CN101851624B - 胰高血糖素受体基因的rna干扰序列 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因技术领域的胰高血糖素受体基因的RNA干扰序列，第一种RNA干扰序列为双链RNA分子，该RNA分子的正义链具有SEQ ID NO：1所示的序列，反义链具有SEQ ID NO：2所示的序列；第二种RNA干扰序列为双链RNA分子，该RNA分子的正义链具有SEQ ID NO：3所示的序列，反义链具有SEQ ID NO：4所示的序列；第三种RNA干扰序列为双链RNA分子，该RNA分子的正义链具有SEQ ID NO：5所示的序列，反义链具有SEQ ID NO：6所示的序列。本发明的干扰RNA序列较为有效的降低糖尿病模型小鼠的血糖浓度，提高小鼠利用葡萄糖的能力。

Description

胰高血糖素受体基因的RNA干扰序列

本发明专利申请为中国发明专利申请号200910053750.4，申请日2009年6月25日，申请人“上海交通大学”，发明名称“胰高血糖素受体基因的RNA干扰序列”的分案申请

技术领域

本发明涉及的是一种基因技术领域的RNA干扰序列，具体涉及一种胰高血糖素受体(GCGR)基因的RNA干扰序列。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞内存在与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默。RNA干扰作用是通过一类较稳定的中间介质实现的。对植物的研究证明，双链RNA复合体先降解成为35nt左右的小RNA分子，然后他们通过序列互补与mRNA结合，从而导致mRNA降解。对果蝇的研究证明，长度为21～23nt的小RNA分子是引起RNA干扰现象的直接原因，这种小RNA分子被称之为小干扰RNA(smallinterfering RNA，siRNA)。小干扰RNA被认为是一种快捷、高效的调控体内基因表达的方法，因而在基因治疗方面具有极大的应用前景。

临床研究认为，对于胰岛素抵抗为主，或胰岛素分泌不足为主伴所致的II型糖尿病病症，可以通过调节胰高血糖素的作用来达到稳定患者体内血糖水平的目的。一方面，胰高血糖素具有强烈的促进糖异生和糖原分解的作用，因此可以通过抑制胰高血糖素的升高血糖作用来缓解症状；另一方面，对胰高血糖素激素的调节将会间接的影响到胰岛素分泌情况，达到缓解症状的目的。胰高血糖素受体分子GCGR是具有七次穿细胞膜结构的G蛋白偶联受体家族，主要分布于肝脏，肾脏，胰腺等器官。其中，肝脏器官分布的胰高血糖素受体与胰高血糖素之间的互相作用对于血糖调节具有重要的意义。R.W.Gelling等发现GCGR的基因敲除小鼠模型中血糖浓度明显降低，并且小鼠的糖耐量得到了很好的提高。近年来小分子药物胰高血糖素受体(GCGR)拮抗剂被报道在糖尿病小鼠模型中等也有很好的降糖稳定作用。而且GCGR的反义抑制核苷酸也被证实能够有效的改善糖尿病小鼠模型中的高血糖。这些研究揭示了肝脏GCGR基因是一个主要的糖尿病治疗药物靶点，抑制肝脏GCGR受体的作用可以缓解血糖升高的症状，治疗糖尿病。

经对现有技术的文献检索发现，尚无胰高血糖素受体基因的RNA干扰序列的有关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种胰高血糖素受体基因的RNA干扰序列。本发明的RNA干扰序列可有效的降低糖尿病模型小鼠的血糖浓度。

本发明是通过以下的技术方案实现的：

本发明涉及的第一种胰高血糖素受体基因的RNA干扰序列，该序列为双链RNA分子，该RNA分子的正义链具有SEQ ID NO：1所示的序列，反义链具有SEQ ID NO：2所示的序列。

本发明涉及的第二种胰高血糖素受体基因的RNA干扰序列，该序列为双链RNA分子，该RNA分子的正义链具有SEQ ID NO：3所示的序列，反义链具有SEQ ID NO：4所示的序列。

本发明涉及的第三种胰高血糖素受体基因的RNA干扰序列，该序列为双链RNA分子，该RNA分子的正义链具有SEQ ID NO：5所示的序列，反义链具有SEQ ID NO：6所示的序列。

本发明具有如下的有益效果：本发明的干扰RNA序列较为有效的降低糖尿病模型小鼠的血糖浓度，通过对血糖-浓度曲线下面积AUC的分析，给药后的模型小鼠在葡萄糖利用能力方面得到了较大的提高。

附图说明

图1为给药后糖尿病小鼠模型糖耐量测试血糖浓度-时间曲线示意图；

图2为不同siRNA组给药后糖尿病小鼠模型血糖含量变化示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

试剂：四氧嘧啶Alloxan monohydrate(HPLC纯试剂，购自美国sigma公司，产品编号A7413)；

葡萄糖测定试剂盒——葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法(购自上海荣盛生物技术有限公司，产品编号361510，批号20030101)；

实验动物：健康雄性♂六周龄昆明鼠，由上海斯莱克试验动物责任有限公司提供(许可证号SCXK(沪)-2007-0005)，通过20℃明暗交替环境中适应性预培养一周后进行实验。

实验过程包括如下步骤：

步骤一，siRNA设计合成

设计小鼠胰高血糖素受体(GCGR)的siRNA，根据GCGR的refseq序列NM_008101，使用美国麻省Whitehead生物医学研究所的siRNA设计软件，设计格式为AA19NTT的siRNA，挑选三条结果如下：

GCGR

siRNA_1靶序列AAAGCTCTTCAGGAGGAAAGGTT(1451-1473)，

正义链5’-AGCUCUUCAGGAGGAAAGGUU

反义链3’-UUUCGAGAAGUCCUCCUUUCC；

siRNA_2靶序列AAAGTGCAGCACCGCCTAGTGTT(455-477)，

正义链5’-AGUGCAGCACCGCCUAGUGUU，

反义链3’-UUUCACGUCGUGGCGGAUCAC；

siRNA_3靶序列AACTACATCCATGGGAACCTGTT(707-729)，

正义链5’-CUACAUCCAUGGGAACCUGUU

反义链3’-UUGAUGUAGGUACCCUUGGAC。

对照组非靶向性siRNA

正义链5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，

反义链3’-TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA。

siRNA的合成由上海吉玛制药技术有限公司完成。

步骤二，糖尿病小鼠模型的建立以及模型稳定性测试

昆明鼠20只，适应饲养环境一周并测正常小鼠空腹4h后的体重以及血糖值；小鼠禁食不禁水12h后，配制新鲜的四氧嘧啶诱导剂溶液，给药方式为一次性小鼠腹腔注射(ip)，剂量为200mg·Kg-1小鼠体重。注射完毕后为小鼠补充饮水以及食物，并且更换垫料。注射诱导剂72h后，测量空腹4h以后的小鼠体重以及血糖，检测建模成功率并且进行分组。建模后16天内，检测小鼠体重情况以了解模型健康状态。

步骤三，血糖检测标准方法建立

小鼠禁食不禁水空腹4h以后，尽量保持小鼠情绪平静，迅速用毛细玻璃管于小鼠眼底取血100ul左右(3到4滴血)，置于0.5ml离心管中。血液样本于4℃冰箱中冷藏放置至离心管底部出现血液凝结后，立即于4℃离心(3000rpm，5min)取上层血清作葡萄糖含量检测。

将葡萄糖检测试剂盒(上海荣盛生物技术有限公司，货号361510)中R1与R2等比例混合作为葡萄糖测试液。取测试样本4ul加入1ml的测试液中，充分混匀，置于37℃水浴15min，使之显色。在紫外波长505nm处，以空白测试液加蒸馏水调零，读取样本管的吸光度值A。同时，制备5～30mmol·L^-1梯度浓度的葡萄糖标准液，制作标准曲线从而读取样本的葡萄糖浓度，标准曲线R²＞0.99。

步骤四，小鼠模型siRNA体内系统给药

将成模的小鼠根据血糖检测情况进行分为4组，分别为siRNA_1，siRNA_2，siRNA_3组和对照组，给药方式采用尾静脉高压快速推注法。将合成siRNA溶于DEPC处理过的PBS中，按照0.1nmol/g老鼠体重进行给药：每只小鼠模型快速推注的溶液体积为小鼠体重的8％，约为3ml左右的PBS-siRNA溶液。给药完毕后密切观察小鼠，及时补充饮水和饲料。

步骤五，糖耐量试验

糖耐量试验：在给药后第2d，禁食4h取血(为零时)，然后腹腔注射葡萄糖(2g/kg)，测定给糖后0.5，1，1.5，2小时的血糖值以及计算血糖曲线下面积。

步骤六，小鼠模型血糖变化曲线

分别于给药后第1d，2d，4d，8d按照步骤三中的血糖检测标准方法测量4组中各个小鼠血糖值。得到给药后8天内的小鼠模型血糖-时间曲线。

试验结果以及分析

(1)糖尿病小鼠模型的建立

20只小鼠诱导前血糖均值7.1±3.0mmol·L^-1,诱导后死亡两只，血糖大于15mmol·L^-1小鼠为12只(血糖均值34.6±3.9mmol·L^-1)；诱导建模成功率为60％。

(2)siRNA给药后糖耐量测试

如附图1所示计算得出四个组别(1)siRNA-1，(2)siRNA-2，(3)siRNA-3，(4)非靶向性对照siRNA血糖-时间曲线下面积(AUC)分别为：964.5；3216.1；2606.9以及4173.9min·mmol·L^-1；AUC反映了动物对葡萄糖的利用程度，AUC的面积越小，证明其越能有效地利用葡萄糖，其中(1)，(2)，(3)组的AUC面积分别为对照(4)组的23.11％，77.1％和62.5％。

(3)siRNA给药后血糖-时间变化曲线

如附图2所示给药后8天模型小鼠血糖-时间曲线：12只诱导成功糖尿病小鼠模型分为4组：

①siRNA-1片段组，给药前血糖38.4±3.3mmol·L^-1，给药后第一天血糖5.4±1.5mmol·L^-1，相比于给药前降低了86.0％；此后的几天内血糖含量有所回升，但第8天血糖含量依然低于给药前血糖，为11.7±3.5mmol·L^-1，相比于给药前降低了69.4％；

②siRNA-2片段组，给药前血糖29.2±4.6mmol·L^-1，给药后第一天血糖17.1±1.4mmol·L^-1，血糖相比于给药前降低了41.4％，此后的几天血糖回升；

③siRNA-3片段组，给药前血糖34.8±3.8mmol·L^-1，给药后第一天血糖27.1±7.8mmol·L^-1，血糖相比于给药前降低了22.2％；此后的几天血糖回升；

④非靶向性siRNA序列对照组，给药前血糖36.1±2.1mmol·L^-1，给药后第一天血糖37.8±4.2mmol·L^-1，血糖相比于给药前升高了4.7％；此后的几天血糖逐渐升高，第8天时模型血糖相比于给药前升高了32％。

<110>上海交通大学

<120>胰高血糖素受体基因的RNA干扰序列

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

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<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>1

agcucuucag gaggaaaggu u    21

<210>2

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<212>RNA

<213>人工序列

<400>2

ccuuuccucc ugaagagcuu u    21

<210>3

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<212>RNA

<213>人工序列

<400>3

agugcagcac cgccuagugu u    21

<210>4

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

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cacuaggcgg ugcugcacuu u    21

<210>5

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<212>RNA

<213>人工序列

<400>5

cuacauccau gggaaccugu u    21

<210>6

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<400>6

cagguuccca uggauguag uu    21

Claims (1)

1.一种胰高血糖素受体基因的RNA干扰序列，其特征在于，该序列为双链RNA分子，该RNA分子的正义链如SEQ ID NO：5所示，反义链如SEQ ID NO：6所示。

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