CN101846676B - 一种氨基化微球的荧光编码方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种氨基化微球的荧光编码方法，利用荧光标记缓冲液和荧光染料母液配制的不同浓度的荧光染料可以牢固的标记氨基化微球，实现氨基化微球的荧光编码，在激发光激发下，荧光编码微球可发射不同强度的发射光，能应用于流式微球阵列等生物技术领域。本发明的氨基化微球的荧光编码方法具有方法简洁、荧光稳定及变异系数小等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种氨基化微球的荧光染料编码方法。
背景技术
流式微球阵列是既能保证信息质量，又能提供相对高通量的分子探测平台，与其技术原理相同的xMAP(flexible multi-analyte profiling，又名液相芯片)技术是美国FDA 2001年批准的首个临床型阵列分析技术。阵列分析时，微球锚定的捕获分子(抗体或核酸探针)捕获靶点分子，荧光标记的报道分子(抗体或核酸探针)报道靶点分子，一种或两种不同浓度荧光编码的微球组建阵列即可进行多参数并行分析。阵列解码常用生物医学工程仪器流式细胞仪(flowcytometer)或专用液相芯片仪。流式微球阵列具有灵敏度高、特异性强、数据图像化及多任务定量的显著优点。
流式微球阵列所用微球直径在0.5～50微米之间，由一种或两种不同浓度的荧光标记微球，以此编码微球，建立荧光微球阵列，其广泛应用在医学、药学、生物技术、标准计量、食品化工、信息工程和微电子技术等领域。尤其在生物医药领域，荧光编码的微米级功能化聚苯乙烯微球对临床分子诊断、药物快速发现、检验检疫、免疫技术、细胞学等研究和应用具有重要价值。利用不同浓度荧光编码的直径0.5～50微米微球组建流式微球阵列，特异性抗体识别融合蛋白或以寡核苷酸探针识别融合基因cDNA拷贝，可以实施白血病诊断和微小残留病监测；流式微球阵列结合分析同步筛选配基竞争性和ATP竞争性受体酪氨酸激酶拮抗剂，可敲除药物抵抗先导物并避免放射法污染，进而快速、准确、有效地发现抗肿瘤先导药物；此外探测细胞ERK信号通路传导的流式微球阵列也见诸报道。相比其它分子检测手段，基于荧光编码微球的流式微球阵列和液相芯片具有下述突出优点：(1)相对高通量。可以并行检测多个参数；(2)灵敏度高。检测下限低于夹心ELISA；(3)微量检测。所需样本少，特别是临床检验只需几微升血液样品，即可快速完成多个并行临床参数检测。
目前微球常用的荧光编码方法是包埋法和乳化法。微球荧光编码包埋法是由单体、引发剂、交联剂、稳定剂、荧光染料及含氨基有机化合物组成反应体系，经一定时间反应生成氨基化微球，荧光染料以分子或离子状态吸附在微球内部孔穴，在微球制备过程中直接将荧光染料包裹在微球内部网状空间中，如：中国专利CN1475805在微球制备过程中掺入荧光染料编码微球；中国专利CN1690163利用诱导相变包埋量子点制备荧光编码微球，此法主要缺点是：(1)荧光标记不稳定，泄露不可避免；(2)荧光强度不易提高；(3)量子点制备技术较为繁冗，不易掌握。微球荧光编码乳化法是将荧光素与一定量的微球、乳化剂、增粘剂、溶剂混合组成反应体系，溶剂可为良溶剂和不良溶剂中的一种或者多种的混合物，体系均匀分散后在一定压力下避光染色数小时至数天，得荧光微球，如：中国专利CN101092487使用乳化法制备荧光编码聚苯乙烯微球，此法虽然可以有效避免荧光染料的泄露问题，但染色反应体系组分多，染色条件相对苛刻，微球荧光的均一性也不易控制。国外也有USP5073498、USP4157323、USP4336173等多篇专利涉及微球的制备和荧光编码技术，但这些专利技术均不包含本专利所要求权利的内容。
发明内容
针对已有微球荧光编码方法的不足，本发明提供了一种氨基化微球的荧光编码方法，可以简洁、快速、有效地实现氨基化微球的不同浓度荧光标记。
本发明的技术方案如下：
一种氨基化微球的荧光编码方法，步骤如下：
(1)称取无机钾盐或无机钠盐溶于双蒸水中，使其摩尔浓度为0.01～1M，pH4～10，制得荧光标记缓冲液；
(2)将0.1～10mg荧光染料溶于0.1～10ml有机溶剂中，制得荧光染料母液；
(3)将步骤(2)制得的荧光染料母液加入到步骤(1)制得的荧光标记缓冲液中，配制不同浓度的荧光染液，荧光染液中的荧光染料浓度范围为0.1～1000μg/ml；
(4)分别取相同体积的步骤(3)制得的不同浓度的荧光染液，分别加入到装有相同重量的氨基化微球的离心管中，得到若干组混合体系，均匀分散后在4℃～25℃条件下摇动并避光进行荧光标记0.5～8小时，将荧光编码的氨基化微球洗涤3次，-20～4℃、避光保存。
上述步骤(4)中所取荧光染液体积为1～100ml，离心管中氨基化微球的装入量为0.1～10mg，氨基化微球的直径为0.5～50微米。
本发明的上述方法，使用不同浓度的荧光染料标记氨基化微球，可实现氨基化微球的荧光编码，在激发光激发下，发射不同强度的的发射光，能应用于流式微球阵列。
所述的无机钠盐选自Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl、Na2SO4、NaHSO4、NaHSO3、Na2SO3、Na2CO3、NaHCO3、Na2B4O7之一或组合，所述的无机钾盐选自K2HPO4、KH2PO4、KCl、K2SO4、KHSO4、K2CO3、KHCO3、KHSO3、K2SO3之一或组合。
所述的荧光染料选自异硫氰酸荧光素(FITC)、Alexa Fluor 488染料之一。
所述的有机溶剂选自乙醇、丙酮、乙醚、苯、二硫化碳、二氯甲烷、吡啶、二氧六环、四氢呋喃、苯、石油醚、乙酸乙酯、含硫有机溶剂、氯仿、酰胺类溶剂中的一种或多种。
所述的微球材料为聚苯乙烯、聚苯乙烯共聚物、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺共聚物、聚丙烯酸酯、聚丙烯酸酯共聚物、聚糖或聚糖共聚物。所述的氨基化微球为在微球材料内部或表面携带氨基基团的微球，或者是在所述的微球材料内部及表面均携带氨基基团的微球。
优选的，所述的氨基化微球是5～10微米氨基化聚苯乙烯微球，10～15微米携带氨基的聚丙烯酰胺微球，0.5～1微米的氨基化聚丙烯酸酯微球。
本发明所述的氨基化微球可以通过市场购买，也可以使用常规方法制备。
如单分散法制备氨基化聚苯乙烯微球，在带有搅拌装置、通氮气溶液的三口烧瓶中，加入稳定剂和溶剂，升温并搅拌成无颗粒均相体系，再加入引发剂、单体、带有氨基基团(-NH2)的有机化合物、其它有机化合物和交联剂，保持温度、氮气气氛和搅拌速度，聚合24-72小时，反应结束后，冷却至室温，将聚合得到的样品用离心机分离，弃去上层清液，然后洗涤下层微球，再离心，弃去上层清液，如此反复3次洗涤，干燥微球，然后收集样品并存贮在100mL棕色瓶中。制备方法参见：冯爱玲，吴道澄，吴红，杨青艳.荧光素三元共聚纳米微粒的合成及其荧光性质.第四军医大学学报，2005；26(4)：325-329。
携带氨基的聚丙烯酰胺微球，制备方法参见：刘机关，倪忠斌，熊万斌，徐亚鹏，封姣，陈明清.聚丙烯酞胺交联微球的制备及其粒径影响因素.石油化工，2008；37(10)：1059-1063。
本发明的优选技术方案如下：
(1)称取无机钠盐溶于双蒸水中，使摩尔浓度为0.1M，pH 9.0，配制荧光标记缓冲液；
(2)将1mg荧光染料溶于1ml有机溶剂中，配制荧光染料母液；
(3)将步骤(2)制得的荧光染料母液加入到步骤(1)制得的荧光标记缓冲液中，配制成荧光染料浓度为0.2μg/ml、0.4μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、31.25μg/ml、62.5μg/ml、781.25μg/ml的荧光染液；
(4)取步骤(3)制得的不同浓度的荧光染液各1ml分别加入到装有1mg的直径5.4微米氨基化微球的离心管中，得到若干组混合体系，均匀分散后在4℃条件下摇动并避光进行荧光标记1小时，将荧光编码的氨基化微球洗涤3次，4℃保存。
本发明氨基化微球的荧光编码方法，包括荧光染料、有机溶剂、荧光标记缓冲液和氨基化微球，其特点在于利用荧光标记缓冲液和有机溶剂，不同浓度的荧光染料可以牢固的标记氨基化微球，实现氨基化微球的荧光编码，在激发光激发下，荧光编码微球可发射不同强度的发射光，能应用于流式微球阵列等生物技术领域。与现有方法比较，本发明的氨基化微球的荧光编码方法具有方法简洁、荧光稳定及变异系数小等显著优点。
本发明的方法是一种简洁、有效、荧光强度易控、荧光结合稳定的氨基化微球荧光编码方法，可广泛应用于流式微球阵列、液相芯片、荧光和激光共焦点扫描显微镜校准品、生物传感器等领域。
附图说明
图1是0.4μg/ml FITC荧光标记的氨基化聚苯乙烯微球在激发波长＝488/发射波长＝520(Ex＝488/Em＝520)的荧光显微镜照片；
图2是5μg/ml FITC荧光标记的氨基化聚苯乙烯微球在Ex＝488/Em＝520的荧光显微镜照片；图3是0.4μg/ml和5μg/ml FITC荧光编码的2个氨基化聚苯乙烯微球群流式点图；
图4是0.2μg/ml、2.5μg/ml及31.25μg/ml Alexa Fluor 488荧光编码的3个氨基化聚苯乙烯微球群流式点图。
具体实施方式
下面给出本发明的实施例，这是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
实施例中使用的荧光染料FITC为Sigma公司产品，Alexa Fluor 488染料为MolecularProbes公司产品。
实施例1、氨基化微球的荧光编码方法
本实施例中的氨基化微球是5.4微米氨基化聚苯乙烯微球，是按现有技术制备的，制备方法参见：冯爱玲，吴道澄，吴红，杨青艳.荧光素三元共聚纳米微粒的合成及其荧光性质.第四军医大学学报，2005；26(4)：325-329。
称取0.358g Na2HPO4溶于10ml双蒸水中，pH 9.0，混匀，配制荧光标记缓冲液；将1mgFITC溶于1ml二甲基亚枫中，配制FITC母液；再将一定量的FITC母液加入到荧光标记缓冲液中，配制0.4μg/ml和5μg/ml FITC染液，分别取1ml FITC染液加入含1mg氨基化聚苯乙烯微球的离心管中，混匀，避光、室温、摇动染色2小时，制得2群荧光编码微球，计数备用。由本实施例制备的两群荧光编码微球，可被488nm激发光激发，发射520nm发射光，得到亮度不同的荧光显微镜照片(250x)：图1为0.4μg/ml FITC荧光标记的氨基化聚苯乙烯微球在Ex＝488/Em＝520的荧光显微镜照片；图2为5μg/ml FITC荧光标记的氨基化聚苯乙烯微球在Ex＝488/Em＝520的荧光显微镜照片；图3为0.4μg/ml和5μg/ml FITC荧光编码的R2和R3氨基化聚苯乙烯微球群流式点图，在FL2 vs FL1流式点图中FL1的荧光强度分别为15.29和38.93。
实施例2、氨基化微球同实施例1。氨基化微球的荧光编码方法，步骤如下：
称取0.084g NaHCO3溶于10ml双蒸水中，pH 8.0，混匀，配制荧光标记缓冲液；将AlexaFluor 488 1mg溶于1ml二甲基亚枫中，配制Alexa Fluor 488母液；使用一定量的Alexa Fluor488母液溶于荧光标记缓冲液中，配制0.2μg/ml、2.5μg/ml及31.25μg/ml Alexa Fluor 488染液，分别取1ml Alexa Fluor 488染液加入含1mg氨基化聚苯乙烯微球的离心管中，混匀，避光、室温、摇动染色2小时，制得3群荧光编码微球，计数备用。由本实施例制备的三群荧光编码微球，可被流式细胞仪488nm激发光激发，发射520nm发射光，得到亮度不同的微球群：图4为0.2μg/ml、2.5μg/ml及31.25μg/ml Alexa Fluor 488荧光编码的R2、R3和R4氨基化聚苯乙烯微球群流式点图，在FL2 vs FL1流式点图中FL1的荧光强度分别为12.5、56.96和162.13。
实施例3、氨基化微球的荧光编码方法
本实施例中的氨基化微球是直径10微米携带氨基的聚丙烯酰胺微球，制备方法参见：刘机关，倪忠斌，熊万斌，徐亚鹏，封姣，陈明清.聚丙烯酰胺交联微球的制备及其粒径影响因素.石油化工，2008；37(10)：1059-1063。
称取0.1g Na2CO3溶于10ml双蒸水中，pH 9.0，混匀，配制荧光标记缓冲液；将1mg FITC溶于1ml二甲基亚枫中，配制FITC母液；再将一定量的FITC母液加入到荧光标记缓冲液中，配制0.2μg/ml和5μg/ml FITC染液，分别取1ml FITC染液加入含1mg携带氨基聚丙烯酰胺微球的离心管中，混匀，避光、室温、摇动染色1小时，制得2群荧光编码微球，计数备用。由本实施例制备的两群荧光编码微球，可被流式细胞仪488nm激发光激发，发射520nm发射光，0.2μg/ml和5μg/ml FITC荧光标记的2个携带氨基聚丙烯酰胺微球群在FL2 vs FL1流式点图中FL1的荧光强度分别为10.61和40.28。
实施例4、氨基化微球的荧光编码方法
本实施例中的氨基化微球是：直径0.5微米的氨基化聚丙烯酸酯微球，购自深圳纳微科技有限公司。
称取0.1g Na2CO3溶于10ml双蒸水中，pH 9.0，混匀，配制荧光标记缓冲液；将1mg FITC溶于1ml二甲基亚枫中，配制FITC母液；再将一定量的FITC母液加入到荧光标记缓冲液中，配制0.2μg/ml和5μg/ml FITC染液，分别取1ml FITC染液加入含1mg氨基化聚丙烯酸酯微球的离心管中，混匀，避光、室温、摇动染色2小时，制得2群荧光编码微球，计数备用。由本实施例制备的两种荧光编码微球，可被流式细胞仪488nm激发光激发，发射520nm发射光，0.2μg/ml和5μg/ml FITC荧光标记的2个氨基化聚丙烯酸酯微球群在FL2vs FL1流式点图中FL1的荧光强度分别为9.53和44.76。
Claims (1)
1.一种氨基化微球的荧光编码方法，步骤如下:
(1) 称取无机钾盐或无机钠盐溶于双蒸水中，使其摩尔浓度为0.01~1M, pH 为8或9, 制得荧光标记缓冲液；
(2) 将0.1~10mg 荧光染料溶于0.1~10ml 有机溶剂中，制得荧光染料母液；
所述的荧光染料选自异硫氰酸荧光素、Alexa Fluor 488染料之一；
所述的有机溶剂是二甲基亚枫；
(3) 将步骤(2)制得的荧光染料母液加入到步骤(1)制得的荧光标记缓冲液中，配制不同浓度的荧光染液，荧光染液中的荧光染料浓度范围为0.1~1000μg/ml；
(4) 分别取相同体积的步骤(3)制得的不同浓度的荧光染液分别加入到装有相同重量的氨基化微球的离心管中，得到若干组混合体系，均匀分散后在4℃~25℃条件下摇动并避光进行荧光标记0.5~8小时，将荧光编码的氨基化微球洗涤3次，-20~4℃、避光保存；
所述的氨基化微球是直径为5~10微米氨基化聚苯乙烯微球，直径为10~15微米携带氨基的聚丙烯酰胺微球或直径为0.5~1微米的氨基化聚丙烯酸酯微球。
2．如权利要求1所述的氨基化微球的荧光编码方法，其特征在于所述的无机钠盐选自Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl、Na2SO4、NaHSO4、NaHSO3、Na2SO3、Na2CO3、NaHCO3、Na2B4O7之一或组合。
3．如权利要求1所述的氨基化微球的荧光编码方法，其特征在于所述的无机钾盐选自K2HPO4、KH2PO4、KCl、K2SO4、KHSO4、K2CO3、KHCO3、KHSO3、K2SO3之一或组合。
4．如权利要求1所述的氨基化微球的荧光编码方法，其特征在于步骤如下:
(1) 称取无机钠盐溶于双蒸水中，使摩尔浓度为0.1 M, pH 9.0, 配制荧光标记缓冲液；
(2) 将1mg 荧光染料溶于1ml 有机溶剂中，配制荧光染料母液；
(3) 将步骤(2)制得的荧光染料母液加入到步骤(1)制得的荧光标记缓冲液中，配制成荧光染料浓度为0.2μg/ml 、0.4μg/ml、2.5μg/ml 、5μg/ml、31.25μg/ml 、62.5μg/ml、781.25μg/ml的荧光染液；
(4) 取步骤(3)制得的不同浓度的荧光染液各1ml分别加入到装有1mg的直径 5.4微米氨基化微球的离心管中，得到若干组混合体系，均匀分散后在4℃条件下摇动并避光进行荧光标记1 小时，将荧光编码的氨基化微球洗涤3次，4℃保存。
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