CN101848723B - 细菌素诱导者肽 - Google Patents

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Abstract

由产细菌素细菌产生的新型的肽在体外刺激细菌素的产生。为了实现细菌肽产生的增加，在新的诱导者细菌和具有VKGLT的羧基端序列的肽的存在下培养所述生产者细菌。

Description

细菌素诱导者肽
发明背景
本发明涉及在诱导者细菌存在下刺激由生产者细菌产生细菌素的新型的肽以及使用所述肽用于细菌素产生的方法。 
发明背景
正常的肠道细菌对于任何宿主动物的健康都是重要的。宿主通过由天然细菌生物相介导的消化代谢过程而受益。从肠道细菌来看，竞争和随之发生的进化提供营养素和生存空间并增加繁殖潜能，使得某些菌株和菌种获得生存优势。在细菌进化期间，细菌素的产生已经发生。在给定的竞争利基(competitive niche)中，细菌素对于其他生物体是拮抗的并因此提供生态优势。这些生物素一般是低分子量的多肽，并被基于分子量的差异分类(Klaenhammer，FEMS Microbiol.Rev.，1993年12-39-85卷)。这些化合物可以容易地被宿主蛋白酶消化成其组成氨基酸。细菌素可能代表得自竞争性排斥的益处中的重要部分(Nurmi和Rantala，Nature(自然)，伦敦，1973年，第241卷，210-211)。 
Nurmi和Rantala(1973，同上)最早描述了通过使用得自健康的成年禽粪便的未确定的细菌菌群控制沙门氏菌在新孵化的雏鸡中的定殖中的竞争性排斥的优点。该途径对于目前涉及合成抗生素的耕作方法而言是有吸引力的备选方案。得自粘膜的竞争性排斥菌群被描述为得自健康的成年母鸡的肠粘膜内膜刮屑的厌氧培养物(Stern等，美国专利5,451,400，公布于1995年9月)。此未确定的菌群在鸡中提供良好的对于沙门氏菌的定殖防护，但是仅提供不稳定的弯曲杆菌(Campylobacter)的定殖控制(Stern，Poult.Sci，1994年，第73卷，402-407)。竞争性排斥出现在野生禽类肠道中并有助于健康的肠道生态。 
微生物产生各种显示抗菌性质的化合物。一类这样化合物，细菌素，由具有类似于离子载体抗生素的作用机制的杀菌蛋白质组成。细菌素常具有抵抗与该细菌素的生产者密切相关的菌种的活性。它们在从复杂的微生物群落(例如肠道、口腔或其他的上皮表面)分离出来的细菌菌种中的广泛存在，表明细菌素在细菌生态系统中的种群动态方面可能具有调节作用。细菌素被定义为由细菌产生的具有生物活性的蛋白部分以及杀菌作用的化合物(Tagg等，细菌学评论(Bacteriological Reviews)，1976年，第40卷，722-256)。其他的特征可以包括：(1)窄谱抑制活性，集中于密切相关的菌种；(2)与特定细胞受体附着；(3)质粒携带的细菌素产生和具有宿主细胞细菌素免疫性的遗传定子。未完全确定的拮抗物质被称为“细菌素样物质”。一些有效抵抗革兰氏阳性细菌，相反不抵抗革兰氏阴性细菌的细菌素，具有较广谱的活性。已有建议术语细菌素，当被用于描述由革兰氏阳性细菌产生的抑制剂时，应该符合(1)是一种肽，(2)具有杀菌活性(Tagg等人，同 上)的最低标准。 
为了经济上可行地在商业上利用细菌素，在产生期间将产量最优化是必要的(Chen和Hoover，食品科学和食品安全综述(Comprehensive Reviews in Food Science andFood Safety)，2003年，第2卷，82-100)。Chen和Hoover宣称发现在生长介质中，针对尼生素(nisin)生产的关键因素是维持最优化的pH以及针对每种产生细菌素的菌株或多种菌株补充具有特定的营养物的介质。 
Knutsen等人(细菌学杂志(Journal of Bacteriology)，2004年，第186卷(10)，3078-3085)公开了一种27个氨基酸的细菌素诱导肽(BIP)，其诱导肺炎链球菌(Streptococcus Pneumoniae)中细菌素的产生。Diep等人(分子生物学(Molecular Biology)2003年第47(2)卷，483-494)公开了许多革兰氏阳性细菌，所述细菌已被报道为应用所谓的基于肽信息素的信号转导途径来调节来自为数众多的乳酸菌的，称为细菌素的抗微生物肽的产生。其还公开了诱导细菌素产生的肽信息素，PInA。Van Belkum和Stiles(Nat.Prod.Rep.，2000年，第17卷，323-335)公开了一些细菌素需要调节基因的产物来产生它们。他们宣称这些基因编码一种分泌的诱导肽以及与组氨酸激酶和响应调节因子同源的蛋白质。该参考文献进一步公开了一些由诱导肽诱导的II类细菌素，而其他的例如肉食杆菌素B2(Carnobacteriocin B2)和乳杆菌素P(Sakacin P)是由诱导肽诱导或者由所合成细菌素自诱导的。 
尽管已经发现各种在细菌中诱导细菌素产生的肽，本领域中仍存在对于采用在体外增加细菌素产生的量的肽的细菌素商业化生产的需要。本发明提供与现有技术中的肽不同的肽并提供大量生产用于商业化用途的细菌素的方法。 
发明简述
因此，本发明的一个目的是提供在体外刺激细菌素产生的肽。 
本发明的又一目的是提供在体外刺激体外细菌素产生，并且具有VKGLT(SEQID NO 1)的羧基端序列的肽。 
本发明的另一目的是提供具有氨基酸序列MVTKSLVLAWVVALLACGMVKGLT(SEQ ID NO 3)的肽。 
本发明另一个目的是提供具有氨基酸序列TNVTKSWWVLAGCNQVVASNCNCGNVKGLT(SEQ ID NO 5)的肽。 
本发明再一个目的是提供具有氨基酸序列WNKYKTNWVLSVCNTGCACAAVKGLT(SEQ ID NO 7)的肽。 
本发明的另一目的是提供体外增加细菌素产生的方法，其中具有VKGLT(SEQID NO 1)的羧基端序列的肽被加至产细菌素细胞的培养物中。 
本发明又一个目的是提供用于体外增加细菌素OR-7的产生的方法，其中具有SEQ ID NO 3的肽被加至唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)PVD-32(NRRL B-30514)细胞的培养物中。 
本发明的另一目的是提供用于体外增加细菌素50-52的产生的方法，其中具有SEQ ID NO 5的肽被加至屎肠球菌(Enterococcus faecium)LWP 50-52细胞(NRRLB-30746)的培养物中。 
本发明再一个目的是提供用于体外增加细菌素760的产生的方法，其中具有SEQID NO 7的肽被加至仓鼠链球菌(Streptococcus cricetus)LWP 760细胞(NRRL B-30745)的培养物中。 
本发明的另一目的是提供通过进一步包括诱导者细胞系而增加由生产者细胞系产生细菌素的方法。 
本发明再一个目的是提供通过进一步包括诱导者细胞系卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)LWP 252(NRRL B-30884)而增加由生产者细胞系唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)PVD-32产生细菌素OR-7的方法。 
本发明再一个目的是提供通过进一步包括诱导者细胞系嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)LWP 320(NRRL B-30510)而增加经生产者细胞系屎肠球菌(Enterococcus faecium)LWP 50-52产生细菌素50-52的方法。 
本发明再一个目的是提供通过进一步包括诱导者细胞系嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)LWP 320而增加经生产者细胞系仓鼠链球菌(Streptococcuscricetus)LWP-760产生细菌素760的方法。 
本发明其他的目的和优势从下述说明中将会变得明显。 
微生物的保藏
唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，标明为NRRL B-30514(菌株PVD32)，于2001年8月3日保藏；仓鼠链球菌(Streptococcus cricetus)，标明为NRRL B-30745(菌株LWP 760)，以及屎肠球菌(Enterococcus faecium)标明为NRRL B-30746(菌株LWP-50-52)于2004年5月3日保藏；而嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)，标 明为NRRL B-30510(菌株LWP 320)于2001年8月3日保藏。卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)，标明为NRRL B-30884(菌株LWP 252)于2005年11月4日保藏。所有上述菌株已按照布达佩斯条约的规定保藏于美国农业部农业研究服务中心专利培养物保藏中心(国家农业应用研究中心(National Center for Agricultural Utilization Research)，1815N.University Street，Peoria，Illinois 61604)。 
附图简述
图1A和1B是显示SDS-PAGE(A)和等电聚焦(B)后对信号肽和细菌素OR-7直接检测的照片。凝胶用空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)覆盖以确定哪个或哪几个条带与抗微生物活性对应，并确定分子量和等电点。在图1A中第1道——2,100-12,500范围的LMW分子量标记(Amersham Pharmacia Biotech)：2,100；5,780；8,400；12,500Da。包含纯的细菌素OR-7的第2道的条带对应抗菌活性，生长抑制的区域具有约5.5kDa的质量。包含纯的来自PVD-32的信号肽的第3道的条带具有约2.5kDa的质量。在图1B中，包含纯的细菌素OR-7的第1道对应抗菌活性；生长抑制的区域具有约8.4的pI。包含纯的来自PVD-32的信号肽的第2道的条带具有约7.9的pI。第3道包含pI标准物(蛋白质测试混合物，I标记蛋白，Serva)：10.0、9.2、8.1、6.9、5.5、4.3。 
图2A和2B是显示SDS-PAGE(A)和等电聚焦(B)后对信号肽和细菌素50-52直接检测的照片。凝胶用空肠弯曲杆菌覆盖以确定哪个或哪几个条带对应抗菌活性，并确定分子量和等电点。在图1A中第1道——约2,100-12,500范围的LMW分子量标记(Amersham Pharmacia Biotech)：2,100；5,780；8,400；12,500Da。包含纯的细菌素50-52的第2道的条带对应抗菌活性，生长抑制的区域具有约3.9kDa的质量。包含纯的针对LWP-50-52的信号肽的第3道的条带具有约3.1kDa的质量。在图2B中，包含纯的细菌素50-52的第1道对应抗菌活性；生长抑制的区域具有约8.4的pI。包含纯的来自LWP-50-52的信号肽的第2道的条带具有约8.1的pI。第3道包含pI标准物(蛋白质测试混合物，I标记蛋白，Serva)：10.0、8.1、7.9、6.4、5.5、4.3、4.1以及3.8。 
图3A和3B是显示SDS-PAGE(A)和等电聚焦(B)后对信号肽和细菌素760直接检测的照片。凝胶用空肠弯曲杆菌覆盖以确定哪个或哪几个条带对应抗菌活性，并确定分子量和等电点。在图3A中，第3道显示约2,100-12,500范围的LMW分子量标记(Amersham Pharmacia Biotech)：2,100；5,780；8,400；12,500Da。包含纯的细菌素760的第1道的条带对应抗菌活性，生长抑制的区域具有约5.5kDa的质量。包含纯的来自LWP760的信号肽的第3道的条带具有约2.1kDa的质量。在图3B中，包含纯的细菌素760的第1道的条带对应抗菌活性；生长抑制的区域具有约9.5的pI。包含纯的来自LWP-760的信号肽的第2道的条带具有约8.9的pI。第3道包含pI标准物(蛋白质测试混合物，I标记蛋白，Serva)：10.0、8.1、7.9、6.4、5.5、4.3、4.1以及3.8。 
发明详述
肠感染在人中的重要性已经被日益充分地认识到，家禽污染和人感染之间的关系也有详尽记载。通过干预家禽加工厂消除这种健康危险的能力也是众所周知的。在肉仔鸡产生和加工过程中，含有病原体的粪便物转移到肉上，并继续存在于加工食品的厨房中。 
竞争性生物的代谢物可能有助于控制病原体例如空肠弯曲杆菌和沙门氏菌。唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，标明为NRRL B-30514(菌株PVD32)，仓鼠链球菌(Streptococcus cricetus)，标明为NRRL B-30745(菌株LWP 760)，以及屎肠球菌(Enterococcus faecium)，标明为NRRL B-30746(菌株LWP-50-52)产生新细菌素，所述新细菌素是2003年8月21日递交的待决美国专利申请10/644,927以及2003年5月1日递交的待决美国专利申请10/426,688的主题，所述专利均通过引用整体包括在本文中。这些菌株还产生体外刺激所述菌株产生更高量的细菌素的新肽。 
本发明提供新信号肽以及产生所述肽的菌株，新诱导者菌株、氨基酸序列以及使用所述的新肽和诱导者菌株的方法。 
唾液乳杆菌，PVD-32(NRRL B-30514)产生信号肽SEQ ID NO 3。它是一种好氧且革兰氏阳性的杆菌，并且能够在约37℃生长。所述菌株在营养琼脂或平板计数琼脂(Plate Count Agar)上生长产生不规则形状的边缘。在约37℃需氧培养约24小时后，所述的菌落是白色的且直径约3mm。 
屎肠球菌，LWP 50-52(NRRL B-30746)产生信号肽SEQ ID NO 5。它是一种兼性好氧菌和革兰氏阳性球菌，并且能够在约37℃生长。所述菌株在营养琼脂或平板计数琼脂上生长产生不规则形状的边缘。在约37℃微需氧培养约24小时后，所述的菌落是灰色的且直径约2mm。 
仓鼠链球菌，LWP-760(NRRL B-30745)产生信号肽SEQ ID NO 7。它是一种兼性好氧菌和革兰氏阳性球菌，并且能够在约37℃生长。所述菌株在营养琼脂或平板计数琼脂上生长产生规则形状的边缘。在约37℃微需氧培养约24小时后，所述的菌落是灰色的且直径约1mm。 
嗜酸乳酸杆菌，LWP 320(NRRL B-30510)，是这样的诱导者菌株，它是兼性好氧菌和革兰氏阳性球菌，并且能够在约37℃生长。所述菌株在营养琼脂或平板计数琼脂上生长产生不规则形状的边缘。在约37℃微需氧培养约24小时后，所述的菌落是白色的且直径约3mm。 
卷曲乳杆菌LWP 252(NRRL B-30884)是这样的诱导者菌株，它是好氧菌和革兰氏阳性球菌，并且能够在约37℃生长。所述菌株在营养琼脂或平板计数琼脂上生长产生规则形状的边缘。在约37℃需氧培养约24小时后，所述的菌落是灰色的且直径约1mm。 
来自产细菌素菌株的信号肽被分离并纯化。生产者细胞主要通过ABC转运系统分泌II类细菌素(Haverstein等，Mol.Microbiol.，第16卷，229-240，1995；Gajic等，J.Biol.Chem.，第36卷，34291-34298，2003)。这类细菌素中的一些的分泌是由于由位于细胞质膜上的Sec转位酶激活的信号肽发生的(Cintas等，Appl.Environ.Microbiol.，第63卷，4321-4330，1997；Doi等，J.Biosci.Bioeng.，第93卷，434-436，2002；Leer等，微生物学(Microbiology)，第141卷，1629-1635，1995；Martinez等，微生物学，第145卷，3155-3161，1999；Tomita等，J.Bacteriol.，第178卷，3585-3593，1999；Worobo等，J.Bacteriol.，第177卷，3143-3149，1995；以及Herranz等，J.Appl.Environ.Microbiol.，第71卷(4)，1959-1963，2005)。信号肽的另一功能可能与细菌现象“群体感应(quorum sensing)”有关(De Kievit等，感染与免疫(Infection and Immunity)，第68卷(9)，4839-4849，2000；Dunny等，在：微生物信号传递与通信(Microbial Signaling and Communication)中，England等编，英国剑桥大学出版社(University Press，Cambridge，United Kingdom)，117-138，1999；Dunning和Leonard，Annu.Rev.Microbiol.，第51卷，527-564，1997；以及Kleerebezem等，Mol.Microbiol.，第24卷，895-904，1997)。信号肽单独或与诱导菌株的代谢物一起激活生产者中的组氨酸蛋白，由此增加细菌素的产生。为了获得最大化的肽产生，产生信号肽的细胞，例如PVD 32，LWP 50-52以及LWP 760，在选自由苯丙氨酸、色氨酸、丙氨酸及其混合物所组成的组的氨基酸所补充的M9肉汤中培养约2-10小时。对于包括在所述组合物中的每种氨基酸，本发明优选的实施方案包括在约0.01％到约0.1％范围内的氨基酸的量。约10％的布氏肉汤介质导致产生较低浓度的信号肽。 
采用硫酸铵沉淀，随后(1)采用Superose 12的高分辨色谱的凝胶过滤；和(2)辛基-琼脂糖凝胶6B Fast Flow(快速流动)疏水作用色谱而将信号肽从培养物上清液中分离出来。 
本发明的信号肽被用于在诱导者细菌存在时体外增加由生产者细胞的细菌素产生。所述的信号肽可以在诱导者和生产者细菌的培养期间的任何时刻添加。若给予本文的发明的详细说明，本领域的普通技术人员可以容易地确定何时添加所述信号肽以获得与仅含所述的肽和生产者、或仅含生产者和诱导者细菌的培养物的细菌素产生相比高水平的细菌素产生。 
当使用信号肽和抵抗空肠弯曲杆菌(C.jejuni)和肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)的诱导者细菌菌株时产生的细菌素的拮抗活性采用斑点试验来评定。所述步骤包括取约10微升体积的各种浓度(μg/ml)的平板接种在预先接种有靶细菌细胞的血补给弯曲菌琼脂(Campylobacter Agar )或营养琼脂(MPA或后蛋白胨琼脂(Meta Peptone Agar))上的纯细菌素制备物。含空肠弯曲杆菌培养物的平板于约42℃在微需氧条件下生长。含肠炎沙门氏菌的平板于约37℃在需氧条件下生长。细菌素的活性以每1毫升制备物任意单位(AU)在其上出现可见的培养物生长抑制区域表示(Henderson等，生物化学和生物物理存档(Archives of Biochemistry and Biophysics)，第295卷，5-12，1992，通过引用并入本文)。 比活也可以以每毫克纯细菌素任意单位表示。 
本发明的信号肽包括由细菌素分泌细菌产生的任何具有VKGLT(SEQ ID NO 1)的羧基端序列的肽，当被加至包括生产者细菌或生产者细菌和诱导者细菌的培养物时，所述肽增加细菌素的产生。 
为了本发明的目的，诱导者细菌被定义为任何这样的细菌，所述细菌当与产细菌素细菌——生产者细菌一起——连同与生产者的信号肽一起培养时，将细菌素的产生增加到超过仅含所述生产者细菌和其信号肽的培养物的细菌素的产生。 
为了本发明的目的，术语“肽”意为至少两个或更多个氨基酸或氨基酸类似物的化合物。所述氨基酸或氨基酸类似物可以通过肽键相连。在另一个实施方案中，氨基酸可以通过其他键，例如酯，醚等相连。肽可以是任何结构构型，包括线性，分支，或环状构型。本文所用的术语“氨基酸”指天然或合成的氨基酸，包括D或L光学异构体，以及氨基酸类似物两者。 
本发明的肽衍生物和类似物包括但不限于包含作为一级氨基酸序列的的那些，所述肽的所述氨基酸序列的全部或部分包括改变的序列，其中，功能上等同的氨基酸残基替代所述序列中的残基导致保守氨基酸替代。 
例如，序列中的一个或更多个氨基酸残基可以由具有相似极性的另外的氨基酸替代，所述具有相似极性的另外的氨基酸起功能等同物的作用，导致沉默改变。序列中氨基酸的替代物可以选自该氨基酸所属类别的其他成员。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，和甲硫氨酸。含有芳香环结构的氨基酸是苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天门冬酰胺，和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸，赖氨酸，和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。预期这种改变不会显著影响聚丙酰胺凝胶电泳确定的分子量或等电点。非保守氨基酸替代也可以被引入以替换氨基酸，使之具有特别偏好的性质。例如，Cys可以被引入到可能的位置以与另一个Cys形成二硫桥。Pro可以因其特别平面的结构而被引入。 
本发明的肽可以被化学合成。合成肽可以用熟知的固相、液相，或肽缩合(peptidecondensation)技术，或任何其组合制备，并且可以包括天然的和/或合成的氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以是使用Merrifield的原创的固相程序的标准去保护、中和、耦联和洗涤方法(J.Am.Chem.Soc，第85卷，2149-2154，1963)的标准Boc(Nα-氨基保护的Nα-t-丁基氧羰基)氨基酸树脂，或碱敏感的Nα-氨基保护的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)氨基酸(Carpino和Han，J.Org.Chem.，第37卷，3403-3409，1972)。此外，本发明的方法可以使用本领域技术人员熟知的其他Nα-保护的基团。固相肽合成可以用本领域的普通技术(参见例如Stewart和Young，Solid Phase Synthesis(固相合成)，第二版，Pierce Chemical Company，Rockford，I11.，1984；Fields和Noble，Int.J.Pept.Protein Res.，第35卷，161-214，1990)，或用自动合成仪完成。 
下述实施例仅仅是为了进一步举例说明本发明，并非要限制由权利要求确定的本发明的范围。 
实施例1
屎肠球菌LWP50-52、仓鼠链球菌LWP-760以及唾液乳杆菌PVD-32菌株的细胞被平板接种在含有约300mL下列介质的烧瓶中：布氏肉汤，10％布氏肉汤或如下表1所示的由氨基酸补充的M9。在约37℃振荡培养约2、4、6和8小时。旋转速度约为120rpm。约-4℃下将培养液的等分试样在约6000×g离心约15分钟。通过用约40％的(NH4)2SO4 溶液在约4℃沉降蛋白大约24小时，随后通过使用Superose-12高分辨色谱凝胶过滤并选择低分子量级份而将蛋白分离。这些级份被施于辛基-琼脂糖凝胶6B Fast Flow(快速流动)疏水作用色谱柱并用约0.1M Tris缓冲液中，pH 5.1的0.4-0.9M的K2HPO梯度洗脱。结果在下面示于表1中。从表1可见，从生产者PVD 32、LWP 50-52以及LWP 760分离的肽是低分子量的并且主要在含饥饿法介质的培养物中积累(M9+指明的氨基酸)。 表1来自菌株PVD-32、LWP-50-52以及LWP-760的诱导者肽的分离和纯化
Figure S2006800519318D00081
如斑点试验所确定的，对于PVD-32的分离的信号肽具有微弱的抵抗空肠弯曲 杆菌和肠炎沙门氏菌的拮抗活性。其活性是约200AU/ml，并且如SDS-PAGE电泳所确定的，其分子量是约2.5kDa。其等电点(pI)是约7.9(图1A和1B)。 
如斑点试验所确定的，针对LWP50-52的分离的信号肽不具有抵抗空肠弯曲杆菌和肠炎沙门氏菌的拮抗活性。如由SDS-PAGE电泳所确定的，其分子量是约3.1kDa，其等电点是约8.1(图2A和2B) 
如斑点试验所确定的，针对LWP-760的分离的信号肽不具有对空肠弯曲杆菌和肠炎沙门氏菌的拮抗活性。如由SDS-PAGE电泳所确定的，其分子量是约2.1kDa，其等电点是约8.9(图3A和3B)。 
实施例2
为了确定从PVD-32细胞中分离的信号肽对细菌素OR-7产生的效力，PVD-32细胞在烧瓶中用约300ml大约10％的布氏肉汤培养。将约1ml含有大约109CFU/ml的PVD-32细胞悬浮液加至所述的肉汤，并添加大约1ml含有约109CFU/ml的LWP 252细胞悬浮液，还有约0.10mg/ml，0.01mg/ml或0.001mg/ml的PVD 32信号肽。对照样品不含所述信号肽。一些样品含不同浓度的信号肽和生产者菌株，不含诱导者菌株。两个样品含0.1mg/ml来自LWP 760的信号肽或0.1mg/ml来自LWP-50-52的信号肽之一，以及诱导者和生产者菌株两者。所述烧瓶采用大约120rpm的搅拌速度在约37℃培养大约14小时。结果总结在以下的表2中。 
在14小时结束时，来自培养物的上清液和1毫升再生琼脂糖凝胶SP FastFlow一起放入500ml(v/v 500∶1)离心烧瓶中。在搅拌下将其在室温温育大约1小时。然后用约100ml pH约6.4的0.2M TRIS-HCl缓冲液洗涤悬浮物。通过用约100ml pH约5.8的约0.2M的K2HPO4在约7,000×g离心约10分钟洗提细菌素。细菌素级份抵抗空肠弯曲杆菌和肠炎沙门氏菌的拮抗活性用上面描述的斑点试验评定。细菌素级份的纯度水平用SDS-PAGE确定。级份的等电点用等电聚焦确定。对于所有细菌素级份的蛋白质浓度用分光光度计在215nm确定。结果表示在下面的表2中。 
如表2中所见，与LWP-252(诱导者)在约0.01mg纯化的来自PVD-32的信号肽一起培养PVD-32(生产者)将细菌素OR-7的产量增加到达到1升培养液约214.5mg。添加分离自菌株LWP 50-52和LWP 760的信号肽不增加相对对照的细菌素OR-7的产量。这表明这样的事实，即信号肽对生产者是强烈特异性的。当所述信号肽、生产者和诱导者同时引入培养液时，细菌素的合成增加。 
为评定所述信号肽在按比例放大的培养下对于细菌素产生的作用，在含大约6升培养液的生物反应器中生长生产菌株和诱导菌株。培养物和所述信号肽的浓度比例是109CFU/ml的PVD-32(生产者菌株)、109CFU/ml的LWP-252(诱导者菌株)以及0.01 mg/ml的纯化的来自PVD-32的信号肽。在约8、10、12和14小时的培养后分离细菌素OR-7。见表3。纯化方案如上所述。实验重复三次。 表2从PVD-32分离的信号肽对细菌素OR-7产生的影响
  实验条件   级份  体积，  ml   蛋白质  浓度  Mg/ml   活性  AU/ml   比活性  AU/mg   mg  蛋白/  升   蛋白质  增加   vs.  对照
  10％B-B，  PVD-32  LWP-252  对照   100   0.2   409,600   2,048,000   66   1
  10％B-B，  PVD32  PVD-32信号肽-0.1mg   100   0.18   102,400   568,888   59.4   0.9
  10％B-B，  PVD-32，  PVD-32信号肽-0.01mg   100   0.2   204,800   1,024,000   66   1
  10％B-B，  PVD-32  PVD-32信号肽  -0.001mg   100   0.2   204,800   1,024,000   66   1
  10％B-B，  PVD-32，  LWP-252  PVD-32信号肽-0.1mg   100   0.22   409,600   1,861,818   72.6   1.1
  10％B-B，  PVD-32，  LWP-252  PVD-32信号肽-0.01mg   100   0.65   1,638,400   2,520,615   214.5   3.25
  10％B-B，  PVD-32，  LWP-252  PVD-32信号肽  -0.001mg   100   0.22   409,600   1,861,818   72.6   1.1
  10％B-B，  PVD-32，  LWP-252  LWP 50-52信号肽  -0.1mg   100   0.17   51,200   301,176   56.1   0.85
  10％B-B，  PVD-32，  LWP-252  LWP 760信号肽-0.1mg   100   0.19   102,400   538,947   62.7   0.95
表3：按比例放大条件下生产者菌株PVD-32和诱导者菌株LWP 50-52在PVD-32信号肽存在下的培养
  实验条件   级份  体积  ml   蛋白质  浓度  mg/ml   活性  AU/ml   比活性  AU/mg   在1升中  产生的蛋  白质的量   mg   蛋白  质量  的增  加vs.  对照
  对照   900   0.5   512,000   1,024,000   75   1
  PVD-32，  LWP 50-52，  0.2mg PVD-32信号  肽   900   1.5   3,276,800   2,184,533   225   3
对照：V-61生物反应器，10％布氏肉汤，PVD-32，LWP252，在pH 6.9，37℃，150r.p.m.下，培养14小时。 信号肽：V-61生物反应器，10％布氏肉汤，PVD-32，LWP 252，PVD-32信号肽-0.2mg在pH 6.9，37℃，150r.p.m.下，培养14小时。 在从PVD-32分离出的特定信号肽的存在下PVD-32(生产菌株)和LWP 252(诱导菌株)的共同培养物允许每升培养液约214-225毫克的细菌素OR-7的产生。 
实施例3
为了确定从LWP 50-52中分离的信号肽对细菌素50-52产生的效力，如实施例2所描述的在37℃培养LWP 50-52。将约1ml含有约109CFU/ml的LWP 50-52细胞悬浮液加至10％的布氏肉汤，将约109CFU/ml的诱导者菌株LWP-320加至所述肉汤，并且还添加约0.10mg/ml，0.01mg/ml，或0.001mg/ml的LWP 50-52信号肽。对照样品不含所述信号肽。一些样品含不同浓度的信号肽和生产者菌株，不含诱导者菌株。两个样品含0.10mg/ml来自LWP 760的信号肽或0.10mg/ml来自PVD-32的信号肽之一，以及诱导者和生产者菌株两者。所述烧瓶采用约120rpm的搅拌速度在约37℃培养约14小时。结果总结在以下的表4中。 
细菌素50-52的分离包括两步：(1)从培养液的上清液中分离细菌素，以及(2)从诱导菌株和生产菌株两者的细胞沉淀中分离细菌素。在步骤1中，收获所述培养物并通过在约10,000×g离心约15min以沉淀所述细胞来分离。上清液被施于辛基-琼脂糖凝胶4FastFlow(快速流动)柱，采用约20mM pH约7.0的K2HPO4的洗脱缓冲液以重新获得所述细菌素。来自步骤2的细胞沉淀被悬浮在pH约5.6的具有约0.7％的NaCl的磷酸盐缓冲液(洗脱缓冲液)中，并将所述的悬浮液混合并温育约20分钟。温育后，将悬浮液在约10,000×g离心约15分钟。采用含约10mM的Tris-HCl和约125mM的NaCl，pH约7.5的洗脱缓冲液，用在Superose SP Fast Flow上的离子交换色谱，从所述的上清液中分离细菌素。所述细菌素级份抵抗空肠弯曲杆菌和肠炎沙门氏菌的拮抗活性在斑点试验中评定。细菌素的纯度水平用SDS-PAGE确定。所述级份的等电点用等电聚焦确定。对于所有细菌素级份的蛋白质浓度用分光光度法在约215nm确定。 表4从LWP 50-52分离的信号肽对细菌素50-52产生的影响
  实验条件   级份  体积，  ml   蛋白质  浓度  mg/ml   活性  AU/ml   比活性  AU/mg   mg  蛋白/升   蛋白质  增加vs.  对照
  10％B-B，  LWP 50-52，  LWP-320  (对照)   100   0.25   819,200   3,276,800   82.5   1
  10％B-B，  LWP 50-52，  LWP 50-52信号  肽：0.1mg/ml   100   0.25   819,200   3,276,800   82.5   1
  10％B-B，  LWP 50-52，  LWP 50-52信号  肽：培养约2小  时后添加0.1  mg/ml   100   0.27   819,200   3,034,074   89.1   1.08
  10％B-B，  LWP 50-52，  LWP 50-52信号  肽：培养约4小  时后添加0.10  mg/ml   100   0.27   819,200   3,034,074   89.1   1.08
  10％B-B，  LWP 50-52，  LWP 50-52信号  肽：培养约6小  时后添加0.10  mg/ml   100   0.26   819,200   3,150,769   85.8   1.04
  10％B-B，  LWP 50-52，  LWP 50-52  信号肽：0.01  mg/ml   100   0.27   819,200   3,034,074   89.1   1.08
  10％B-B，  LWP 50-52，  LWP 50-52信号  肽：培养约2小  时后添加0.01  mg/ml   100   0.31   819,200   2,642,580   102.3   1.24
  10％B-B，  LWP 50-52，  LWP 50-52信号  肽：培养约4小  时后添加0.01  mg/ml   100   0.27   819,200   3,034,074   89.1   1.08
  10％B-B，  LWP 50-52，  LWP 50-52信号  肽：培养约6小  时后添加0.01  mg/ml   100   0.27   819,200   3,034,074   89.1   1.08
 
  10％B-B，  LWP 50-52，  LWP 50-52信号  肽：0.001mg/ml   100   0.25   819,200   3,276,800   82.5   1
  10％B-B，  LWP 50-52，  LWP 50-52信号  肽：培养约2小  时后添加0.001  mg/ml   100   0.25   819,200   3,276,800   82.5   1
  10％B-B，  LWP 50-52，  LWP 50-52信号  肽：培养约4小  时后添加0.001  mg/ml   100   0.25   819,200   3,276,800   82.5   1
  10％B-B，  LWP 50-52，  LWP 50-52信号  肽：培养约6小  时后添加0.001  mg/ml   100   0.25   819,200   3,276,800   82.5   1
  10％B-B，  LWP 50-52，  LWP 320信号  肽：0.1mg/ml   100   0.25   819,200   3,276,800   82.5   1
  10％B-B，  LWP 50-52，  LWP 320信号肽：  培养约2小时后  添加0.1mg/ml   100   0.25   819,200   3,276,800   82.5   1
  10％B-B，  LWP 50-52，  LWP 320信号肽：  培养约4小时后  添加0.1mg/ml   100   0.25   819,200   3,276,800   82.5   1
  10％B-B，  LWP 50-52，  LWP 320信号肽：  培养约6小时后  添加0.1mg/ml   100   0.25   819,200   3,276,800   82.5   1
  10％B-B，  LWP 50-52，  LWP 320信号  肽：0.01mg/ml   100   1.0   1,638,400   1,638,400   330.0   4
  10％B-B，  LWP 50-52，  LWP 320信号肽：  培养约2小时后  添加0.01mg/ml   100   1.07   3,726,800   3,026,429   353.1   4.28
 
  10％B-B，  LWP 50-52，  LWP 320信号肽：  培养约4小时后  添加0.01mg/ml   100   1.0   1,638,400   1,638,400   330.0   4
  10％B-B，  LWP 50-52.  LWP 320信号肽：  培养约6小时后  添加0.01mg/ml   100   1.0   1,638,400   1,638,400   330.0   4
  10％B-B，  LWP 50-52.  LWP 320信号  肽：0.001mg/ml   100   0.25   819,200   3,276,800   82.5   1
  10％B-B，  LWP 50-52.  LWP 320信号肽：  培养约2小时后  添加0.001mg/ml   100   0.25   819,200   3,276,800   82.5   1
  10％B-B，  LWP 50-52.  LWP 320信号肽：  培养约4小时后  添加0.001mg/ml   100   0.25   819,200   3,276,800   82.5   1
  10％B-B，  LWP 50-52.  LWP 320信号肽：  培养约6小时后  添加0.001mg/ml   100   0.25   819,200   3,276,800   82.5   1
  10％B-B，  LWP 50-52.  LWP 320，  LWP 760信号  肽：添加0.1  mg/ml   100   0.25   819,200   3,276,800   82.5   1
  10％B-B，  LWP 50-52.  LWP 320，  PVD-32信号肽：  添加0.001mg/ml   100   0.25   819,200   3,276,800   82.5   1
如从表4可见，在约0.01mg/mL来自LWP 50-52的信号肽的存在下同时培养LWP50-52(生产者菌株)和LWP 50-52(诱导者菌株)约8小时将细菌素50-52的产量增加到直到1升培养液约353.1mg。添加分离自PVD-32和LWP 760的信号肽相对于对照不增加细菌素50-52的产量。应该注意到如果信号肽在培养开始大约2小时后引入培养液，总的培养时间为约12小时，细菌素的合成被最大化地增加。 
为评定所述信号肽在按比例放大的培养下对于细菌素生产的影响，在含有约6升介质的V-6升生物反应器中培养液的生物反应器中生长生产菌株和诱导菌株。对于10％ 的布氏肉汤、LWP 50-52、LWP 320，维持如表5的培养物和所述信号肽的浓度比例，在培养约2小时后添加0.01mg/ml的LWP 50-52信号肽。如上所述，细菌素50-52的分离在按如上所述培养约8、10、12和14小时后进行。对照含有pH约6.9，在约37℃，以及约150rpm的10％的布氏肉汤、LWP 50-52、LWP 320。在培养约12小时后分离细菌素50-52。对于第二个条件，除在培养2小时后添加大约0.22mg的LWP 50-52信号肽之外，所述条件是相同的。结果下面示于表5。每个条件重复3次。 表5.LWP 50-52信号肽的存在下生产者LWP 50-52和诱导者菌株LWP-320的培养
  实验条件   级份  体积  mL   蛋白质  浓度  mg/ml   活性  AU/ml   比活性  AU/mg   蛋白质的  量/介质  升   mg   蛋白质  量的增加   vs.对照
  对照   900   0.6   1,638,400   2,730,667   90   1
  在培养2小时后  添加0.22mg  LWP 50-52信号  肽   900   2.4   6,553,600   2,730,665   360   4
在LWP 50-52信号肽的存在下与LWP-320一起培养LWP 50-52，所述的LWP 50-52信号肽在培养开始约2小时后引入，在大约12小时的培养后导致约360mg/升的细菌素50-52的产生。 
实施例4
为了确定从LWP-760中分离的信号肽对细菌素760产生的效力，如实施例2所描述的在约37℃培养LWP-760。将约1ml含有大约109CFU/ml的LWP-760细胞悬浮液加至约10％的布氏肉汤，并在培养时或在培养开始约2，4，6小时后添加大约1ml的0.1mg/ml，0.01mg/ml，或0.001mg/ml的LWP-760信号肽制备物。对于另一系列变量，将约1ml含有约109CFU/ml的LWP-760细胞悬浮液加至约10％的布氏肉汤，将大约1ml含有大约109CFU/ml的诱导者菌株LWP-320细胞悬浮液加至所述肉汤，并在培养时或在开始培养约2，4或6小时后添加大约1ml的大约0.1mg/ml，0.01mg/ml，或0.001mg/ml的LWP-760信号肽制备物。下一系列条件包括含有大约109CFU/ml的约1ml的LWP-760细胞悬浮液被加至约10％的布氏肉汤，将大约1ml含有大约109CFU/ml的诱导者菌株LWP-320细胞悬浮液加至所述肉汤，并在培养开始时添加约1ml大约0.1mg/ml的纯化的LWP-50-52信号肽或纯化的PVD-32信号肽的制备物。对照在约10％布氏肉汤中含有约1ml含大约109CFU/ml的LWP-760细胞悬浮液以及含大约109CFU/ml的诱导者菌株LWP-320细胞悬浮液。 
采用在约10,000×g下离心约15分钟分开细胞和培养液来分离细菌素760。上清液被施于辛基琼脂糖凝胶4Fast Flow(快速流动)柱以重新获得所述细菌素，并采用约15mM的pH约6.3的K2HPO4洗脱缓冲液洗脱。细胞小团被悬浮在pH约5.6的约0.7％ 的NaCl的磷酸盐缓冲液(洗脱缓冲液)中，并将所述的悬浮液混合并温育约20分钟。温育阶段后，将悬浮液在约10,000×g下离心约15分钟。上清液被施于Superose SP Fast Flow(快速流动)柱以分离所述细菌素，采用约25mM的Tris-HCl以及约90mMNaCl的pH约6.4的洗脱缓冲液。所述细菌素级份抵抗空肠弯曲杆菌和肠炎沙门氏菌的拮抗活性在如上所述的斑点试验中评定。细菌素760的纯度水平用SDS-PAGE确定。等电点用等电聚焦确定。蛋白质浓度用分光光度法在约215nm确定。结果在下面的表6中展示。 表6LWP 760信号肽对细菌素760产生的影响
实验条件   级份  体积   mL   蛋白质  浓度   mg/ml   活性  AU/ml   比活性  AU/mg   从1升  培养液  产生的  蛋白质   mg   蛋白质   量的  增加vs.  对照
对照LWP 760LWP-320   100   0.3   1,638,840   5,462,666   99   1
LWP 760+0.1mg LWP 760信号肽   100   0.31   1,638,840   5,286,580   102.3   1.03
LWP 760+培养约2小时后添加的0.1mgLWP760信号肽   100   0.31   1,638,840   5,286,580   102.3   1.03
LWP 760+培养约4小时后添加的0.1mgLWP760信号肽   100   0.31   ,638,840   5,286,580   102.3   1.03
LWP 760+培养约6小时后添加的0.1mgLWP760信号肽   100   0.31   1,638,840   5,286,580   102.3   1.03
LWP 760+0.01mg LWP 760信号肽   100   0.3   1,638,840   5,462,666   99   1
LWP 760+培养约2小时后添加的0.01mgLWP760信号肽   100   0.30   1,638,840   5,462,666   99   1
LWP 760+培养约4小时后添加的0.01mgLWP760信号肽   100   0.30   1,638,840   5,462,666   99   1
LWP 760+培养约6小时后添加的0.01mgLWP760信号肽   100   0.30   1,638,840   5,462,666   99   1
LWP 760+0.001mgLWP760信号肽   100   0.30   1,638,840   5,462,666   99   1
LWP 760+培养约2小时后添加的0.001mgLWP760信号肽   100   0.30   1,638,840   5,462,666   99   1
 
LWP 760+培养约4小时后添加的0.001mgLWP760信号肽   100   0.30   1,638,840   5,462,666   99   1
LWP 760+培养约6小时后添加的0.001mgLWP760信号肽   100   0.30   1,638,840   5,462,666   99   1
LWP 760+LWP 320+0.1mg LWP760信号肽   100   0.28   1,638,840   5,853,000   92.4   0.9
LWP 760+LWP 320+培养约2小时后添加的0.1mgLWP760信号肽   100   0.35   1,638,840   4,682,400   115.5   1.16
LWP 760+LWP 320+培养约4小时后添加的0.1mgLWP760信号肽   100   0.35   1,638,840   4,682,400   115.5   1.16
LWP 760+LWP 320+培养约6小时后添加的0.1mgLWP760信号肽   100   0.35   1,638,840   4,682,400   115.5   1.16
LWP 760+LWP 320+0.01mgLWP760信号肽   100   1.56   6,533,600   4,201,025   514.8   5.2
LWP 760+LWP 320+培养约2小时后添加的0.01mgLWP760信号肽   100   1.56   6,533,600   4,201,025   514.8   5.2
LWP 760+LWP 320+培养约4小时后添加的0.01mgLWP760信号肽   100   2.1   13,107,200   6,241,523   693   7
LWP 760+LWP 320+培养约6小时后添加的0.01mgLWP760信号肽   100   1.56   6,553,600   4,201,025   514.8   5.2
LWP 760+LWP 320+0.001mgLWP760信号肽   100   0.32   1,638,840   5,121,375   105.6   1.06
LWP 760+LWP 320+培养约2小时后添加的0.001mgLWP760信号肽   100   0.32   1,638,840   5,121,375   105.6   1.06
 
LWP 760+LWP 320+培养约4小时后添加的0.001mgLWP760信号肽   100   0.32   1,638,840   5,121,375   105.6   1.06
LWP 760+LWP 320+培养约6小时后添加的0.001mgLWP760信号肽   100   0.32   1,638,840   5,121,375   105.6   1.06
LWP 760+LWP 320+0.1mgLWP50-52信号肽   100   0.30   1,638,840   5,462,666   99   1
LWP 760+LWP 320+0.1mgLWPPVD32信号肽   100   0.30   1,638,840   5,462,666   99   1
如从表6可见，诱导者菌株LWP 760和诱导者菌株320与约0.01mg来自LWP 760的信号肽的培养在4小时的培养中将细菌素760的产量增加到达到1升培养液大约693mg。引入来自PVD 32和LWP 50-52的信号肽相对于对照不增加细菌素760的细菌素生产的产量。 
为评定所述信号肽在按比例放大的培养下对于产生细菌素的作用，在有6升10％的布氏肉汤的V-6升生物反应器中生长LWP 760和LWP 320。维持如上表7中的产生510毫克/升的细菌素760的条件的培养物和所述信号肽的浓度比例。在培养约8、10、12和14小时后分离细菌素760。最大的细菌素产生发生在培养12小时之后(下表7)。 表7.按比例放大的条件下在LWP信号肽的存在下生产者菌株LWP 760和诱导者菌株LWP-320的培养
  实验条件   级份  体积  mL   蛋白质  浓度  mg/ml   活性  AU/ml   比活性  AU/mg   每升介质产  生的蛋白质  的量   mg   蛋白质  量的增  加vs.  对照
  对照   900   0.8   3,276,800   4,096,000   120   1
  0.22mg信号肽760   900   3.4   13,107,200   3,855,058   510   4.25
对照：V-61生物反应器，10％布氏肉汤，LWP 760，LWP 320，在pH 6.9，37℃，150r.p.m.下，培养12小时。 信号肽：V-61反应器，10％布氏肉汤，LWP 760，LWP 320，LWP 760信号肽-在培养2小时后添加0.22mg，pH 6.9，37℃，150r.p.m.，培养12小时。 
实施例5
针对所述信号肽的氨基酸序列由Edman降解确定，按产生商的说明使用491cLC自动测序仪(Applied Biosystems，La Jolla，Calif.)。每种信号肽的分子量的确定是通过具 有电喷雾离子化质谱(API IIITAGA 6000E，CJEX，Mumbai，印度)的基质辅助基质解吸和电离-飞行时间质谱仪(MALDI-TOFMS)按产生商的说明进行的。结果示于下表8中。 表8.细菌素OR-7，LWP50-52以及LWP760的氨基酸序列及其相应的信号肽
  样品   氨基酸序列   分子量  (Da)a
  细菌素   OR-7 KTYYGTNGVHCTKNSLWGKVRlKNMKYDQNTTYMGRLQDIL LGWATGAFGKTH SEQ ID NO 2   5,123
  PVD 32  信号肽   MVTKSLVLAWVVALLACGMVKGLT  SEQ ID NO 3   2,347
  细菌素  50-52 TTKNYGNGVCNSVNWCQCGNVWASCNLATGCAAWLCKLA SEQ ID NO 4   3,932
  LWP 50-52  信号肽 TNVTKSWWVLAGCNQVVASNCNCGNVKGLT SEQ ID NO 5   3,065
  细菌素760 NRWYCNSAAGGVGGAAVCGLAGYVGEAKENIAGEVRKGWG MAGGFTHNKACKSFPGSGWASG SEQ ID NO 6   5,362
  LWP 760  信号肽   WNKYKTNWVLSVCNTGCACAAVKGLT  SEQ ID NO 7   2,095
前述详细描述是为了举例说明的目的。这些细节仅仅是为了该目的，本领域技术人员可以做出变化而不会背离本发明的精神和范围。 
序列表
<110>Stern，Norman J.
Svetoch，Edward A.
Eruslanov，Boris V.
Perelygin，Vladimir V.
Levchuk，Vladimir P.
<120>细菌素诱导者肽
<130>0021.06
<160>7
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>细菌
<400>1
Val Lys Gly Leu Thr
1               5
<210>2
<211>53
<212>PRT
<213>唾液乳杆菌
<400>2
Lys Thr Tyr Tyr Gly Thr Asn Gly Val His Cys Thr Lys Asn Ser Leu
1               5                   10                  15
Trp Gly Lys Val Arg Leu Lys Asn Met Lys Tyr Asp Gln Asn Thr Thr
            20                  25                  30
Tyr Met Gly Arg Leu Gln Asp Ile Leu Leu Gly Trp Ala Thr Gly Ala
        35                  40                  45
Phe Gly Lys Thr His
    50
<210>3
<211>24
<212>PRT
<213>唾液乳杆菌
<400>3
Met Val Thr Lys Ser Leu Val Leu Ala Trp Val Val Ala Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Cys Gly Met Val Lys Gly Leu Thr
            20
<210>4
<211>39
<212>PRT
<213>屎肠球菌
<400>4
Thr Thr Lys Asn Tyr Gly Asn Gly Val Cys Asn Ser Val Asn Trp Cys
1               5                   10                  15
Gln Cys Gly Asn Val Trp Ala Ser Cys Asn Leu Ala Thr Gly Cys Ala
            20                  25                  30
Ala Trp Leu Cys Lys Leu Ala
        35
<210>5
<211>30
<212>PRT
<213>屎肠球菌
<400>5
Thr Asn Val Thr Lys Ser Trp Trp Val Leu Ala Gly Cys Asn Gln Val
1               5                   10                  15
Val Ala Ser Asn Cys Asn Cys Gly Asn Val Lys Gly Leu Thr
            20                  25                  30
<210>6
<211>62
<212>PRT
<213>仓鼠链球菌
<400>6
Asn Arg Trp Tyr Cys Asn Ser Ala Ala Gly Gly Val Gly Gly Ala Ala
1               5                   10                  15
Val Cys Gly Leu Ala Gly Tyr Val Gly Glu Ala Lys Glu Asn Ile Ala
            20                  25                  30
Gly Glu Val Arg Lys Gly Trp Gly Met Ala Gly Gly Phe Thr His Asn
        35                  40                  45
Lys Ala Cys Lys Ser Phe Pro Gly Ser Gly Trp Ala Ser Gly
    50                  55                  60
<210>7
<211>26
<212>PRT
<213>仓鼠链球菌
<400>7
Trp Asn Lys Tyr Lys Thr Asn Trp Val Leu Ser Val Cys Asn Thr Gly
1               5                   10                  15
Cys Ala Cys Ala Ala Val Lys Gly Leu Thr
            20                  25

Claims (6)

1.一种肽，所述肽的氨基酸序列是SEQ ID NO 3。
2.一种肽，所述肽的氨基酸序列是SEQ ID NO 5。
3.一种肽，所述肽的氨基酸序列是SEQ ID NO 7。
4.一种用于刺激氨基酸序列是SEQ ID NO 2的细菌素的产生的方法，包括：
a.向培养物体系添加产细菌素细胞系NRRL B-30514和诱导者细胞系NRRL B-30884，
b.添加如权利要求1所述的肽，以及
c.培养所述细菌和所述肽一段时间以实现与不添加所述肽的对照相比增加的所述细菌素的产生。
5.一种用于刺激氨基酸序列是SEQ ID NO 4的细菌素的产生的方法，包括：
a.向培养物体系添加产细菌素细胞系NRRL B-30746和诱导者细胞系NRRL B-30510，
b.向所述体系添加如权利要求2所述的肽，以及
c.培养所述细菌和肽一段时间以实现与不添加所述肽的对照相比增加的所述细菌素的产生。
6.一种用于刺激氨基酸序列是SEQ ID NO 6的细菌素的产生的方法，包括：
d.向培养物体系添加产细菌素细胞系NRRL B-30745和诱导者细胞系NRRL B-30510，
e.添加如权利要求3所述的肽，以及
f.培养所述细菌和所述肽一段时间以实现与不添加所述肽的对照相比增加的所述细菌素的产生。
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