，将碱催化的皂化反应改用生物催化剂来进行反应，提高乙酸龙脑酯水解的选择性。
2.本发明以可催化龙脑酯水解的微生物细胞为催化剂，获得正龙脑含量达75％以上的龙脑产品，同时反应副产物少。
具体实施方式
实施例1
用10g/L的蛋白胨，10g/L的葡萄糖，1.0g/L的牛肉膏，1.0g/L的KH2PO4，0.1g/L的MgSO4，1.0g/L的NaCl和0.5g/L的(NH4)2SO4配制成pH5.5的培养基40mL，放入250mL三角瓶中，然后接入斜面保藏的特氏克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)菌株，在30℃，150rpm的摇床中培养36h，再将培养好的菌液于4℃、4500rpm下离心10min收集菌体细胞，并用pH5.5的磷酸盐缓冲液洗涤菌体2次，冰箱保藏待用。
在250mL锥形瓶中依次加入20mL、pH6.5的磷酸缓冲盐、1ml乙醇(即体积含量为4％)、前述的菌体细胞和333μL的乙酸龙脑酯(85mM)，然后置于22℃，60rpm摇床中反应2d。反应结束后，先将生物催化剂过滤分离后重复使用，再分别用10mL石油醚萃取三次，合并萃取液，GC检测龙脑浓度。GC分析条件为：FID检测器，检测器温度：290℃；HP-1玻璃毛细管柱(30m×0.53mm×0.88mm)，柱温80℃；汽化室温度280℃，采用程序升温；分流比30∶1，进样量0.2μL；以萘为内标物。测定得到转化率66.3％，正龙脑含量为79.1％。
实施例2
用10g/L的蛋白胨，20g/L的废糖蜜，5.0g/L的牛肉膏，1.0g/L的KH2PO4，0.5g/L的MgSO4，0.5g/L的NaCl和1.0g/L的(NH4)2SO4配制成pH7.0的培养基100mL，置入1000mL三角瓶中，接入特氏克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)菌种后在40℃，250rpm的摇床中培养40h，再将培养好的菌液于4℃、4500rpm下离心10min收集菌体细胞，并用pH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤菌体2次，冰箱保藏待用。
在500mL锥形瓶中依次加入50mL、pH7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、5mL石油醚(即体积含量为10％)、前述的菌体细胞和1.5mL龙脑酯(150mM)，然后置于28℃，150rpm摇床中反应4d。反应结束后，先将生物催化剂过滤分离后重复使用，再用蒸馏的方法将龙脑产品分离出来，经测定，得到龙脑固体190mg，正龙脑含量78.3％。
实施例3
用15g/L的玉米粉，15g/L的葡萄糖，5.0g/L的牛肉膏，0.8g/L的KH2PO4，0.2g/L的MgSO4，1.5g/L的NaCl和1.0g/L的(NH4)2SO4配制成pH8.5的培养基100mL，接入特氏克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)菌种后在45℃，350rpm的摇床中培养70h，再将培养好的菌液于4℃、4500rpm下离心10min收集菌体细胞，并用pH8.5的磷酸盐缓冲液洗涤菌体2次，冰箱保藏待用。
在500mL锥形瓶中依次加入45mL、pH7.5的磷酸缓冲盐、5mL乙酸乙酯(即体积含量为10％)、培养好的菌体细胞和1.5mL龙脑酯(150mM)，然后置于35℃，300rpm摇床中反应6d。反应结束后，先将生物催化剂过滤分离后重复使用，再用重结晶的方法将龙脑产品分离出来，经测定，得到龙脑固体150mg，正龙脑含量79.5％。
实施例4
用10g/L的蛋白胨，20g/L的马铃薯汁，2.0g/L的牛肉膏，0.5g/L的KH2PO4，0.2g/L的MgSO4，0.5g/L的NaCl和0.5g/L的(NH4)2SO4配制成pH7.5的培养基40mL，然后挑取斜面保藏的特氏克雷伯氏菌(Klebsiellaplanticola)菌株接种，在25℃，200rpm的摇床中培养50h，再将培养好的菌液于4℃、4500rpm下离心10min收集菌体细胞，并用pH6.5的磷酸盐缓冲液洗涤菌体2次，冰箱保藏待用。
在500mL三角瓶中依次加入40mL、pH 6.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、10mL正己烷(折合体积含量为20％)、培养好的菌体细胞和2mL龙脑酯(200mM)，然后置于30℃，120rpm摇床中反应5d。反应结束后，先将生物催化剂过滤分离后重复使用，再用干燥的方法将龙脑产品分离出来，经测定，得到龙脑固体181mg，正龙脑含量77.3％。
实施例5
发酵用培养基组成为：15g/L玉米粉，15g/L废糖蜜，4.0g/L牛肉膏，0.7g/LKH2PO4，0.2g/L MgSO4，1.0g/L NaCl和2.0g/L(NH4)2SO4，pH8.0。配制200mL培养基置于2500mL三角瓶中，接入特氏克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)，在25℃，200rpm的摇床中培养50h，再将培养好的菌液于4℃、4500rpm下离心10min收集菌体细胞，并用pH6.5的磷酸盐缓冲液洗涤菌体2次，冰箱保藏待用。
在500mL锥形瓶中依次加入50mL、pH 7.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、培养好的菌体细胞和5mL龙脑酯(500mM)，然后置于30℃，120rpm摇床中反应4d。反应结束后，先将生物催化剂过滤分离后重复使用，再用干燥的方法将龙脑产品分离出来，经测定，得到龙脑固体2.5g，正龙脑含量77.3％。
实施例6(对比实验)
称取3.92g乙酸龙脑酯置于三口烧瓶中、加入10mL 45％氢氧化钾溶液，搅拌，加热至124～128℃，反应9h，停止反应，冷却，过滤并用热水洗涤多次至滤液成中性，产物于真空干燥箱中干燥，得到白色龙脑固体。取少量该固体用乙醇溶解后进行GC检测，得到龙脑2.76g，正龙脑含量65％。
由此可见，采用此化学法水解得到的产品正龙脑含量比生物法低15％左右。
Claims (10)
1.一种龙脑的生物合成方法，其特征在于：包括生物催化剂制备、酶促水解反应、生物催化剂分离、龙脑产品分离，工艺过程如下：将菌株在发酵培养基中进行发酵，然后离心发酵液收集细胞作为生物催化剂；将制备好的生物催化剂加入到含乙酸龙脑酯的有机溶剂-缓冲盐混合体系或缓冲盐溶液中，进行酶促水解反应；酶促水解反应结束后先将生物催化剂分离；分离生物催化剂后，采用常规的分离方法将龙脑产品从反应液中与未反应的乙酸龙脑酯分离，得到龙脑产品。
2.根据权利要求1所述的龙脑的生物合成方法，其特征在于：生物催化剂制备所用的菌种为特氏克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)。
3.根据权利要求1所述的龙脑的生物合成方法，其特征在于：生物催化剂制备所用的发酵培养基主要成分包括玉米粉、蛋白胨、淀粉、蔗糖、葡萄糖、废糖蜜、马铃薯汁、牛肉膏、KH2PO4、MgSO4、NaCl、(NH4)2SO4中的一种或者多种的混合物，用量分别为：玉米粉或蛋白胨5～20g/L，淀粉、蔗糖、葡萄糖、废糖蜜或马铃薯汁5～20g/L，牛肉膏1.0～5.0g/L，KH2PO4 0.5～1.5g/L，MgSO4 0.05～0.5g/L，NaCl 0.2～2.0g/L，(NH4)2SO4 0.5～5.0g/L；生物催化剂制备的发酵条件为：25～-50℃，pH5.5～9.0，转速100～400rpm，培养时间1～3天。
4.根据权利要求1所述的龙脑的生物合成方法，其特征在于：乙酸龙脑酯酶促水解反应中有机溶剂的体积含量为0～20％。
5.根据权利要求4所述的龙脑的生物合成方法，其特征在于：乙酸龙脑酯酶促水解反应中有机溶剂的体积含量为0～10％。
6.根据权利要求1所述的龙脑的生物合成方法，其特征在于：酶促水解反应中所用的有机溶剂选自石油醚、乙醇、乙酸乙酯或正己烷中的一种。
7.根据权利要求1所述的龙脑的生物合成方法，其特征在于：酶促水解反应在摇床中进行，摇床转速为50～300rpm，乙酸龙脑酯加入量为0.01～0.5M，反应的温度为20～35℃，时间为2～7天。
8.根据权利要求1～7所述的龙脑的生物合成方法，其特征在于：酶促水解反应所用的缓冲盐为磷酸盐缓冲液或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH为6.0～8.0。
9.根据权利要求1项所述的龙脑的生物合成方法，其特征在于：分离生物催化剂是用过滤的方法。
10.根据权利要求1所述的龙脑的生物合成方法，其特征在于：龙脑产品分离选用的分离方法包括：萃取、蒸馏、重结晶、干燥或其他常规分离方法。
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